11. Analýza částic

Velikost částic

Příprava předmětu byla podpořena

projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

• Usazování je jednou z nejstarších metod pro určování velikosti

farmaceutických pevných látek v suspenzích nebo v proudu

vzduchu.

• Principem je rozdílná rychlost usazování částic podle jejich

hmotnosti a velikosti v kapalném nebo plynném mediu. Tuto

techniku lze použít také při zjišťování distribuce velikostí částic.

• Usazování sférické částice ve viskózním prostředí vlivem

gravitace se řídí Stokesovým zákonem.

• Pro prostředí s malými Reynoldsovými čísly (laminární proudění)

je rychlost usazování částic závislá na rozdílu hustoty prostředí

a částic, na viskozitě prostředí a velikosti částic.

2

Usazování

• Na částici působí gravitační sila Fg a vztlaková síla Fd.

• Mezní rychlostí je označován stav, kdy jsou Fg a Fd v rovnováze.

• Pro sférické částice, které mají stejnou hustotu, lze odvodit

následující vztah:

𝐹𝑔 =𝜋𝑑𝑠𝑡

3

6𝜌𝑆 − 𝜌𝑓 𝑔

dst je průměr částice

S je hustota pevné látky

f je hustota kapaliny

• Podle Stokesova zákona je vztlaková síla dána vztahem

𝐹𝑑 = 3𝜋𝜇𝑑𝑠𝑡

kde je viskozita prostředí a je relativní rychlost částice vzhledem

k médiu.

3

Usazování

• Za předpokladu Fg = Fd platí:

= t = 𝑑𝑠𝑡

2

18𝜇𝜌𝑆 − 𝜌𝑓 𝑔

• Z tohoto vztahu plyne, že mezní rychlost je funkcí druhé mocniny

průměru částice.

• Sedimentaci lze rozdělit na metody kumulativní a inkrementální

techniky.

• Kumulativní techniky spočívají v měření rychlosti usazování

částic, které je prováděno vážením částic v určité hloubce

v průběhu času.

• Inkrementální technika slouží ke stanovení změny koncentrace

nebo hustoty materiálu v určité hloubce v průběhu času. Při

těchto měření se používají rentgenové paprsky.

• Z důvodů snazší automatizace, rychlosti a přesnosti měření jsou

komerčně více rozšířeny inkrementální techniky měření.

4

Usazování

• Nejrozšířenější je RTG sedimentace (XGS). Tenký horizontální

svazek RTG záření měří částice v dané hloubce v průběhu času

a absorpce RTG záření je přímo úměrná koncentraci (hmotnosti)

částic s průměrem menším než dst spočteným podle Stokesovy

rovnice.

• Při sedimentaci je možné počítat pouze s jedinou hodnotou

hustoty částic, což způsobuje chyby měření velikosti částic

různého složení.

• Další chyby měření jsou způsobeny nepravidelným tvarem

částic, který ovlivňuje rychlost usazování.

• U měření malých částic (ve vodě 1 m) se uplatňuje Brownův

pohyb, což významně ovlivňuje měření.

• Dolní limit uváděný výrobci přístrojů je 0,2 m, avšak při měření

částic pod 1 m jsou měření zatížená velkou nejistotou.

• Koncentrační rozsah měření XGS je 1 – 5 % (w/V). 5

Usazování

• Nejrozšířenější metoda pro určení velikostí aerodynamických

částic.

6

Inerciální zaklínění

Schéma inerciálního zaklínění částic ve vznosu

• Při průtoku částic zařízením působí na částici dvě síly. První je

síla, která pohání částici kupředu a druhou silou je odpor

okolního vzduchu. Větší částice jsou usazovány a menší částice

pokračují v proudu vzduchu

• Pravděpodobnost dopadu částice na povrch je funkcí Stokesova

čísla, které nabývá hodnot 0 až 1. Čím je vyšší, tím

pravděpodobněji nastane depozice částice.

𝑆𝑡𝐾 =𝜌𝐶𝑉𝑑2

9𝜇𝐷𝑗

kde StK je Stokesovo číslo, je hustota částic, C je

Cunninghamův korekční faktor skluzu, V je rychlost, d je průměr

částice, viskozita kapaliny, Dj je průměr trysky.

7

Inerciální zaklínění

• Cunninghamův korekční faktor skluzu je dán vztahem:

𝐶 = 1 +1,6 ∗ 10−5

𝑑𝑝

• Vyjadřuje snížení střední dráhy letu částice v plynu.

• V praxi se používá StK50, což vyjadřuje 50% pravděpodobnost

depozice částice. Hodnota d50 odpovídá velikosti částic

𝑑50 =9𝜇𝐷𝑗

𝜌𝐶𝑉𝑆𝑡𝐾50

• Částice s velkým průměrem nebo vysoký průtok plynu zvyšují

pravděpodobnost depozice částic.

8

Inerciální zaklínění

• Dynamický rozptyl světla (DLS) neboli fotonová korelační

spektroskopie (PCS) neboli kvazielastický rozptyl světla (QELS).

• DLS je široce používanou technikou pro určení velikosti částic

menších než 1 m.

• K měření je požíván rozptyl laserového záření dopadajícího na

povrch částic pohybujících se Brownovým pohybem. Intenzita

rozptýlené záření měřená pod určitým úhlem závisí na difuzní

rychlosti částice, která souvisí s její velikostí.

• Difuzní koeficient (D) je popsaný Stokes-Einsteinovou rovnicí:

𝐷 = 𝑘𝐵𝑇

3𝜋𝑑

kde d je průměr částice, kB je Boltzmanova konstanta,

T je teplota, je dynamická viskozita rozpouštědla.

9

Dynamický rozptyl světla

• Pomocí DLS se měří hydrodynamický průměr částice, který

odpovídá průměru koule o stejném difuzním koeficientu jako má

měřená částice.

• V konvenčních DLS se rozptýlené záření snímá pod úhlem 90°.

Rozptýlené záření je převedeno na elektrický signál.

• Konečný výsledek ovlivňují především dva faktory. Prvním je

vzájemná interakce částic, která ovlivňuje jejich difuzní rychlost

a druhým je vícenásobný rozptyl. Z těchto důvodů je nutné

k měření používat vhodně zředěné vzorky.

• Tyto problémy lze částečně eliminovat snímáním rozptýleného

záření v úhlu 173°, což eliminuje vícenásobný rozptyl a umožňuje

měření roztoků o vyšších koncentracích.

• Zetasizer Nano umožňuje měřit částice v rozmezí 0,6 nm do

6 m.

10

Dynamický rozptyl světla

• Čítač jednotlivých částic (SPC) používá rozptýlené záření pro

určení počtu částic prošlých relativně malým objemem.

• Tyto čítače lze rozdělit na dva druhy, amplitudově závislé

a nezávislé.

• Amplitudově závislé čítače měří absolutní intenzitu rozptýleného

světla. Velikost částic se určí z Lorenz-Mieho teorie.

• Přístroj musí být kalibrován pomocí standardu.

• Používají se přístroje se dvěma štěrbinami různých šířek,

přičemž užší umožňuje měřit částice v rozsahu 0,5 až 2 m

a širší v rozsahu 3 m až několik set mikrometrů.

• Amplitudově nezávislé čítače – měření velikosti částic nezávisí

na intenzitě rozptýleného záření.

• Pro zjištění velikosti částic používají Dopplerovu metodu. Měří se

fázový rozdíl v rozptylu světla v minimálně dvou místech.

• Tímto způsobem lze měřit částice o velikosti 0,3 m do 8 mm

s přesností 5 %.

11

Čítač jednotlivých částic

• Povrch pevných látek může být definován jako:

a) viditelný nebo vnější povrch,

b) součet vnějších ploch neporézních částí,

c) celková plocha včetně pórů.

• Řada vlastností farmaceutických látek včetně biologické aktivity

může záviset na vlastnostech povrchu.

• Pro stanovení povrchových vlastností se proto používá řada

technik, například rtuťová porozimetrie, adsorpce plynu

a permeace plynu.

12

Měření velikosti povrchu

• Pro zjištění velikosti povrchu lze použít adsorpci inertních plynů

jako je dusík, helium nebo krypton, které vykazují BET izotermu.

• Principem metody je, že množství plynu absorbovaného na

povrch částic je přímo úměrné velikosti povrchu částice podle

následující rovnice

kde V je objem plynu absorbovaného na povrch při tlaku P, Vm

objem plnu adsorbovaného v monovrstvě, P0 je tlak nasycených

par za experimentální teploty, C je konstanta související

s entalpií adsorpce a kondenzace.

13

Adsorpce plynu

• Po vytvoření grafu závislosti P/V(P0-P) oproti P/P0 lze ze

součtu převrácené hodnoty směrnice této přímky a úseku

vypočítat Vm. Plochu vzorku lze spočítat podle následující

rovnice:

kde St je celková plocha vzorku, N0 je Avogadrovo číslo, Acs

průřezová plocha adsorbované molekuly, Mw je molekulová

hmotnost adsorbované molekuly.

• Specifický povrch lze spočítat z rovnice S = St / m , kde m je

hmotnost vzorku.

• Použití této metody zahrnuje řadu aproximací, nicméně

experimenty ukázaly, že touto metodou lze poměrně přesně

charakterizovat povrch řady materiálů.

• Dusík je použitelný pro povrchy s velikostí větší než

1,0 m2g-1, zatímco krypton by měl být použit pro menší povrchy.

14

Adsorpce plynu

• Principem této metody je permeace tekutiny přes vrstvu prášku.

Velikost povrchu lze určit z odporu, který klade práškový materiál

tekutině podle Kozenyovy-Carmanovy rovnice:

Sv je povrch, P ztráta tlaku při tloušťce prášku L, A je plocha

vrstvy prášku kolmá na směr průtoku tekutiny, V je objem

tekutiny prošlý za čas t, viskozita tekutiny, porozita práškové

vrstvy, k je konstanta závisející na tvaru a drsnosti částic (pro

sférické částice k = 5).

• Výhodou je jednoduchá aparatura a rychlé měření.

• Lze měřit průtok kapalin i plynů. Při použití plynů jsou výsledky

o něco vyšší než v případě použití kapalin.

15

Permeační metody

• Patří mezi nejrozšířenější metody pro charakterizaci vnitřních

dutin pevných látek.

• Výhodou je, že se rtuť chová jako nesmáčivá kapalina

a neproniká tak skrz zkoumaný materiál.

• Měření využívá závislosti mezi aplikovaným tlakem a minimálním

průměrem otevřených pórů, který může rtuť zaplnit.

• Pro kruhové póry lze vypočítat jejich poloměr na základě

následujícího vztahu

kde r je poloměr póru v m, P je použitý tlak v psi.

• Při měření velikosti větších pórů je tedy třeba aplikovat malý tlak

a naopak.

• Při samotném měření se postupně zvyšuje tlak a sleduje se

množství rtuti zachycené v pórech.

16

Rtuťová porozimetrie

• Při snižování tlaku se naopak rtuť z pórů dostává pryč, ale část

v nich zůstává a výsledkem je proto hysterzní křivka.

• Z těchto měření lze odvodit řadu informací jako je poloměr pórů,

plocha pórů a plocha povrchu částic a dokonce i velikost částic.

• Tato metoda má také ale řadu omezení. Například předpokládá,

že póry jsou válcovitého tvaru. Dále může při vyšších tlacích

docházet k deformaci částic. Pro dosažení potřebné přesnosti

měření by měl být změřen kontaktní úhel rtuti se zkoumaným

povrchem a povrchová tenze par rtuti. Mezi další nevýhody patří

možnost měřit pouze otevřené póry.

• I přes zmíněné nevýhody poskytuje rtuťová porozimetrie

v kombinaci s dalšími metodami cenné informace o povrchové

struktuře farmaceutických látek.

17

Rtuťová porozimetrie

• Pro správnou funkci řady léčiv je důležitá velikost částic, která

ovlivňuje jejich rozpustnost, ale také jejich případné použití (např.

léčiva pro plicní použití musí mít vhodnou velikost částic).

• Metody zmenšování částic lze rozdělit na konvenční

a mechanické.

• Konvenční metody zahrnují sušení rozprašováním a krystalizaci.

• Mechanické metody zahrnují mletí, drcení a rozmělňování.

• Ve farmacii lze provádět různá mletí, používanou technikou je

např. mletí částic ve dvou navzájem protichůdných proudech

plynu, kdy nárazy částic způsobí jejich zmenšení. Pro separaci

požadovaných velikostí lze použít např. separace pomocí

cyklonu.

• Nevýhodou mechanického zpracování je, že se vždy ve vzorku

objevují po jeho provedení amorfní oblasti, které mají odlišné

fyzikálně-chemické vlastnosti. 18

Redukce velikosti částic

• Sušení rozprašováním je ve farmaceutickém průmyslu používáno

již dlouhou dobu. Vlastnosti vzniklých částic jsou ovlivněny

mnoha faktory, jako je koncentrace léčiva, gradient teplot atd.

Obecně lze říct, že tímto způsobem jsou připravovány sypké duté

kulovité částice s nízkou hustotou (ve srovnání z původním

materiálem). Tato metoda není vhodná pro tepelně nestálé látky.

• Vhodnou velikost částic lze zajistit také během krystalizace

volbou krystalizačních podmínek. V praxi se často používá

metoda přídavku vhodného srážedla.

• Nevýhodou krystalizace je energetická náročnost a tepelná

závislost celého procesu, kontaminace dalšími látkami a malý

výtěžek vzhledem k velkým objemům roztoků.

• Řadu těchto problémů lze odstranit superkritickou fluidní

krystalizací, která používá stlačené kapalné plyny (typickým

používaný plynem je např. dusík).

19

Redukce velikosti částic

• Měření velikosti částic zahrnuje správný odběr a přípravu vzorků

• Vlastní měření velikosti částic musí splňovat následující

předpoklady:

o Získaný vzorek musí být dostatečně reprezentativní.

o Příprava vzorku by neměla mít vliv na velikost částic.

o Je třeba zvolit vhodnou metodu pro určování velikosti.

o Přístroj musí být optimálně nastaven.

o Při měření by nemělo docházet ke změně tvaru a velikosti

částic.

o Získána data je nutno správně interpretovat.

20

Hodnocení velikosti částic

a farmaceutický vývoj

• V praxi nelze měřit velké objemy vzorků, a proto je vždy nutné,

aby byly vybrané vzorky dostatečně reprezentativní.

• Pro odběr vzorku existuje řada technik.

• Objemy sypkých vzorků lze redukovat metodou kvartace, kdy se

z hromady sypkého materiálu odstraní vrchol. Zbytek prášku se

rozdělí na čtvrtiny a protilehlé strany se oddělí (viz obr.). Celý

postup lze opakovat až do získání optimálního množství prášku.

21

Vzorkování

• Po získání vhodného objemu vzorku musí být tento vzorek

připraven podle podmínek nutných pro provedení analýzy.

• Např. pro laserovou difrakci musí být pevný vzorek rozptýlen ve

vhodném rozpouštědle, ve kterém nedochází k rozpouštění

částic.

• Při mikroskopických pozorováních musejí být částice vhodně

zředěny, aby nedocházelo k jejich agregaci.

• V technikách jako je např. TOF, kdy jsou částice urychleny, může

docházet k nežádoucím změnám velikosti v důsledku působení

vysokých sil. Na druhou stranu vztah mezi velikostí částic

a aplikovaným tlakem vzduchu může poskytnout cenné

informace o soudržnosti původního materiálu.

22

Vzorkování

• Pro správné provedení analýzy je nutné postupovat podle

pokynů výrobce přístroje a tam, kde je to vyžadováno, provádět

pravidelnou kalibraci.

• Kalibrace představuje ověřování správnosti měření pomoci řady

standardů.

• Pro měření velikosti částic existují čtyři třídy referenčních

materiálů.

• První třídou jsou mezinárodní standardy délky.

• Druhou třídou jsou certifikované nebo standardní materiály.

• Třetí třídou jsou sekundární standardní materiály, které se

používají v metodách, jako je např. sítová analýza.

• Poslední typ představují terciální standardy, které jsou pro

kalibraci připravovány in situ.

23

Přístrojová kalibrace

a instrumentace

• Pro správný výběr techniky měření jsou rozhodující tyto

parametry: účel měření, přesnost a preciznost měření, časová

náročnost, reprodukovatelnost, snadnost provedení a cena.

Účel měření

• Účel měření odpovídá druhu informace, který má měření

poskytnout. Např. bude-li nás zajímat velikost a morfologie

částic, použijeme mikroskopická měření a obrazovou analýzu.

Bude-li nás zajímat aerodynamický průměr částic, použijeme

TOF. Pokud nás bude zajímat rychlost a velikost částic

v aerosolu, použijeme Dopplerovu fázovou analýzu, pro kontrolu

kvality produktů použijeme laserovou difrakci.

• Neexistuje univerzální metoda.

• Běžně se pro charakterizaci využívají alespoň dvě různé metody.

24

Výběr techniky pro určení

velikosti částic

• V ideálním případě by měla technika měření pokrýt celou škálu

velikostí vzorku. V následující tabulce jsou uvedeny rozsahy

měření jednotlivých technik.

25

Rozsah velikostí

26

Rozsah velikostí

Preciznost

• Těsnost shody mezi naměřenými hodnotami veličiny získanými

opakovanými měřeními na stejném objektu.

Přesnost

• Těsnost shody mezi naměřenou hodnotou veličiny a pravou

hodnotou měřené veličiny.

Reprodukovatelnost

• Preciznost měření za podmínek reprodukovatelnosti měření (tedy

měřením různým způsobem - různými měřidly, personálem či na

různém místě a v různém čase).

Rozlišení

• Rozlišení metody: nejmenší změna veličiny, která způsobí

rozeznatelnou změnu v odpovídající indikaci (zjednodušeně jde

o nejmenší dílek na stupnici.

• Rozlišení přístroje: schopnost odlišit různé distribuce velikosti

částic, například při bimodální distribuci.

27

Vyhodnocení výsledků

28

Účinnost a cena

• Tyto faktory jsou zejména důležité při každodenním měření

velkého množství vzorků.

• Některé techniky, jako je například obrazová analýza

a sedimentace, jsou pomalé na provedení. Na druhou stranu

techniky, jako je rozptyl světla, jsou rychlé.

• Dalším kritériem je univerzálnost metody, která zohledňuje

omezení jednotlivých metod na určité typy částic. Například pro

sedimentaci je zapotřebí velké množství vzorku, pro elektronovou

mikroskopii nesmí vzorek za vakua sublimovat a pro analýzu

Coulterovým čítačem nesmí být částice rozpustné ve vodě.

• Je třeba rozlišovat metody vhodné pro akademický výzkum a pro

průmysl.

• Posledním faktorem, který je potřeba zohlednit, je pořizovací

cena přístroje, provozní cena přístroje a náklady na jeho údržbu.

Vyhodnocení výsledků

• Důležitými parametry z hlediska použití metody jsou specifičnost,

přesnost, opakovatelnost a robustnost metody.

• V následující tabulce jsou uvedeny definice těchto pojmů.

29

Metody vývoje a validace

• Validace dané metody musí být provedena s podobnými

částicemi, které budou analyzovány.

• Podobnost musí být jak ve velikosti, tak při přípravě těchto částic.

• Pokud je validace provedena s částicemi připravenými

krystalizací, je nevhodné používat metodu na analýzu částic

připravených mletím.

• Reprodukovatelnost se provádí s minimálně 5 vzorky s 5

opakovanými měřeními každého vzorku.

• Výsledky velikostí se uvádí jako d10, d50 a d90, což vyjadřuje, že

10 %, 50 % a 90 % částic má velikost nižší než uvádí dané číslo.

• Pro laserovou difrakci by pro velikost částic větších než 10 m

mělo být (při reprodukovatelnosti výsledků průměru částic

uvedených jako d50) RSD 3 % a u d10 a d90 RSD 5 %.

30

Metody vývoje a validace

• Metody pro stanovení velikosti a distribuce částic, stejně jako

finální farmaceutické produkty s určitou velikostí částic podléhají

mezinárodním směrnicím, jako jsou:

• Mezinárodní konference pro harmonizaci technických požadavků

na registraci farmaceutik pro humánní použití (ICH Q6A, ICH

Q2A and Q2B)

• Lékopis Spojených států (USP)

• Evropský lékopis (Ph. Eur.)

• USA: Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA)

• Evropa: Evropská agentura pro hodnocení léčivých přípravků

(EMEA).

31

Regulační směrnice

• ICH Q6A – se zabývá klasifikací částic podle specifických testů,

které jsou řazeny podle API a podle finálního produktu. Studuje

distribuci API, obsah nerozpuštěné API, rozpustnost, biologickou

dostupnost, zpracovatelnost, stabilitu, jednotný obsah, vzhled

konečného výrobku a další faktory.

• FDA – navrhuje studie stejných parametrů jako ICH Q6A

a doplňuje nutnost kontroly léčiva v průběhu skladování pro

kontrolu, zda dochází ke změnám velikosti částic.

• Obdobné požadavky na charakterizaci materiálů jsou uvedeny

také ve směrnici EMEA.

32

Regulační směrnice

• Jednou z možností podání léčivá je aplikace aerosolů do

dýchacích cest.

• Částice se podle velikosti ukládají na různá místa dýchacího

traktu.

• Obecně lze říct, že běžně používané částice z aerosolů

s velikostí 15 m jsou ukládány v extratorakální oblasti, menší

částice s velikostí 5 – 10 m jsou ukládány v tracheobronchiální

oblasti. Částice s velikostí 1- 3 m jsou ukládány v dolních

cestách dýchacích.

• Inhalované částice mají nejčastěji průměr od 1 do 5 m.

• Při podávání léčiv pomocí inhalátoru suchého prášku (DPI) nebo

pomocí inhalátoru pod tlakem (pMDI) je důležitým parametrem

velikost částic.

33

Příklad: medicinální aerosoly

• Farmaceutické částice určené pro inhalace mají typicky rozmezí

velikostí 0,5 – 10 m a pro jejich charakterizaci je nejvhodnější

laserová difrakce.

• Další možností charakterizace prášků používaných při DPI je

TOF, který lze použít i pro měření velikosti excipientů.

• Jedním z široce používaných excipientů je monohydrát -laktózy.

Velikost částic -laktózy hraje roli při zajišťování uniformity

podané látky.

• Velikost mikronizované -laktózy se obvykle pohybuje v rozmezí

10 – 500 m a může být charakterizována mikroskopickými

technikami, laserovou difrakcí nebo TOF.

• Výhodou je použití kombinace těchto technik, které poskytnou

údaje o velikosti částic, jejich distribuci, ale také o povrchové

struktuře a tvaru studovaných částic.

34

Příklad: medicinální aerosoly

• Aerodynamická velikost finálního farmaceutického produktu

může být velmi odlišná od velikosti částic API, protože obsahuje

také excipient.

• Pro hodnocení aerodynamické velikosti se podle úmluv USP

a Ph. Eur. používají techniky uvedené v následující tabulce.

35

Příklad: medicinální aerosoly

• Obvykle nejsou sledovány všechny body distribuce velikosti

částic.

• Obvykle se sleduje podíl jemné, průměrné a hrubé frakce.

• Průměrná velikost částice se vyjadřuje mediánem d50, jemná

frakce d10 a hrubá d90.

• Šíři distribuce velikosti částic lze vypočítat ze vzorce

𝑆𝑝𝑎𝑛 = 𝑑90 − 𝑑10

𝑑50

• Pro mikronizovaná léčiva určená pro inhalaci je třeba uvádět

podíl částic velkých 0,5-3 m, 3-5 m a 5-10 m.

36

Příklad: medicinální aerosoly

• Analýza velikosti částic je nezbytnou součástí farmaceutického

vývoje a kontroly farmaceutických produktů.

• Používané metody jsou do značné míry závislé na odběru

a přípravě vzorků, technice analýzy a zpracování dat.

• Různé techniky měření poskytují různé charakteristiky velikosti

částic.

• Neexistuje univerzální metoda pro měření velikosti

farmaceutických částic.

• Existuje však řada přístrojů, které jsou komerčně dostupné a jsou

široce používány.

• Pro měření farmaceutických produktů a vlastností finálních

farmaceutických produktů byla publikována řada mezinárodně

uznávaných směrnic.

37

Závěr