15/03/2010
1
transgenoze a klonování transgenoze a klonování živočichůživočichů
základní metody transformace živočišných buněkzákladní metody transformace živočišných buněk
•• MiMikroinjekcekroinjekce – cizorodá DNA se přenáší do oplodněného vajíčka pomocí tenké skleněné kapiláry pod mikroskopem
– mikroinjekce spermioidů
•• Injekce rekombinantními kmenovými buňkamiInjekce rekombinantními kmenovými buňkami
•• LipofekceLipofekce
•• ElektroporaceElektroporace
•• Retrovirální infekceRetrovirální infekce – viz přednáška genové terapie
15/03/2010
2
lipofekcelipofekce
• DNA se zabalí umělými lipidovými vezikuly (lipozomy) a přirozenou cestou je dopravená až do jádra
• DNA je záporně nabitáli id j bi kl d• lipidové monomery jsou nabité kladně
3-dimethylamino-1,2-propanediol
oleyl-toluensulfonát
dioleyloxy(propyl)-N,N,N- trimetylamonium chlorid
lipofekcelipofekce
15/03/2010
3
DNADNA
lipofekce lipofekce (snímky z elektronového mikroskopu)(snímky z elektronového mikroskopu)
liposomliposom
komplexkomplex
liposomy mohou sloužit jako tkáňově liposomy mohou sloužit jako tkáňově (tumor) specifické transportery DNA(tumor) specifické transportery DNA
nové přístupy: zacílení na specifické buňky, do struktury liposomů se zabudují protilátky specifické na dané buňky
15/03/2010
4
mmiikroinjekcekroinjekce
mmiikroinjekcekroinjekce•• transgen je vložen do vhodného vektorutransgen je vložen do vhodného vektoru
a) rekombinační vektor (virový vektor)a) rekombinační vektor (virový vektor)
b) transgen je vyštěpenb) transgen je vyštěpen) g j y p) g j y p
•• oplozené vajíčko před splynutím pronukleů je vybráno ze oplozené vajíčko před splynutím pronukleů je vybráno ze samice a centrifugováno (cytoplasma se nahromadí v jedné části a samice a centrifugováno (cytoplasma se nahromadí v jedné části a samičí pronucleus je lépe viditelný)samičí pronucleus je lépe viditelný)..
•• mikroinjekce DNA kapilárou do pronucleu jednoho vajíčka pod mikroinjekce DNA kapilárou do pronucleu jednoho vajíčka pod mikroskopemmikroskopem
•• implantace vajíčka do náhradní matkyimplantace vajíčka do náhradní matky. .
•• embryo se dále vyvíjí normálně a proběhne řádný porodembryo se dále vyvíjí normálně a proběhne řádný porod. .
•• detekce potomka vykazující fenotyp transgenudetekce potomka vykazující fenotyp transgenu
•• stále nejpoužívanější metoda, stále nejpoužívanější metoda, účinnost 1účinnost 1--5% 5%
elektroporace elektroporace –– vajíčko ve stavu pronukleů se v roztoku s DNA vajíčko ve stavu pronukleů se v roztoku s DNA elektroporuje, jediná metoda fungující u spermatozoidůelektroporuje, jediná metoda fungující u spermatozoidů
15/03/2010
5
mmiikroinjekcekroinjekce
aaa aaa
modelový organismus modelový organismus ––Xenopus laevisXenopus laevis (drápatka vodní)(drápatka vodní)
• obrovská vajíčka umožňují velice snadnou mikroinjekci
• zárodky (pulci) se vyvíjejí mimo tělo matky – velice snadné i lpozorování a manipulace
• studium vývoje zárodku a zakládání orgánů (embryogeneze)
• nevýhody: pomalý životní cyklus, tetraploidní genom
druh X. laevis X. tropicalis
ploidie allotetraploidní diploidní
N 18 chromozomů 10 chromozomů
velikost genomu 3.1 x 10 9 bp 1.7 x 10 9 bp
teplotní optimum 16-22o C 25-30o C
velikost dospělce 10 cm 4-5 cm
velikost vajíčka 1-1.3 mm 0.7-0.8 mm
počet vajíček 300-1000 1000-3000
životní cyklus 1-2 roky 4 měsíce
PG5
15/03/2010
6
příkladpříklad
mmiikroinjekcekroinjekce
metallothionein promoter regulovaný těžkými kovy
• krysí gen pro růstový hormon bylmikroinjekcí vpraven do myši
• pod myším promotorem prometallothionein, který jeaktivován těžkými kovy
• homozygotní linie bylavyselektována na potravě bohaténa těžké kovy
• 10 týdnů staří sourozencilaboratorní myši (49 versus 29gramů živé váhy)
PG6
příkladpříklad
mmiikroinjekcekroinjekcetransgenní losostransgenní losos
• gen pro růstový hormon z většího lososa mořského byl pod specifickýmantifreeze promotorem vložen do menšího říčního lososa
• fenotyp – ryba roste daleko rychleji a dosahuje dospělosti za polovinu dobynež wild-typová ryba.
• nebezpečí: transgenní ryba unikne ze sádek do volné přírody?
pstruh
• transgenní ryby mají výhodu při páření ale jsou méně zdatnější – evolučně velice nebezpečné – může zdecimovat veškerou populaci
• řešení: sterilní ryby, nebo pěstování ve vnitrozemských sádkách
PG1 PG7
Snímek 11
PG6 metalothionein - protein podilejici se na transportu zinku, jeho druhou funkci je detoxifikace jedovatých těžkých kovů Cd, Hg.., ktere pak uklada ve formě inkluzi např v kostech. Je to maly protein majici až 30% cysteinu.galuszka; 10/04/2007
Snímek 12
PG1 V celosvětovém měřítku se vyvíjí nejméně 35 druhů transgenních ryb. Kvalitním biotechnologickým výzkumem se kupodivu může chlubit Kuba. Zelenou tu dostala konzumace geneticky upravených tilapií nilských. Tato sladkovodní ryba z čeledi cichlid měla tu čest být prvním modifikovaným živočichem na světě, o němž úřady prohlásily: můžete jej chovat a jíst. Útěky obyčejných, nemodifikovaných tilapií z uzavřených chovných prostor přitom způsobily v Latinské Americe nejednukatastrofu. Tato mimořádně přizpůsobivá ryba snadno vytlačí původní druhy. V Číně zase údajně plujízatopenými rýžovými poli transgenní kapři. Úřady prý zastávají pragmatické stanovisko: zakazujte si na Západě genetické modifikace, jak chcete, my musíme nakrmit více než miliardu lidí. Nemáme čas na rozmýšlení. Mohou tedy modifikované ryby ohrozit přírodu? ˝Riziko tu určitě je,˝ říká ing. JaroslavPetr z Výzkumného ústavu živočišné výroby. Mnohem horší jsou ale podle něj zločiny, které s genetikou vůbec nesouvisejí: například znečištěné řeky v Kanadě, v nichž lososi samovolně mění pohlaví, či vypouštění nepůvodních druhů do moří, jezer a vodních toků.galuszka; 10/04/2007
PG7 u dobytka tento přístup selhávágaluszka; 08/04/2008
15/03/2010
7
injekce kmenových buněkinjekce kmenových buněk
kmenové buňkykmenové buňky
– nediferenciované buňky, které se mohou diferenciovat v jakoukoliv jinou buňku (totipotentnítotipotentní)
h k l i i i dif i- mohou se kultivovat in vitro v nediferenciovaném stavu a snadno geneticky manipulovat, jsou nesmrtelné
EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYodvozeny z vnitřních buněk embrya ve stavu blastocysty - jsou pluripotentnípluripotentní
multipotentnímultipotentní
injekce kmenových buněkinjekce kmenových buněk
velice citlivé na vnější podměty, při sebemenší změně se začínají diferenciovatvelice citlivé na vnější podměty, při sebemenší změně se začínají diferenciovat
in vitro již byly připravena většina ze zhruba 250 typů savčích buněk (neurony,ganglia etc )
1998 – zjištěno, jak se dají nekonečně dlouho množit in vitroa získat z abortovaných lidských embryí při umělém oplodnění (aktivní telomerasy)
ganglia etc.)
propro speciálníspeciální účelyúčely mohoumohou býtbýt kmenovékmenové buňkybuňkyodvozenyodvozeny ii zz dospěléhodospělého jedincejedince
napřnapř.. kmenovékmenové buňkybuňky zz lidskélidské kostníkostní dřenědřeně lzelzediferenciovatdiferenciovat inin vitrovitro nana prekurzorovéprekurzorové buňkybuňkymozkové,mozkové, jaterníjaterní čiči svalové),svalové), lzelze jeje všakvšak velmivelmi těžcetěžcevyselektovatvyselektovat (u(u 4040--letéholetého jedincejedince jeje toto jednajedna buňkabuňka zz1010 miliard)miliard)
20022002 –– kmenovékmenové buňkybuňky bylybyly získányzískány zz odsátéhoodsátého tukutukupopo liposukci,liposukci, zaza 15001500 dolarůdolarů navíc,navíc, jeje lzelze najítnajít aauchovatuchovat dodo budoucnabudoucna..
20042004 –– bylybyly připravenypřipraveny pluripotentnípluripotentní buňkybuňky zeze zubnízubnídřenědřeně mléčnýchmléčných zubůzubů
20052005 –– inin vitrovitro množenémnožené buňkybuňky obsahujíobsahují množstvímnožstvíletálníchletálních mutacímutací
signál
PG2
Snímek 14
PG2 2005 - při množení kmenových buňěk vzniká velké množství mutací
SELEKCE KMENOVÝCH BUNěK SE PROVÁDÍ POMOCÍ MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK
ekb mají aktivní enzym telomerasu, která prodlužuje telomery při dělenígaluszka; 02/04/2006
15/03/2010
8
za prsní implantáty a Viagru se utrácí podstatně více peněz, než za výzkum Alzheimera. To znamená, že kolem roku 2030 zde bude široká
důchodcovská populace s krásnými ňadry a obrovskými erekcemi, která si ale ani za boha nevzpomene, co s tím má dělat…
transformacetransformace
selekceselekce
injekce injekce kmenových kmenových ýý
buněkbuněk
--vznik chimerické myšivznik chimerické myši
15/03/2010
9
injekce kmenových buněkinjekce kmenových buněk--vznik chimerické myšivznik chimerické myši
normální blastocystanormální blastocysta
ICMICM (inner cell mass)(inner cell mass)
injekce
embryonální kmenové buňkyembryonální kmenové buňky
vzniká chimerická myš tzn. že má vzniká chimerická myš tzn. že má část těla z buněk svých a část těla z část těla z buněk svých a část těla z
buněk kmenovýchbuněk kmenových
mikrochimerismus u člověkamikrochimerismus u člověka
PG3
Snímek 18
PG3 Byla jednou jedna maminka a ta otěhotněla. Malá náhodička způsobila, že čekala dvojvaječná dvojčátka, chlapečka a holčičku. Jenže plod, ze kterého mohl být chlapeček z nějakého důvodu odumřel, nebyl schopný života. A organismus vedle něho - jeho vlastní sesterský plod - ho časem pohltil. Ale plod, ze kterého by byl chlapeček nezmizel úplně beze stopy. Jeho sestra po něm "podědila" krevní oběh. No a když se narodila, vyrostla, otěhotněla a rozváděla se...přišla na to, že její krev není její. A že mohla mít dvojče :-(Petr Galuszka; 08/04/2009
15/03/2010
10
transformace kmenových buněktransformace kmenových buněk
inserční vektor substituční vektor
pozitivní selekce na neomycin (gen M)
Křížení Křížení –– selekce transgenní myšiselekce transgenní myši
X
chimerický myšák normální myška
ES blast
tm = mutace (nebo nový gen)
A – dominantní pro agouti srst
barva srsti:
genotyp:
gamety:
blast
agouti black black
AABB aaBB aaBB
tm/+ES +B6 /+B6 +B6 /+B6
tm a +ES +B6 +B6
AB aB aB
potomstvo F1:
tm/+B6+ES/+B6 +B6/+B6
agoutiagouti black
AaBBAaBB aaBB
pokud je recesivní –bez projevupokud je dominantní –část potomstva s projevem
15/03/2010
11
Křížení Křížení –– selekce transgenní myšiselekce transgenní myši
tm = mutace (nebo nový gen)
potomstvo F2:
tm/+B6 tm/+B6
X
t /t t /+B6 +B6/+B6
p
tm/tm tm/+B6 +B6/+B6
25% 50% 25%
transgenní homozygottransgenní homozygot
knockoutovaná myšknockoutovaná myš• gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru
• gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu) do jeho ORF
• transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu
• vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky
• selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu)
inzerční vektor
gen v genomu EKB
homologní rekombinace a přerušení genu
15/03/2010
12
knockoutovaná myšknockoutovaná myš• PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NESPECIFICKÉ REKOMBINACE
(antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen)
• možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci
• do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa) mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné rekombinaci, přenese se do genomu EKB kéEKB také tento gen
• selekce GANGCYKLOVIREM prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk
• náhodně rekombinované buňky po přídavku gangcykloviru umírají
N R HSVtk
linearizovaný substituční vektorhomologní rekombinace náhodná integrace
NeoR HSVtk
NeoR
NeoR+/ HSVtk- NeoR+/ HSVtk+
knockoutovaná myšknockoutovaná myš-důležitý model pro testování ůležitý model pro testování funkce jednotlivých genů u funkce jednotlivých genů u
obratlovcůobratlovcůPROBLÉMY:
1) knockout zabíjí časné fáze embrya i když by neměl letální vliv na dospělého jedince.
2) nedostatečnost transgenní placenty – přenesení embrya do netransformované matky (část placenty vzniká z embrya)y ( p y y )
ŘEŠENÍ: PODMÍNĚNÝ KNOCKOUTPODMÍNĚNÝ KNOCKOUT
Nobelova cena za medicínu 2007
15/03/2010
13
podmíněný knockout• využívá rekombinasový systém P1 fága Cre –lox,
• Cre-rekombinasa je specificky fungující enzym pro lox sekvence (34bp, sekvence mezi je tzv. floxovaná)
• standardně jsou připraveny dvě linie transgenní myši pomocí kmenových buněk
• první) je připravená homologní rekombinaci tak že má do sebe vložený ž d ý (j ál f kč í) fl ý l í l k ipožadovaný transgen (je stále funkční) floxovaný lox místy a geny pro selekci
• druhá) je připravená náhodnou rekombinací a je do ní vložen gen pro Cre rekombinasu pod specifickým promotorem
a) tkáňově specifický
b) indukovatelný tetracyklinem
• z obou linií se vyselektují homozygoti
• ti se zkříží• gen je knockoutován pouze
ve specifické tkáni(místně)
• nebo časověpo indukci tetracyklinem
problémy práce s embryonálními problémy práce s embryonálními kmenovými buňkamikmenovými buňkami
•• etickéetické – v některých zemích je zákaz odvozovat a pracovat s EKB
úplný zákaz: Německo, Rakousko, Francie, Švýcarsko, Norsko, Irsko, Polsko, Brazílie
částečný: USA pouze linie odvozené do roku 2001, nesmí se derivovat nové
volná manipulace: Japonsko, Kanada, Španělsko, Itálie, Finsko, Švédsko, Izrael, Singapur, Austrálie, ČR
•• imunologická inkompaktibilita imunologická inkompaktibilita vytvořené linie nejsou imunologicky kompatibilní s většinou pacientů kteří potřebují transplantaci
•• teratomy teratomy nediferenciované EKB tvoří často po implantaci do těla pacienta teratomy, pokusy s diferenciaci in vitro a až poté implantace
•• kmenové buňky dospělé kmenové buňky dospělé špatná diferenciace, ale 100% imunologická kompaktibilita pokud jsou ze stejného jedince
15/03/2010
14
řešení řešení ––vlastní embryonální buňkyvlastní embryonální buňky
terapeutické klonování aneb přenos jader i ký h b ěksomatických buněk
květen 2005 SCIENCE
první úspěšné terapeutické klonování člověka ??
Woo-suk HWANG
leden 2006 - skandál
využití kmenových buňekvyužití kmenových buňek
kmenové buňky odvozené z kostní dřeně pacienta implantovány do postižené kmenové buňky odvozené z kostní dřeně pacienta implantovány do postižené tkáně (např. infarkt myokardu)tkáně (např. infarkt myokardu)
• pokusy na myši u které byl uměle vyvolán infarkt prokazovaly, že kmenové b ňk j h dif i t i l t i d č í b ňkbuňky nejsou schopny diferenciovat po implantaci v srdeční buňky.
• u některých myši se však funkce srdce zlepšila
• kmenové buňky byly označeny GFP a sledovány po implantaci do myšího srdce, bylo zjištěno, že u některých myší se transformují v nové cévy a zlepšují tak prokrvení nemocného srdce.
2003 v Praze první pacient, kterému byly po těžkém 2003 v Praze první pacient, kterému byly po těžkém infarktu myokardu implantovány vlastní kmenové buňky z infarktu myokardu implantovány vlastní kmenové buňky z
k t í dř ěk t í dř ěkostní dřeněkostní dřeněpo zlepšení následovali další pacienti, u člověka se po zlepšení následovali další pacienti, u člověka se zlepšení projevovalo daleko výrazněji než u myší.zlepšení projevovalo daleko výrazněji než u myší.
zatím však lidské kmenové buňky nemohou být nijak zatím však lidské kmenové buňky nemohou být nijak upravovány či značeny a tak se neví zda regenerace upravovány či značeny a tak se neví zda regenerace
srdečního svalu pomocí kmenových buněk u lidí funguje srdečního svalu pomocí kmenových buněk u lidí funguje jinak než u myšíjinak než u myší
podobné pokusy probíhají v Německu a Holandskupodobné pokusy probíhají v Německu a Holandsku
PG3
Snímek 28
PG3 klasický přístup pro léčbu leukemie
testování např. léčba sklerózy, poranění míchy, slepota atd.galuszka; 02/04/2006
15/03/2010
15
využití transgenních zvířatvyužití transgenních zvířat
jakojako bioreaktorybioreaktory::domácí zvířata produkující mléko, do kterého je vylučován produkt
transgenu.
• gen je včleněn do genomu zvířete pod specifickým promotorem β-ge je vč e ě do ge o u v ete pod spec c ý p o oto e βlaktoglobulínu exprimujícím se v prsních žlázách
• produkt transgenu neovlivňuje život transgenního zvířete
• produkce lidských proteinu: inzulín, erytropoetin atd.
• pavoučí mléko: fa NEXIA začala produkovat transgenní kozy exprimujícígeny pro produkci pavoučího proteinu, ze kterého pavouk vyrábí sítě domléka
• pavoučí vlákno je odolnější než ocel a používá se napavoučí vlákno je odolnější než ocel a používá se na výrobu neprůstřelných vest
SPIDER WEB SILK IN THE GOAT MILKSPIDER WEB SILK IN THE GOAT MILK
využití transgenních zvířatvyužití transgenních zvířatxenotransplantacexenotransplantace::• prasata jsou nejvhodnější dárce, podobná velikost, podobný imunitní
systém
• v současné době se vyvíjejí prasata, která mají pozměněný imunitnív současné době se vyvíjejí prasata, která mají pozměněný imunitnísystém, nebo modifikované povrchové proteiny buňky, tak aby jeneodmítal lidský imunitní systém
• např. inaktivace 1,3-galaktosyl transferasy, která přenáší galaktosu napovrch prasečích buněk a kterou rozpoznává lidský imunitní systém jakoantigen
• odstranění receptorů, které jsou důležité pro imunitní odpověď z prasečíchbuněk
• 2003 - první nezdařené pokusy s transplantací srdce a ledvin pocházející• 2003 první nezdařené pokusy s transplantací srdce a ledvin pocházejícíz prasete
• první úspěšný pokus: transplantace prasečích ostrůvkovitých buněkslinivky břišní, produkující lidský inzulín diabetikovi
PROBLÉMY: etické, přenospřenos prasečíchprasečích virovýchvirových onemocněníonemocnění nana lidilidi(endogenní retroviry), spousta „odpadních“ selat při selekci vhodnéhodárce
15/03/2010
16
využití transgenních zvířatvyužití transgenních zvířatprodukceprodukce „zdravých“„zdravých“ zvířatzvířat::• produkce drůbeže z masem, které má nižší obsah tuku
• produkce vajec se sníženým obsahem cholesterolu atd.
zvyšovánízvyšování odolnostiodolnosti hospodářskýchhospodářských zvířatzvířat protiproti nemocemnemocem
buněčné klonováníbuněčné klonovánízaškrcení embryazaškrcení embrya
partenogenezepartenogeneze• zárodek se vyvíjí z neoplodněného vajíčka vzniká pouze samičí
potomstvo (haploidní jedinec)
• nejstarší metoda klonování• i přirozeně (jednovaječná dvojčata, normální způsob u
pásovců, vždy vznikají 4 stejné klony)• u člověka docházelo k deformaci jednoho embrya
polyembryonie
transplantace jádratransplantace jádra• hlavní technika v současnosti
používaná
potomstvo (haploidní jedinec)• zdařilé pokusy (i přirozeně u nižších živočichů, typické pro mravence) u
savců se zatím nezdařila bez deformací embrya
15/03/2010
17
transplantace jádratransplantace jádra
1. denukleace hostitelské buňky
jádro z jedince který je klonován do bezjaderného vajíčka
chromozomy jsou jemně nasáty ostrou mikropipetou ze zralého neoplodněného vajíčka v metafázi II
2 ř jád
oocyt cytoplast
denukleace
2. přenos jádra
A. elektrofokusace – celá donorová (somatická) buňka dárce je elektroporována za zónu peliculu (vnější membrána oocytu) a fúzována s cytoplasmou hostitelského denukleovaného oocytu
B. jaderná injekce – jádro somatické donorové buňky je mikroinjektováno do cytoplastu (honolulská metoda)
transplantace jádratransplantace jádraelekroporaceelekroporace
somatická buňka(kmenová buňka, tuková buňka, buňky pohlavních žláz, fibroblast, neuron)
t l tcytoplast
15/03/2010
18
transplantace jádratransplantace jádrajaderná injekcejaderná injekcetuková buňka z vaječníku cytoplast
a) disperzované tukové buňky) p yb) jádra (šipky) nasáté do mikropipetyc) propíchnutí zóny pelikulyd) zasunutí mikropipety až k ooleměe) aplikace piezo impulsu, který prolomí
oolemuf) injekce jádra tukové buňky do
ooplastu
transplantace jádratransplantace jádragenetické přeprogramovánígenetické přeprogramování
je nutné pokud je jádro klonu vzato ze somatické buňky dospělého jedince
“přeprogramování” – aktivace genomu dárcovské buňky k obnovení jeho totipotence tak, aby mohla nově vzniklá buňka se dělit a diferenciovat ve všechny další typy buněk celého organismu
nejlépe k němu dochází právě v cytoplasmě denukleovaného oocytuoocytu
přeprogramovánípřeprogramování
15/03/2010
19
transplantace jádratransplantace jádra
vývoj embrya z buňky obsahující cizí jádrovývoj embrya z buňky obsahující cizí jádro
buňky po transformaci jsou pěstovány v médiuindukce embryogeneze chemicky: chlorid strontnatý
implantace embryaimplantace embrya
embryo je ze živného roztoku chirurgicky přeneseno do dělohyembryo je ze živného roztoku chirurgicky přeneseno do dělohy vhodné náhradní matky
vždy je vloženo několik embryí současně (malá pravděpodobnost uchycení)
buněčné klonováníbuněčné klonování19581958 – první pokusy o klonování, vědci dokázali poprvé totipotenci buňěk
15/03/2010
20
buněčné klonováníbuněčné klonování19861986 první klonovaný savecprvní klonovaný saveckráva byla naklonována z buněk časného stádia embryogeneze (nemá svůj jinak starý klon!)jinak starý klon!)
19931993 – telata byla získána jaderným přenosem z embryonálních kmenových buněk pěstovaných in vitro
19951995 – dvě ovce Megan & Morag byly naklonovány z embryonálních buněk
příběh ovečky Dollypříběh ovečky Dolly19961996 - první savec naklonovaný ze somatické buňky.
• byly odebrány somatické buňky z prsní žlázy (vemeno) 6-leté ovce (genetická matka Dolly plemeno Finn Dorset)(genetická matka Dolly, plemeno Finn Dorset)
• buňky byly přeneseny na vhodné médium in vitro a pěstovány
• buňky pak byly na 5 dní přeneseny na médium bez živin aby přestaly růst (dostaly se do G0 fáze a zbavily se naprogramování na prsní žlázu)
• každá z buněk pak byla elektroporačně zfúzována s denukleovaným ovčím oocytem ve stádiu metafáze II
• zfúzovaná buňka byla přenesená zpět do živného média a chemicky bylo indukováno dělení a embryogeneze (SrCl2)
• v 16-buněčném stádiu bylo embryo chirurgicky přeneseno do dělohy náhradní matky (plemeno Scotish blackface, skotská černohubka).
• Dolly se narodila 5.6.1996 v Roslinově institutu ve Skotsku
• Dolly má v podstatě tři matky – genetickou, tu co poskytla denukleované vajíčko a tu co ji donosila.
15/03/2010
21
rodokmen Dollyiny rodinyrodokmen Dollyiny rodiny
z Dollyina fotoalbaz Dollyina fotoalbaDolly a její „otec“ Ian Wilmut
Dolly a její náhradní matka
manžel Dolly beran David plemeno velšské horské
Dolly s prvorozeným jehnětem Bonnie (13.4.1998)
Dolly s třemi dalšími jehňaty (2xM a 1xŽ) 24.3.1999)
15/03/2010
22
úspěšnost klonování:úspěšnost klonování:
• na přípravu Dolly bylo zfúzováno 277 denukleovaných jader s 277 somatickými buňkami
• 29 embryií přežilo
• 13 se úspěšně usadilo v dělohách náhradních matek
příběh ovečky Dollypříběh ovečky Dolly
• pouze jedna donosila živé jehně
Dolly zemřela 13.února 2003 na progresivní plicní rozedmu ve věku 6 letDolly zemřela 13.února 2003 na progresivní plicní rozedmu ve věku 6 let (průměrný věk ovce je 12)
problémproblém: ZKRÁCENÉ TELOMERYZKRÁCENÉ TELOMERY
- bylo statisticky potvrzeno u Dolly
vědci se přou o to zda Dolly vznikla opravdu ze somatické buňky nebo pouze z kmenové buňky přítomné ve vemeni
bylo statisticky potvrzeno u Dolly
mitochondriální DNA:mitochondriální DNA: obsahuje 37 genů většinouodpovědných za regulaci energetického metabolismu (dědí se v mateřské linii).Dolly mtDNA zdědila od druhé matky, která darovala vajíčkopři přenosu somatické buňky dochází i k přenosu mtDNA první matky, ta je však ve vajíčku zničena, stejně jako mtDNA spermiíu člověka je dědičně vrozená hluchota spojená s mutacemi na mtDNA
1997 první klonovaná ovce nesoucí lidský gen1997 první klonovaná ovce nesoucí lidský gen
-- narodila se také v Roslinově institutu ve Skotsku
příběh ovečky Pollypříběh ovečky Polly
- byla naklonována z fibroblastu ovčího plodu, který byl in vitro geneticky modifikován
- byl do něj vložen lidský gen pro alpha-1-antitrypsin pod promotorem s expresí do mléka
- je to protein používaný pro terapii cystické fibrózy
- ovce produkující další terapeuticky významné proteiny jsou na světě
- jejích produktů se zatím nevyužívá protože je obava, že mohou mít chorobu svědivku, která může mít podobný základ jako BSE a u lidí vyvolávat Jacobs-Creutzveldovu chorobu
15/03/2010
23
myš Cumulina a její sestrymyš Cumulina a její sestry
1999 první klonovaná myš z dospělé buňky na Honolulské Univerzitě na Hawaii
z několika náhradních matek vzniklo 22 samičích klonů první generace, první myš byla pojmenována Cumulinagenerace, první myš byla pojmenována Cumulina
z myší první generace byly odebrány somatické buňky a bylo vytvořeno 28 klonů druhé generace
myši byly klonovány z tukové buňky vaječníku
buňky nebyly fúzovány elektroporačně
ale tzv. honolulskou technikou pomocí
speciální mikropipety
úspěšnost 2-4%
tým se také pokoušel o naklonování
myši z neuronu
a poprvé se také pokusily vytvořit
mužské klony ze Sertoliho buněk
varlat
- neúspěšně
XENA XENA –– první klonované seleprvní klonované sele
2000 v Roslinově ústavu se narodilo černé sele Xena bílé prasnici
metoda použitá při klonování Dolly selhala a sele bylo získáno honolulskou technikou z sele bylo získáno honolulskou technikou zbuňky odebrané z měsíčního plodu
úspěšnost: Xena vzešla ze 110 klonovaných vajíček, které byly implantovány do 4 náhradních matek
Embryos clonally derived by microinjecting thenuclei of Meishan x Meishan breed (black coat)fetal fibroblasts into Landrace breed (white coat)enucleated oocytes. These embryos are at the
four-cell stage after 40 hours of culture in vitro.
15/03/2010
24
první klonované prase s lidskou první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitouimunokompaktibilitou
2002 opět v Roslinově ústavu ve spolupráci s japonskou firmou PPLTherapeutics se narodilo prvních pět selat s knock-outovaným genem proalfa 1 3 galaktosyltransferasu (nejsou to klony)alfa- 1,3- galaktosyltransferasu (nejsou to klony)
1,3- galaktosa na povrchu prasečích buněk způsobuje „hyperacuterejection“ –HAR při xenotransplantacích, což je rychlá humorálně imunitníodpověď lidského těla na prasečí buňky
2003 byly připraveny prasata s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3-galaktosyltransferasu a vloženým lidským genem pro alfa- 1,2-fukosyltransferasu, která se podílí na tvorbě univerzálně akceptovanéhoantigenu HT na povrchu buněk
2005 plánovány první transplantace prasečích srdcí, ledvin,
slinivek, jater, kůží a krevních buněk z 1,3-GT knock-out
HT transgeních prasat do lidí.
PG4
první klonované prase s lidskou první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitouimunokompaktibilitou
standardně byly připraveny selata overexprimující lidský gen pro alfa- 1,2-fukosylosyltransferasu a pomocí PCR byly vyselektováni z vrhu dvaheterozygoti (samec a samice) a ti spáření dohromady
samice byla ve 30 dnů těhotenství zabita a z jejího těla bylo odebráno 12plodů, ze všech byla odstraněna hlava, končetiny a vnitřnosti a zbylá tkáň bylarozsekaná a kultivována na jednotlivé buňky
buňky byly elektroporovány s linearizovaným vektorem nesoucí knock-outovaný gen pro 1,3 galaktosyl transferasu a dvojitě transgenní linievyselektovány na neomycinu
tyto buňky pak byly použity na přenos do denukleovaných oocytů honolulskoumetodoumetodou
HT+HT-
Snímek 47
PG4 fukosyl transferasa enzym přenášející GDP fukosu na receptory na povrchu buněk sliznic člověkagaluszka; 02/04/2006
15/03/2010
25
první klonované kotě CCprvní klonované kotě CC
se narodilo 22 prosince 2001 v texaské firmě A&M
na získání CC bylo použito 188 embryí
CC není stejná jako Rainbow, barva srstí a její textura je částečně ovlivněnatř dí děl h (f é i kti X h )prostředím dělohy (fenomén inaktivace X-chromozomu)
první pokus: byly použitý kožní buňky, jediná těhotná kočka nesoucí klonpotratila ve 44 dnu
CC byla připravena nakonec stejně jako Cumulina z tukové buňky vaječníku
Rainbowgenetická matka
náhradní matka
CopyCat
z katalogu firmy:z katalogu firmy:
genetický dárce klony
gizmo malý gizmo
tahini baba nanusch a tabouli
nicky malý nicky
používají novou metodu klonování:chromatinový transfer
cena za jeden klon:32 000 $
kl á í ů k lik ější:cena za uložení
buněk z mrtvého či živého zvířete do
banky :850 $
klonování psů komplikovanější:
- nepravidelná a velmi řídká ovulace (nutnost udržovatvelkou populaci náhradních matek)
- vajíčka nedozrávají ve vaječnících ale až vevejcovodech a proto je nelze jako u jiných savcůzískávat při sterilizaci zvířat (nutno operativně – drahé)
- psí vajíčka jsou zakalené spoustou tuku a lze je těžko
mikroskopicky denukleovat
15/03/2010
26
nedostatky klonování savcůnedostatky klonování savců
• velmi malá klonovací úspěšnost, většinou pod 1%
• vysoká úmrtnost čerstvě narozených klonů
• „oversize offspring syndrome“ – zatím nevysvětlen
• časté jsou také fyzické deformace narozených plodů – časté u metodyčasté jsou také fyzické deformace narozených plodů časté u metody zaškrcování embrya
• artritida, srdeční arytmie, respirační problémy či totální selhání imunity klonů
• problém se stářím klonů - telomery
druh počet použitých oocytů počet narozených klonů zemřeli po porodu
myš 2468 31 (1.3%) -
kráva 440 6 (1.4%) 2
ovce 417 14 (3.4%) 11 po 6 měsících
prase 977 5 (0.5%) -
koza 285 3 (1.1%) -
počítají se pouze klony vzniknuvší z dospělé somatické buňky, do konce roku 2002
PG1
třetí metoda klonování savcůtřetí metoda klonování savců
• nejlevnější a nejúčinnější
• upravené embryonální buňky do tetraploidních embryí
• u vyšších savců tetraploidie neslučitelná se životem
• tetraploidní buňky se podílí pouze na tvorbě plodových obalů a placenty
• v současnosti nejpoužívanější metoda klonování
• úspěšně funguje u myší
Snímek 51
PG1 oversize offspring syndrome - vznika pravdepodobne kultivaci casneho embrya v zivnem systemuPetr Galuszka; 14/04/2008
15/03/2010
27
první klonovaný primát první klonovaný primát –– opice Tetraopice Tetra2002 byla připravená metodou zaškrcování embrya,která do té doby u primátů, ani u člověkanefungovala
z jednoho přirozenou cestou získaného embrya (vet 8 b ěk) k k h b l ři istavu 8-buněk) makaka rhesus byly připraveny in
vitro 4 klony (dvoubuněčné embrya)
2 odumřely ještě ve zkumavce, třetí abortoval vděloze náhradní matky. Pouze Tetra se „dožila“porodu a těší se dobrému zdraví
Tetra v podstatě není klon,protože neexistuje jí totožnýjedinec
pokusy naklonovat makakametodou jaderného přenosuselhávají
všechna embrya získána z cizího jádra abortovala nejpozdějive stádiu blastuly
bylo zjištěno že při dělení buněk dochází k náhodnýmpřesunům chromozomů mezi buňkami
15/03/2010
28
klonování primátu jaderným přenosemklonování primátu jaderným přenosem2002 firma CLONAID řízená sektou Reliánů podává spekulativníinformace o klonováných lidských embryiích a dokonce i o narozeníprvních klonovaných dětí.
leden 2004 Dr. Zavos v Londýně oznámil, že implantoval 35-letéženě první naklonované lidské embryo z buńky jejího manžela. Uženy nedošlo k těhotenství Nepodal žádné bližšíženy nedošlo k těhotenství. Nepodal žádné bližšíinformace.
únor 2004 tým z národní jihokorejské univerzitypoprvé připravil naklonována lidská embrya(do stádia blastuly) jaderným přenosem z dospělé buňky. Pokus oimplantaci embrya do náhradní matky neproběhl.
prosinec 2004 tým z Pittsburgu ve spolupráci s jihokorejcipřipravil první nedegenerovaná embrya nukleárním přenosempřipravil první nedegenerovaná embrya nukleárním přenosemmakaka rhesuse. 188 těchto embryií bylo přeneseno do 25náhradních matek. Ani u jedné však nebylo zjištěno pokročilétěhotenství.
obě skupiny z embryí připravili stabilní linie kmenových buněk
úspěchu dosáhli až poté co zdokonalili metodu použitou u Dolly, kdy denukleaci oocytuprovedli pomocí pórů v buněčné stěně. neodstranili tak společně s jádrem esenciálníbílkoviny z cytoplasmy důležité pro dělení nového jádra.
PG8
klonování primátu jaderným přenosemklonování primátu jaderným přenosemVYUŽITÍ KLONOVANÝCH EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH
BUNĚK
TERAPEUTICKÉ KLONOVÁNÍ přenos jader somatických buněk
• nejsou velké etické zábrany veřejnosti pro výzkum v této oblasti.
• embryonální kmenové buňky jsou nejvíce prozkoumány a zdají se být na rozdíl odostatních kmenových buněk nejvhodnější pro terapii.
• odpadá imunologická inkompatibilita
• stejné genetické stáři buňky jako buněk jejích příjemce
• začíná se s prvními výzkumy v oblasti léčby nemocí, kde je specifická tkáňdegenerována a může být nahrazena těmito buňkami: diabetes, osteoartritida,Parkinsonova a Altzheimerova choroba.
VYUŽITÍ OPIČÍCH KLONů PRO TESTOVÁNÍ NOVÝCH LÉČIV
15/03/2010
29
klonování primátu jaderným přenosemklonování primátu jaderným přenosem
ETIKAETIKA
celosvětový zákaz reproduktivního klonování byl schválen a vydán OSN v roce 2005
• většina vyspělých zemí má reproduktivní klonování zakázáno vlastní legislativou
• USA povolená manipulace s klonovanými lidskými embryi do stáři dvou týdnů
• EVROPA – povolená manipulace s embryonálními kmenovými buňkami – Holandsko, Švedsko, Řecko a Finsko, pouze s těmi vznikající jako odpad při umělých oplodněních
• VÉLKÁ BRITÁNIE jediná země, kde je povoleno záměrně vytvářet lidská embryapro zisk kmenových buněk
KONZERVAČNÍ BIOLOGIEKONZERVAČNÍ BIOLOGIE• se zabývá zachováním ohrožených druhů živočichů na Zemi
• The Center for Reproduction of Endangered Wilidlife (CREW) v CincinnatiZOO se začal zabývat klonováním ohrožených druhů
• prvním klonovaným živočichem byl sameček divokého malajského gaura,kteří žijí již pouze v zajetí v ZOO. Tito živočichové pěstovaní v zajetí sevšak často odmítají vzájemně pářit.
• jejich klonování je důležité proto,aby byla zachována genetickádiverzita v málo početné populaci.
• sameček Noah byl také prvnímvytvořeným samčím savčím klonem,který se dožil porodukterý se dožil porodu
• jeho chromatin byl vložen dodenukleovaného oocytu krávyplemena Holstein, která ho taképorodila
• Noah bohužel zemřel dva dny poporodu na infekci
15/03/2010
30
KONZERVAČNÍ BIOLOGIEKONZERVAČNÍ BIOLOGIE• dalším ohroženým druhem „úspěšně“ naklonovaným byla antilopa bongo
• zvažuje se klonování velkých červených pand. Neexistuje však vhodnánáhradní matka. Vědci nechtějí použít vlastní samice pand, protože již takmálo jedinců by bylo vystaveno velkému nebezpečí. Nejbližším vhodnýmříb ý j ý lpříbuzným je mýval.
• v Austrálii chtějí klonovat Tasmánskéhotygra, který byl vyhuben v roce 1930.(jediný exemplář je mládě ve zkumavce,jeho DNA už však začíná být částečněfragmentovaná)
• 1999 příběh španělské kozy Celie(bucardo) jak se bude klon rozmnožovat?
• má smysl tyto živočichy oživovat, kdyžstejně nebudeme schopni jim zaručitgenetickou diverzitu v rámci druhu?
• mamut – zatím nebyl nalezen vhodnývzorek DNA (daleká budoucnost)
• dinosauři - utopie maximální životnostDNA je 10.000 let