Genová exprese
Regulace
genové exprese
28 000 genů
6 000 -
12 000 genů
Ústřední dogma molekulární
biologie
„Svět RNA“
Prokaryotická a eukaryotická mRNA
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Chemická struktura RNA
Ribosa (2’-OH skupina)
Uracil místo thyminu (absence methylu v
poloze 5)
Důsledky: Většinou jednořetězcová šroubovice s kratšími dvouřetězcovými úseky Variabilita prostorové organizace druhého a dalších řádů Komplexní trojrozměrná struktura RNA může mít i strukturní a katalytickou funkci
Rozdílymezi RNA a DNA:
Funkční domény 23S rRNA
Katalyzované reakce – substrátem většinou RNA
nejčastěji místně specifická hydrolýza fosfodiesterových vazeb
endonukleasa
obrácený směr – syntéza fosfodiesterových vazeb
RNA ligasa, RNA polymerasa
transesterifikace
sestřih
Katalytická RNA - ribozymy
Substrátem není RNA !
hydrolýza aminoacylesterových vazeb
syntéza peptidové vazby
28S rRNA
Typy RNA v buňce
Dvě základní regulační úrovně:1. Struktura chromatinu
2. Aktivita RNA polymerasy a s ní kooperujících bílkovin
Transkripce
Dvě základní regulační úrovně:1. Struktura chromatinu
2. Aktivita RNA polymerasy a s ní kooperujících bílkovin
heterogenní jaderná RNA = primární transkript
= pre-mRNA = hnRNA
Polyadenylace
m7G
m7G
AAAAAm7G
Zrání pre-mRNA - posttranskripční modifikace
mediátorová RNA = mRNA
Sestřih
Syntéza čepičky
exon intron
čepička
poly(A) řetězec
CTD platforma
C-terminální doména RNA polymerasy II
Regulace aktivity RNAP II
Platforma pro asociaci RNP komplexů
posttranskripčních modifikací primárního
transkriptu
Vytvoření čepičky, sestřih, rozštěpení, polyadenylace
RNA a RNP
hnRNP/mRNP – komplexní a dynamická struktura velká množina bílkovin vážících se k transkriptu po celou dobu jeho existence obecné a specifické bílkoviny bílkovinné složení se průběžně mění
RNP – ribonukleoproteinová částice
Základní struktura čepičky: m7GpppN(m)pN(m)p
Čepička
1974: mRNA několika eukaryotických virů
na 5’-konci není trifosfát, ale čepičkaDnes: Čepička u téměř všech eukaryotických mRNA
Úprava 3’-konce pre-mRNA - polyadenylace
Význam čepičky a poly(A) řetězce
Účast při sestřihu
Export mRNA z jádra
Stabilizace mRNA v cytoplasmě
Regulace degradace mRNA
Komunikace obou konců mRNA
Translace
Výjimka – histonové mRNA
Metabolismus histonové mRNA
Replikace DNA S-fáze buněčného cyklu: syntéza DNA koordinovaná syntéza množství histonů
Histonová mRNA –– 70 typů H mRNA (savci) neobsahuje introny, není polyadenylovaná synchronizovaná regulace exprese všech H
genů
S-fáze 35 x nárůst abundance H mRNA
aktivace transkripce
zvýšení stability (T1/2 = 45-60 min)
konec S-fáze úbytek H mRNA
represe transkripce
destabilizace mRNA (T1/2 = 10 min)
M
E
C
H
A
N
I
S
M
U
S
Lidský gen pro dystrofin78 intronů: 99.4 % délky genuPre-mRNA: 2 500 000 nt / 79 exonůmRNA: 14 000 nt
Sestřih (splicing)Vystřižení intervenujících
sekvencí (intronů) následované spojením
odpovídajících částí kódující oblasti (exonů)
Obratlovci a rostliny
Introny v 80 - 85 % všech genů
Kvasinky
Introny v 235 z 6000 genů
snRNP, spliceosom
Katalytické jádro spliceosomu
Fosfát vážící Mg++
Formování terciálních interakcí mezi U6 a U2 snRNA (pseudoknot)
Místo 2’,3’,5’-fosfotriesterové vazbys A v místě větvení
Párování k 5’-SS
Párování k místu větvení
velice pravděpodobně ribozym
Alternativní sestřih
Sestřih pre-mRNA• Nezbytná součást genové exprese• Významný regulační krok
Variabilní užití potenciálních míst setřihu
Komplexní transkripční jednotka• Jedna pre-mRNA může dát vzniknout mnoha zralým mRNA• Mnoho bílkovin může být kódovanáno jedním genem
Člověk - 40 % genů( podle 5 000 000 EST / 33 000 genů )
Arabidopsis - zatím asi 5 % genů( podle 179 000 EST / 27 000 genů )
Drosophila gen pro Down syndrome cell adhesion molecule (DSCAM): teoreticky až 38 016 isoforem
ORF
Součástkatalytickéha
jádra
ribozym
nukleofil
Samosestřih - ribozymy
Mobilní genetické elementy
Mechanismus sestřihu stejný jako u spliceosomů• snad jejich evoluční předchůdci• teorie vzniku snRNA rozpadem intronů II. typu
Samosestřih – introny II. typu
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Komplex jaderného póru
1 000 – 10 000 jaderných pórů na jednom jádře
Obratlovci (Xenopus) – 125 MDa (30 x velikost ribosomu);odhad: původně 50-100 bílkovin, dnes cca 30-40
Celý komplex průměr 120 nm
Průměr kanálu 9 nm v klidu 26 nm v aktivním stavu
Komplex jaderného póru
Hustota pórů na povrchu
jádra oocytu Xenopus laevis
Export mRNP z jádra
Slinné žlázy larev Chironomus tentans
Obrovská mRNA
~ 75 kb > 10 MDa
Ø 50 nm
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Stabilita, lokalizace a translatovatelnost mRNA
Cis-elementyPrimární sekvence mRNA
Strukturní elementyČepička (5’-5’ trifosfátová vazba)
Poly(A) řetězec
Trans-faktoryRibosomy
RNA-vazebné bílkoviny
Ribonukleasy
Antisense RNA
Komplexní soubor vztahů – dynamické složení mRNP
lokalizace x stabilita x translační aktivace/inhibice
Stabilita, lokalizace a translatovatelnost mRNA
Abundance mRNA – aktuální poměr rychlosti syntézy a degradace
TranskriptyExtrémně stabilní - skladované mRNA
Stabilní - konstitutivní geny
Nestabilní – regulační bílkoviny transkripční faktory, geny buněčného cyklu, geny stresové odpovědi regulace stability mRNA – změna poločasu života dané mRNA až 10x
fyziologická – vývojové stadium, rychlost růstu, diferenciace podněty okolí – stres, výživa, hormony
Iron-responsive element
IRE (iron-responsive element)
vlásenka (23-27 nt) smyčka (6 nt)
Transferrin receptorexprese při nedostatku Fe
IRP (IRE-binding protein)
volný – enzym akonitasa vazba k IRE stabilizuje TR mRNA regulace železem
Vztah stability a translatability mRNA
Ferritinexprese při nadbytku Fe
Naprosto opačný efekt stejného elementu v závislosti na jeho poloze v
mRNA
Lokalizační cis-elementy
ash1 mRNA
Drosophila melanogast
er
Embryo
Lokalizace některých
mRNA
Protismyslná RNA
RNA komplementární k cílové RNA, reguluje její funkci ovlivnění stability cílové RNA inhibice nebo zesílení exprese chemická modifikace cílové
RNA/DNA
Umělé protismyslné molekuly – antisense DNA oligonukleotidy
terapeutické užití
štěpeny RNasou H (štěpí DNA/RNA hybrid)
Délka 22 nt až >10 kb
Umlčování genů / gene silencing
Petunia (1990): změny barev květů po transformaci genem pro chalcon synthasu za 35S promotorem
Obranná strategie – kontrola virové infekce umlčování cizorodých genů
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Translace
Syntéza bílkovin na základě matrice mRNA
Ribosom – největší RNP částice
4,2 MDa = 2,8 + 1,4 MDa
Peptidyl transferasa - ribozym
Ribosom a translace
Translace video
Zrání ribosomální RNA
Rozštěpení polycistronického 45S transkriptu
endonukleasy, exonukleasy
Samosestřih pre-rRNA
ribozym
Modifikace nukleotidů pre-rRNA
účast snoRNP
Posttranskripční modifikace tRNA
Úprava 5’-konce tRNA RNasa P, RNP ribozym RNA + 1 či více bílkovin
Modifikace nukleotidů
3’-terminální sekvence CCAATP(CTP):tRNA nukleotidyltransferasa enzymatická syntéza bez templátu
Sestřih (introny IV. typu) introny v antikodonové smyčce enzymatický – endonukleasa, ligasa
Modifikacenukleotidů v tRNA
80 popsaných (2001) nukleotidových derivátů
Specificita aminoacylace
Rozpoznání kodónu
3D struktura molekuly
Zvýšení povrchu tRNA(dostupnost pro bílkoviny)
Význam:
Úrovně regulace genové exprese eukaryot
Závěry
Množství úrovní regulace genové exprese
Komplikovanost a vzájemné propojení regulačních mechanismů
Obrovská variabilita „světa RNA“ v současné eukaryotické buňce
Řada reakcí katalyzovaných ribozymy
Dynamika formování a přeskupování ribonukleoproteinových komplexů
Kontinuum světa RNA a bílkovin v eukaryotické buňce
Kontakt:David Honys
ÚEB AV ČR
http://www.ueb.cas.cz/laboratory_of_pollen_biology/default.htm