Základy princip pr tokovécytometrie

Flow Cytometry

Flow cytometrie je technologický proces, který umož ujeindividuální stanovení fluorescencejednotlivých bun k.

Tento proces umož uje stanovit tisíce bun k za vte inu

Informace jsou d ležité z hlediska charakterizace bun k

Historie• Flow cytometrie je vyvinuta z mikroskopické

techniky• F.T. Gucker (1947) poprvé sestrojil p ístroj pro

detekci bakterií v laminárním proudu vzduchu• L. Kamentsky (IBM Labs), a M. Fulwyler (Los

Alamos Nat. Lab.) dále experimentovali síd ním bun k podle jednotlivých charakterizací

• V roce 1972 L. Herzenberg (Stanford Univ.)vyvinul „t ídi “, který rozd loval bu ky obarvenéfluorescen zna enými Ab - FluorescenceActivated Cell Sorter (FACS).

Aktiva ní proces fluorescence neboImunofluorescence

FITC FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

Antibodies recognize specificmolecules in the surface ofsome cells

But not others

When the cells are analyzed by flowcytometry the cells expressing the markerfor which the antibody is specific willmanifest fluorescence. Cells who lack themarker will not manifest fluorescence

Antibodies are artificiallyconjugated to fluorochromes

Antibodies

Bun né parametry, které mohou býteny pomocí FC

• No reagents or probesrequired (Structural)– Cell size(Forward Light

Scatter)– Cytoplasmic grabularity(90

degree Light Scatter)– Photsynthetic pigments

• Reagents are required.– Structural

• DNA content• DNA base ratios• RNA content

– Functional• Surface and intracellular

receptors.• DNA synthesis• DNA degradation

(apoptosis)• Cytoplasmic Ca++• Gene expression

Hlavní Vedlejší

Aplikace FC

• Immunofluorescence• Kinetika bun ného cyklu• Bun ná kinetika• Genetika• Molekulární biologie• Mikrobiologie• Parasitologie

• Velikosti bun k

• Cytoplazmatické granularity

• Povrchových antigen

• Apoptózy

• Intracelulární produkce cytokin

• Intracelulární signalizace

• Bun ného cyklu, množství DNA….

• Vázaného a volného kalcia

• Bun né proliferace

Tyto aplikace zahrnují zjišt ní:

• Flow cytometrie v sob integrujeelektroniku, fluidiku, PC, optiku, softwarea laser technologie v relativnjednoduchém uspo ádání

Laser optics

Laser Beam

Flowchamber

Sheath

SampleY

X

Z

Y Z

X

Hydrodynamickáfokusace

PE FL

FITC FL

488nm Sct

Laminar Fluidic Sheath

CoreSheath

OuterSheath

• Each cell generates a quanta of fluorescence

PE FL FITC FL 488nm Sct

Confocal LensDichroic Lenses

Photomultiplier Tubes

(PMT’s)

DiscriminatingFilters

ForwardLightScatteringDetector

FlowCell

LaserBeam

FSSensor

FluorescencePickup Lens

SSSensor

FL1Sensor525BP

FL2Sensor575BP

FL3Sensor620BP

FL4Sensor675BP

488DL

488BK

550DL

600DL

645DL

Optical BenchSchematic

From Fluorescence to Computer Display• Bun ná fluorescence je detekována r znými

detektory(PMT’s).• PMT’s convert light into electrical pulses.• These electrical signals are amplified and digitized using

Analog to Digital Converters (ADC’s).• Each event is designated a channel number (based on

the fluorescence intensity as originally detected by thePMT’s) on a 1 Parameter Histogram or 2 ParameterHistogram.

• All events are individually correlated for all theparameters collected.

Light Scattering, 2 Parameter Histogram

Forward Light Scatter (FLS)

90 degreeLight Scatter

Bigger

MoreGranular

Live Cells

BiggerCells

DeadCells

ApoptoticCells

X Axis

Y Axis

1 Parameter Histogram

1 2 3 4 6 7 150 160 170 .. 190

Channel Number

Positive

Negative

BrighterDimmerCount

1

4

6

Fluorescence picked up from the FITCPMT

2 Parameter Histogram

FITC FL

PE FL

NegativePopulation

Single PositiveFITCPopulation

SinglePositive PIPopulation

Double PositivePopulation

Flow Cytometry Data

SmallerRegion,Live cellsmostly

Larger Regionincludes all cells

UltrasonicTransducer

488nm Formard Light Scatter Detector

Collimated Light Path ThroughDichroic and Band Pass Filters

SS FL2FL1

FL4

FL3

Pulse Height(0-10Volts)

Time(useconds)

Pressurized1XPBS(Sheath)

Pressurized CellSample

Analog Data

PMTs

Flow Cytometry and sorting

ení trombocyt na analyzátoruSYSMEX XE-2100

U analyzátor využívající pr tokové cytometrie mohou býtvýsledky ovlivn ny zne išt ním a technickým stavem p ístroje a

ítomnosti jiných krevních element jedná se o metodu nep ímou.

Stanovení trombocyt opticky• 4,5 l vzorku je na ed no 895,5 l Ret Search (II) diulentem• vzorek je injektován do RET reak ního kanálu, kde je ke vzorku p idáno

18 l barva, která proniká p es membránu do bun k a barví RNAretikulocyt a DNA/RNA v jaderných bu kách (reagencie Ret Search(II) dye)

• po 31 vte inách dochází k obarvení vzorku• vzorek je analyzován metodou pr tokové cytometrie za použití

semikonduktorového laseru

Vyhodnocení• zm ené výsledky jsou zobrazeny pro jednotlivé parametry na displeji

ístroje a na monitoru po íta e• analyzátor podává p esné informace i o po tech erytrocyt a

leukocyt