Základy hmotnostníspektrometrie

Lenka Hernychováe-mail: hernychova@pmfhk.cz

Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové

HistorieKoichi TanakaKoichi Tanaka vyvinul MALDI technikuTanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., YoshidaT.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151

JB JB FennFenn vyvinul ionizaci elektrosprejemFenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64

Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie

Tanaka K.

Fenn J.B.

PrincipHmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, kteráurčuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty.

Přístroj se nazývá hmotnostníspektrometr.

PrincipMS vypovídá o primární struktuře analyzované

látky

Neposkytuje informace o sekundární či terciálnístruktuře proteinu

Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace….) a může určit i místo modifikace

Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13C/12C, 34S/32S, 18O/16O - kvantifikace

Princip

Umožňuje analýzu komplexních směsí

Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality

Identifikaci proteinů

Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby

Možnost analýzy nekovalentních komplexů

Vlastnosti hmotnostní spektrometrie

Citlivá

Specifická

Rychlá

Jednoduchá interpretace dat

Popis přístroje

1. Iontový zdroj

2. Hmotnostní analyzátor

3. Detektor

4. Řídící počítač

Experimentální uspořádání

Vacuum Vacuum SystemSystem

Sample Sample InletInlet DetectorDetector Data Data

SystemSystemMass Mass

AnalyserAnalyserIonisationIonisationMethodMethod

Atmosphere

SouSouččáásti MS syststi MS systéémumu

MALDI-TOF hmotnostní spektrometry

Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)

4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems)

MALDI-TOF Voyager

(Applied Biosystems)

PrincipIonizace1.Měkké techniky ionizaceEnergetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá.

2. Tvrdé techniky ionizaceDodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.

Typy ionizace

- nárazem elektronů (EI)- působením elektrostatického pole (FI, FD)- chemickou ionizací (CI)- nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB)- ionizací fotony- ionizací 252Cf- elektrosprejem, termosprejem (ESI)- ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)

Hmotnostní analyzátoryUmožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech.

Typy analyzátorůKvadrupolový analyzátor (jednoduché, trojnásobné)

Iontová pastPrůletový analyzátor (TOF)Hybridní (Q-TOF, Q-trap, TOF-TOF, trap-TOF, trap-ICR, …)

FT-MS (ICR-MS)

DetektorPoskytuje analogový signál úměrný počtu

dopadajících iontů.

Dělí se do dvou skupin1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud

vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů(měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin)

2. Násobičové detektory využívají efekt násobeníelektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)

MALDIMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization

Metoda využívá ionizace laserempulsní technika -------- UV (N2)

IR (CO2) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns)

dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých)

jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)

MALDI-TOF MS - ionizace

1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) a usušen (vykrystalizován) na MALDI destičce

2. Laserový výstřel ionizujemolekuly matrice.

3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonuz matrice:

MH+ + A M + AH+

+

MALDI destička

Laser

AH+

+20 kV Ground Variable Grid Grid

Proces MALDI ionizace

Měkká ionizaceMalá nebo žádná fragmentaceJednou nabité ionty [M+H]+; [M-H]-

Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery …Analýza komplexních sloučeninRychlá příprava vzorku & analýzaTolerantní k detergentům a solímJednoduchá interpretace datSpojený s TOF analyzátorem

Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu majírychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z

Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t

Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu

t = k ( m1/z - m2/z)

TOF analyzátor

TOF analyzátor

Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovéma PSD módu

Lineární mód – měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m)Reflektronový mód – měření peptidů (dráha letuje prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m)Post-Source Decay (PSD) – kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)

Letová trubice

Detektor

Zdroj iontů

15-25 kV

Průletový analyzátor (TOF)

Letová trubice

Detektor

Zdrojiontů

Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.

15-25 kV

Průletový analyzátor (TOF)

Lineární mód

Reflektronový mód

Charakteristika – reflektronový mód

Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm)

Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol)

Teoreticky neomezené rozmezí m/z

Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra v jednom ionizačním pulsu

Příprava vzorků pro MSPředseparační techniky

rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, capLC, MudPIT HPLC ….)

Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí

Separace proteinů 1D elektroforézou

+ _-

++ +- -

-+ + + --

++-

-

-

++ - -

- -

-

-- + +

-

-++

-

-pI 3 pI 10+ + +- -

-+

+

+-

-

++---

+

+- -- - -

--

++-

-

++--

PolyaPolyakkrylamidrylamidovýový gelgel

+ +

- -

+

+

-

-

+

- -

--

++

-++

-

První dimenzeDruhá

dimenze

2-Dimensionální PolyAkrylamidováGelová Elektroforéza 2D-PAGE

Separace proteinů 2D elektroforézoupH 3-10

Separace proteinů 2D elektroforézoupH 6-11

Chromatogram separace acetonitrilového extraktu(proteiny) Brucella melitensis získaný z HPLC Alliance.

ACN extrakt Brucella melitensis

Modrými šipkami je označena oblast, ve které byly jímány frakce, a šipky zelenéoznačují konkrétně najímané frakce.

Iontový záznam v podobě BPI (base peak intensity) tryptického digestuacetonitrilového extraktu Francisella tularensis LVS separovaný na CapLC a detekovaný na hmotnostním spektrometru Q-TOF Ultima API.

14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00Time0

100

%

ACN_FT_101204_2MS TOF MS ES+ BPI

3.28e334.78

23.76

22.0918.82

18.65

18.40

13.86

19.89

18.99

21.58

21.28

20.31

23.43

22.47

26.16

25.21

24.17

28.95

28.08

27.57

27.33

30.92

34.07

Separovaný

Protein

Proteolytické

peptidy

MALDI-TOFMS spektrum

proteolyt. peptidů

Proteasa

Postup přípravy vzorků

2D-PAGE a MALDI-TOF

Enzymatické štěpení vzorku

Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidovévazby u kladně nabitých zbytků.

Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin.

- Phe - Trp - Met - Gly - Ala - Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys -

TrypsinTrypsin

Matrice

Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum

Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpacírychlostí vakuového systému)

Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly

U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, kterézajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH3CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci

MALDI-TOF MS Výběr matrice

Sinapinic Acid Proteiny > 10kDa

α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (CHCA)

Peptidy < 10kDa

2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)

Neutrální karbohydráty,Syntetické polymery

“Super DHB”Proteiny,Glycosylované proteinyOligonukleotidy

HABA Proteiny,Oligosaccharidy

3-Hydroxypicolinic acid

Krystalizace matrice

α cyano Sinapinic acidZakulacené Kosodélníky

Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce

Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensisBrucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensis

Interpretace spekter

Metoda peptidového mapování (PMF)

700 1260 1820 2380 2940 3500Mass (m/z)

0

4.0E+

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593]

1112.57

1508.83

1337.66

1806.97

721.401032.59

1718.911278.702299.222007.11

874.52 1204.641381.70 1851.911530.83 2310.251095.54

1025.0 1028.8 1032.6 1036.4 1040.2 1044.0Mass (m/z)

0

1.0E+

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593]

1032.59

1033.59

1034.59

Selekce monoizotopického píkuPro přesnost měření je důležitá kalibrace přístroje

1025.0 1028.8 1032.6 1036.4 1040.2 1044.0Mass (m/z)

0

7.7E

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100%

Inte

nsity

Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717]

1032.59

699.0 1359.2 2019.4 2679.6 3339.8 4000.0Mass (m/z)

0

3.3E+

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1 MC=>DI[BP = 1112.6, 325717]

1112.57

1508.83

1806.97

1337.66

1718.91 2298.252006.111032.59 1702.91721.40

1278.701154.53 1851.911381.70 2211.111134.56 1530.831707.80 1979.99

721.4041251032.5903461112.5702701113.0455971134.5595991154.5338961204.6393201278.6989381337.6588941381.7014981507.8229941635.9078881702.9114391718.9152571806.9685921829.9027191851.9158471869.0375222006.1106772298.2439162301.201154

MALDI-TOFhttp://prospector.ucsf.edu/

Hodnocení spekter pomocí databáze- identifikace proteinu

Primární struktura proteinu

Štěpící místa proteinu (Arg, Lys)

Teoreticky vypočtené m/zproteolytických peptidů

Primární struktura DNA

Spektrum z MS

Experimentálně zjištěné m/zproteolytických peptidů vs.

Metoda Metoda peptidovpeptidovééhoho mapovmapováánníí -- Peptide Peptide MassMass FingerprintingFingerprinting

Interpretace spekterDatabáze přístupné na Internetu

Interpretace spekterHodnocení v databázích

Interpretace spekterVýsledek

Anotace 2D-PAGE proteinové mapy

http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/menu_frame.cgi

Kalibrace přístroje

699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 4001.0Mass (m/z)

0

1.7E

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100%

Inte

nsityVoyager Spec #1[BP = 1298.0, 17155]

1298.0050

1047.6398

1674.5700

2096.0804

2468.4231

1771.68092112.08081312.04791069.6449 1678.6340 2482.4645

699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 4001.0Mass (m/z)

0

1.7E

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100%

Inte

nsity

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7[BP = 1298.0, 16995]

1298.0050

1047.6397

1674.5696

2096.0800

2468.4233

1771.6816

2112.06991302.00031069.6447 1678.6244 2482.4588

699.0 1359.4 2019.8 2680.2 3340.6 4001.0Mass (m/z)

0

1.7E

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100%

Inte

nsity

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>MC[BP = 1296.7, 16

1296.6862

1046.5400

1672.9278

2094.0833

2466.1173

1769.9575

2110.05981300.67801068.5256 1676.9791 2480.1411

Angiotensin IAngiotensin IINeurotensinACTH (1-17)ACTH (18-39)

MS/MS spektra

Schéma fragmentace

NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO2HR4R1 R2 R3

y1

b3

N-terminus C-terminus

b2b1

y3 y2

Schéma fragmentace

Hmotnosti aminokyselin

Hledání y-iontové sérieJr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

968.2

584.9

969.2

653.2

766.2218.8

654.1 881.2190.9

534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2

859.0748.1635.1552.1

F

∆71

A

∆87

S

∆115

D

∆113

X

∆101

T

∆113

X

∆129

E

Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

968.2

584.9

969.2

653.2

766.2218.8

654.1 881.2190.9

534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2

859.0748.1635.1552.1

FASDXTXEK, Y

Hledání y-iontové série

Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

968.2

584.9

969.2

653.2

766.2218.8

654.1 881.2190.9

534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2

859.0748.1635.1552.1

FASDXTXEK, Y

F A S D X T X E Y K

Hledání b-iontové série

Kontrola hmotnosti prekurzorového píku(součet hmotností všech aminokyselin)

Jr_74 #888-890 RT: 22.70-22.74 AV:2 NL: 4.66E5T: + c d Full ms2 593.8@35.00 [ 150.00-1200.00]

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100m/z

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

968.2

584.9

969.2

653.2

766.2218.8

654.1 881.2190.9

534.0475.9877.2439.1 970.2310.1 585.8420.9 767.2516.0 1039.2730.3 950.2220.0 617.1305.9 403.1 882.2 1021.1841.1292.0 462.9 822.3385.7261.1 714.2694.1 894.1341.1 1042.2

859.0748.1635.1552.1

FASDXTXEK, Y

F A S D X T X E Y K

1186.61186.6