Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

1

Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/

2

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Teorie HPLC

Praktické aspekty, vývoj metody

Validace chromatografické metody

Aplikace HPLC

Sylabus přednášky:

Základní chromatografické charakteristiky: distribuční konstanta retenční čas retenční objem průtok mobilní fáze kapacitní faktor separační faktor rozlišení symetrie píku Teorie chromatografického patra: účinnost separačního procesu Van Deemterova rovnice ovlivnění rozlišení

3

Distribuční konstanta HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi.

Distribuční konstanta KD je poměr rovnovážné koncentrace analytu ve stacionární fázi a mobilní fázi

m

s

D

A

AK

sA je rovnovážná koncentrace analytu ve stacionární fázi

mA je rovnovážná koncentrace analytu v mobilní fázi

4

Retenční charakteristiky

iRMiR ttt ,, 'Mt

iRt ,

Retenční čas tR je doba, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky

Mrtvý čas tM je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován.

Redukovaný retenční čas t‘R je čas, který stráví analyt ve stacionární fázi.

iRMiR VVV ,, '

Retenční objem VR je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se příslušný analyt dostal od počatku ke konci separační kolony.

Mrtvý objem VM je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se nezadržovaný analyt dostal od počátku ke konci kolony.

5

Retenční charakteristiky

Lineární rychlost mobilní fáze u [cm/min]

Objemová průtoková rychlost mobilní fáze Fm [ml/min]

Mt

Lu

M

M

m

t

VF

Kapacitní faktor

M

MiR

t

ttk

, m

s

ID

mi

si

V

VK

n

nk *,

6

Výhoda – nezávislý na délce kolony a průtoku mobilní fáze

k = 0 analyt nestráví ve SF žádný čas a proto není zadržován k = 1 analyt stráví stejný čas v MF a v SF a proto eluuje ve 2x mrtvého času kolony k = 4 analyt stráví 4x času ve SF oproti MF a proto eluuje v 5x mrtvého času kolony

7

Separační faktor - selektivita

1,

2,

1

2

D

D

K

K

k

k

Retenční charakteristiky

α = 1,2 α = 1 α = 1,6

Retenční charakteristiky Rozlišení píků

)(*2

1

)(

1,2,

1,2,

2,1

BB

RR

ww

ttR

2,Rt1,Rt

Dva píky jsou rozděleny na základní linii, pokud R>1.5

8

Symetrie píku Faktor asymetrie píku Tailing faktor píku

Snažíme se o co možná nejsymetričtější píky!

Nesymetrické (¨fronting nebo tailing¨) píkí mohou způsobit

nepřesnou kvantifikaci zhoršení rozlišení zakrytí minoritních píků nereprodukovatelnost retenčních časů

9

Teorie chromatografického patra Účinnost chromatografického procesu nám říká, jak hodně (málo) je zóna eluující látky rozšiřována při průchodu HPLC systémem a kolonou.

Gaussova křivka

10

tr – střední hodnota δ – směrodatná odchylka

Teorie chromatografického patra Počet teoretických pater

22

5.0

,,

*545.5*16

w

t

w

tN

iR

b

iR

Výškový ekvivalent teoretického patra

N

LH

Typický počet teoretických pater za optimálních separačních

podmínek

11

Van Deemterova teorie

mdp HHHH

pH

dH

mH

vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi

molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi

odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi

12

pH vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi

AdH pp **2

Díky nehomogenitě stacionární fáze proudí mobilní fáze různými kanálky stacionární fáze a tím urazí různou dráhu (analyty se proto navzájem opožďují nebo předbíhají)

geometrický faktor

velikost částic

Jak minimalizovat vířivou difuzi: používat dobře naplněné kolony používat malé částice používat kolony s malou distribucí velikosti částic

13

dH molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi

Molekuly analytu difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s nižší koncentrací.

u

B

u

DH

md

**2

korekční faktor charakterizující tvar kanálků v náplni kolony

difúzní koeficient

lineární rychlost mobilní fáze

Jak minimalizovat vířivou difuzi: používat vyšší průtoky mobilní fáze používat krátké spojovací kapiláry s vhodným vnitřním průměrem

Příspěvek molekulární difúze v LC je při běžných průtocích mobilní fáze zanedbatelný

14

mH odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi

uCuD

d

D

dH

p

p

m

p**

** 22

koeficient závislý na distribuci velikosti částic a distribuci pórů

průměr částic náplně kolony

difúzní koeficient analytu v mobilní fázi

intračásticový difúzní koeficient

Jak minimalizovat odpor proti převodu hmoty:

používat nižší průtoky mobilní fáze používat menší rozměry částic používat vyšší teplotu na koloně

15

Van Deemterova rovnice

H (µm)

lineární průtoková rychlost (cm)

optimální průtoková rychlost

minimální H

16

Mimokolonové příspěvky k rozšiřování zón

2

det

2222

ektorspojeinjektorkolonacelkem

objem vzorku má být co nejmenší

spojovací kapiláry mají být co nejkratší s malým vnitřním průměrem

zavisí na objemu a geometrii detekční cely

17

18

19

Jak ovlivnit rozlišení?

)(*2

1

)(

1,2,

1,2,

2,1

BB

RR

ww

ttR

k

kNR

1*

1*

42,1

účinnost selektivita retence

Skutečná rovnice rozlišení

kinetický aspekt termodynamický aspekt kapacitní aspekt

rozlišení je přímo úměrné druhé odmocnině z počtu teoretických pater kolony

rozlišení je přímo úměrné selektivitě a blíží se k nule pokud se selektivita blíží k jedné

rozlišení je přímo úměrné retenci a blíží se k nule pokud se retence blíží k nule

20

k

kNR

1*

1*

42,1

Jak ovlivnit rozlišení?

největší efekt změny k pro k < 2 pro k > 10 nemá smysl dále zvyšovat k

21

k

kNR

1*

1*

42,1

Jak ovlivnit rozlišení? selektivita je nejúčinější nástroj jak ovlivnit rozlišení

Parametr Použití

organická složka mobilní fáze změna organické složky (acetonitril X metanol X

tetrahydrofuran)

pH mobilní fáze změna stupně ionizace analytů (změna hydrofobicity)

síla mobilní fáze + aditiva mobilní fáze

změna poměru organické a vodné složky mobilní fáze

stacionární fáze největší vliv na selektivitu

teplota nejmenší vliv na selektivitu, často používán v chirálních

separacích

22

k

kNR

1*

1*

42,1

Jak ovlivnit rozlišení?

23

k

kNR

1*

1*

42,1

Jak ovlivnit rozlišení?

Faktory ovlivňující účinnost průtok mobilní fáze délka kolony velikost částic

24

k

kNR

1*

1*

42,1

Jak ovlivnit rozlišení?

25

Gradientová eluce

V průběhu gradientové eluce dochází ke změně složení mobilní fáze.

g

e

bk

*3,2

1

strmost gradientu

g

g

t

Stb

*0

doba trvání gradientu

mrtvý čas kolony

změna složení mobilní fáze během gradientu

eluční síla organického modifikátoru

bn

g

wn

tP

1*1

1

Píková kapacita

26

Gradientová eluce gradientový průběh je charakterizován gradientovými křivkami

27

Gradientová eluce píky 8 a 9 jsou velmi široké a eluují ve

vysokých retenčních časech

vyřešen problém s píky 8 a 9. Došlo ke zhoršení rozlišení píku 1

a 2, které koeluují

Problémy isokratické eluce řeší gradientová eluce, kdy všechny píky jsou rozděleny na základní linii s krátkou dobou celkové analýzy

28

Gradientová eluce

Příklad celkové doby gradientu na selektivity některých píku

29

Použité zdroje a zároveň doporučená literatura

30

Monografie: Snyder R. L., Kirkland J. J.: Practical HPLC method development Snyder R. L., Kirkland J. J.: Introduction to modern chromatography Nováková L., Douša M.: Moderní HPLC separace v teorii a praxi (první a druhý díl) Snyder R. L., Dolan J. W.: High performance gradient elution Meyer V. R.: Practical high performance liquid chromatography Dong M. W.: Modern HPLC for practicing scientists Kromidas S.: More practical problem solving in HPLC

Internetové zdroje: www.hpst.cz www.waters.com www.chromacademy.com www.hplc.cz http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/ www.shimadzu.com

Časopisy: Journal of Chromatography A, B Journal of Separation Science Analytical Chemistry Chromatographia Journal of Liquid Chromatography LCGC