Vyšetřování parametrů humorální imunity

Imunochemické metody

• řada metod založených na principu reakce:

antigen (Ag) + protilátka (Ab) → imunokomplex (IK)

• stanovujeme buď Ag nebo Ab (obecně analyt)

Vyšetřování humorální imunity• Imunoprecipitace v roztoku - Nefelometrie

- Turbidimetrie

• Imunoprecipitace v gelu - Imunodifuze

- Elektroforéza

• Aglutinace (Ag – korpuskulární charakter; IgM, IgG)

• Komplementfixační testy (Ab+Ag+komplement)

• Imunoreakce se značenými protilátkami (EIA, ELISA, RIA)

• Imunobloting (southerblot, notherbloting,westernbloting)

• imunofluorescence

Imunoprecipitační křivka

Zákalové metody: nefelometrie a turbidimetrie

Použití: – používá se prostanovení vzorků o vyšších

koncentracích proteinů

– stanovení množství (koncentrací) běžných proteinů lidského séra (jednotlivé třídy Ig, CRP, RF, složky komplementu C3 a C4, C1 INH)

Nefelometrie

Princip: základem metody je měření intenzity odraženého světla od zákalu vzniklého reakcí Ag – Ab.

Z – zdroj (laser, výbojka)

K – kyveta se vzorkem

D – detektor D↑

Z →→→→ K (Ag-Ab)

↓

D

 

 

Nefelometrie

Vyhodnocení: dle kalibrační křivky sestavené pomocí standardu (Ag o známé koncentraci) a získaných odpovídajících hodnot intenzity odraženého světla

intenzita odraženého světla

koncentrace Ag

Princip: měří úbytek intenzity světla po jeho

průchodu kyvetou obsahující IK

 Zdroj – Kyveta – Detektor jsou umístěny v jedné přímce:

Z →→→→ IK (Ag-Ab) → D

 

Vyhodnocení: dle kalibrační křivky

Turbidimetrie

Radiální imunodifuze

Postup: gel smícháme s Ab → inkubace s Ag → Ag difunduje do okolí a tvoří s Ab imunokomplexy (IK) → prstencový precipitát

 

Hodnocení: změří se průměr prstence a koncentrace Ag se odečte na kalibrační křivce

Použití principu RID: stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu, funkční test C1 INH

Jednoduchá radiální imunodifuze ( S1 – S7 – standardy, V1 – V2 – vzorky)

Dvojitá imunodifuzeOuchterlony

• pasivní dvojitá imunodifuze - difunduje Ag i Ab• používá se pro stanovení extrahovatelných jaderných antigenů

Identické antigeny neidentické antigeny částečně identické antigeny

Aglutinace (shlukování)

• Antigen v této reakci má korpuskulární charakter (např. erytrocyt, bakterie, Ag navázaný na latexové častici…)

• Protože protilátka (IgG, IgM) má více vazebných míst, dochází ke shlukování částic či buněk na jejichž povrchu je lokalizovaný Ag

EIA – enzyme immunoassay• skupina metod

Společný princip: použije se Ag nebo Ab značená enzymem (Ag*, Ab*) → po navázaní s hledaným Ag nebo Ab ze vzorku je tak enzymem označen celý IK (Ag-Ab*, Ab-Ag*) → enzym reaguje s přidaným substrátem za vzniku výsledného produktu, který detekujeme

Vyhodnocení: pomocí kalibrační křivky (Ag o známé koncentraci – standardy- a k nim změřené vlastnosti produktu – př. intenzita zbarvení)

 

Použití: kvantitativní stanovení malých množství některých proteinů (př. specifických Ab, hormonů, cytokinů, TU markerů...)

EIA – enzyme immunoassay

Dělení EIA metod:

a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu:

• ELISA (fotometrická detekce barevného produktu)• FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného

produktu)• LEIA (luminometrická detekce světla

uvolněného/emitovaného při změně chemické struktury substrátu)

b) dle postupu: • heterogenní x homogenní • kompetitivní x nekompetitivní

EIA – enzyme immunoassay

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay

= heterogenní nekompetitivní sandwichová ELISA vícevrstevnatá (sandwichová) metoda – analyt (Ag nebo Ab), je v konečné fázi vázán mezi dvěma vrstvami:Ab-Ag-Ab* nebo Ag-Ab-Ab*

Princip: pevná fáze je pokryta př. Ag → přidáme vzorek s hledanou Ab → tvorba IK (Ag - Ab) → promytí → přidáme konjugát, tzv. „sekundární Ab“ → vzniká komplex Ag-Ab-Ab* → promytí → přidán substrát → enzymatická reakce → vznik barevného produktu

ELISA

Hodnocení ELISA: fotometr měří absorbanci (intenzitu zbarvení) vzniklého barevného produktu.

Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vyšetřovaného vzorku a příslušná hodnota se odečítá pomocí kalibrační křivky

ELISA

ELISA

ELISA

EIA – enzyme immunoassayPozn:

FEIA – fluoroenzymoimunoanalýza

- výsledkem reakce je fluoreskující produkt

hodnocení: dle kalibrační křivky! - fluorometr měří intenzitu fluorescence

použití: př. stanovení specifických IgE 

 

LEIA – luminoenzymoimunoanalýza

– výsledkem reakce je změna chemické struktury substrátu - způsobí uvolnění fotonů - světélkování

hodnocení: dle kalibrační křivky! - luminometr měří intenzitu emitovaného světla

použití: př. stanovování hladin specifických IgE, ECP, některých hormonů, TU markerů atd.

RIA – radioimunoanalýza

Princip: Ag nebo Ab se značí radioaktivním isotopem (rozdíl od metody EIA)→ následně označen IK

• vysoká citlivost a specifičnost• nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení,

bezpečnost práce

Použití: př. stanovování hladin některých hormonů, TU markerů, ...

Nepřímá imunofluorescence

Postup:1. inkubace pacientova séra (Ab) se substrátem (Ag) fixovaným na podložním sklíčku2. inkubace s anti-lidskou protilátkou značenou např. FITC (anti-human IgM/FITC, anti-human IgG/FITC, anti-human IgA/FITC)3. detekce pomocí fluorescenčního mikroskopu

Nepřímá imunofluorescence