1 Universitas Indonesia
UJI PENGHAMBATAN AKTIVITAS -GLUKOSIDASE EKSTRAK
DAN FRAKSI DAUN Antidesma neurocarpum Miq. SERTA
IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI
TERAKTIF
Rieka Widihasputri, Berna Elya dan Azizahwati
Fakultas Farmasi Universitas Indonesia
Program Sarjana Farmasi
ABSTRAK
Diabetes melitus adalah penyakit berupa gangguan metabolisme yang ditandai
dengan hiperglikemia dan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein.
Diabetes melitus dapat diobati dengan inhibitor -glukosidase. Penelitian terdahulu
dilaporkan bahwa ekstrak metanol daun Antidesma neurocarpum Miq. memiliki memiliki
aktivitas penghambatan yang kuat terhadap -glukosidase (IC50=2,18 µg/mL). Uji
penghambatan aktivitas -glukosidase dilakukan untuk mengetahui ekstrak dan fraksi teraktif
serta mengetahui golongan senyawa kimia dari ekstrak dan fraksi teraktif tersebut. Ekstraksi
dilakukan dengan maserasi bertingkat (n-heksan, etil asetat dan metanol). Uji penghambatan
aktivitas -glukosidase dilakukan dengan microplate reader (=405 nm). Sebagai standar,
digunakan akarbosa (IC50=38,37 μg/mL). Ekstrak metanol memiliki aktivitas penghambatan
-glukosidase paling kuat dengan persen inhibisi paling tinggi (89,53%). Ekstrak metanol
tersebut diidentifikasi golongan senyawa kimianya dan difraksinasi dengan kromatografi
kolom dipercepat. Fraksinasi menghasilkan 15 fraksi gabungan. Fraksi gabungan yang lebih
dari 200 mg diuji aktivitas penghambatannya terhadap -glukosidase. Fraksi gabungan ke-8
adalah fraksi gabungan teraktif (IC50=40,77 µg/mL) dengan mekanisme penghambatan
secara kompetitif terhadap -glukosidase. Golongan senyawa kimia yang terdapat pada
ekstrak metanol dan fraksi gabungan daun Antidesma neurocarpum Miq. adalah flavonoid,
tanin, glikosida, fenol dan alkaloid.
Kata Kunci : -glukosidase; akarbosa; Antidesma neurocarpum Miq.; diabetes melitus.
ABSTRACT
Diabetes mellitus is a disease that symphyton of metabolism disfunction showed by
hyperglikemia and abnormallity of carbohydrates, fats, and proteins metabolism. It’s known
can be cured with -glycosidase inhibitor. Previous experiment reported that methanol
extract from leaves of Antidesma neurocarpum Miq. has a strong inhibitory activity of -
glukosidase (IC50=2,18 µg/mL). This experiment is done to know about the most active
extract and fraction of inhibitory activity of -glycosidase and also the chemical compounds
from those most active extract and fraction. Extraction is done by using multilevel maceration
(n-hexane, ethyl acetate and methanol). Inhibitory activity of -glycosidase tested with
microplate reader (=405 nm). As standard, used akarbosa (IC50=38.37 μg/mL). Methanol
extract has the strongest inhibitory activity of -glycosidase with the highest inhibitor
percentage (89,53%). It’s identified the chemical compounds and fracinationed by flash
column chromatography. Fractination produced 15 combined fractions. Combined fractions
which more than 200 mg tested to know their inhibitory activity of -glukosidase. Result
showed that the most active fraction is the 8th
(IC50=40,77 µg/mL) with a competitive
inhibitor mechanism to -glycosidase. Chemical compounds that is found in the methanol
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
2 Universitas Indonesia
extract and 8th
fraction of Antidesma neurocarpum Miq. leaves are flavonoids, tannins,
glycosides, fenol and alkaloids.
Key Words : -glukosidase; akarbose; Antidesma neurocarpum Miq.; diabetes melitus.
PENDAHULUAN
Diabetes melitus (DM) adalah gangguan metabolisme yang ditandai dengan
hiperglikemia dan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein. Hal ini
disebabkan akibat berkurangnya sekresi insulin, menurunnya sensitivitas insulin, atau
keduanya (DiPiro, et al., 2005). Prevelensi penyakit diabetes ini diperkirakan akan
meningkat terus dari tahun 2000 yang hanya 2,8 menjadi 4,4 % di tahun 2030 mendatang
(Wild, et all., 2004). Besarnya insidensi, prevelensi dan komplikasi DM menggambarkan
betapa pentingnya pencegahan dan penatalaksanaan dini penyakit tersebut.
Inhibitor α-glukosidase diketahui merupakan salah satu agen terapi untuk pengobatan
gangguan metabolisme karbohidrat, khususnya diabetes (Gao, et al., 2010). Salah satu obat
yang termasuk golongan inhibitor α-glukosidase adalah akarbose yang telah disetujui
untuk penggunaan klinis dalam pengobatan diabetes tipe 2 (Dong dan Ni, 2008), namun
akarbose diketahui dapat menimbulkan efek samping seperti distensi perut, perut kembung,
dan diare. Berbagai penelitian dilakukan untuk mencari inhibitor α-glukosidase lain yang
lebih efektif dan aman. Penelitian-penelitian tersebut untuk mencari inhibitor α-glukosidase
yang berasal dari bahan alami (Dong dan Ni, 2008). Hal ini didasarkan atas pertimbangan
bahwa penggunaan obat tradisional memiliki efek samping lebih sedikit dari obat sintesis
(Sari, 2006) dan didorong dengan pengetahuan bahwa zat alami dalam beberapa tanaman
memiliki efek penghambatan α-glukosidase yang cukup baik. Selain itu, penggunaan bahan
alami sebagai pengobatan banyak diminati masyarakat.
Antidesma adalah salah satu bagian dari marga tumbuhan dalam suku Euphorbiaceae
yang banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional (Buske, et al, 2009). Salah satu tanaman
dari suku Euphorbiaceae ini adalah Antidesma neurocarpum Miq. yang diketahui
mengandung glikosida, tanin, antrakuinon dan flavanoid (Elya, et al., 2012). Data dari
penelitian sebelumnya yang menguji ekstrak metanol daun Antidesma neurocarpum Miq.,
didapatkan nilai IC50 2,18 µg/mL (Elya, et al.,2012), namun belum diketahui fraksi yang
memiliki aktivitas penghambatan terhadap α-glukosidase paling kuat.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekstrak dan fraksi yang memiliki aktivitas
penghambatan α-glukosidase tertinggi dari daun Antidesma neurocarpum Miq. dan
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
3 Universitas Indonesia
mengetahui golongan senyawa kimia dari fraksi teraktif tersebut yang selanjutnya dapat
dimanfaatkan untuk pengobatan penyakit diabetes melitus.
Penelitian ini bermanfaat untuk memberikan informasi ilmiah pada masyarakat.
Selain itu, dengan dilakukannya penelitian ini, dapat diketahui ekstrak dan fraksi teraktif dari
daun Antidesma neurocarpum Miq. dalam menghambat aktivitas α-glukosidase yang
nantinya diharapkan dapat dikembangkan sebagai obat antidiabetes baru.
TINJAUAN PUSTAKA
Enzim
Enzim merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis dalam
metabolisme tubuh. Katalis adalah substansi yang hanya mempercepat laju reaksi kimia
dalam tubuh, tetapi tidak ikut bereaksi atau mengalami perubahan selama reaksi tersebut
(McPherson & Pincus, 2011). Enzim mengkatalisis konversi satu atau lebih senyawa
(substrat) menjadi satu atau lebih senyawa lain (produk) dengan meningkatkan laju reaksinya
106 kali lebih cepat dibandingkan jika tanpa katalis (Murray,et al.,2009).
Molekul enzim memiliki kantung khusus yang disebut active site. Active site ini
mengandung rantai samping asam amino yang membentuk permukaan tiga dimensi. Active
site ini akan mengikat substrat kemudian membentuk kompleks enzim-substrat (ES). ES
diubah menjadi enzim-produk (EP) yang kemudian akan berdisosiasi menjadi enzim bebas
dan produk. (Harvey dan Ferrier, 2010)
Inhibitor enzim adalah suatu zat yang dapat menurunkan kecepatan reaksi katalisis
dari suatu enzim. Berdasarkan mekanisme inhibisi enzim, inhibitor enzim diklasifikasikan
menjadi dua, yaitu irreversible dan reversible. Inhibisi irreversible terjadi ketika
terbentuknya ikatan kovalen dengan gugus fungsi spesifik enzim sehingga menyebabkan
enzim menjadi inaktif. Inhibitor reversible dapat berikatan dengan inhibitor secara bolak-
balik. Ada dua tipe inhibitor reversible yaitu kompetitif dan nonkompetitif (Seager dan
Slabaugh, 2008).
Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidasea
α-Glukosidase adalah suatu enzim yang mengkatalisis pemecahan kompleks
karbohidrat menjadi gula sederhana di bagian tepi permukaan sel usus halus (Chisholm-
Burns, et al., 2008). α-Glukosidase dapat menghidrolisis ikatan glukopiranosida
membentuk α-D-glukosa sehingga kadar glukosa meningkat (Dewi, et al., 2007).
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
4 Universitas Indonesia
α-Glukosidase yang diisolasi dari Saccharomyces cerevisiae yang direaksikan dengan
substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (pNGP) akan menghasilkan p-nitofenol yang
berwarna kuning (Wilson dan Walker, 2010). Reaksi enzimatis α-glukosidase dan p-
nitrofenil-α-D-glukopiranosa dapat dilihat pada Gambar 2.6. Apabila ekstrak tanaman
memiliki kemampuan menghambat aktivitas α-glukosidase maka p-nitrofenol yang
dihasilkan akan berkurang (Dewi, et al., 2007).
[Sumber : Guo, et al., 2010]
Gambar 1. Reaksi enzimatis α-glukosidase dan p-nitrofenil-α-D-glukopiranosa
Antidesma neurocarpum Miq.
Antidesma neurocarpum Miq. berasal dari suku Euphorbiaceae. Tanaman ini
termasuk golongan dikotil. (Indonesian Institute of Sciences National Biological, 1985;
Jones, S.B dan Luchsinger, A.E, 1987).
.
Fraksinasi
Fraksinasi adalah proses penarikan atau pemisahan senyawa pada ekstrak dengan
menggunakan dua macam pelarut yang tidak bercampur. Proses pemisahan komponen yang
diinginkan dengan komponen lain ini didasarkan pada prinsip kepolaran senyawa dan pelarut.
Metode yang dapat digunakan untuk memisahkan komponen-komponen senyawa umumnya
berupa metode kromatografi, yakni kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis.
Kromatografi Lapis Tipis
KLT adalah metode pemisahan fisikokimia yang didasarkan atas penyerapan, partisi
atau gabungannya (Harmita, 2006) dan merupakan metode pemisahan fisikokimia yang
didasarkan pada adsorpsi, partisi, atau kombinasi keduanya, tergantung dari jenis zat
penyangga, cara pembuatan, dan jenis pelarut yang digunakan (Depkes RI, 1995a). KLT
adalah bagian dari kromatografi cair. Dimana fase gerak pada metode ini berupa cairan dan
fase diamnya dilekatkan pada lapisan tipis dengan permukaan yang rata atau berupa padatan
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
5 Universitas Indonesia
absorben. Derajat retensi dinyatakan dengan Rf yang digunakan untuk menyatakan posisi dari
zat setelah pengembangan, dapat dihitung dengan (Alexander & Griffiths, 1993) :
(1)
Harga Rf dipengaruhi oleh jenis penyerap, ketebalan, metode arah pengembangan,
kadar dan jumlah cuplikan, dan jarak yang ditempuh bercak.
Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi cair yang baik digunakan
untuk pemisahan campuran dalam skala besar (lebih dari 1 gram). Kromatografi kolom
terbagi dua jenis yaitu kromatografi kolom lambat dan kromatografi kolom dipercepat (kilat).
Pada kromarografi kolom dipercepat, pelarut pengembang didorong dengan cepat (dengan
tekanan gas) melalui kolom yang berisi penjerap basah. Pada kromatografi kolom fase diam
yang digunakan dapat berupa silika gel, selulosa atau poliamida. Sedangkan fase geraknya
dapat dimulai dengan pelarut non polar kemudian ditingkatkan kepolarannya secara bertahap,
baik dengan pelarut tunggal ataupun kombinasi dua pelarut yang berbeda kepolarannya
dengan perbandingan tertentu sesuai tingkat kepolaran yang dibutuhkan.
Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia adalah pemeriksaan kandungan kimia secara kualitatif untuk
mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam suatu tumbuhan. Pemeriksaan
diarahkan pada senyawa metabolit sekunder yang memiliki khasiat bagi kesehatan seperti,
alkaloid, flavonoid, terpen, tanin, saponin, glikosida, kuinon dan antrakuinon (Harborne,
1987).
METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Laboratorium Penelitian Fitokimia dan Laboratorium Kimia Farmasi Analisis
Kuantitatif Fakultas Farmasi Universitas Indonesia, Depok, mulai Februari sampai Mei
2012.
Alat
Timbangan analitik (AND GR-202®), rotary vacuum evaporator (Hanshin®, Ika®,
Buchii®), penangas air (Imperial IV ®), freezer dengan temperatur -20ºC (Modena®), lemari
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
6 Universitas Indonesia
pendingin dengan temperatur 2-6ºC, termometer, vortex mixer, pH meter (Eutech
Instruments®), mikropipet (Thermo®), inkubator suhu 37ºC (Biotek ELX 808), microplate
reader (Biotek ELX 808), pipet volume, vacuum pump, bejana KLT, pipa kapiler , kolom
kromatografi, vial dan botol penampung berbagai ukuran, dan alat-alat gelas.
Bahan
Bahan Uji
Ekstrak methanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksan dari daun Antidesma
neurocarpum Miq yang telah didapatkan dari Laboratorium Penelitian Fitokimia Fakultas
Farmasi Universitas Indonesia yang diekstraksi secara maserasi bertingkat.
Bahan Kimia
α-Glukosidase yang berasal dari Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich®), p-
nitrofenil-α-D-glukopiranosida (Sigma-Aldrich®), bovine serum albumin (Merck, Jerman),
akarbose (Dexa Medica, Indonesia), kalium dihidrogen fosfat (Merck, Jerman), dimetil
sulfoksida (DMSO) (Merck, Jerman), etil asetat teknis (Brataco), n-heksana teknis (Brataco),
metanol teknis (Brataco), etanol 96% teknis (Brataco), aqua demineralisata (Brataco), silika
gel 60 F254 (Merck, Jerman), kalium iodida, bismuth nitrat, kalium hidroksida, natrium
hidroksida, natrium karbonat (Merck, Jerman), asam klorida (Merck, Jerman), asam nitrat
(Merck, Jerman), gelatin, besi (III) klorida, asam sulfat, Pb (II) asetat, sodium sulfat anhidrat
(Merck, Jerman), akuades, air bebas CO2, natrium karbonat (Merk, Jerman), lempeng KLT
dan silika gel.
Bahan Pembanding
Akarbosa (Dexa®), ekstrak metanol kina, ekstrak metanol daun teh, ekstrak metanol
Theae Folium, ekstrak metanol kuarsetin, ekstrak metanol orthosiphon, ekstrak metanol
Digitalis Folium, ekstrak metanol Liquiritae Radix.
Prosedur Pelaksanaan
Uji pendahuluan berupa penentuan aktivitas α-glukosidase dan optimasi konsentrasi
substrat dilakukan sebelum dilakukan uji penghambatan aktivitas α-glukosidase. Akarbosa
sebagai standard dilakukan uji penghambatan aktivitas α-glukosidase nya terlebih dahulu lalu
selanjutnya pada ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksan. Ekstrak dengan persen inhibisi
tertinggi, dilakukan identifikasi golongan senyawa kimianya dan dilakukan fraksinasi dengan
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
7 Universitas Indonesia
metode kromatografi kolom dipercepat. Metode KLT digunakan pada proses
pengelompokkan fraksi hasil kromatografi kolom dipercepat tersebut hingga didapatkan
beberapa fraksi gabungan. Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase kembali dilakukan pada
fraksi-fraksi gabungan tersebut. Fraksi gabungan teraktif kemudian diuji kinetika
penghambatan α-glukosidasenya dan diidentifikasi golongan senyawa kimianya.
Penyiapan Larutan Pereaksi Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase
Larutan Dapar Fosfat pH 6,8
Kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dibuat dengan melarutkan 6,805 g kalium
dihidrogenfosfat dalam aqua demineralisata bebas karbondioksida dan diencerkan hingga
250,0 mL. Natrium hidroksida 0,2 M dibuat dengan melarutkan 1,6 g NaOH dalam air
demineralisata bebas karbondioksida hingga 200,0 mL. Dapar fosfat pH 6,8 dibuat dengan
mencampurkan 125,0 mL kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dengan 56,0 mL natrium hidroksida
0,2 M dan diencerkan dengan air demineralisata bebas karbondioksida hingga 500,0 mL.
Larutan α-Glukosidase
Larutan α-glukosidase (stok) dibuat dengan cara melarutkan 5,0 mg α-glukosidase
dalam 50 mL larutan Bovine Serum Albumin (BSA) dalam kondisi suhu rendah (2-8ºC).
Kemudian larutan α-glukosidase (stok) diencerkan dengan dapar fosfat pH 6,8 hingga
diperoleh aktivitas sebesar 1,5 Unit/mL.
Larutan substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG)
Larutan substrat 20 mM dibuat dengan cara melarutkan 60,25 mg PNPG dalam 10,0
mL aqua demineralisata bebas karbondioksida. Larutan substrat dapat diencerkan dengan
aqua demineralisata bebas karbondioksida hingga diperoleh konsentrasi larutan substrat 20;
10; 5; 2,5; 1,25 dan 0,625 mM sehingga dalam pengujian diperoleh konsentrasi akhir masing-
masing 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 dan 0,0312 mM. Larutan substrat untuk pengujian harus
segar dan harus segera digunakan setelah dibuat.
Larutan Natrium Karbonat 200 mM
Serbuk natrium karbonat sejumlah 10,6 g ditimbang kemudian dilarutkan dengan 500
mL akua demineralisata bebas karbondioksida sehingga mencapai konsentrasi 200 mM. pH
natrium karbonat yang digunakan adalah 8,7.
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
8 Universitas Indonesia
Fraksinasi Ekstrak Metanol dengan Kromatografi Kolom Dipercepat
Sebelum dilakukan fraksinasi dengan kromatografi kolom, terlebih dahulu ditentukan
perbandingan pelarut yang memberikan pemisahan paling baik pada bercak dengan
kromatografi lapis tipis (KLT). Ekstrak metanol ditimbang sebanyak 10,0 mg kemudian
dilarutkan dengan 1 mL metanol. Larutan ekstrak ditotolkan pada lempeng KLT dan dielusi
dalam bejana yang telah dijenuhkan selama 30 menit. Setelah dielusi, lempeng dikeluarkan,
dikeringkan, dan diamati bercaknya dengan menggunakan lampu UV pada panjang
gelombang 254 dan 366 nm. Kemudian disemprot dengan pereaksi semprot universal, asam
sulfat 10% dalam metanol. Perbandingan pelarut yang memberikan pemisahan yang baik
pada lempeng KLT digunakan sebagai fase gerak untuk fraksinasi dengan kromatografi
kolom.
Ekstrak kering metanol daun Antidesma neurocarpum Miq. ditimbang dengan
seksama kurang lebih 40,0 g lalu dilarutkan dengan sedikit metanol kemudian ditambahkan ±
18 g silika hingga sekiranya homogen. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam kolom dan
pada bagian atas sampel diletakkan kembali kertas saring. Fase gerak yang digunakan adalah
gradien pelarut n-heksan dan etil asetat kemudian dilanjutkan gradien etil asetat dan metanol
yang ditingkatkan kepolarannya. Masing-masing hasil fraksi ditotolkan pada lempeng KLT
dan dielusi dalam bejana yang berisi campuran eluen dan telah dijenuhkan selama 30 menit.
Setelah dielusi, lempeng KLT dikeringkan dan diamati dengan menggunakan lampu UV pada
panjang gelombang 254 dan 366 nm. Fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatografi sama
digabungkan.
Kromatografi Lapis Tipis
Hasil dari kromatografi kolom dipercepat dikelompokkan menggunakan metode
kromatografi lapis tipis. Cara pengelompokkannya adalah dengan melihat spot-spot atau pola
kromatografinya. Hasil dari kromatografi lapis tipis ini kemudian dilihat pula dengan sinar
UV dengan 256 dan 365 nm. Pola kromatografi yang sama kemudian disatukan menjadi
satu fraksi gabungan. Hasil penggabungan adalah sebanyak lima belas fraksi gabungan.
Uji Pendahuluan Aktivitas -Glukosidase
Uji pendahuluan harus dilakukan terlebih dahulu sebelum melakukan uji
penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase. Variabel yang dioptimasi adalah konsentrasi
substrat. Prosedur optimasi konsentrasi substrat dapat dilihat pada Tabel 1.
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
9 Universitas Indonesia
Tabel 1. Prosedur Optimasi Konsentrasi Substrat Sampel (S) Kontrol (K)
Reagen Volume (µL) Reagen Volume (µL)
Dapar fosfat (pH 6,8) 66 Dapar fosfat (pH 6,8) 66
PNPG (konsentrasi 5/ 4/ 3/ 2/ 1
mM) 17
PNPG (konsentrasi 5/4/ 3/ 2/
1 mM) 17
Inkubasi 37ºC, 5 menit
Enzim (0,15 U/mL) 17 Natrium karbonat 267 mM 100
Inkubasi 37ºC, 15 menit
Natrium karbonat 267 Mm 100 Enzim (0,15 U/mL) 17
Ukur absorbansi p-nitrofenol yang terbentuk pada 405 nm
Perhitungan Aktivitas Enzim
Unit/ml enzim :
( 2 )
Unit/mg enzim = Unit/mL enzim x (1/c) ( 3 )
Keterangan :
V = Volume total (mL)
Ve = Volume enzim (mL)
df = faktor pengenceran
t = Waktu inkubasi (menit)
18.1 = Ekstinsi milimolar p-Nitrophenol pada 400 nm
C = Banyaknya α-glukosidase dalam larutan (mg/mL)
Definisi Unit: (Sigma, 1996)
Satu unit akan melepaskan 1,0 μmol D-glukosa dari p-nitrofenil-α-D-glukosida per menit pada
pH 6,8 dan suhu 37oC.
Penentuan Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase
Pengujian blanko dilakukan dengan cara sebanyak 30 μL larutan dimetil sulfoksida
2% dalam dapar fosfat pH 6,8 ditambah dengan 36 μL dapar fosfat pH 6,8 dan 17 μL p-
nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG) 5 mM, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37ºC.
Kemudian ditambahkan 17 μL larutan enzim 0,15 U/mL, dan diinkubasi kembali selama 15
menit pada suhu 37ºC. Setelah masa inkubasi selesai, ditambahkan 100 μL natrium karbonat
267 mM. Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada 405 nm. Pengujian
dilakukan sebanyak dua kali (duplo).
Pengujian kontrol blanko dilakukan dengan cara sebanyak 30 μL larutan dimetil
sulfoksida 2% dalam dapar fosfat pH 6,8 ditambah dengan 36 μL dapar fosfat pH 6,8 dan 17
μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (PNPG) 5 mM, diinkubasi selama 5 menit pada suhu
37ºC. Setelah itu, ditambahkan 100 μL 267 mM natrium karbonat dan diinkubasi kembali
selama 15 menit pada suhu 37ºC. Setelah masa inkubasi selesai, ditambahkan 17 μL larutan
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
10 Universitas Indonesia
enzim 0,15 U/mL. Larutan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada 405 nm.
Pengujian dilakukan sebanyak dua kali (duplo).
Pengujian standar dilkukan dengan cara sebanyak 30 μL larutan standar (akarbose)
ditambah dengan 36 μL dapar fosfat pH 6,8 dan 17 μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida
(PNPG) 5 mM, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37ºC. Kemudian ditambahkan 100 μL
267 mM natrium karbonat dan diinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu 37ºC. Setelah
masa inkubasi selesai, ditambahkan 17 μL larutan enzim. Larutan diukur absorbansinya
dengan microplate reader pada 405 nm. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali (duplo).
Prosedur yang sama dilakukan untuk kontrol, hanya perbedaanya setelah diinkubasi pada
suhu 37oC selama 15 menit, ditambahkan 100 μL natrium karbonat 200 mM. Larutan diukur
absorbansinya dengan microplate reader pada λ 405 nm. Cara pengujian terhadap
penghambatan aktivitas -glukosidase dapat dilihat pada Tabel 2.
Persen inhibisi α-glukosidase dapat dihitung dengan rumus (Gholamhoseinian, et al.,
2008): (4)
IC50 dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear, konsentrasi
sampel sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu y. Dari persamaan: y = a + bx dapat
dihitung nilai IC50 dengan menggunakan rumus :
(5)
Tabel 2. Prosedur uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dengan volume total masing-
masing 200 µL
Keterangan : B1= Blanko,
B0= Kontrol Blanko,
S1= Sampel dan Standar (akarbose),
S0= Kontrol Sampel dan Kontrol Standar (akarbose)
Reagen Volume (µL)
B1 B0 S1 S0
Sampel / standar - - 30 30
DMSO 2% dalam dapar fosfat (pH 6,8) 30 30 - -
Dapar fosfat pH 6,8 36 36 36 36
PNPG (5 mM) 17 17 17 17
Inkubasi pada 37ºC, 5 menit
Enzim (0,15 U/mL) 17 - 17 -
Inkubasi pada 37ºC, 15 menit
Natrium karbonat 267 mM 100 - 100 -
Ukur absorbansi p-nitrofenol yang terbentuk pada 405 nm
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
11 Universitas Indonesia
Penentuan Kinetika Inhibisi Enzim
Penentuan kinetika penghambatan enzim dilakukan pada fraksi yang memiliki
aktivitas inhibisi terkuat (IC50 terkecil), yaitu metanol. Prosedur penentuan kinetika
penghambatan enzim dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Prosedur penentuan kinetika penghambatan enzim dengan volume total masing-
masing 200 µL
Reagen Volume (µL)
Tanpa Inhibitor Dengan Inhibitor
Ekstrak/Standar - 30
DMSO 6% dalam dapar fosfat (pH 6,8) 30 -
Dapar fosfat (pH 6,8) 36 36
PNPG (5; 4; 3; 2; dan 1 mM) 17 17
Inkubasi pada 37ºC selama 5 menit
Enzim (0,15 U/mL) 17 17
Inkubasi pada 37ºC selama 15 menit
Natrium karbonat 267 mM 100 100
Ukur absorbansi p-nitrofenol yang terbentuk pada 405 nm
Identifikasi Golongan Senyawa Kimia
Ekstrak teraktif dan fraksi teraktif dari hasil fraksinasi menggunakan kromatografi
kolom dipercepat dilakukan identifikasi komponen-komponen yang terkandung didalamnya.
Identifikasi dilakukan dengan dua metode yaitu dengan reaksi warna dan KLT.
Metode KLT dilakukan dengan menyiapkan larutan uji terlebih dahulu yaitu dengan
melarutkan 10 mg ekstrak metanol dengan 5 ml metanol dan 10 mg fraksi gabungan ke-8
dengan 5 ml metanol. Selanjutnya, larutan tersebut digunakan untuk identifikasi golongan
senyawa kimia lebih lanjut.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyiapan Bahan Uji
Simplisia daun Antidesma neurocarpum Miq. dipilih karena merupakan salah satu
simplisia yang memiliki aktivitas tinggi dalam menghambat aktivitas α-glukosidase dengan
IC50 sebesar 2,18 µg/mL (Elya, et al., 2012). Cara ekstraksi yang digunakan adalah dengan
maserasi bertingkat dengan pelarut n-heksan, etil asetat dan metanol.
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
12 Universitas Indonesia
Uji Pendahuluan Aktivitas α-Glukosidase
Optimasi Aktivitas -glukosidase dengan Variasi Konsentrasi PNPG
α-Glukosidase yang digunakan berasal dari Saccharomyces cereviceae recombinant.
Grafik optimasi substrat dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Grafik Optimasi Aktivitas Enzim dengan Variasi Konsentrasi Substrat
Pada hasil uji pendahuluan , dipilih konsentrasi substrat optimum sebesar 5 mM.
Pada konsentrasi 5 mM, substrat relatif stabil pada setiap kali pengujian penentuan optimasi
substrat. Peningkatan substrat menjadi 6 mM menghasilkan serapan yang melonjak tinggi,
dikarenakan substrat menggeser produk inhibitor yang menduduki sisi aktif enzim
sehingga dihasilkan kembali produk yang lebih banyak.
Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase
Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dilakukan dengan menggunakan
microplate reader. Microplate reader dipilih karena pengukuran enzimatis dapat
berlangsung dengan cepat, dapat mengukur lebih dari satu sampel dalam waktu yang
bersamaan serta jumlah sampel dan pereaksi yang digunakan jumlahnya lebih sedikit
(dalam µL).
Aktivitas enzim dilakukan dengan membandingkan nilai absorbansi sampel dengan
blanko. Aktivitas -glukosidase yang digunakan dalam uji pendahuluan ini adalah 0,15
U/mL. Proses inkubasi yang terdiri dari dua tahap yaitu tahap pertama dimana waktu
inkubasi adalah 5 menit bertujuan untuk memberikan waktu bagi larutan uji untuk
mencapai suhu 37ºC, sedangkan tahap kedua yaitu inkubasi selama 30 menit adalah
untuk reaksi enzimatis.
Uji Penghambatan Aktivitas -glukosidase pada Akarbose
Akarbose diketahui telah teruji mampu menghambat aktivitas α-glukosidase dan
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
13 Universitas Indonesia
merupakan obat yang telah umum digunakan dalam pengobatan klinis. Hasil uji
penghambatan aktivitas -glukosidase terhadap akarbose dengan metode microplate readers,
didapatkan IC50 akarbose (dalam well) sebesar 38,37 μg/mL.
Uji Penghambatan Aktivitas -glukosidase pada Tiga Ekstrak
Hasil pengujian didapatkan bahwa ekstrak metanol merupakan ekstrak yang paling
aktif dengan persen inhibisi paling tinggi. Grafik hasil uji penghambatan aktivitas -
glukosidase pada tiga ekstrak dari daun Antidesma neurocarpum Miq. ini dapat dilihat pada
Gambar 3.
Gambar 3. Diagram Batang Uji Penghambatan Aktivitas -gukosidase Ekstrak
Pada ekstrak n-heksan, hasil minus pada persen inhibisinya dapat terjadi karena
larutan uji pada ekstrak n-heksan tidak larut sempurna meskipun telah ditambahkan DMSO
hingga lebih dari 50%. Penambahan DMSO sebagai kosolven diharapkan mampu
meningkatkan kelarutan. Pada awal penambahan DMSO, ekstrak n-heksan terlihat larut,
namun ketika ditambahkan larutan dapar fosfat, larutan ekstrak n-heksan ini terlihat ada
endapan dan ekstrak kental yang masih menggumpal. Ekstak n-heksan yang tidak dapat
larut sempurna ini tidak dapat diuji penghambatan aktivitas -glukosidasenya.
Fraksinasi Ekstrak Metanol
Fraksinasi dilakukan hanya pada ekstrak metanol (persen inhibisi tertinggi). Metode
kromatogfrafi kolom dipercepat dipilih karena metode ini dinilai lebih efisien dan hemat
pelarut. Hasil fraksinasi didapatkan sebanyak 142 fraksi.
Diagram Batang Uji Penghambatan Aktivitas -gukosidase Ekstrak
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
14 Universitas Indonesia
Pengelompokkan Fraksi dengan Metode KLT
Sebanyak 142 fraksi hasil kromatografi kolom dipercepat dibiarkan menguap. Fraksi
yang telah kering selanjutnya dilakukan pengelompokkan dengan metode KLT. Pada proses
ini, masing-masing fraksi yang dilihat pola kromatogramnya terlebih dahulu dilarutkan
dengan sedikit metanol dan ditotolkan pada plat KLT. Fase gerak yang digunakan adalah n-
heksan, etil asetat dan metanol dengan berbagai perbandingan konsentrasi. Setelah
dilakukan penggabungan fraksi, ternyata diperoleh 15 fraksi gabungan akhir.
Uji Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase Pada Fraksi Gabungan
Sebanyak 15 fraksi gabungan ditimbang dan kemudian dipilih yang bobot fraksi
keringnya lebih dari 200 mg (8 fraksi gabungan). Uji penghambatan aktivitas -glukosidase
kemudian dilakukan pada kedelapan fraksi gabungan tersebut dengan cara yang sama pada
tiga ekstrak (metanol, etil asetat, dan n-heksan).
Berdasarkan hasil uji pada delapan fraksi gabungan yang diuji, fraksi gabungan ke-8
adalah fraksi gabungan teraktif dengan IC50 sebesar 40,77. Pada beberapa fraksi gabungan
yang diuji penghambatan aktivitas -glukosidasenya, didapatkan persen inhibisi yang lebih
dari 100%. Persen inhibisi yang terlalu tinggi ini disebabkan karena larutan uji yang
digunakan terlalu pekat. Konsentrasi yang digunakan sebaiknya diturunkan sehingga persen
inhibisi yang didapat tidak melebihi 100%.
Penentuan Kinetika Penghambatan Aktivitas α-Glukosidase dari Fraksi Teraktif
Kinetika enzim dilakukan untuk mengetahui jenis inhibisi sampel terhadap enzim.
Untuk menganalisis kinetika enzim, dapat digunakan plot Lineweaver-Burk, dimana sumbu x
adalah satu per konsentrasi substrat (1/S) sedangkan sumbu y adalah satu per kecepatan
reaksi enzim (1/V). Kinetika enzim dapat diketahui dengan melihat aktivitasnya terhadap
kenaikan konsentrasi substrat, dimana konsentrasi yang digunakan adalah 0,085; 0,17; 0,255;
0,34; dan 0,425 mM.
Penghambat yang dipilih adalah fraksi gabungan ke-8 karena merupakan fraksi yang
paling aktif dibandingkan fraksi uji yang lain. Konsentrasi fraksi gabungan ke-8 yang
digunakan adalah 410,4 ppm.
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
15 Universitas Indonesia
Gambar 4. Hasil Plot Kurva Lineweaver – Burk pada Fraksi gabungan ke-8
Hasil uji kinetika penghambatan enzim menunjukkan bahwa fraksi gabungan ke-
8 dari Antidesma neurocarpum Miq. memiliki tipe penghambatan kompetitif. Hasil
perhitungan tetapan Michaelis-Menten Fraksi Gabungan ke-8 dengan Konsentrasi 410,4
µg/mL yang digunakan sebagai data grafik gambar 4 dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil Perhitungan Tetapan Michaelis-Menten Fraksi Gabungan ke-8
A B Vmax Km
Tanpa inhibitor 1,108 0,184 0,90 0,17
Inhibitor 74,7
µg/mL
0,0411 0,1093 24,33 2,66
Identifikasi Golongan Kimia
Hasil identifikasi kandungan kimia ekstrak metanol dan fraksi gabungan ke-8 daun
Antidesma neurocarpum Miq. mengandung alkaloid, tanin, fenol, flavanoid, dan glikosida.
Tabel hasil identifikasi golongan kimia pada ekstrak metanol dan fraksi ke-8 dari daun
Antidesma neurocarpum Miq. dapat dilihat pada Tabel 4.2.
Tabel 5. Hasil Identifikasi Golongan Kimia dari Ekstrak metanol dan Fraksi Gabungan ke-8 daun
Antidesma neurocarpum Miq.
G o l o n g a n S e n y a w a K i m i a E k s t r a k m e t a n o l d a n
F r a k s i g a b u n g a n k e - 8
A l k a l o i d +
T a n i n +
F e n o l +
F l a v a n o i d +
G l i k o s i d a +
S t e r o l / T e r p e n -
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
16 Universitas Indonesia
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh hasil sebagai berikut :
a. Uji penghambatan aktivitas α-glukosidase dari ketiga ekstrak (metanol, etil asetat dan
n-heksan) diperoleh hasil bahwa ekstrak metanol merupakan ekstrak yang paling aktif
dengan persen inhibisi paling tinggi (89,53%), dibandingkan dengan fraksi etil asetat
dan n-heksan.
b. Uji penghambatan aktivitas -glukosidase terhadap lima belas fraksi gabungan hasil
fraksinasi kromatografi kolom dipercepat diperoleh hasil bahwa fraksi gabungan ke-8
adalah fraksi yang paling aktif dengan IC50 sebesar 40,77.
c. Hasil identifikasi ekstrak teraktif (metanol) yang didapat dengan metode maserasi
bertingkat dan fraksi gabungan teraktif (fraksi ke-8) hasil fraksinasi dengan metode
kromatografi kolom dipercepat menunjukkan adanya golongan senyawa flavonoid,
tanin, glikosida, fenol dan alkaloid.
SARAN
Untuk mendukung data penelitian ini, hendaknya dilakukan penelitian lebih
lanjut mengenai pemurnian dan karakterisasi senyawa isolat dari daun Antidesma
neurocarpum Miq. Selain itu perlu dilakukan penelitian secara in vivo menggunakan
hewan coba untuk mendukung perkembangan obat alam terhadap penyakit diabetes
melitus.
KEPUSTAKAAN
Chisholm-Burns, M. A., Wells, B. G., Schwinghammer, T. L., Malone, P. M., Kolesar, J. M.,
Rotschafer, J. C., et al. (2008). Pharmacotherapy Principles and Practice. New
York: McGraw-Hill .
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1979). Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta:
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995a). Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta:
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995b). Materia Medika Indonesia Jilid VI.
Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak
Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Dewi, R. (2013). Faktor Risiko Perilaku yang Berhubungan dengan Kadar Gula Darah pada
Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 di RSUD Kabupaten Karanganyar . Jurnal
Kesehatan Masyarakat 2013, Volume 2, Nomor 1.
Dewi, R., Iskandar, Y., Hanafi, M., Kardono, L., Angelina, M., Dewijanti, I., et al. (2007).
Inhibitory Effect of Koji Aspergillus terreus on alfa-Glucosidase Activity and
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013
17 Universitas Indonesia
Postprandial Hyperglycemia. Pakistan Journal of Biological Science, 10, 18 , 3131-
3135.
DiPiro, et al., (2005). Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach (8th ed.). New York:
McGraw-Hill.
Dong, L., dan Ni, J. m. (2008). Preliminary study of an α-glucosidase inhibitor from the roots
and stems of Polygonatum sibiricum Red. Asian Journal of Traditional Medicines, 3
( 5 ) , 179-185.
Elya, et al., (2012). Screening of α-glucosidase inhibitory activity from some plants of
apocynaceae, clusiaceae, euphorbiaceae,and rubiaceae. Journal of Biomedicine and
Biotechnology .
Gao, et. al. (2004). Hepatoprotective activity of Terminalia catappa L. leaves and its two
triterpenoids. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1449-1455.
Gao,et al., (2010). Constituents from the testas of Castanea mollissima Blume with a-
glucosidase inhibitory activity. Journal of Asian Natural Products Research , 144-14
Guo, L.-P., Jiang, T.-F., Lv, Z.-H., dan Wang, Y.-H. (2010). Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 53 , 1250–1253.
Harborne, JB. (1987). Metode fitokimia: penuntun cara modern menganalisis tumbuhan
(Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, Penerjemah). Bandung: Institut
Teknologi Bandung.
Harmita. (2006). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok : Departemen Farmasi FMIPA UI,
205-211.
Harvey, R. A., dan Ferrier, D. R. (2010). Lippincott’s Illustrated Reviews : Biochemistry (5th
ed.). Philadelpia: Lippincott Williams & Wilkins.
Liu ZM, Chen Y, Suzanne C Ho, Ho YP, Woo J. Effect of soy protein and isoflavones on
glycemic control and insulin sensitivity: a 6-mo double-blind, Randomized Placebbo
Controlled Trial in Postmenopausal Chinese Women with Prediabetes orn Untreated
Early Diabeteds. Am J Clin Nutr 2010;91:1394-40
LIPI. (2009).Pengobatan Alternatif dengan Tanaman Obat. UPT-Balai Informasi Teknologi
LIPI.
HYPERLINK "http://www.bit.lipi.go.id/pangan
kesehatan/documents/artikel_hipertensi/tanaman_obat.pdf"
http://www.bit.lipi.go.id/pangan-
kesehatan/documents/artikel_hipertensi/tanaman_obat.pdf , 21 Januari 2012, pk.
17.00.
McPherson, R., dan Pincus, M. (2011). Henry's Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods (22nd ed.). Philadelphia: Elsevier.
Murray, et al., (2009). Harper's Illustrated Biochemistry (28th ed.). New York: McGraw-
Hill.
Sari, L.O.R.K. (2006). Pemanfaatan obat tradisonal dengan pertimbangan manfaat dan
keamanannya, majalah ilmu kefarmasian, 3(1), 1-7.
Seager, L.S., Slaubaugh, M.R. (2008). Organic and biochemistry for today. Thomson
Learning: USA.
Sinaga, E. Dan Wirawanni, Y. (2012). Pengaruh Pemberian Susu Kedelai terhadap Kadar
Glukosa Darah Puasa pada Wanita Prediabetes. Journal of Nutrition College,
Volume I, Nomor I, Tahun 2012, Halaman 563-579.
Wilson, K., dan Walker, J. (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular
Biology (7th ed.). New York: Cambridge University Press.
Uji penghambatan..., Rieka Widihasputri, FF UI, 2013