Toxicita TiO2 NPs(pravdy, polopravdy a mýty)

Miloslav PouzarUniverzita Pardubice

2014

Spiknutí toxikologů proti TiO2?

"Jak dlouho ještě budou toxikologové tahat peníze z nás, z průmyslu, na prokazování už tolikrát prokázaného? Stovky studií zaměřených na studium zdravotních následků profesionální expozice jasně dokládají, že je TiO2 mnohem méně škodlivý, než polétavý prach. V rámci inhalačních in-vivo studií je dokonce tato látka používána po mnoho let jako negativní kontrola. Může mi tedy někdo vysvětlit, proč se tím vůbec ještě zabývat?"

Ing. Jan Procházka Ph.D.ředitel firmy Advanced Materials - JTJ s.r.o.(nano TiO2, fotokatalytické aplikace)

v rámci akce: Kulatý stůl - Nanobezpečnost a odpovědné nakládání s nanomateriály v ČR a EU, Praha, Ústav experimentální medicíny AV ČR, Česká technologická platforma bezpečnosti průmyslu, 14.4.2014

http://www.czso.cz/csu/2013edicniplan.nsf/t/6600344856/$File/960113a04.pdf

Spiknutí toxikologů proti TiO2?

Warheit D.B., DuPont Haskell Centers for Health and Environmental Sciences, "How to measure hazard/risks following exposures to nanoscale or pigment-grade titanium dioxide particles"

Warheit D.B., Toxicology Letters 220 (2013) 193 - 204

• toxikologická data o TiO2 - nedostatečná FCH charakterizace částic

– krystalová struktura (rutil - pigmenty, anatas – fotokatalytické NPs)– velikost částic (250 - 400 nm - pigmenty; < 100 – fotokatalytické NPs)– povrchová úprava a pH povrchu (neupravené částice "kyselejší")

• další nezbytné údaje

– stupeň aglomerace v relevantním médiu– povrchová reaktivita– metoda přípravy/výroby včetně úpravy povrchu (neutralizace)– čistota

Warheit D.B., Toxicology Letters 220 (2013) 193 - 204

R//382nm//5,8 m2/g// Db 0,4//

R//136nm//18,2 m2/g// Db 10,1//

R//149nm//35,7 m2/g// Db 1,2

0,8 A-0,2 R// 129 nm// 53,0 m2/g// Db 23,8

PMNs - % neutrofilů - BAL

Spiknutí toxikologů proti TiO2?

Potkan, intratracheální instilace

Spiknutí toxikologů proti TiO2?• in-vivo studie – nesmyslně vysoké koncentrace, nevhodný model a způsob aplikace

– Lee a kol. (1985) – 2-letá inhalační studie, potkan, TiO2 pigment gr. (10, 50 a 250 mg.m-3), tumory pouze u nejvyšší koncentrace

– Bermudez a kol. (2004) – 13-ti týdenní inhalační studie, uf-TiO2 (0,5; 2 a 10 mg.m-3), fem. potkan, myš a křeček, křečci větší schopnost vylučovat NPs než myši a potkani, u myší a potkanů pozorovány při 10 mg.m-3 biomarkery zánětu a cytotoxicity, u potkanů též známky vznikající fibrózy

– Nikula a kol. (2001) – inhalační expozice různým typům částic (uhelný prach, zplodiny z dieselového motoru – 2mg. mg.m-3, 24 měsíců), celkový záchyt částic v plicích u primátů a potkanů podobný, vyšší retence částic v alveolách a vyšší zánětlivá reakce u potkanů

– Warheit akol. (1997) – 4-týdení inhalační studie, potkan, TiO2 pigment gr. a pentakarbonyl železa (10, 50 a 250 mg.m-3), při nejvyšší koncentraci 6-měsíců přetrvávající zánětlivá reakce, proliferace plicních buněk, zhoršené vylučování částic, poškozená funkce makrofágů – vliv přetížení plic (overload), nikoli typu částic

Warheit D.B., Toxicology Letters 220 (2013) 193 - 204

Spiknutí toxikologů proti TiO2?• kohortové studie - expozice v pracovním prostředí – žádný důkaz o zvýšené

incidenci či mortalitě rakoviny plic, nenádorových plicních a srdečních onemocnění

– Chen a kol. (1988) – 1 576 mužů, 1 rok výroba TiO2 , 2 závody v USA

– Fryzek a kol. (2003) – 4 241 osob, retrospektivní studie, 4 závody v USA– Boffeta a kol. (2004) – 15 017 osob, 1 rok výroba TiO2 , 11 závodů v EU

– Ellis a kol. (2010, 2014) – 3 607 osob, výroba TiO2, DuPont 1935 - 2006

Warheit D.B., Toxicology Letters 220 (2013) 193 - 204

• IARC (TiO2 – 2006 a 2010 karcinogen třídy 2B – v publikaci neuvedeno !!!)

– výrazná disproporce mezi výsledky epidemiologických studií a in-vivo testy inhalační toxicity; studie prokazující negativní korelaci mezi expozicí TiO2 a incidencí rakoviny plic [Siemiatycki (1991); Boffetta a kol. (2001); Ramanakumar a kol. (2006, 2008)]

– TiO2 NPs tvoří málo významnou frakci dosud studovaných TiO2 produktů

TiO2 – mechanismy toxického účinku

• plicní makrofágy účinně pohlcují pouze částice o velikosti v řádu m, v případě TiO2 NPs fagocytovány jen větší aglomeráty – volné NPs setrvávají dlouhodobě v plicní tkáni

• TiO2 NPs po inhalační expozici prostupují do epiteliálních a endoteliálních buněk a fibroblastů, pohybují se v cytoplazmě – možnost interakce s buněčnými organelami

Skocaj M. a kol., Radiology and Oncology (2011) 227 - 247

Přestup do buněk

• celá řada in-vitro testů prokázala schopnost TiO2 NPs prostupovat do buněk, zvyšovat tvorbu ROS, ovlivňovat expresi genů významných antioxidačních enzymů, způsobit vyčerpání antioxidantů (GSH) a poškodit buňku (peroxidace lipidů, poškození DNA apod.)

• vliv UV záření (anatas) – fotoaktivované TiO2 NPs výrazněji indukují oxidativní stres i bez přítomnosti UV záření (stejný účinek pro anatas 25 a 100 nm)

• oxidativní stres dále vyvolává produkci pro-zánětlivých mediátorů (TNF, MIP-2), poškození DNA a denaturaci protreinů

Indukce oxidativního stresu

Manke A. a kol., BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 942916

Poškození DNA Poškození mitochondrií, apoptóza

Peroxidace lipidů

Tvorba mikrojader

Fagocytující buňky - ROS

NP

Nádory

Oxidativní stres

TNF, IL-1, TGF-

P38-MAPK, NF-BProliferace ECM

ROS

Fibróza Zánět

Pelclova D., Sborník NANOCON 2012 Conference, Brno, Czech Rep. October 23-25.

Analýza kondenzátu vydechovaného vzduchu• Vyšetření dělníků z výroby TiO2 (11 kuřáků, 9 nekuřáků, věk 355 let, zaměstnání 94 roky)

• Expozice TiO2 0,1 – 30 mg.m3 (15 nm - 10m, 90 % částic 100 nm)

Oxidace proteinů Markery zánětu

TiO2 – mechanismy toxického účinku

• obvykle negativní výsledky in-vitro testů mutagenity (Amesův test, mikronukleus test ap)• genotoxicita nejčastěji jako sekundární projev oxidativního stresu a zánětu – vliv velikosti, krystalické struktury ( anatas),

povrchového náboje atd.• Li a kol. (2010) - přímá interakce nano-anatasu s bázemi DNA jaterních buněk (ip aplikace, 14 dní, 5-150 mg.kg-1)

Skocaj M. a kol., Radiology and Oncology (2011) 227 - 247

Genotoxicita

• Interakce s makrofágy, monocyty, leukocyty a dendritickými buňkami závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech nanomateriálu• apoptóza a nekróza buněk v důsledku oxidativního stresu – prozánětlivé cytokiny• Li a kol. (2013) – intranasální instilace, anatas 6 nm (2,5; 5 a 10 mg.kg-1) , 90 dní, známky oxidativního stresu a zánětu vykazující závislost na dávce, zvýšená exprese genů regulujících odezvu na

oxidativní stres, zánětlivou reakci a buněčný cyklus • adjuvantní aktivita – vznik alergií

Imunotoxický efekt

TiO2 – mechanismy toxického účinku

Iavicoli I. a kol., Journal of Nanomaterials (2012) ID 964381

Cit. Modifikace(velikost v nm)

Expozice Model Účinek

31 Rutil (80 nm); Anatas (155 nm)

Intranasální inst. 500 g; 15 dní

Myš (Fem, CD-1)

Distribuce v čichovém laloku a hipokampu; oxidativní stres

92 Rutil (80 nm); Anatas (155 nm)

Intranasální inst. 500 g; 15 dní

Myš (Fem, CD-1, ICR)

Distribuce v hipokampu; oxidativní stres; markéry zánětu - TNF

* Anatas (5-6 nm; DH = 294 nm)

Intranasální inst. 2,5 -10 mg.kg-1 ; 90 dní

Myš (Mal, CD-1, ICR)

Konc. v mozku závislá na dávce; oxidativní stres; krvácení do mozku (přepočet 150 – 700 mg.kg-1 - 70 kg)

73 Anatas (3 nm) Intratrach. inst. 3,3 mg.kg-1 ; 4 týdny

Myš (Mal, Kunming)

koncentrace v mozku; oxidativní stres; nekróza a zánět mozkové tkáně

94 Anatas (5 nm) Intragastr. adm. 5 - 50 mg.kg-1 ; 60 dní

Myš (Fem) NT – Ach, Glu a NO; NT – NE, DA, 5-HT, DOPAC;změna enzymatické aktivity

OSHA PEL (TiO2 FPs) = 15 mg.kg-1 ; NIOSH REL (TiO2 NPs) = 0,3 mg.kg-1; NEDO (TiO2 NPs) = 1,2 mg.kg-1

* Yuguan Z. a kol., Chemosphere 92 (2013) 1183–1189

Neurotoxicita

Rizika – expozice TiO2 NPs

• tvorba ROS, zánět a nádorová onemocnění plic – pomalejší vylučování NPs u lidí než u myší a potkanů – data ze studií na potkanech relevantní pro odhad rizika u lidí

• Nurkiewitz a kol. (2008) – potkan, inhalační expozice TiO2 (21 nm, 1,5-12 mg.m-3, 240 – 720 min) – poškození krevních kapilár bez zjevných známek poškození či zánětu plic

• přestup do mozku (axonální translokace i přestup z krve) – neurotoxické účinky

Skocaj M. a kol., Radiology and Oncology (2011) 227 - 247

Inhalační

• NOAEL = 62,5 mg.kg-1.den-1 – 30 dní, 5 nm anatas, myš, žaludeční sonda; poškození jater (zvýšená enzymatická aktivita, triglyceridy a cholesterol) při 125 mg.kg -1.den-1 (Duan a kol. 2010)• LOAEL = 5 mg.kg-1.den-1 - 60 dní, 5 nm anatas, myš, žaludeční sonda – imunosuprese, poškození jater a mozku (Hu a kol. 2010)• TiO2 NPs (5 nm) - 60 denní aplikace žaludeční sondou (10 a 50 mg.kg-1.den-1 ), myš – akumulace v játrech, hepatotoxicita a imunotoxicita

• neurotoxicita – anatas 5 nm, 60 dní, 5 - 50 mg.kg-1

Orální (www.nicnas.gov.au)

E 171 – průměr 110 nm; rozpětí 30 – 400 nm; 36 % částic pod 100 nm

FDA - obsah TiO2 nesmí překročit 1% hmotnosti potraviny

Weir A. a kol., Environmental Science and Technology (2012) 46, 2242 - 2250

Rizika – expozice TiO2 NPs

• TiO2 v opalovacích krémech od roku 1952, povolení FDA – 1999

• velikost částic 5 – 500 nm, 50 nm – ideální poměr mezi barvou a UV opacitou (rutil), povrchová úprava (silika, alumina, zirkonium)

• penetrační studie – obvykle záchyt NPs ve stratum corneum (10 m mrtvých buněk, keratin)

• popsán průnik přes kůži bezsrsté myši (lipidy, abnormální folikuly)

• Sadrieh a kol. (2010) – 4-týdenní studie, TiO2 různá velikost a povrchová úprava, 5% v krému, miniprase – zvýšená koncentrace TiO2 v epidermis, dermis a tříselných uzlinách (v dermis 810-5 % aplikované dávky) – 4 týdenní používání krému vede k přestupu 2,61010 částic

• Yanagisawa a kol. (2009) – intradermální injekce TiO2 – atopická dermatitida (aktivace imunitního systému) – vliv poškození kůže

Skocaj M. a kol., Radiology and Oncology (2011) 227 - 247

Dermální

http://www.itn.pt/sec/fis/eb/uk_eb_stratum_corneum.htm

Fotokatalýza

Liou J.-W. a kol., Arch. Immunol. Ther. Exp. (2012) 60:267–275

E. coli

Rizika TiO2 NPs spojená s fotokatalýzou

• anatas (Eg = 3,2 eV), rutil (Eg = 3,02 eV) → 387,5 a 410 nm (3% intenzity slunečního světla)

• viry > gram-negativní bakterie > gram-pozitivní bakterie > endospory > kvasinky > vláknité houby

• kompletní fotokatalytická destrukce buněčných komponent (za 75 h)

Markowska-Szczupak A. a kol., Catalysis Today 169 (2011) 249–257

Antimikrobiální aktivita

• Huang Z. a kol. (2000) - E. coli – produkce enzymů SOD (konverze O2- na H2O2) a katalázy (konverze H2O2 na H2O a O2)

• Tsai T.-M. a kol. (2010) - není korelace mezi odolností vůči antibiotikům a TiO2, odolnost vůči TiO2 v některých případech spojena s tvorbou plasmidů

Rezistence

Rizika TiO2 NPs spojená s fotokatalýzou

• pokusy s odstraňováním VOCs, PAHs a NOx v laboratorních podmínkách → koncentrace v ppm ( - konstantní, účinnost oxidace závislá na ); v reálných podmínkách koncentrace v ppb (význam )

• prudký pokles rychlosti oxidace při koncentracích jednotky ppm

• oxidace směsí → např. inhibiční účinek SO2

Lyu J. a kol: Catalysis Today 225 (2014) 24 - 33

Rozklad škodlivin

• vliv vzdušné vlhkosti → např. snížená adsorpce škodlivin, vysoká koncentrace meziproduktů vytlačovaných vlhkostí do plynné fáze (nedokonalá mineralizace)

• Gunschera J. a kol. (2009) – mezi typické produkty fotooxidace VOCs na TiO2 patří formaldehyd, formaldehyde, furfural, acetophenon, n-butylbutyrát, n-butyl-i-butyrát, n-butylpropionát, 4-heptanon, kyselina octová, i-butyraldehyd a krotonaldehyd

• Auvinen J. a kol. (2008) – zdrojem toxických produktů fotooxidace může být i degradace organické složky nátěrové hmoty

nano TiO2 (5-150 nm)

Pig.1 (20% TiO2, 4 % nano TiO2 )

Pig.2 (20% TiO2 )

Pig.3 (org. matrice)

TiO2

nano SiO2

Rizika TiO2 NPs spojená s fotokatalýzou

• Kaiser a kol. (2013) zvětrávání nátěrů v klimatické komoře, mletí a aplikace na buňky CaCo-2 (trávicí trakt – nádor tlustého střeva) a Jurkat (imunitní systém – lidské T lymfocyty)

Kaiser J.-P. a kol: Plos One (2013) 8 (12) e83215

Uvolňování TiO2 z nátěrů

CaCo-2

A to je konec…..Děkuji za pozornost