Univerzita Palackého v Olomouci

Přírodovědecká fakulta

Katedra biochemie

Laboratorní cvičení z biochemie (KBC/BCHC)

Zavedení úloh pro analýzu biologicky aktivních látek

LUCIE ČINČALOVÁ, TEREZA TICHÁ, LENKA LUHOVÁ, MAREK PETŘIVALSKÝ

Olomouc 2015

OBSAH

Laboratorní řád 3

Bezpečnost práce v chemické laboratoři 3

První pomoc při nehodě 4

1. Proteiny 5

1.1 Důkaz keratinu ve vlasech, rohovině a peří 5

1.2 Zjištění přítomnosti glutamátu v instantních polévkách 9

2. Sacharidy 12

2.1 Izolace bramborového škrobu 12

2.2 Pozorování škrobových zrn pod mikroskopem 13

3. Stanovení a důkazy vitamínů 15

3.1 Kvantitativní důkaz vitamínů 19

3.2 Ověření množství vitamínu C v ovoci, zelenině a nápojích 20

3.2.1 Důkaz vitamínu C v ovoci 23

3.2.2 Množství vitamínu C v nápojích 24

3.2.3 Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové 24

3.2.4 Stanovení koncentrace vitamínu C v ovocné šťávě 25

4. Enzymy v potravinách 26

4.1 Stanovení proteasové aktivity v ovoci a zelenině 26

4.2 Katalasa v potravinách 30

5. Nukleové kyseliny 31

5.1 Analýza a detekce DNA a RNA pomocí agarosové elektroforézy 31

6. Testové otázky 35

LABORATORNÍ ŘÁD

1. Student je povinen se seznámit před zahájením práce v laboratoři s laboratorním řádem, s bezpečnostními předpisy a s poskytováním první pomoci.

2. Pro získání zápočtu je nutná 100% účast na cvičení. V případě nemoci si lze cvičení nahradit v rámci zápočtového týdne (výjimečné situace se budou řešit individuálně, př. pobyt v nemocnici).

3. Každá absence musí být omluvena. Má-li student vážné osobní důvody, pro které se nemůže zúčastnit cvičení, sdělí to vedoucímu předem. Každá zameškaná úloha musí být nahrazena. Na termínu náhradního cvičení se dohodne posluchač s vedoucím cvičení.

4. Student je povinen přicházet do laboratoře včas. 5. Student musí být na praktické cvičení teoreticky připravený. Před zahájením cvičení vyučující

ověřuje znalosti studentů. Pokud student nemá dostatečné znalosti k řešení dané úlohy, cvičení vykoná v náhradním termínu. Maximální počet náhradních cvičení je 2.

6. Při práci v laboratoři musí mít student pracovní plášť a přezůvky. 7. Studenti pracují ve dvojicích. Před zahájením práce zkontrolují podle přiloženého seznamu

pracovní stůl, na případné nesrovnalosti upozorní vyučujícího. 8. Při práci je nutné postupovat přesně podle zadané úlohy a pokynů vyučujícího. Před používáním

přístrojů se musí student nejprve seznámit s jejich obsluhou. 9. Průběh práce a dosažené výsledky si každý student zaznamenává do protokolárního sešitu. Po

skončení cvičení předloží výsledky k ověření vedoucímu cvičení. 10. Následující cvičení dvojice studentů, řešící spolu danou úlohu, odevzdá jeden společný protokol,

který musí obsahovat: jména studentů, studijní kombinaci, datum, název úlohy, stručný princip úlohy, stručný pracovní postup, výsledky, diskusi, závěr (tabulky, grafy) a odpovědi na otázky uvedené u každé úlohy.

11. Po skončení práce je student povinen dát své pracovní místo do pořádku, řádně umýt sklo a opláchnout jej destilovanou vodou.

12. Student smí opustit laboratoř až po kontrole dosažených výsledků a stavu pracovního stolu vyučujícím.

13. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit. 14. Studenti jsou povinni dodržovat bezpečnostní předpisy. 15. Práce s jedovatými těkavými a páchnoucími látkami se provádí pouze v digestoři. 16. Zvláštní opatrnosti je třeba dbát při manipulaci s otevřeným ohněm, hořlavinami, žíravinami

a jedovatými látkami. 17. Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění je nutné ihned hlásit vyučujícímu a v případě

potřeby poskytnout okamžitě první pomoc.

BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI

Všichni studenti musí být před zahájením cvičení seznámeni a přezkoušeni ze zákona č. 356/2003 Sb.

V chemické laboratoři může dojít k poranění při práci se sklem, při neopatrné manipulaci

s elektrickými přístroji a zejména při práci s chemikáliemi. Aby nedocházelo k poškození zdraví, je

nutné dodržovat základní zásady bezpečnosti práce:

1. Provádíme pouze práce podle pokynů vyučujícího. 2. Seznámíme se s rozmístěním hasicích přístrojů a s únikovými východy z laboratoře. 3. V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a nekouříme. K jídlu a pití nikdy nepoužíváme chemické sklo. 4. Po skončení práce si důkladně umyjeme ruce. 5. Tašky a oblečení uložíme na vyhrazené místo mimo laboratoř. 6. Při práci v laboratoři vždy nosíme pracovní plášť a vhodnou obuv.

7. Neprovádíme samovolné opravy nebo úpravy na elektrické instalaci a přístrojích. 8. Chemikálie nikdy nezkoušíme ústy a neinhalujeme výpary. 9. Nepipetujeme ústy! 10. Při práci se žíravinami a jinými nebezpečnými látkami si chráníme obličej a oči ochranným štítem,

ruce gumovými rukavicemi. 11. Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu. Dbáme, abychom vnější stěny nádob nebo pracovní

místo nepotřísnili chemikáliemi. 12. Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem po

tyčince do vody za současného míchání a chlazení. 13. Při provádění pokusů ve zkumavkách držíme ústí zkumavek odvrácené od obličeje (svého

i spolupracovníků). 14. Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň. 15. Zbytky jedů likvidujeme podle pokynů vyučujícího. 16. Při práci s etherem dbáme úzkostlivě na bezpečnostní opatření (možnost vznícení i od horkých

součástí). 17. V případě nehody okamžitě informujeme vyučujícího a poskytneme první pomoc. 18. Po skončení práce uzavřeme vodu a vypneme elektrické spotřebiče.

PRVNÍ POMOC PŘI NEHODĚ

1. Při poleptání kůže silnou zásadou nebo kyselinou zasažené místo ihned důkladně omyjeme proudem vody. Při poleptání kyselinou provedeme neutralizaci roztokem hydrogenuhličitanu sodného (20 g/l), při poleptání zásadou zředěnou kyselinou octovou (5 g/l).

2. Při zasažení oka chemikálií ihned oko vypláchneme slabým proudem vody. V případě zasažení zásadou oko vypláchneme borovou vodou (roztok kyseliny borité 30 g/l), jedná-li se o kyselinu, použijeme k výplachu roztok boraxu (20 g/l). V každém případě je nutné vyhledat odborné vyšetření u očního lékaře.

3. Při poleptání sliznice v ústech provedeme důkladný výplach úst vodou a následně neutralizaci výplachem kyselinou octovou (poleptání zásadou) nebo hydrogenuhličitanem sodným (poleptání kyselinou).

4. Při požití

louhu se doporučuje pít zředěnou kyselinu octovou (0,5-2,0 g/l),

kyseliny pijeme suspenzi oxidu hořečnatého nebo hydroxidu hlinitého ve vodě,

jedů je charakter první pomoci specifický podle druhu otravy, doporučuje se vypít aspoň 0,5 l vody a vyvolat zvracení,

chemikálií je nutné vyhledat odborné lékařské ošetření. 5. V případě vzplanutí hořlavých látek okamžitě vypneme elektrický proud a odstraníme všechny

hořlavé látky z blízkosti požáru. Hořící oděv hasíme přikrývkou nebo sprchovou vodou. Při likvidaci větších plamenů použijeme hasicí přístroje. Při malých popáleninách ošetříme postižené místo mastí na spáleniny a zakryjeme sterilním obvazem. Větší popáleniny ošetří lékař.

6. Při pořezání sklem odstraníme z povrchové rány sklo, okolí otřeme zředěným peroxidem vodíku (0,9 mol/l) a ovážeme sterilním obvazem. Větší zranění ošetří lékař.

1. Proteiny 1.1 Důkaz keratinu ve vlasech, rohovině a peří Teoretický úvod Keratin je klíčovou stavební bílkovinou, která představuje základní složku vlasů, chlupů a vytváří se z něj také nehty či peří. Název keratin je odvozen řeckého keras (κέρας) znamenajícího roh či rohovinu. Patří mezi nejhojnější proteiny v epiteliální tkáni a v buňkách tvoří tzv. intermediární filamenta, která se podílejí na vzniku buněčné kostry (cytoskeletu). V pokožce se keratin nachází zejména v keratinocytech tvořících až 95 % všech buněk lidské pokožky. Vznik keratinu v buňkách a vznik různých (hlavně kožních) struktur bohatých na keratin se nazývá keratinizace čili rohovatění. Mrtvé plně keratinizované buňky tvoří tzv. stratum corneum neboli rohovou vrstvu o tloušťce 0,01 až 0,04 mm sloužící jako vlastní kožní bariéra chránící tělo před infekcí. Pokud je tato vrstva zničena, člověk do 24 hodin umírá na následky ztráty tekutin.

Keratin má vláknitou strukturu, řadíme ho tedy mezi skleroproteiny. Jednotlivé monomery mívají délku 400–644 aminokyselin, ale větví se do polymerů o velkých rozměrech. Obsahuje zejména sirné aminokyseliny, cystein a methionin. Celkový obsah síry v keratinu bývá v rozmezí od 2 do 5 % na sušinu. Konečný tvar molekuly, terciární strukturu, zajišťují příčné disulfidické můstky. Tím jsou vysvětleny jeho dvě nejdůležitější biologické vlastnosti, nerozpustnost a pevnost v ohybu. Při rovnání vlasů teplem se právě tato přirozená struktura ztrácí a ničí se disulfidické můstky. Keratin je rovněž odolný vůči působení proteolytických enzymů. Struktura keratinových útvarů je charakterizována fibrilární částí a podílem základní amorfní látky, tzv. matrixu. Matrix vyplňuje prostor mezi vřetenovitými buňkami a je intramolekulárně zesíťován cystinem. Jednou z hlavních skupin keratinů jsou α-keratiny, které jsou tvořeny pravotočivým polypeptidovým řetězcem s α-helikální strukturou (Obrázek 2). Jejich relativní molekulová hmotnost dosahuje až 50 000 kDa. Vřetenovité buňky keratinového vlákna se skládají z mikrofibril, které se spojují do makrofibril (průměr 200 nm) (Obrázek 1). Mikrofibrily se dále skládají z protofibril (průměr 2 nm), které tvoří peptidickými řetězci α-struktury. Devět protofibril je uspořádáno v kruhu po obvodě mikrofibrily a dvě tvoří jádro tohoto útvaru. Tento strukturní motiv 9+2 se často vyskytuje v bičících, které používá eukaryotní buňka při svém pohybu. Protažením keratinového vlákna (ve vlhkém stavu až o 100%) dochází k přestavbě α-struktury na zřasenou β-strukturu (struktura skládaného listu) s paralelním uspořádáním (o průměru 4 nm). Tuto změnu α-struktury na zřasenou β-strukturu lze pozorovat pomocí rentgenové difrakce.

Chemická struktura keratinu umožňuje řadu reakčních možností díky přítomností aminokyselinových zbytků. Na reaktivitu keratinu má kromě funkčních skupin bílkovin významný vliv přítomnost disulfidické kovalentní vazby. Dále je reaktivita keratinu podmíněná přítomností cystinu. Keratiny bobtnají ve vodě. Vlna se při bobtnání prodlouží asi o 1,2 % a její tloušťka se zvětší asi o 11 %. Bobtnání lze vysvětlit částečným narušením elektrovalentních (iontových) a vodíkových vazeb a vnikáním vody do uvolněné fibrilární struktury. Absorbce vody závisí na přítomnosti hydrofilních skupin v keratinu, ke kterým přísluší především skupiny -NH2, -COOH, -OH a peptidové skupiny. Absorpce vody hraje důležitou roli ve fyzikálních vlastnostech keratinu.

Keratin je poměrně odolný vůči působení kyselin, což je způsobeno odolností disulfidické vazby vůči kyselé hydrolýze. Reakcí s kyselinami je potlačena disociace -COOH skupiny, které jsou v porovnání s bazickými skupinami vždy v nadbytku. Keratin má izolelektrický bod při pH 3,67 a s přídavkem dalšího množství kyselin získá kladný náboj. Až při delším varu a vyšších koncentracích minerálních kyselin nastává hydrolýza bez porušení cystinu. Totální hydrolýza keratinu nastává při zahřívání s 30% kyselinou sírovou nebo 6N kyselinou chlorovodíkovou při 110°C po dobu 24 hodin. Působení zásad na keratin je výraznější a je funkcí pH, teploty a doby. V alkalickém prostředí se potlačí disociace –NH3

+ skupin a keratin získává negativní náboj. Disulfidická vazba cystinu podléhá hydrolytickému štěpení. Na disulfidickou vazbu keratinu působí oxidačně bez štěpení roztok peroxidu vodíku, roztok manganistanu draselného a fotooxidace při stárnutí keratinových bílkovin.

Keratiny se rozdělují na dva typy:

keratiny I. typu – menší, kyselé (K9–K23, Ha1–Ha8, Irs1-4), keratiny II. typu – větší, neutrální nebo zásadité (K1–K8, Hb1–Hb6, K6irs1–4).

Keratinové odpady tvoří značnou část odpadů masného a koželužského průmyslu, zejména srst, štětiny, kopyta, peří. Zužitkovává se pouze malé množství těchto odpadů především jako péřová moučka nebo zpěňovací přísada do hasicích přístrojů. Jedním ze způsobů zpracovávání keratinových odpadů je výroba keratinových hydrolyzátů či keratinových filmů. V kosmetickém průmyslu se používá tzv. hydrolyzovaný keratin. V kosmetickém průmyslu se získaná jemně žlutá tekutina používá v šampónech, maskách, kondicionérech, produktech pro konečnou úpravu a v celé řadě produktů pro péči o pleť. Hydrolyzovaný keratin má hydratační, zjemňující a vyhlazující účinky. Ve vlasové kosmetice se přidává ke snížení statické elektřiny odstraněním povrchového elektrického náboje z vlasů. Keratinové hydrolyzáty se z velké části využívají jako zdroj proteinu při výživě dobytka pro svůj vysoký obsah proteinů. Dále pro přípravu obalových materiálů pro mikrokapsule. Enkapsulují se barviva, léčiva, vůně, oleje a tuky. Výhodou je zachování aktivity dané substance a regulace jejího uvolňování na specifickém místě. Keratinové hydrolyzáty se rovněž využívají pro úpravu lýka, kdy zvyšují jeho pevnost. Dále se také využívají v zemědělství pro výrobu hnojiv a díky vysokému obsahu aminokyselin slouží jako stimulátory růstu.

Obrázek 1. Uložení keratinu ve struktuře lidského vlasu (převzato z https://peerj.com/articles/619/).

Obrázek 2. Struktura α-keratinu s intermolekulárními vodíkovými vazbami, které zajišťují jeho pevnost (převzato z itech.dickinson.edu).

Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: zkumavky, kádinka, stojan na zkumavky, držák na zkumavky, lihový kahan, Pasteurova pipeta, laboratorní váhy. Chemikálie a materiál: vlasy, peří, kůže, rohovina, 1% roztok CuSO4.5H2O (molární hmotnost 249,68 g/mol), 10% roztok NaOH (molární hmotnost 39,99 g/mol). Pracovní postup Chomáček vlasů, peří nebo několik kousků rohoviny ve zkumavce povaříme s 5 ml roztoku 10% hydroxidu sodného (NaOH). Po vychladnutí přidáme po kapkách roztok 1% síranu měďnatého (CuSO4). Pozorujte barevnou změnu.

Obrázek 3. Důkaz keratinu ve vlasech. (A) Chomáček vlasů v roztoku 10% NaOH. (B) Zahřívání vlasů nad kahanem. (C) Vlasy se povařením v 10% NaOH rozpustily. (D) Přidáním pár kapek 1% CuSO4

vzniklo modrofialové až červenofialové zbarvení jako důkaz keratinu.

Obrázek 4. Důkaz keratinu v rohovině. (A) Pár kousků rohoviny v roztoku 10% NaOH. (B) Zahřívání rohoviny nad kahanem. (C) Povařením rohoviny v 10% NaOH roztok zežloutnul. (D) Přidáním pár kapek 1% CuSO4 vzniklo modrofialové až červenofialové zbarvení jako důkaz keratinu.

Obrázek 5. Důkaz keratinu v peří. (A) Pírko peří v roztoku 10% NaOH. (B) Povařením peří v 10% NaOH roztok zežloutnul. (D) Přidáním pár kapek 1% CuSO4 vzniklo modrofialové až červenofialové zbarvení jako důkaz keratinu.

Vyhodnocení Přítomnost keratinu (bílkoviny) ve vlasech, rohovině či peří (Obrázek 3, 4, 5) dokazuje vznik modrofialového až červenofialového zbarvení. Měďnaté ionty v alkalickém prostředí NaOH vytvářejí s peptidovou vazbou fialové komplexní sloučeniny.

1.2 Zjištění přítomnosti glutamátu v instantních polévkách Teoretický úvod

Kyselina L-glutamová (systematický název: kyselina (2S)-2-aminopentandiová, racionální název: kyselina L-2-aminoglutarová) je glukogenní neesenciální aminokyselina. Vzhledem k přítomnosti dvou karboxylových skupin v molekule vykazuje kyselina L-glutamová slabě kyselou reakci; proto se řadí ke kyselým aminokyselinám společně s kyselinou L-asparagovou. Protože má v molekule jedno chirální centrum, uhlíkový atom, k němuž je připojena karboxylová a aminová skupina, existuje kyselina glutamová ve dvou stereoizomerech, jako kyselina L-glutamová a kyselina D-glutamová, které mají stejné fyzikální vlastnosti s výjimkou optické aktivity. Živé organismy však většinou vytváří pouze bílkoviny obsahující L-formu. Glutamát (glutaman) je sůl odvozená od kyseliny L-glutamové a je běžně vázaná ve všech bílkovinách. Obě tyto látky tvoří bezbarvé krystaly nebo bílý prášek. Kyselinu L-glutamovou najdeme v lidském těle i ve volné formě, například svaly obsahují přibližně 6 000 mg, mozek 2 250 mg, ledviny 680 mg, játra 670 mg, krevní plasma 40 mg volné kyseliny glutamové. Celkově se tedy v lidském organismu vyskytuje zhruba 10 g volné kyseliny L-glutamové. V potravinách denně přijímáme zhruba 10 – 20 g kyseliny L-glutamové vázané v bílkovinách a 1 – 3 g ve volné formě. Bílkoviny jsou štěpeny na jednotlivé aminokyseliny, což představuje další vstup kyseliny L-glutamové do organismu, avšak pouze okolo 4 % volné či vázané kyseliny L-glutamové je vstřebáno. Vzhledem k tomu, že se jedná o neesenciální aminokyselinu, lidské tělo vyprodukuje zhruba 48 g vlastními biosyntetickými procesy nad rámec pocházející z potravinových zdrojů. Podobě jako v lidském organismu i v říši rostlin a živočichů se vyskytuje volný glutaman. Obsah glutamanu se v různých druzích masa pohybuje okolo 20 – 40 mg/100 g. Například hrášek a rajčata obsahují o řád vyšší hladinu 200 mg/100 g a 140 mg/100 g. Houby obsahují 180 mg/100 g. Jedna z nejvyšších hodnot přirozeně se vyskytujících v potravinách je 1200 mg/100 g v sýru parmezán. Největší biologický význam má samotná kyselina L-glutamová, která se vyskytuje v centrální nervové soustavě a v sítnici obratlovců. Funguje zde jako excitační neurotransmiter podobně jako noradrenalin, acetylcholin či γ-aminomáselná kyselina. Zprostředkovává až 75 % všech excitací. Výkyvy hladiny mohou způsobovat problémy od přechodných stavů (bolest hlavy, břicha, křeče, zvýšení tepové frekvence) až po dlouhodobější (poruchy mozku a sítnice).

V potravinářském průmyslu jsou kyselina L-glutamová a její sodná sůl označovány kódem E620 a E621. Obě se používají jako dochucovadla – látky zvýrazňující chuť a vůni, a jako antioxidanty. Z historického pohledu sahá konzumace potravin se zvýšenou hladinou glutamátu daleko do minulosti, a to aniž by se o existence této látky vědělo. Jedná se o omáčku připravenou z nakládaných ryb s více než 2 500letou tradicí v oblasti Středomoří. V roce 1908 byl glutaman sodný izolován z řasy rodu Laminaria japonica profesorem Kikunae Ikedou z Tokijské university. Tato řasa se v Japonsku využívala běžně po staletí. První průmyslové použití glutamátu na světě bylo popsáno v roce 1909. V dnešní době se přírodně identická L-forma průmyslově vyrábí hydrolytickým štěpením rostlinných bílkovin (sója) nebo fermentací bramborového či obilného škrobu nebo z melasy. Sodná sůl kyseliny L-glutamové, neboli E621, bývá také označována rovněž pod zkratkou MSG (angl. monosodium glutamate). Vyskytuje se jako bílá krystalická látka bez vůně, s charakteristickou masovou chutí. Pro tuto další chuť byl přijat název „umami“ – vedle kyselého, sladkého, hořkého a slaného vjemu. Výraz pochází z japonštiny, kde „umai“ znamená chutný, delikátní. Specifický chuťový receptor taste-mGluR4 byl popsán až v roce 2 000. Glutamát se používá hojně v mnoha kořenících směsích, instantních pokrmech jako jsou polévky a omáčky, v konzervovaných jídlech, zejména zelenině, v želatinových desertech a želé, ve zmrzlinách. Dále v masných výrobcích, výrobcích z ryb a uzeninách. Je součástí mnoha aromat (smažené brambůrky) a slouží jako náhrada soli. Účinky glutamanu byly testovány v řadě studií a ve 20. století tuto problematiku doprovázely velké spory o toxicitě glutamanu. V rámci těchto studií a dalších studií pod záštitou Světové zdravotnické organizace WHO nebyly shledány žádné negativní účinky na centrální nervový systém po jednorázové vyšší konzumaci glutamanu v množství 10 g. Údaje o příjmu glutamanu závisí do značné míry na regionálních i individuálních stravovacích zvyklostech. Průměrně konzumujeme 0,5 až 2 g přírodního volného glutamanu a 0,5 – 1 g ve formě přídatné látky. Naše legislativa umožňuje používat kyselinu L-glutamovou a její soli do potravin a nápojů (s výjimkou nealkoholických a dětské výživy do 3 let)

v množství do 10 g na kilogram nebo litr. Toto omezení se netýká kořenících přípravků a směsí koření, kde neplatí žádné omezení a výše přídavku je regulována pouze požadovaným účinkem. Platí ovšem předpoklad, že se nepodávají dětem do 3 let. Vzhledem k tomu, že nejčastější formou přidávané kyseliny L-glutamové je její sodná sůl, mohou být výhrady k nadbytečnému množství konzumovaného sodíku. Pokud se kyselina L- glutamová uplatňuje i jako součást náhrady soli, pak je výhodné použít vápenaté nebo amonné soli.

Chromatografickými metodami lze v potravinářských výrobcích zjistit přítomnost a případně i porovnat množství kyseliny glutamové a glutamátu. Detekce se provádí ninhydrinovou reakcí, kdy pozorujeme vývoj červenofialového až modrofialového zbarvení. Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: kádinky, odměrný válec, pipeta, skleněná tyčinka, lžička, nůžky, pinzeta, rozprašovač, sušárna (fén), silufolová deska nebo filtrační papír, krycí sklíčko na kádinku/vanu. Chemikálie a materiál: 1% roztok ninhydrinu (molární hmotnost 178,14 g/mol) v acetonu, 96% ethanol, 1% kyselina L-glutamová (standard, molární hmotnost 147,13 g/mol), amoniak (vodný roztok 25%), vzorky instantních polévek a dochucovadel. Pracovní postup Vzorek instantní polévky či jiných dochucovadel (Obrázek 6) rozmíchejte v malém množství vody a nechejte usadit. Připravte si silufolovou desku nebo filtrační papír (asi 8x15 cm) k chromatografii a 1 cm od spodního okraje vyznačte tužkou startovací čáru. Malou kapku připraveného vzorku naneste kapátkem nebo mikropipetou na startovací čáru, nechejte kapku zaschnout (popřípadě použijte fén) a postup zopakujte třikrát. Takto postupujte se všemi instantními polévkami, které máte k dispozici. Vzorky nanášejte vedle sebe v dostatečné vzdálenosti, jako poslední naneste kapku 1% roztoku kyseliny glutamové jako standardu. Chromatogram (Silufol či filtrační papír) vložte do vyšší úzké kádinky nebo vyvíjecí vany s vyvíjecí směsí ethanol:amoniak v poměru 8:2 a přikryjte sklíčkem. Asi po 2 hodinách vyjměte chromatogram z kádinky a detekujte. Postříkejte ho z rozprašovače 1% roztokem ninhydrinu, poté usušte a zahřívejte v sušárně nebo pomocí fénu (Obrázek 7).

Obrázek 6. Použité vzorky instantních polévek či jiných dochucovadel – masox, Knorr instantní brokolicová polévka, Nahrin vegeta (Gourmet-Mix), Nahrin instantní polévka (Klare Suppe vegetable).

Obrázek 7. Postup testování přítomnosti glutamátu v instantních polévkách. (A) Nanášení kapky vzorku s následným sušením pomocí fénu na startovací čáru vyznačenou na silufolové desce. (B) Silufol ve vyvíjecí vaně s vyvíjecí směsí ethanol:amoniak. (C) Po 2 hodinách vyvíjení a usušení je Silufol připraven k detekci pomocí 1% roztoku ninhydrinu. Vyhodnocení Přítomnost kyseliny glutamové (glutamátu) obsažené v instantních polévkách či dochucovadlech se projeví červenofialovým zbarvením po detekci ninhydrinem (Obrázek 8).

Obrázek 8. Chromatogram po detekci ninhydrinem. Vzorek 1 – kyselina L-glutamová, 2 – masox, 3 – Just vegeta, 4 – Just instantní polévka, 5 – Knorr instantní polévka

2. Sacharidy 2.1 Izolace bramborového škrobu Teoretický úvod Škrob (amylum) je zásobní polysacharid rostlin. Polysacharidy jsou vysokomolekulární látky složené z velkého počtu stejných nebo různých molekul monosacharidů, které se vzájemně váží glykosidickými vazbami v přímé nebo rozvětvené řetězce. Škrob je bílá, ve vodě málo rozpustná makromolekulární látka. Obecný vzorec škrobu je (C6H10O5)n. Je složený z dvou různých polysacharidů: amylosy a amylopektinu, tvořených několika tisíci až desetitisíci molekul glukózy. Struktury jsou uvedeny na Obrázku 9. Vlastnosti amylosy a amylopektinu jsou přehledně shrnuty v Tabulce 1. Škrob kromě glukosy obsahuje v malém množství lipidy, proteiny a 25–35 % vody. (A) (B)

Obrázek 9. Lineární a šroubovicová sekundární struktura amylosy (A) a rozvětvená struktura amylopektinu (B). Tabulka 1. Porovnání vlastností amylosy a amylopektinu.

Vlastnost Amylosa Amylopektin

Počet glukosových jednotek Obilné škroby 1000-2000 Bramborový škrob až 4500

50000-1000000

Molární hmotnost 105-10

6 10

7-10

8

Glykosidické vazby Převážně (1,4)-α-D- (1,4)-α-D- (1,6)-α-D-

Reakce s jódem Barva modrá Barva červenofialová

Náchylnost k retrodegradaci Velká Malá

Produkty působení β-amylasy Maltosa Maltosa β-hraniční dextrin

Produkty působení glukoamylasy D-glukosa D-glukosa

Tvar molekuly Lineární; šroubovicová sekundární struktura (na jednu otočku závitu

připadá 6 molekul glukosy)

Rozvětvený

Obsah fosforu (%) 0,03 0,2

Většina nativních škrobů obsahuje 20-25 % amylosy a 75-80 % amylopektinu. Existují speciálně

vyšlechtěné rostliny, které se liší obsahem škrobu, například vosková kukuřice či voskový ječmen mají obsah okolo 5 % amylosy, naopak amylokukuřice a amyloječmen obsahují okolo 60-70 % amylosy. Pro amylosu je rovněž charakteristická její rozpustnost v horké vodě. Díky spirálovitému řetězci poskytuje amylosa reakci s jódem. Téměř minimálně podléhá esterifikaci kyselinou fosforečnou. Po delší době stání ve vodném roztoku je amylosa vylučována ve formě bílého prášku retrodegradací. Dochází ke změnám struktury a reologických vlastností. Příčinou je tvorba intermolekulárních vodíkových vazeb přednostně u amylosy, velmi málo u amylopektinu. V případě škrobových disperzí

je tento děj označován jako retrodegradace a vede ke vzniku dvoufázového systému pevná látka-kapalina. Na rychost retrodegradace má vliv zejména obsah a polymerační stupeň přítomné amylosy, teplota, pH, obsah anorganických solí, povrchové napětí. Amylopektin tvoří v horké vodě stabilní vysoce viskózní koloidní roztoky až mazy, které s jódem poskytují červenofialovou reakci.

Průmyslová výroba škrobu vychází z izolace z plodin, které mají vysoký obsah škrobu. Škrob se přirozeně ukládá procesem asimilace v zásobních orgánech rostlin (semenech kukuřice, pšenice, rýže a dalších nebo v hlízách brambor) ve formě škrobových zrn. Zvláště bohaté na škrob jsou brambory, banány, obilniny a tapioka. Technologie izolace škrobu z jednotlivých surovin se liší v první fázi uvolňování škrobu z hmoty, další technologické postupy vykazují společné rysy. Ze škrobu se tedy vyrábí: produkty frakcionace škrobu (amylosa, amylopektin), termicky modifikované škroby (extrudované), dextriny, (chemicky) modifikované škroby, substituované škroby, hydrolyzáty škrobu. Co se týče využití škrobu, z celkové produkce se spotřebuje 50 % v rámci potravinářského průmyslu, zbytek se uplatňuje v dalších odvětvích průmyslu, a to 30 % v papírenství, 10 % chemický průmysl a zbylých 10 % ostatní odvětví. V České republice se tradičně vyrábí škrob bramborový (70 %) a pšeničný (30 %), a to v celkovém objemu 4 0000 – 5 0000 tun za rok. V potravinářském průmyslu mají největší využití hydrolyzáty škrobu, modifikované a substituované škroby. Modifikované škroby se uplatňují zejména v mlékárenském průmyslu k výrobě sušených mléčných výrobků a instantních směsí (vázání vody a zahušťování). Pekárenský průmysl využívá škrob jako vaznou látku do těst, zlepšovací přísadu do mouk pro zvýšení elasticity lepkové složky. Také se využívá pro výrobu sladidel. V papírenském průmyslu slouží pro klížení povrchu a výrobě vlnité lepenky. Další využití škrobu je v textilním průmyslu a při výrobě lepidel. V zemědělství se využívají termicky upravené škroby jako komponenty při výrobě krmiv. Pro škrobení prádla se používají především termicky modifikované škroby a dále i škroby oxidované. Velmi důležité je uplatnění maltodextrinů ve zdravotnictví, jako součást tekuté výživy. Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: nůž, struhadlo, škrabka na brambory, kádinky, lžička, gáza nebo cedník. Chemikálie a materiál: brambora, voda. Pracovní postup Bramboru oloupejte nožem či oškrábejte škrabkou a nastrouhejte na jemném struhadle do kádinky. K nastrouhané hmotě poté přidejte trochu vody a promíchejte. Směs přeceďte do čisté kádinky přes gázu či cedník. Filtrát nechte 10 minut stát a poté pozorujte. Vyhodnocení Na dně kádinky s filtrátem se usadí bílý prášek – škrob. Hlíza brambory obsahuje až 20 % škrobu. Škrob se skládá z amylosy a amylopektinu. 2.1 Pozorování škrobových zrn pod mikroskopem Teoretický úvod Škrob je nejdůležitější zásobní látkou vyšších rostlin. Slouží rostlině k uložení energie získané v průběhu procesu fotosyntézy. Škrobová zrna se tvoří v buňce v amyloplastech. Škrob se ukládá v zásobních orgánech rostlin ve formě zrn, která mají pro daný rostlinný druh charakteristický tvar. Podle počtu iniciálních krystalizačních jader se tvoří buď jednoduchá škrobová zrna (jedno krystalizační jádro), nebo složená škrobová zrna (několik krystalizačních jader) (Obrázek 10). U složených škrobových zrn počet elementárních zrn, která je tvoří, značně kolísá v rozpětí řádů jednotek až tisíců. U některých škrobových zrn můžeme pozorovat jednotlivé vrstvy, z nichž je škrobové zrno složeno - tato vrstevnatost je dána kolísajícím obsahem vody. Podle pozice původního krystalizačního centra pak můžeme rozeznat zrna koncentricky vrstevnatá a excentricky vrstevnatá. Vlivem pnutí se často uvnitř větších zrn vytváří rhexigenní dutina. V průběhu vývoje mohou škrobová zrna narůst do takových rozměrů, že dojde k protržení membrán amyloplastů a tím k uvolnění škrobových zrn do cytoplasmy. Škrobová zrna mají často pro daný rostlinný druh

charakteristický tvar. V Tabulce 2 je uvedena charakteristika škrobů různých plodin, a to včetně velikosti a průměru škrobových zrn.

Ve studené vodě škrobová zrna mírně bobtnají, přijímají zhruba 30 % vody (vztaženo na hmotnost škrobu). Se zvyšující se teplotou nabývá bobtnání na intenzitě. Do teploty 60°C, která je počáteční teplotou mazovatění, je celistvost škrobových zrn neporušena. Po dosažení této teploty dochází k porušování vodíkových můstků a ztrátě původní struktury, zrna prudce zvětšují svůj objem a uvolněná amylosa difunduje do roztoku. Dalším zvyšováním teploty pokračuje hydratace škrobových zrn, následně dochází ke ztrátě jejich integrace, praskání a roztrhávání. Proces, při kterém tento proces zasáhne všechna škrobová zrna v rozmezí teplot 10-15°C, se nazývá mazovatění škrobu. Tento děj je již irreverzibilní. Teplota mazovatění je pro různé škroby rozdílná, pohybuje se v rozmezí 55-70°C, přičemž nejnižší teplotu má žitný škrob. Při mazovatění škrobu jsou důležitými faktory pH prostředí, přítomnost solí, tuků a poměr škrob:voda. Škrobový maz je čirá viskózní kapalina. Při ochlazování vzniká škrobový gel, tvořen spojitou trojrozměrnou sítí, která je vysoce viskózní a tvoří pastu.

Obrázek 10. Struktura škrobového zrna kukuřice (a), pšenice (b), bramboru (c), rýže (d). Tabulka 2. Charakteristika škrobových zrn různých plodin.

Plodina Obsah škrobu (%) Velikost škrobových zrn

(µm)

Průměr škrobových zrn (µm)

Tvar zrn

Kukuřice 86-75 5-25 15 Polygonální

Pšenice 70-62 3-35 7, 20 Eliptický

Brambor 20 5-100 36 Oválný

Rýže 45 3-8 Nepravidelný

Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: nůž, preparační jehla, podložní a krycí sklíčka, žiletka, kapátko. Chemikálie a materiál: brambor, obilky ovsa či pšenice, zrnka rýže, kukuřice, mouka, pudinkový prášek, voda, Lugolův roztok (5 g jodu a 10 g jodidu draselného v 100 ml destilované vody, uchováme v tmavé lahvičce). Přístroje: mikroskop. Pracovní postup Rozřízněte hlízu bramboru a pomocí preparační jehly seškrábněte trochu šťávy z řezné plochy čerstvě rozřezané hlízy bramboru a rozetřete ji na podložní sklíčko. Přikryjte krycím sklíčkem. Tvar škrobových zrn pozorujte pod mikroskopem. Preparát pro zvýraznění škrobových zrn probarvěte Lugolovým roztokem tak, že na jednu stranu krycího sklíčka kápnete malou kapku barviva a na druhé straně přiloženým filtračním papírem odsáváte přebytečnou vodu. Tímto způsobem dosáhnete plynulejšího probarvení škrobových zrn. Na jiná podložní sklíčka naneste velmi malá množství pšeničného, rýžového nebo kukuřičného škrobu. Lze také použít trochu mouky či pudinkového prášku rozmíchaného ve vodě k pozorování škrobových zrn. V případě použití obilek ovsa, rýže či jiné obiloviny rozpulte obilku a preparační

jehlou seškrábněte trochu endospermu (vnitřní část obilky). Ve všech případech pozorujte při malém zvětšení. Zakreslete nebo vyfotografujte jednotlivé tvary zrn (Obrázek 11). Vyhodnocení

Obrázek 11. Škrobová zrna lilku bramboru, kukuřice, rýže, pšenice, mouky a pudinkového prášku. Zvětšeno 20x.

3. Stanovení a důkazy vitamínů Teoretický úvod Vitamíny jsou nízkomolekulární organické látky, které společně s cukry, tuky a bílkovinami jsou základní složkou lidské potravy. V lidském těle mají nezastupitelnou funkci jako součást biokatalyzátorů. Výraz vitamin pochází přibližně z roku 1911, kdy polský biochemik Kazimierz Funk objevil vitamin B1 v otrubách rýže. Funk navrhl název vitamín podle latinského vital a amine = „životně důležité aminy“. Ačkoli podle dnešních poznatků nejde o aminy, název se ujal. Tento termín byl později rozšířen na všechny podobné látky (vitamíny A, B, C, D, E, K a pseudovitamíny). Historie objevení vitamínů sahá o několik tisíciletí zpět, ovšem skutečné vědecké studium započalo až s rozvojem chemie v 19. a na začátku 20. století a vyvrcholilo poznáním jednotlivých přídatných potravinových faktorů, které byly pojmenovány podle abecedy v tom pořadí, v jakém byly objeveny. Ovšem projevy nedostatku těchto látek byly známy mnohem dříve. Šeroslepost, porucha vidění za šera, způsobovaná nedostatkem vitaminu A, byla popsána už ve starém Egyptě v roce 1600 př. n. l., ale zkušenosti měli i staří Číňané, kteří ji léčili podáváním jater zvířat, popř. inhalováním par vystupujících z vařících se jater. Nemoc zvaná kurděje byla známá již několik tisíc před naším letopočtem. Trpěli jí hlavně námořníci při dlouhých plavbách, kdy byl problém obstarat pro posádku čerstvé potraviny. Zánět dásní, vypadávání zubů a zvýšená krvácivost jsou typickými projevy nedostatku vitamínu C. Tento syndrom byl popsán již v roce 450 př. n. l. filosofem Aristotelem.

Podle farmakologického slovníku představují vitamíny esenciální složku potravy, která v organismu plní katalytické funkce. Denní potřeba vitamínů, s výjimkou vitamínu C, je v rozmezí od několika mikrogramů do několika miligramů. Existuje 13 základních typů vitamínů. Lidský organismus

si, až na některé výjimky, nedokáže vitamíny sám vyrobit, a proto je musí získávat prostřednictvím stravy. Z chemického hlediska patří vitaminy k různým druhům sloučenin, mezi nimiž není žádná chemická příbuznost. Tím zaniká možnost jejich klasifikace podle strukturního hlediska. Začalo se proto používat třídění podle některých fyzikálních vlastností, především podle rozpustnosti. Podle ní dělíme vitaminy na rozpustné ve vodě (hydrofilní) a rozpustné v tucích (lipofilní). Kromě rozpustnosti se však tyto dvě skupiny liší ještě v dalších základních biologických vlastnostech. Vitamíny rozpustné v tucích mohou být skladovány. Jejich nadbytečný příjem může proto vést k hypervitaminózám a zejména v případě vitamínu A a vitamínu D vyvolat vážné poruchy organismu. Množství potřebné pro optimální funkci lidského organismu se pro jednotlivé vitamíny liší. Jejich rozdílné role v metabolismu mají vliv na to, ke které fyzikální veličině se vztahuje jejich denní doporučená dávka (DDD). U vitamínů B1, B2, B3 je DDD vztažena na denní spotřebu kalorií, u vitamínu B6 na denní spotřebu gramů bílkovin obsažených ve stravě, v případě kyseliny pantothenové a vitaminu K je DDD vztažena k hmotnosti člověka.

Než byla objasněna struktura vitamínů, bylo zavedeno jejich označování písmeny abecedy, přičemž vitamíny se stejnými nebo podobnými fyziologickými vlastnostmi byly ještě odlišovány číselnými indexy. Později byly zavedeny triviální názvy, často i několik různých pro jednu a tutéž látku. Řada z nich se už nepoužívá, řada z nich se ale uchytila a bývá užívána častěji, než abecední označování. Termín “vitamín” se dříve používal pro řadu chemických látek, které nesplňovaly kritéria předepsaná pro vitaminy. U řady sloučenin dříve popisovaných jako vitamíny (např. vitamin G, M, T) se zjistila aktivita již známého vitamínu (např. vitamín G je identický s vitamínem B2 (riboflavinem), vitamín M, Bc, T je identický s kyselinou listovou). Na konci minulého století bylo v literatuře uváděno, že existuje 13 různých vitamínů: A, C, D, E, K a 8 různých vitaminů skupiny B. Další výzkumy přinesly třináct vitamínů skupiny B, od vitaminu B12 a niacinu až 6 dalších se forem, které působí rozdílně. Téměř z 500 karotenů je 60 uznáno jako předstupně vitamínu A, zhruba 110 karotenů je považováno za účinnější než samotný vitamin. Od vitamínu C a D se vyskytují čtyři různé varianty a dvanáct od tokoferolu.

Vitamíny jsou organické sloučeniny rozmanitých struktur, avšak s charakteristickou strukturální specifitou. Sebemenší změna ve struktuře molekuly způsobí změnu jejich funkce i negativním směrem. V přírodě se vyskytuje řada látek, které snižují nebo zcela ruší účinek vitamínů. Tyto látky se nazývají antivitamíny a mohou být připraveny i synteticky. Podle způsobu účinku se tyto látky dělí do tří skupin: a) enzymy rozkládající vitamíny - askorbátoxidasa, peroxidasa, b) látky tvořící s vitamíny nevyužitelné komplexy - avidin, c) látky strukturně podobné vitamínům, které mohou zaujímat místo vitamínů v biologických systémech (ovšem bez plnění jejich úlohy) tzv. kompetitivní inhibitory - sulfonamidy, antibiotika, dikumarol.

V potravinách se vitamíny vyskytují v množství µg·kg-1 po stovky až tisíce mg·kg-1 dle druhu vitamínu, ročního období, druhu potraviny a způsobu jejího zpracování. Vitamíny se vyskytují jak volné, tak i vázané zejména na bílkoviny a sacharidy. Vitamíny jsou labilní složkou potravin, zejména vitamíny rozpustné ve vodě dochází ke ztrátám během technologického i kulinárního zpracování výluhem, u vitamínů rozpustných v tucích pak jejich oxidací. Nedostatek některého vitamínu se projeví tzv. hypovitaminózou, avšak je-li vitamín přechodně nedostatečně dodáván, hrozí tzv. avitaminóza projevující se poruchami některých biochemických procesů. Většina příznaků avitaminózy po dodání chybějícího vitamínu vymizí, v případě dlouhodobé avitaminózy hrozí nenávratné změny organismu až smrt. Příčinou nedostatečné resorpce vitamínů bývají většinou onemocnění zažívacího ústrojí. Naopak, při nadbytečném příjmu vitamínů hrozí tzv. hypervitaminóza, která rovněž vede k závažným poruchám biochemických procesů až smrti. V Tabulce 3 a 4 jsou shrnuty doporučené denní dávky, zdroje a funkce jak vitamínů rozpustných v tucích a ve vodě. Rovněž jsou uvedeny následky hypervitaminózy a avitaminózy. Obrázky 12 a 13 zobrazují vybrané strukturní vzorce vitaminů.

Tabulka 3. Charakteristika vitamínů rozpustných v tucích. Vitamín DDD Zdroj Funkce Hypervitaminóza Avitaminóza

Vitamín A (retinol)

0,8 mg

Mléčný tuk, vaječný žloutek, játra, rybí olej, v barevné zelenině jako provitamin

(mrkev, brokolice, špenát)

Nezbytný pro tvorbu barviv na

sítnici, podílí se na syntéze bílkovin v

kůži a sliznicích

Praskání a krvácení rtů,

podrážděnost, poruchy vývoje

plodu v těhotenství

Šeroslepost, rohovatění

kůže a sliznic, poškození skloviny

Vitamín D (kalciferol)

5 µg

Rybí tuk, kvasnice, vejce,

mléko; syntéza v kůži působením UV

záření

Vstřebávání vápníku a fosforu

v těle

Zvápenatění měkkých tkání, narušení růstu,

poškození ledvin

Křivice, odvápňování a měknutí kostí

Vitamín E (tokoferol)

12 mg

Rostlinné oleje, vlašské ořechy, obilné klíčky,

listová zelenina

Antioxidant, zvyšuje plodnost, podporuje činnost

nervového systému

Žaludeční potíže, průjmy, zhoršené

vstřebávání vitamínu K → snížení krevní

srážlivosti

Porucha funkce

vaječníků a varlat

Vitamín K1 (antihemorrhagický,

fylochinon) 75 µg

Listová zelenina, kvasnice; tvorba mikroorganismy

ve střevě

Důležitý pro srážení krve,

mineralizaci kostí

Iniciace hemolytické

anémie, hyperbilirubinémie

Zvýšená krvácivost, krvácení do

tělních dutin

(a) (b)

(c) (d)

Obrázek 12. Strukturní vzorce vitamínů rozpustných v tucích. (a) vitamín A (retinol), (b) vitamín D

(kalciferol), (c) vitamín E (α-tokoferol), (d) vitamín K1.

Tabulka 4. Charakteristika vitamínů rozpustných ve vodě. Vitamín DDD Zdroj Funkce Hypervitaminóza Avitaminóza

B1 (thiamin, aneurin)

1,1 mg

Obiloviny (klíčky), kvasnice, játra, srdce, ledviny, libové vepřové

maso

Ovlivňuje metabolismus

cukrů v CNS a ve svalech

Zvýšená únava, křeče svalstva, zánět nervů až

nemoc beri-beri

B2 (riboflavin, laktoflavin)

1,4 mg

Mléko, listová zelenina,

kvasnice, játra, srdce a ledviny

Součást enzymů v dýchacím řetězci → nezbytný pro

základní buněčný metabolismus

Malinový jazyk, bolavé ústní

koutky, poruchy ústní

sliznice, světloplachost

B3 (kyselina nikotinová, vitamín

PP, niacin) 16 mg

Játra, ledviny, libové maso,

ryby, kvasnice, houby

Syntéza NAD+ a

NADP+

→ koenzymy

dehydrogenas, snižuje množství

cholesterolu v krvi

Zánět nervů, duševní

poruchy, záněty sliznic a

kůže, těžké průjmy

B5 (kyselina pantothenová)

6 mg

Játra, kvasnice, hrách, maso, ryby, mléko,

vejce

Aktivní forma k. pantothenové je

koenzym A → metabolismus

sacharidů, lipidů

Pálení chodidel,

poruchy růstu, dermatologické

poruchy

B6 (pyridoxin) 1,4 mg Mléko, kvasnice,

obilné klíčky, maso, luštěniny

Podporuje účinek vitamínu B1 a B2

Pomalé hojení zánětů,

zhoršená regenerace

sliznic

B9 (kyselina listová, k. folová)

0,2 mg Listová zelenina, kvasnice, játra

Ovlivňuje metabolismus aminokyselin a

nukleových kyselin, klíčová

pro tvorbu červených krvinek

Chudokrevnost

B12 (kobalamin) 2,5 µg Játra, maso,

ústřice; tvorba činností bakterií

Klíčový pro krvetvorbu

Perniciosní

anémie

C (kyselina askorbová)

80 mg

Šípek, syrové ovoce a zelenina

Metabolismus aminokyselin, udržuje dobrý stav vaziva a chrupavek,

podporuje tvorbu protilátek

Únava, snížená odolnost proti

nakažlivým chorobám, krvácení,

vypadávání zubů, smrtelné

onemocnění kurděje

(skorbut)

H (biotin, B7) 50 µg Kvasnice, játra,

ledviny

Podporuje růst a dělení všech

živočišných buněk

Záněty kůže, papil jazyka,

únava, deprese,

svalové bolesti, nechutenství

(a) (b)

(c) (d)

Obrázek 13. Strukturní vzorce vitamínů rozpustných ve vodě uplatňujících se jako prekursory

koenzymů. (a) vitamín B2 (riboflavin), (b) vitamín B3 (niacin), (c) vitamín B5 (panthotenová kyselina),

(d) vitamín B6 (pyridoxin).

3.1 Kvantitativní důkaz vitamínů Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: třecí miska s tloučkem, filtrační aparatura, kádinky, zkumavky, stojánek na zkumavky, odměrná baňka, struhadlo, pH papírek. Chemikálie a materiál: benzín, konc. H2SO4, Fehlingovo činidlo (vznikne smícháním činidla I a II), 30% H2O2, 5 % roztok dusičnanu stříbrného (AgNO3, molární hmotnost 169,87 g/mol), 12% HCl, 0,02 M manganistan draselný (KMnO4, molární hmotnost 158,034 g/mol), anilín, nasycený roztok chloridu antimonitého (SbCl3, molární hmotnost 228,11 g/mol) v chloroformu, amoniak (vodný roztok 25%), mrkev, pomeranč, Celaskon, Spofavit (vitamínový doplněk stravy z lékárny), rybí tuk, šípky, kvasnice. Fehlingovo činidlo I (4 g síranu měďnatého pentahydrátu CuSO4.5H2O rozpustíme v 50 ml vody a doplníme na 100 ml) Fehlingovo činidlo II (22,9 g vinanu draselnosodného KNaC4H4O6 a 15 g hydroxidu sodného NaOH rozpustíme v 75 ml vody a doplníme na 100 ml) Činidlo I (50 ml 5,8% NaHCO3 a 50 ml 4% NaOH). Činidlo II (kyselina p-diazobenzensulfanová, 0,9 g kyseliny sulfanilové rozpustíme v 9 ml konc. HCl a doplníme vodou do 100 ml). Potom 1,5 ml tohoto roztoku nalejeme do 50 ml odměrné baňky stojící v ledu a přidáme 1,5 ml čerstvě připraveného 5% roztoku NaNO3. Dále během 1 minuty přidáme postupně za chlazení vodu po značku 50 ml. Ponecháme ještě 15 minut v ledu za občasného protřepání.

Pracovní postup 1. V mrkvi, Spofavitu a šípku dokažte vitamín A: A) Dužninu šípku a kousek mrkve najemno nastrouhejte a dejte zvlášť do dvou zkumavek a do třetí

nasypte trochu prášku Spofavitu a přilijte 3 ml benzínu. Důkladně protřepejte a nechejte ustát 3 minuty. Potom benzín slijte na hodinové sklíčko a ponechejte odpařit. Pak na sklíčko přikápněte několik kapek kyseliny sírové.

B) Asi 10 kapek rybího oleje přidejte k 3 ml nasyceného chloroformovému roztoku chloridu antimonitého.

2. Důkaz vitamínu C: A) Důkaz v Celaskonu, Spofavitu. B) Důkaz v přírodním materiálu (pomerančová šťáva). Nejprve musíte kyselinu L-askorbovou vázanou

v askorbigenu uvolnit např. působením kyseliny chlorovodíkové. a) 3 ml dusičnanu stříbrného a několik kapek amoniaku + 2 ml roztoku vitamínu C – zahřejte – vzniká

černá sraženina. b) 2 ml Fehlingova činidla + 2 ml roztoku vit. C – zahřejte – Fehlingův roztok se odbarvuje, vylučuje se

červený oxid měďný. c) 1 g šípků nebo citrónu rozdrtíte v misce s pískem a přidejte po částech 25 ml 12% HCl. Zfiltrujte

a takto získaný filtrát rozdělte na dvě části. K první části filtrátu ve zkumavce přidejte stejný objem 30% H2O2. Povařte asi 3 minuty a přidejte po kapkách 0,02 M roztok manganistanu draselného. Současně k druhé části filtrátu přidávejte jen 0,02 M roztok manganistanu draselného. Sledujte obě zkumavky a pozorujte odbarvení roztoků KMnO4 v obou zkumavkách. Vysvětlete rozdílné chování.

3. Důkaz vitaminu B1 (thiamin): Sušené pivovarské kvasnice rozmíchejte s vodou a nechejte stát 3 hodiny za občasného promíchání (50 ml vody na 5 g kvasnic). Roztok zfiltrujte a filtrát odpařte do sucha. Před reakcí zřeďte vodou (10 ml) a okyselte 12% HCl do pH 3 (použijte pH papírky). Do zkumavky dejte 1 ml činidla I a 10 kapek činidla II. Přidejte 20 kapek extraktu z kvasnic. Je-li přítomen B1, vznikne žluté zbarvení, které přechází během 2-3 minut v růžové.

4. V roztoku Spofavitu a Infadinu (rybím tuku) dokažte vitamín D: Do zkumavek se Spofavitem či rybím tukem přidejte 5 ml koncentrované kyseliny sírové a povařte 30-40 sekund. Žlutá barva se mění v rudou. Vyhodnocení 1A) Karoten, který se v benzínu rozpustil, se po odpaření benzínu usadí v podobě kruhů. Po přidání kyseliny sírové se zbarví modře – fialově až hnědě. 1B) Modré zbarvení roztoku dokazuje přítomnost vitamínu A. Po zmizení modrého zbarvení se roztok zbarví červeně, což dokazuje přítomnost vitamínu D. 2A,B) Kyselina L-askorbová má silné redukční účinky, ztrátou vodíku se dehydrogenuje na kyselinu L-dehydroaskorbovou. Pozn. Reakce není specifická, dává ji řada jiných látek, např. fruktosa, laktosa, pepsin aj. 3) Thiamin poskytuje při reakci s diazotovanou kyselinou sulfanilovou sloučeninu, která je růžově zbarvena vzniklým azobarvivem. 3.2 Ověření množství vitamínu C v ovoci, zelenině a nápojích Teoretický úvod Vitamín C řadíme mezi vitamíny rozpustné ve vodě. Nejčastěji se setkáváme s označením kyselina L-askorbová. Jedná se o γ-lakton kyseliny 2-oxo-L-gulonové, jehož biosyntéza probíhá u řady organismů, avšak s výjimkou člověka, morčete, primátů, indického netopýra, některých ptáků a bezobratlých (Obrázek 14).

Obrázek 14. Schéma biosyntézy kyseliny askorbové u obratlovců a rostlin.

Kyselina askorbová má čtyři možné stereoisomery (asymetrický uhlík C-4 a C-5), z nichž aktivitu

vitamínu C vykazuje pouze kyselina L-askorbová (γ-lakton L-threo-2-hexenonové kyseliny, dříve označované cerit-aminová, 2-keto-L-gulonová, L-xylo-2-hexulosonová a později L-xylo-askorbová kyselina). Její isomer D-askorbová kyselina a druhý pár enantiomerů, tj. L- a D-isoaskorbová (nazývané též L- a D- erythorbová kyselina a dříve označované jako L- a D-arabino-askorbová kyselina) aktivitu vitamínu C nevykazují. Pod názvem vitamín C je nejen označována kyselina L-askorbová, ale také její celý reversibilní redoxní systém zahrnující produkty její oxidace – L-askorbylradikál čili kyselinu L-monodehydroaskorbovou a také produkt dvouelektronové oxidace kyselinu L-dehydroaskorbovou. Ve fyziologickém prostředí se chovají kyselina askorbová a askorbylradikál jako anionty. Tvoří bezbarvé krystaly dobře rozpustné ve vodě (1 g na 3 ml vody), špatně rozpustné v alkoholu (1 g na 50 ml) a ostatních organických rozpouštědlech. Ve vodném prostředí se chová jako středně silná kyselina s disociačními konstantami pK1 = 4,17 a pK2 = 11,57.

Vitamín C je nejznámější a nejrozšířenější ze všech vitamínů, jedná se o nejčastěji používaný potravinový doplněk. Průmyslově se vyrábí z D-glukosy, která je katalytickou dehydrogenací převedena na D-sorbitol. Poté následuje mikrobiální oxidace díky Acetobacter suboxidans, která vede k produkci L-sorbosy. L-sorbosa v reakci s acetonem v prostředí kyseliny sírové poskytuje 2,3:4,6-bis-(O-isopropyliden)-α-L-sorbofuranosu. Oxidací tohoto produktu pomocí manganistanu draselného v alkalickém prostředí se získá kyselina diaceton-2-oxo-L-gulonová. Po hydrolýze chránících skupin (ketalů) vzniká kyselina L-askorbová.

Obsah vitamínu C v potravinách je velmi proměnlivý, závisí na geografických podmínkách, skladování, tepelné úpravě a na mnoha dalších faktorech. Například vařením se ničí až 60 % vitamínu C, sušením až 50 %, šetrnější je dušení v páře. Velké ztráty způsobuje tepelná konzervace. Nejšetrnější k vitamínu C je mražení. Nejvyšší obsah vitamínu C má čerstvé ovoce a zelenina. Absolutně nejvyšší koncentrace byla nalezena v plodech barbadoské třešně aceroly lysé (Malpighia punicifolia). Z jednoho hektaru se sklidí průměrně 25 tun ovoce, ze kterého se získá asi 2,5 t šťávy a z ní asi 500 kg askorbové kyseliny (dehydroaskorbové). Nejvíce vitamínu C obsahují ještě nezralé zelené plody. Bohatým zdrojem vitamínu C jsou šípky (8000 mg/kg), černý rybíz (1360 mg/kg), naťová petržel (1369 mg/kg), avšak vzhledem k příležitostné konzumaci malého množství nejsou příliš významné pro pokrytí denní potřeby. Větší význam mají zdroje s průměrným obsahem, které se

konzumují pravidelně a ve větším množství, například brambory (rané 232 mg/kg, podzimní X-XII 126 mg/kg, IV-VII 65 mg/kg). Co se týče potravin živočišného původu, větší množství vitamínu C obsahují játra (hovězí 300 mg/kg) a čerstvá krev. Čerstvě nadojené mléko je také bohatým zdrojem vitamínu C, ale vlivem světla dochází k jeho oxidaci.

Co se týče doporučeného denního dávkování vitamínu C, k prevenci proti kurdějím se doporučuje přijímat 10-12 mg denně. Avšak pro správné fungování organismu je tato dávka nedostačující. Podle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví České republiky je průměrná denní potřeba 60 mg. Pro stanovení doporučených dávek jsou podle Carra a Freie (The American Journal of Clinical Nutrition, 1999) vhodnějším podkladem výsledky epidemiologických studií (ověřování spotřeby jednotlivých potravin v závislosti na stravovacích zvyklostech, ročním období atd.), protože odrážejí skutečný příjem vitamínu C v potravě, kdežto klinické studie podávají hodnotné informace o možnostech doplňování preparáty obsahujícími vitamín C. Při podání 100 mg kyseliny askorbové za den stoupá její koncentrace v plazmě téměř lineárně až do hodnoty okolo 50 μmol/l, při které dochází k překročení ledvinového prahu a začne stoupat vylučování nemetabolizované kyseliny askorbové v moči. Při podání vitamínu C v dávkách vyšších než 200 mg se vylučování kyseliny askorbové močí rapidně zvyšuje a doplňování se tak míjí účinkem. Klinické příznaky nedostatku se projeví, když klesne celková zásoba v těle pod 300 mg. Dlouhodobý nedostatek vitamínu C vyvolává u dětí i dospělých kurděje. Pokud člověk po dobu 4-5 měsíců trvale postrádá vitamín C v potravě, dochází ke smrti. V případě konzumace nadbytečného množství dochází ke gastrointestinálním potížím. Množství vitamínu C, které člověk snese, lze stanovit tzv. tolerancí střeva – projevem dyspeptických potíží. Horní hranice příjmu vitamínu C byla pro děti do 3 let stanovena ve výši 400 mg na den, pro dospělé 2000 mg na den. V poslední době se začíná užívat vitamín C s prodlouženým účinkem, resp. s pomalou absorpcí.

Hlavní funkcí vitamínu C v lidském organismu je účast v oxidoredukčních dějích. Kyselina askorbová i její isomery a deriváty mohou reagovat s volnými radikály, které způsobují oxidaci lipidů a dalších oxidovatelných složek potravin a působí jako antioxidanty. Navíc v kombinaci s tokoferoly působí mnohem účinněji. Kyselina askorbová se podílí rovněž na hydroxylaci prolinu, aminokyseliny, která je hlavní složkou kolagenu nezbytného pojiva v kůži, kostech, kloubech, šlachách a chrupavkách. Pokud není v těle dostatek vitamínu C, nedochází k hydroxylaci prolinu a špatně se tvoří kolagen. Je známo, že železo obsažené v ovoci, zelenině a obilninách se v těle poměrně špatně vstřebává. Vitamín C zlepšuje vstřebávání železa až o 85%, při jeho nedostatku se doporučuje zvýšit příjem vitamínu C díky namísto zvýšení spotřeby železa, což může být i rizikové. Další funkcí vitamínu C je napomáhání syntézy karnitinu z aminokyseliny lysinu. Karnitin transportuje mastné kyseliny do mitochondrií, kde dochází k jejich degradaci. Bylo popsáno, že konzumace dostatečného množství vitamínu C chrání před srdečními chorobami daleko účinněji než udržování nízké hladiny cholesterolu dietou.

Vitamín C je rovněž bohatě využíván v potravinářství, kde se řadí mezi tzv. přídatné látky (aditiva), konkrétně do skupiny antioxidantů. Označuje se jako E300, E301 značí askorbát sodný, E304 estery kyseliny askorbové askorbylpalmitát a askorbylstearát. Díky svým vlastnostem – vitamín, antioxidant, chelatační činidlo, má uplatnění v konzervárenství, kvasné technologii a technologii masa, tuků a cereálií. Hydrofilní sůl askorbátu sodného a lipofilní kyselina 6-palmitoyl-L-askorbová inhibují vznik nitrosaminů v nakládaném mase a masných výrobcích. Hojně se přidává do ovocných džusů, konzervovanému či mraženému ovoci, aby nedošlo během skladování a zpracování ke změnám aromat. V množství 20-30 mg/kg se přidává do piva pro zabránění tvorby chladových a oxidačních zákalů, také nežádoucích změn chuti a aromat. Kyselina askorbová je využívána rovněž i při výrobě vína, kdy umožňuje snížení použití oxidu siřičitého k síření. V množství 10 – 100 mg/kg se používá v pekařství jako prostředek zlepšující pekařské vlastnosti mouky. Askorbylpalmitát se používá v množství 0,006 – 0,04 % jako antioxidant tuků.

3.2.1 Důkaz vitamínu C v ovoci a zelenině Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: třecí miska s tloučkem, filtrační aparatura, nálevka, zkumavky. Chemikálie a materiál: 5% roztok chloridu železitého FeCl3, 5% roztok hexakyanoželezitanu draselného K3[Fe(CN)6], tableta Celaskonu, vzorek ovoce či zeleniny (jablko, citron, cibule, mrkev, …). Pracovní postup Rozetřete asi 5 g vzorku s 5 ml destilované vody v třecí misce a směs přefiltrujte do čisté zkumavky. K filtrátu přidejte 2 ml roztoku chloridu železitého a potom stejný objem roztoku hexakyanoželezitanu draselného. Zaznamenejte barevné změny ve zkumavce a porovnejte barevné výsledky u použitých vzorků ovoce a zeleniny s kontrolním vzorkem (Celaskonem). Popište chemický průběh reakce. Vyhodnocení Po přidání obou směsí roztoků k vitamínu C (Obrázek 15) se směs zbarví temně zeleně. Časem přechází zbarvení do modrozelené (Berlínská modř). Barevné změny jsou důsledkem přítomnosti vitamínu C jako redukčního činidla. FeCl3 FeCl2

FeCl2 + K3[Fe(CN)6] FeII3[FeIII(CN)6]

-III 2 + 3K+ K[FeIIIFeII(CN)6] (zelená barva) (Berlínská modř)

Obrázek 15. Důkaz vitamínu C. (A) Rozetřené vzorky jablka, nektarinky, kiwi, banánu a mrkve v třecí misce. (B) Vzorky po filtraci do zkumavky + zkumavka s tabletou Celaskonu jako vit. C. (C) Filtrát s 2 ml roztoku chloridu železitého. (D) Vzorky po přídavku 2 ml roztoku hexakyanoželezitanu draselného, kdy vzniká modrozelená Berlínská modř.

Vitamín C

3.2.2 Množství vitamínu C v nápojích V potravinářském průmyslu se kyselina askorbová (vitamín C) používá k omezení oxidace v potravinách. Snižuje oxidaci tuků, přidává se proto zejména do uzenin, ve kterých pomáhá udržovat červenou barvu. Množství vitamínu C lze určit titrací po odečtení z kalibrační křivky standardu. Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: titrační baňka, byreta, pipeta. Chemikálie a materiál: tablety Celaskonu, 0,1% roztok vitaminu C (pomerančový džus, limonáda), 6 M kyselina octová, 1% roztok škrobu, roztok jodu I2 v jodidu draselném KI (1% KI, 0,125% I2). Pracovní postup Nejprve si připravte kalibrační křivku pomocí titrace standardu Celaskonu: do 125 ml titrační baňky odpipetujte 25 ml standardu o známé koncentraci, přidejte 2 ml 6 M kyseliny octové a 3 ml 1% škrobu. Pomocí byrety titrujte roztokem jodu v KI až do modrého zbarvení a zaznamenejte spotřebu. Zakreslete titrační křivku. Pro vlastní titraci pro určení kvantitativního množství vitamínu C v nápoji použijte přefiltrovaný džus, limonádu či šťávu z kompotu. Použijte postup stejný jako pro titraci Celaskonu, podle spotřeby titračního roztoku jodu v KI odečítejte příslušnou koncentraci vitamínu C. Vyhodnocení Pro titraci se používá roztok jodu v KI a detekuje se pomocí reakce jodu se škrobem (do modrého zbarvení v bodě ekvivalence). Kyselina askorbová v nápojích reaguje kvantitativně s jodem dle rovnice:

Kyselina askorbová Kyselina dehydroaskorbová 3.2.3 Stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové Titrační stanovení kyseliny L-askorbové je založeno na její snadné oxidovatelnosti za vzniku kyseliny L-dehydroaskorbové. Jako odměrné činidlo se používá roztok sodné soli 2,6-dichlorfenolindofenolu, která je v neutrálním a alkalickém prostředí modrá, v kyselém prostředí růžová. Redukcí kyselinou L-askorbovou přechází modře zbarvená sůl na bezbarvou leukoformu. Ekvivalenční bod je určen vznikem růžového zbarvení kyselého titrovaného roztoku (kyselina L-askorbová je rozpuštěna v kyselině chlorovodíkové). Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: Erlenmayerova baňka, titrační baňka, byreta, pipeta, stojan. Chemikálie a materiál: kyselina L-askorbová (celaskon), sodná sůl 2,6-dichlorfenolindofenolu. Pracovní postup Do Erlenmayerovy baňky napipetujte 2 ml roztoku kyseliny L-askorbové (celaskon). Titrujte odměrným činidlem – modrým roztokem sodné soli 2,6-dichlorfenolindofenolu do růžového zbarvení (Obrázek 16), titraci proveďte 3x a vypočítejte průměrnou spotřebu.

Vyhodnocení Dle vzorce vypočítejte koncentraci kyseliny L-askorbové a hodnoty zaznamenejte do tabulky 5.

L-askorbová kyselina (mg/l) = Mr . Cčinidlo . Včinidlo / Vtitrovaný

Mr – relativní molekulová hmotnost kyseliny L-askorbové (176,1 g/mol) Včinidlo – objem 2,6-dichlorfenolindofenolu potřebný pro titraci vzorku v ml Vtitrovaný – objem kyseliny L-askorbové, který byl titrován v ml Tabulka 5:

Průměrná spotřeba činidla v ml (ze tří titrací)

mg/l kyseliny L-askorbové

mmol/l kyseliny L-askorbové

Obrázek 16. Průběh stanovení koncentrace kyseliny L-askorbové. (A) Sestavená titrační aparatura obsahující stojan, svorky, byretu naplněnou titračním roztokem a titrační baňku. (B) Titrační činidlo sodná sůl 2,6- dichlorfenolindofenolu poskytující modře zbarvený roztok. (C) Roztok celaskonu (kyselina L-askorbová) v titrační baňce před přídavkem 2,6- dichlorfenolindofenolu. (D) Roztok celaskonu po přídavku titračního činidla – ekvivalenční bod – růžové zbarvení roztoku. 3.2.4 Stanovení koncentrace vitamínu C v ovocné šťávě Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: Erlenmayerova baňka, titrační baňka, byreta, pipeta. Chemikálie a materiál: pomerančový džus od různých výrobců, sodná sůl 2,6-dichlorfenolindofenolu.

Pracovní postup Do Erlenmayerovy baňky odpipetujte 2 ml ovocné šťávy (10x zředěné destilovanou vodou) a titrujte odměrným činidlem - roztokem sodné soli 2,6-dichlorfenolindofenolu do růžového zbarvení – ekvivalenční bod. Vyhodnocení Ze spotřeby odměrného činidla vypočítejte koncentraci vitamínu C ve zředěné pomerančové šťávě (mg/l). Výsledek vynásobte 10x (ředění) a zapište do tabulky 6. Výsledek zkuste porovnat s údaji poskytnutými různými výrobci na obalech (Tabulka 7). Tabulka 6:

Spotřeba odměrného činidla (ml)

Koncentrace kyseliny L-askorbové ve zředěné šťávě (mg/ml)

Koncentrace kyseliny L-askorbové v původní šťávě (mg/ml)

Údaj výrobce (mg/ml)

Tabulka 7:

Výrobce Koncentrace vitamínu C

Relax 100% jablko fresh juice 30 mg na 100 ml

Hello 100% pomeranč 40 mg na 100 ml

Zelený čaj 158 mg na 100 ml

Černý čaj 102 mg na 100 ml

Červené víno 220 mg na 100 ml

4. Enzymy v potravinách Enzymy jsou velmi citlivé živiny, které zodpovídají za provádění prakticky všech metabolických funkcí. V našem těle máme kolem 3 000 unikátních enzymů, které se podílí na více než 7 000 enzymatických reakcích. Enzymy jsou potřebné pro všechny chemické reakce, které se uskutečňují v lidském těle. Žádné minerály, vitamíny ani hormony nevykonají práci bez enzymů. Naše těla, všechny naše orgány, tkáně a buňky fungují díky enzymům. Bez enzymů bychom tedy přestali fungovat.

Bohužel průměrná strava je téměř zcela bez účinných enzymů. Zpracované a vařená jídla často zcela zničilo obsah enzymů. Máme-li jakékoli zdravotní potíže, měli bychom používat více enzymů ve stravě, resp. v ovoci a zelenině jako je ananas obsahující bromelain, papája obsahující papain, včelí pyl nebo fermentovaná zelenina jako kysané zelí. Mezi ostatní na enzymy bohaté potraviny patří melouny, mango, kiwi, hroznové víno, avokádo, syrový (nepasterizovaný) med, kefír, listová zelenina, syrové ovocné a zeleninové šťávy a kokosová voda. Strava bohatá na enzymy dá vašemu tělu energii, posílí imunitní systém a léčebné procesy těla. 4.1 Stanovení proteasové aktivity v ovoci a zelenině Teoretický úvod Proteasy (proteinasy) představují skupinu enzymů, které štěpí proteiny (bílkoviny) na peptidy a oligopeptidy na aminokyseliny. Patří do třídy hydrolas, hydrolyzují tedy peptidové vazby aminokyselin, pomocí kterých aminokyseliny drží pohromadě. Termodynamická rovnováha je posunuta ve směru rozkladu peptidové vazby, enzymy, které tento rozklad katalyzují, nepotřebují dodávku energie. Vzhledem k množství různých typů proteinů s odlišnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi existuje řada různých typů enzymů, které jsou schopné je štěpit. Budeme se zabývat zejména enzymy, které dokážou štěpit centrální oblasti proteinů. Takové enzymy se nazývají proteinasy. Naproti tomu existuje skupina enzymů odštěpujících koncové aminokyseliny, tzv. exopeptidasy.

Proteinasy lze roztřídit podle celé řady kritérií. Chemická povaha aktivního místa a substrát, na který enzym přednostně působí, nám poskytují i náhled na mechanismus jeho účinku. V Tabulce 8 je uveden základní přehled proteinas. Na základě biochemických mechanismů rozlišujeme čtyři základní typy katalytické aktivity. Ty tvoří serinové, metalo-, cysteinové a aspartátové proteinasy. Serinové proteinasy a metaloproteinasy jsou nejvíce aktivní v rozmezí pH 7,0 - 9,0 a hrají hlavní úlohu při degradaci extracelulárních proteinů. Na druhé straně aspartátové a cysteinové proteinasy mají kyselé pH optimum a podílejí se zejména na degradaci intracelulárních proteinů uvnitř lysosomů, kde je dostatečně kyselé prostředí.

Tabulka 8. Příklady vybraných proteinas.

Mechanismus Aktivní místo pH optimum Příklady

Serinové proteinasy Ser, His, Asp 7,0 – 9,0 Trypsin, chymotrypsin

thrombin, koagulační faktory

Metaloproteinasy Zn2+

koordinačně vázaný na

aminokyseliny

3,0 – 6,0 Metaloelastasa (MMP-12)

Cysteinové proteinasy

Cys, His 3,0 – 6,0 Katepsin S, L, B, H Papain

Bromelain Ficin

Aspartátové proteinasy

2 zbytky Asp 2,0 – 5,0 Pepsin Renin

Serinové proteinasy tvoří největší skupinu savčích proteinas. Jejich aktivita závisí na katalytické

triádě His57, Asp102, Ser195 (čísla udávají polohu aminokyseliny od N-konce, jak se vyskytují v chymotrypsinu). Jednotlivé aminokyseliny jsou od sebe v sekvenci dost vzdáleny, ale při vytváření trojrozměrné struktury enzymu se původní "tkanička" proteinového řetězce poskládá takovým způsobem, aby aminokyseliny tvořící aktivní místo zaujímaly v prostoru potřebné postavení. Většina serinových proteinas je syntetizována jako inaktivní prekursory (zymogeny), které potřebují k aktivaci omezenou proteolýzu. Výjimku představují lidská leukocytová elastasa, katepsin G, a proteinasa 3, které jsou skladovány v aktivní formě v granulích leukocytů. Všechny tyto tři enzymy mají význam v řadě patologických stavů u člověka.

Chymotrypsin (EC 3.4.21.4) katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb, v nichž je karboxylová skupina poskytována aromatickými aminokyselinami (fenylalanin, tyrosin, tryptofan) či aminokyselinami s velkým nepolárním zbytkem (např. methionin). Podobně jako řada dalších proteinas, katalyzuje hydrolýzu některých esterů. Má tedy esterasovou aktivitu. Z fyziologického hlediska nemá tato aktivita význam. Co se týče struktury, chymotrypsin sestává ze tří polypeptidových řetězců spojených disulfidovými můstky. Nachází se v inaktivní formě jako chymotrypsinogen, který je aktivován působením trypsinu. Chymotrypsin ve své struktuře obsahuje vysoce reaktivní serin 195 (číslo udává pořadí aminokyseliny v aminokyselinovém řetězci), který je inaktivován po vazbě diisopropylfosfofluoridu jako jediný z 27 serinových zbytků ve struktuře.

Trypsin (EC 3.4.21.4) katalyzuje hydrolýzu vazby –Lys- (lysin)-X-Arg (arginin), kde X je libovolná aminokyselina (nesmí po nich následovat prolin). V pankreatické šťávě se nachází v inaktivní formě trypsinogenu, který je aktivován v tenkém střevě enteropeptidasou (enterokinasou). Vytvořený trypsin vlivem této peptidasy pak aktivuje další molekuly trypsinogenu i jiné zymogeny. Samotná aktivace spočívá v odštěpení hexapeptidu o sekvenci Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. Existuje řada inhibitorů schopných trypsin účinně inhibovat. Samotná pankreatická šťáva obsahuje trypsinový inhibitor. Další známý inhibitor je glykoprotein z vaječného bílku ovomukoid, který se váže na trypsin v poměru 1:1.

Další významnou serinovou proteinasou je thrombin neboli koagulační faktor II a. Jeho funkcí je odštěpení fibrinopeptidů z fibrinogenu, posledního stupně kaskády hemokoagulace. Je homologní

s trávícími enzymy trypsinem, chymotrypsinem a elastasou. Vzniká rozštěpením molekuly prothrombinu (faktor II) aktivovaným faktorem X; tato reakce je významně urychlována aktivovaným faktorem V a přítomností fosfolipidů. Zatímco prothrombin je tvořen 582 aminokyselinovými zbytky, aktivní thrombin obsahuje pouze 259 zbytků. Syntéza prothrombinu je, závislá na vitaminu K, který se podílí na posttranslační karboxylaci postranních řetězců zbytků kyseliny glutamové (vzniká γ-karboxyglutamyl).

Metaloproteinasy působí zejména na extracelulární matrix (matrix metaloproteinases, MMP) a vyžadují k plné aktivaci navázané ionty Zn2+ a stimulaci ionty Ca2+ z vnějšku. Souhrnně mohou MMP degradovat všechny komponenty extracelulární matrix. Intersticiální kolagenasy představují nejvíce substrát-specifickou skupinu enzymů. Jejich katalytická aktivita účinkuje zejména na skupinu nativních helikálních kolagenů (typu I, II, III, a X) a rovněž degradují proteoglykany. Želatinasy s širší proteolytickou aktivitou dále degradují želatiny (kolageny denaturované intersticiálními kolagenasami) a také degradují kolageny typu IV, V, VII, X a XI, elastin, a komponenty bazální membrány.

Cysteinové proteinasy (rovněž thiolové proteinasy) mají společný katalytický mechanismus, dvojdoménovou globulární strukturu a podobnou velikost (23-27 kDa). Do papainové nadrodiny cysteinových proteinas patří čtyři lidské lysosomální proteinasy (katepsiny B, H, L, S). Všechny čtyři jsou syntetizovány jako proenzymy, které jsou aktivovány omezenou proteolýzou na aktivní formy, které se nacházejí v lysosomech. Lysosomální cysteinové proteinasy jsou uzpůsobeny k fungování v kyselém (pH 5,0 - 6,5) a redukujícím prostředí lysosomů. Významnou skupinu cysteinových proteinas představují kaspasy. Všechny kaspasy se syntetizují jako neaktivní prekursory, které jsou lokalizovány v cytoplasmě buněk. Jejich hlavní úloha je při apoptose, programované buněčné smrti. Proces aktivace je zahajován kaspasou-8, která potom spouští celou kaskádu vzájemných aktivací dalších kaspas. Výsledkem činnosti kaspas je destrukce celé řady intracelulárních proteinů, což představuje ireversibilní fázi apoptosy.

V potravinářském průmyslu je využívána řada rostlinných cysteinových proteinas, zejména papain (EC 3.4.22.2), chymopapain (EC 3.4.22.6), ficin (EC 3.4.22.3) a bromelain (EC 3.4.22.4). Papain se získává z rostliny papaya (Carica papaya, Vasconcellea cundinamarcensis) a z některých dalších plodů frakcionováním, odstřeďováním a ultrafiltrací. Výnos je asi 100 g papainu ze stromu za rok. Čím je papája zralejší, tím obsahuje méně enzymu papainu. Mléko z rostliny papaya a její zelené plody obsahují dva proteolytické enzymy - papain a chymopapain. Chymopapainu je v nich nejvíce, ale papain je dvojnásobně účinnější. Je syntetizován ve formě neaktivního zymogenu, který je aktivován odštěpením N-terminálního propeptidu. Tento propeptid je důležitý pro správné složení nově syntetizovaného enzymu, inaktivaci peptidasové domény a stabilizaci enzymu vůči denaturaci v neutrálním a alkalickém pH. Struktura papainu byla vyřešena v roce 1970 Ronaldem F. J. Mitchelem. Prekursorový protein papainu obsahuje 345 aminokyselin, z toho tvoří zbytky 1-18 signální sekvenci, 19-133 propeptid, 134-345 plně funkční peptid. Struktura obsahuje celkem sedm cysteinových zbytků, z nichž je pouze jeden volný a ostatní tvoří disulfidické můstky. Právě volná sulfhydrylová skupina cysteinu Cys25 slouží jako vazebné místo substrátu v aktivním centru enzymu. Chemická modifikace této sulfhydrylové skupiny způsobuje ztrátu peptidasové aktivity papainu. Struktura papainu je mimořádně stabilní, odolává denaturaci 8M močovinou a 70% ethanolem. Teplotní optimum se pohybuje v rozmezí 60-70°C. Hydrolyticky štěpí peptidy, amidy i estery. V peptidovém řetězci nejlépe štěpí druhou peptidovou vazbu následující směrem k tzv. C-konci za zbytkem fenylalaninu. V imunologii se využívá jeho schopnosti odštěpit Fc fragment imunoglobulinů (krystalizující část, nožičky těžkého řetězce) od Fab části (antigen-vázající, raménka lehkého řetězce), a to v místě závěsu (přechod ramének v nožičku, v tomto místě je molekula velmi pohyblivá). Papain se nachází v přirozeně vysoké koncentraci v zelené slupce a v jádrech ovocného plodu. Má rovněž mírné, uklidňující účinky na žaludek a napomáhá trávení proteinů. Dále se používá k tenderizování "rozrušení" masa, v medicínských přípravcích díky jeho protizánětlivým vlastnostem a v doplňcích stravy jako součást tablet napomáhajících trávení. V lékařství se používá při léčení ekzémů a nekros - neprogramovaná (patologická) smrt buňky, ke které dochází v důsledku nevratného narušení některé ze základních buněčných funkcí. Tento enzym má i řadu dalších použití, například v kuchyni se

používá ke zjemnění rybího masa, při vaření piva zamezuje zkalení piva. V textilní technice se používá jako pomůcka k výrobě vlny a hedvábí, aby se zamezilo jejich zplstnatění a scvrknutí.

Jako bromelain (bromelin) je označován extrakt proteolytických enzymů (EC 3.4.22.32 a EC 3.4.22.33) společně s dalšími složkami obsaženými v čerstvém ananasu. Pro izolaci bromelainu pro komerční využití se využívá zejména stonek, avšak i plody jsou jeho významným zdrojem. Bromelain má silně protizánětlivé vlastnosti, čehož se využívá při léčbě bolestí, otoků a hojení tkání. Také zabraňuje srážení krevních destiček, což je prospěšné při prevenci srdečních chorob, protože snižuje riziko vzniku trombóz. pH optimum se pohybuje v rozmezí 4,5-5,5 a teplotní optimum v rozmezí teplot 50-60°C. V kulinářství má využití ke změkčování (tenderizaci) masa, kdy se k masu přidává v práškové formě společně s marinádou nebo se přímo nasype do tepelně neupraveného masa. Vařením či konzervací ztrácí bromelain svoji aktivitu.

Významným zástupcem z rodiny aspartátových proteinas je pepsin A (EC 3.4.23.1). Katalyzuje hydrolýzu vazeb Glu (glutamová kyselina) - Leu (leucin) - Tyr (tyrosin) - Phe (fenylalanin). Je produkován buňkami žaludeční sliznice, a to ve formě inaktivního pepsinogenu. Ten se aktivuje na pepsin katalyticky protonem. Vlivem iontu H+, při pH 1,5 - 2,5 a již aktivních molekul pepsinu, se z molekul pepsinogenu odštěpuje více peptidu, přičemž se uvolní katalyticky aktivní centrum. Odštěpený peptid (inhibiční peptid) se může při slabě kyselém, resp. neutrálním pH vázat s pepsinem a intenzivně snižovat jeho aktivitu. Při kyselém pH (menším než 4,5) se inhibiční peptid z pepsinu odštěpí. Pro účinek pepsinu je tudíž potřebná dostatečná sekrece kyseliny chlorovodíkové. Během sekrece žaludeční šťávy se malé množství pepsinogenu přepravuje z hlavních buněk do krevní plazmy a močí se vylučuje jako uropepsinogen. Vylučování uropepsinogenu roste při poškození žaludeční sliznice. Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: Petriho miska, nůž, kádinky, vařič, párátko. Chemikálie a materiál: jablko, citron, kiwi, čerstvý ananas, želatina, šunkový salám, salám Vysočina. Pracovní postup Kolečka salámu položte na Petriho misku a na něj položte plátek citronu, jablka, kiwi či ananasu. Ponechejte 1 den a poté pozorujte strukturu salámu pod jednotlivými druhy ovoce. Vyzkoušejte, jak silnou stopu zanechá škrábnutí párátkem na místech salámu pod ovocem. Dále připravte asi 150 ml želatiny a nalijte ji do tří kádinek a nechejte ztuhnout. Na každou z kádinek položte plátek ovoce a nechte půl dne působit. Pozorujte strukturu želatiny pod jednotlivými druhy ovoce (Obrázek 17). Vyhodnocení Kiwi a ananas obsahují velké množství proteinas. Ty štěpí bílkoviny přítomné v mase nebo želatině na kratší řetězce. Po působení enzymu můžeme pozorovat „rozbřednutí“ bílkovinné hmoty – želatina se roztéká.

Obrázek 17. Proteasová aktivita v ovoci. (A) Kolečka salámu a ztuhlá želatina připravena k pokusu v Petriho miskách. (B) Pořadí vzorků: banán, nektarinka, jablko, kiwi a mrkev – 1. den. (C) Tytéž vzorky již po 24 hodinové inkubaci při 25°C – 2. den. (D) Struktura želatiny/salámu pod jednotlivými vzorky. 4.2 Katalasa v potravinách Teoretický úvod Katalasa (EC 1.11.1.6, KAT) je enzym ze třídy oxidoreduktas fungující jako katalyzátor rozkladu dvou molekul toxického peroxidu vodíku na vodu a kyslík: 2 H2O2 → 2 H2O + O2. Peroxid vodíku je vedlejší produkt metabolických procesů buňky. Kataláza je enzym schopný kromě redukce, i oxidace peroxidu vodíku, čímž se podstatně liší od peroxidas (EC 1.11.1.5), které dovedou H2O2 pouze redukovat za současné oxidace sekundárního substrátu, kterým mohou být (pro buňky toxické) objemnější molekuly fenolických sloučenin. Katalasy a peroxidasy představují esenciální výbavu buněk při překonávání škodlivých účinků oxidačního stresu – brání membrány před oxidativním poškozením.

Katalasa je přítomna u téměř všech organismů s aerobním metabolismem, tedy v živočišných orgánech (zejména v erytrocytech a v peroxisomech jaterních buněk), v rostlinných pletivech a aerobních mikroorganismech. V buňkách eukaryot je katalasa typickým markerem subcelulárních organel, známých jako peroxisomy, které obsahují anabolické systémy, jako například mechanismus β-oxidace mastných kyselin. Její hlavní fyziologická role tkví v ochraně buněk před mimořádně reaktivními molekulami s peroxidickou vazbou, které vznikají jako vedlejší produkty katabolismu. Její prosthetickou skupinou je hem – obsahuje čtyři porfyrinové hemové (železnaté) skupiny. Katalasa je mimořádně katalyticky účinná; jedna molekula enzymu může za minutu přeměnit 5 milionů molekul peroxidu vodíku.

Cílem úlohy je porovnat vybrané potraviny (ovoce, zelenina) z hlediska obsahu enzymu katalasy rozkládající peroxid vodíku a identifikovat plyn, který tímto rozkladem vzniká. Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: zkumavky ve stojánku, nůž, kádinka, prkénko, zápalky, špejle Chemikálie a materiál: 10% roztok peroxidu vodíku, ovoce (kiwi, citron, jablko), zelenina (brambora, cibule, mrkev), droždí (sušené nebo čerstvé), sacharosa Pracovní postup V menší kádince připravte 20 ml 10% vlažného roztoku sacharosy. Poté do roztoku sacharosy vsypejte asi čtvrt lžičky droždí a nechejte 10 min vzejít. Do 7 zkumavek ve stojánku nalejte vždy 5 ml 10% roztoku peroxidu vodíku. Z uvedeného ovoce odkrojte vždy stejně velký kousek (dle velikosti použitých zkumavek). Do prvních 6 zkumavek vhoďte kousek ovoce/zeleniny a do sedmé zkumavky nalejte asi 2 ml připravené suspenze droždí (v sacharose). Po 2-5 minutách pozorujte a popište intenzitu reakcí v jednotlivých zkumavkách, poté vsuňte do zkumavek doutnající špejli a pozorujte její chování, které zapište do tabulky 9. Vyhodnocení Vyhodnoťte, která z vybraných surovin má nejvyšší obsah katalasy dle intenzity rozkladu H2O2. Při reakci se uvolňuje kyslík, který lze identifikovat doutnající špejlí – kyslík podporuje hoření – špejle nad hladinou zkumavky jasně vzplane. Nejintenzivnější rozklad probíhá v droždí, poté v bramborách nebo kiwi. Katalasa se však hojně vyskytuje i v syrových kuřecích játrech nebo jiné prokrvené tkáni (krev při styku s H2O2 jako dezinfekčním činidlem „bublá“). Jaké jsou další zdroje katalasy? Tabulka 9. Tabulka pro záznam pozorování intenzity vzniku bublinek.

Surovina kiwi jablko citron mrkev brambora cibule droždí

Intenzita rozkladu

5. Nukleové kyseliny 5.1 Analýza a detekce DNA a RNA pomocí agarosové elektroforézy Teoretický úvod V současné době se moderní biochemický výzkum neobejde bez základních znalostí molekulární biologie a metod používaných pro práci s mikroorganismy a nukleovými kyselinami.

Elektroforéza, neboli migrace iontů v elektrickém poli, se velmi často používá pro analytické dělení biologických látek, hlavně pak proteinů a nukleových kyselin. Elektroforéza většinou probíhá na vhodném nosiči jako je papír, celulosa nebo polymerní gel. Nejčastějším typem gelové elektroforézy je agarosová elektroforéza (Obrázek 18), která se používá hlavně na dělení látek s velkou molekulovou hmotností (DNA, RNA). Aby byla zajištěná dostatečná pohyblivost takto velkých molekul, musela by se použít velmi nízká koncentrace akrylamidu (pod 3%) a gel by byl velice měkký a manipulace s ním komplikovaná. Agarosové gely jsou i v nízkých koncentracích velmi pevné a koncentrace agarosy v nich je závislá na velikosti dělených nukleových kyselin, od 3% pro fragmenty DNA a RNA mající desítky až stovky párů bází po 0.8% pro fragmenty velikostí tisíců až desetitisíců párů nukleotidových bází.

Obrázek 18. Princip agarosové elektroforézy (převzato z http://mmp.vfu.cz/opvk2011/?title=popis_metod-gelova_elektroforeza). Chemicky je agarosa polysacharid skládající se z D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy (Obrázek 19), který se izoluje z červených řas – ruduch. Je teoreticky zcela nenabitá, nicméně může obsahovat příměsi nabitých sulfátových či pyruvátových skupin. Agarosa našla celou řadu praktických uplatnění v laboratorní praxi, vytváří síťovitý materiál, v němž může být realizována elektroforéza, imunodifuze, gelová filtrace či afinitní chromatografie.

Obrázek 19. Podjednotka agarosy. Nejčastější uspořádaní agarosové elektroforézy je horizontální, přičemž princip dělení je na rozdíl od proteinů vždy závislý pouze na velikosti nukleové kyseliny, která je sama o sobě negativně nabitá a pohybuje se proto směrem od katody (-) k anodě (+). DNA fragmenty se pohybují v agarosovém gelu vlivem působení stejnosměrného elektrického pole. Dělení fragmentů je závislé na jejich velikosti; větší fragmenty se pohybují pomaleji, menší rychleji. Koncentrace agarosového gelu určuje velikost pórů; DNA fragmenty určité velikosti se pohybují agarosovými gely o různé koncentraci různě rychle. Existuje lineární korelace mezi ´log´ pohyblivosti (mobility) a koncentrací gelu pro určitý rozsah velikostí dělených fragmentů. To znamená, že koncentrace gelu musí být volena v závislosti na velikosti separovaných DNA fragmentů. Závislost ´log´ molekulové váhy známých markerů a jejich mobility umožňuje sestavit kalibrační křivku a určit molekulovou váhu neznámých fragmentů. DNA však není v agarosovém ani polyakrylamidovém gelu možno vidět. Je proto nutné ji nějakým způsobem obarvit nebo označit. Nejpoužívanějším barvivem pro DNA jsou planární aromatické kationty, jako je např. ethidium bromid, akridinová oranž nebo SybrGreen, které se interkalují (vmezeří) do struktury dvoušroubovice (fluorescenční barviva) a po ozáření UV světlem následně fluoreskují (pomocí transluminátoru, λ = 300 nm).

Gelová elektroforéza je často využívána ke stanovení čistoty a stupně degradace izolované DNA. RNA kontaminující vzorky DNA se projevuje šmouhou o nízké molekulové váze. Rozdělené molekuly DNA lze také ve funkční formě izolovat z gelu. Experimentální vybavení Laboratorní pomůcky: mikrozkumavky 1,5 ml (eppendorfky), horizontální elektroforetická komůrka SafeBlue se zdrojem napětí (Obrázek 20), systém pro digitální fotodokumentaci gelů, mikropipety, špičky, parafilm Chemikálie a materiál: 1 % agarosa v 1x TAE pufru (0,04 M Tris-kyselina octová, 0,001 M EDTA), 0,125 % bromfenolová modř (nanášecí barvička), 1 kb DNA marker

Obrázek 20. SafeBlue horizontální elektroforetická komůrka se zdrojem napětí využívající Blue LED světlo pro okamžitou vizualizaci DNA/RNA bandů během průběhu agarosové elektroforézy. Pracovní postup Pod dohledem vyučujícího si sestavíme elektroforetickou komůrku pro agarosový gel v horizontálním uspořádání. Po celou dobu pracujeme v nitrilových rukavicích. Připravíme si 1% agarosu v 1x TAE pufru (1 g práškové agarosy na 100 ml 1x TAE) a rozpustíme v mikrovlnné troubě (případně nad kahanem či na plotně magnetického míchadla). Připravenou agarosu poté po mírném zchladnutí (na cca 60°C) nalijeme do elektroforetické komůrky do výšky asi 1 cm. Agarosa se nalévá do prostoru ohraničeného postranními plastovými deskami (gumičkami) na nosnou skleněnou desku. Ihned přidáme na 100 ml agarosy 8 μl GelRed barviva (firma Biotinum) a promícháme špičkou. Zhruba 1 cm od startu (katoda, černý kabel) zasadíme do agarosy hřeben tak, aby zasahoval asi 0,8 cm do hloubky gelu (pozor na tvorbu bublinek). Gel ponecháme tuhnout asi 30 minut. Po 30 minutách odstraníme postranní plastové desky a do komůrky nalijeme asi 500 ml elektrodového pufru 1x TAE tak, aby hladina splývala s agarosovým gelem a nakonec pod hladinou odstraníme opatrně hřeben. Během tuhnutí gelu si připravíme vzorky DNA a RNA, které jsme izolovali bud pomocí komerčního kitu, fenol-chloroformovou extrakcí nebo pomocí pouhé lýze buněk. Na připravený proužek parafilmu (lze smíchat i v mikrozkumavkách a poté stočit v pikofuze) pipetujeme 10 μl izolované DNA či RNA a přidáme pětinu objemu denaturačního barviva (nanášecí barvičky obsahující bromfenolovou modř) a promícháme špičkou.

Jednotlivé vzorky nanášíme opatrně pipetou do jamek v gelu vytvořených hřebínkem na startu elektroforézy. Mezi nanášením jednotlivých vzorků, špičku pipety vyplachujeme v elektrodovém pufru přímo v komůrce. Pečlivě si zaznamenáme pořadí a polohu jednotlivých vzorků. Do první a poslední jamky naneseme 5 μl DNA 1 kb markeru jako standard molekulových hmotností DNA/případně RNA markeru. Elektroforetickou komůrku uzavřeme bezpečnostním víkem a nastavíme na zdroji napětí 120 V po dobu asi 30-40 minut. Průběh elektroforézy je možné sledovat podle pohybu pásů barviv ze vzorků. Vypneme přívod proudu, odkryjeme víko a vyjmeme agarosový gel na nosném skle a pořídíme snímek digitální kamerou připojenou k UV-transluminátoru podle pokynů vedoucího cvičení. Vyhodnocení Pořízený snímek včetně DNA či RNA markeru popíšeme a vyhodnotíme. Na obrázku 21 lze vidět elektroforézu intaktní RNA, kdy lze vidět dva jasné bandy 18S a 28S rRNA značící kvalitní RNA. V případě již degradované RNA bychom pozorovali vznik mnoha fragmentů o různých velikostech.

Obrázek 21. Agarosová elektroforéza RNA v 1% gelu.

6. Testové otázky

Číslo úlohy: 1

Název úlohy: Proteiny

Otázka: Keratin se řadí mezi proteiny s funkcí:

Správná odpověď: stavební

Chybná odpověď: skladovací

Chybná odpověď: ochrannou

Otázka: Terciární strukturu keratinu jako skleroproteinu zajišťují:

Správná odpověď: Disulfidické můstky

Chybná odpověď: Vodíkové vazby

Chybná odpověď: Kovalentní vazby

Otázka: V jakém průmyslu a k čemu se využívá hydrolyzovaný keratin?

Správná odpověď: V kosmetickém průmyslu do masek, šamponů a kondicionérů

Chybná odpověď: Jako zpěňovací přísada do hasicích přístrojů

Chybná odpověď: V masném průmyslu jako odpad ze srsti a kopyt k zahušťování

Otázka: Kolik karboxylových skupin ve své molekule obsahuje kyselina glutamová?

Správná odpověď: dvě

Chybná odpověď: jednu

Chybná odpověď: tři

Otázka: V potravinářském průmyslu se kyselina glutamová označuje kódem:

Správná odpověď: E620

Chybná odpověď: E334

Chybná odpověď: E220

Otázka: Kolik g na kg či litr kyseliny glutamové umožňuje používat česká legislativa v potravinách?

Správná odpověď: 10

Chybná odpověď: 2

Chybná odpověď: 0,5

Číslo úlohy: 2

Název úlohy: Sacharidy

Otázka: Z kterých dvou polysacharidů se skládá škrob?

Správná odpověď: Amylosa a amylopektin

Chybná odpověď: Amylosa a glykogen

Chybná odpověď: Amylopektin a glukoamylasa

Otázka: Amylopektin poskytuje s jodem:

Správná odpověď: Červenofialovou reakci

Chybná odpověď: Červenohnědou reakci

Chybná odpověď: Modrou reakci

Otázka: 50% produkce škrobu se využije v průmyslu:

Správná odpověď: Potravinářském

Chybná odpověď: Papírenském

Chybná odpověď: Oděvním

Otázka: Která z uvedených plodin obsahuje nejvyšší obsah škrobu ve škrobových zrnech?

Správná odpověď: kukuřice

Chybná odpověď: rýže

Chybná odpověď: brambory

Otázka: V které části buňky se tvoří škrobová zrna?

Správná odpověď: amyloplasty

Chybná odpověď: chromoplasty

Chybná odpověď: vakuoly

Otázka: Která teplota se udává jako počáteční teplota mazovatění škrobových zrn?

Správná odpověď: 60°C

Chybná odpověď: 37°C

Chybná odpověď: 90°C

Číslo úlohy: 3

Název úlohy: Stanovení a důkazy vitamínů

Otázka: Kolik existuje základních typů vitamínů?

Správná odpověď: 13

Chybná odpověď: 10

Chybná odpověď: 20

Otázka: Mezi vitamíny rozpustné v tucích se řadí:

Správná odpověď: tokoferol

Chybná odpověď: biotin

Chybná odpověď: riboflavin

Otázka: Mezi vitamíny rozpustné ve vodě se řadí:

Správná odpověď: Kyselina askorbová

Chybná odpověď: retinol

Chybná odpověď: Vitamín E

Otázka: Mezi vitamíny rozpustné v tucích se řadí:

Správná odpověď: Vitamín K

Chybná odpověď: Kyselina listová

Chybná odpověď: Kyselina nikotinová

Otázka: Který z vitamínů způsobuje při jeho nedostatku křivici, odvápňování a měknutí kostí?

Správná odpověď: kalciferol

Chybná odpověď: tokoferol

Chybná odpověď: riboflavin

Otázka: Který z vitamínů je klíčový pro krvetvorbu?

Správná odpověď: Kobalamin (B12)

Chybná odpověď: Pyridoxin (B6)

Chybná odpověď: Riboflavin (B2)

Číslo úlohy: 4

Název úlohy: Enzymy v potravinách

Otázka: Proteasy se řadí do třídy enzymů:

Správná odpověď: hydrolasy

Chybná odpověď: lyasy

Chybná odpověď: transferasy

Otázka: Serinové proteasy mají pH optimum ve škále:

Správná odpověď: 7,0-9,0

Chybná odpověď: 2,0-5,0

Chybná odpověď: 3,0-6,0

Otázka: Které ionty ke své plné aktivaci a stimulaci potřebují metaloproteinasy?

Správná odpověď: Zn2+, Ca2+

Chybná odpověď: Cu2+, Ca2+

Chybná odpověď: Zn2+, Fe2+

Otázka: Bromelain jako extrakt proteolytických enzymů se nachází v které plodině?

Správná odpověď: ananas

Chybná odpověď: brokolice

Chybná odpověď: papája

Otázka: Katalasa katalyzuje rozklad dvou molekul:

Správná odpověď: Peroxidu vodíku

Chybná odpověď: Vody

Chybná odpověď: Kyslíku

Otázka: Katalasa se využívá jako marker které buněčné organely?

Správná odpověď: peroxisomy

Chybná odpověď: vakuoly

Chybná odpověď: plastidy

Číslo úlohy: 5

Název úlohy: Nukleové kyseliny

Otázka: Při elektroforéze migrují ionty v:

Správná odpověď: Elektrickém poli

Chybná odpověď: Magnetickém poli

Chybná odpověď: Stacionárním magnetickém poli

Otázka: Agarosa je polysacharid skládající se z:

Správná odpověď: D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy

Chybná odpověď: L-galaktosy a glukosaminu

Chybná odpověď: L-galaktopyranosy a agaropektinu

Otázka: Nukleová kyselina je sama o sobě nabitá:

Správná odpověď: Negativně

Chybná odpověď: Kladně

Chybná odpověď: Neutrálně

Otázka: Lze DNA/RNA v agarosovém gelu vidět?

Správná odpověď: Ne

Chybná odpověď: Ano

Chybná odpověď:

Otázka: Které toxické barvivo se nejčastěji používá pro barvení DNA/RNA?

Správná odpověď: Ethidium bromid

Chybná odpověď: GelRed

Chybná odpověď: SybrGreen