Vliv vnitVliv vnitřřnníích a vnch a vněějjšíších ch faktorfaktorůů na mikroorganizmy v na mikroorganizmy v
potravinpotravinááchch
Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách
Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodníaktivita,antimikrobiální aktivity
Vnější: vlhkost, teplota, atmosféraImplicitní: specifická růstová rychlost,
synergismus, antagonismus, komensalismusTechnologické: krájení, mytí, balení, záření,
pasteurizace
Mikroorganizmus a potravinaMikroorganizmus a potravina
• uchycení mikroorganizmů (fimbrie, pouzdra, slizovávrstva)
• kontaminační dávka• druh mikroorganizmů (růstová fáze, generační
doba)• mikroflóra potraviny (vzájemné vztahy mezi
mikroorganizmy)• vliv vnitřních faktorů• vliv vnějších faktorů
VnitVnitřřnníí faktoryfaktoryPůsobením mikroorganismů se mění vlastnosti potravin (např. textura, konzistence, vůně, chuť, vzhled). K jakým změnám dojde je závislé na chemických a fyzikálních vlastnostech potraviny (intrinsic factors):
• složení potraviny (dostupnost živin)• koncentrace vodíkových iontů (pH)• aktivita vody (aw)• oxido-redukční potenciál (Eh)• textura potraviny• přítomnost antimikrobiálních látek v potravinách
VnVněějjšíší faktoryfaktory
Způsob uchování a skladování potravin má významný vliv na mikroflóru potravin. Jakost a trvanlivost potravin je určována vnějšími faktory (extrinsicfactors).
• teplota prostředí• relativní vlhkost vzduchu (% RV)• složení atmosféry• čas
DalDalšíší faktoryfaktory
Vedle vnitřních a vnějších faktorů má na trvanlivost potravin z pohledu mikrobiologického vliv také počet a druhové zastoupení mikroflóry.
Čím méně je v potravině mikroorganismů a čím ménějsou aktivní, tím delší čas je potřeba k jejich pomnožení a vzniku senzorických změn (dlouhá lagfáze a delší generační čas)
Tlak, záření, působení antimikrobiálních látek, dezinfekčních prostředků
Vztahy mezi mikroorganismyVztahy mezi mikroorganismy
KomenzalizmusKomenzalizmus- volné sdružení MO, kteří si vzájemně neškodí ani
neprospívají (např. mikroflóra úst, kožnímikroflóra, atd.)
SynergizmusSynergizmus ((syntrofizmussyntrofizmus))- umožňuje žít určitým MO v daném prostředí pouze
v přítomnosti MO jiných (např. aeroby odčerpávajíkyslík z prostředí → umožňují růst anaerobů, štěpení makromolekul extracelulárními enzymy, kefírové kultury)
Vztahy mezi mikroorganismyVztahy mezi mikroorganismy
SymbiSymbióózaza- vzájemně prospěšné soužití MO, např. s hmyzem,
rostlinami nebo vyššími živočichy (např. rozklad celulózy v bachoru přežvýkavců, produkce vitaminu K bakteriemi střevního traktu)
AntagonizmusAntagonizmus- nepříznivé působení jedné skupiny mikroorganizmů
na druhou (např. bakterie mléčného kvašení a hnilobné bakterie)
Vztahy mezi mikroorganismyVztahy mezi mikroorganismy
ParazitizmusParazitizmus- jeden MO využívá vnitrobuněčných meziproduktů
metabolismu jiného druhu a tím jej ničí. Jev častější pro soužití mikroorganizmů s živočichy nebo rostlinami (např. bakteriofágy, mykoviry)
MetabiMetabióózaza- produkty metabolismu jedněch mikroorganizmů
jsou postupně využívány mikroorganizmy dalšími (např. zoctovatění alkoholických nápojů)
- metabióza umožňuje rychlou mineralizaci organických látek v přírodě - koloběh prvků
VnitVnitřřnníí faktory faktory -- slosložženeníí potravinypotraviny
Obecně platí, že potraviny obsahující více nízkomolekulárních látek a větší množství vody se kazí rychleji.
• obsah vody v potravině• zdroj energie a zdroj dusíku (sacharidy, alkoholy,
AMK)• zdroj dusíku (AMK, peptidy, bílkoviny)• vitamíny a růstové faktory (B vitamíny)• minerální látky
pHpH
BakterieBakterie –– slabě kyseléaž slabě alkalické pH
KvasinkyKvasinky –– preferujíkyselé prostředí
PlPlíísnsněě –– tolerují velmi široké rozmezí
pHpH
Hodnota pH ovlivHodnota pH ovlivňňuje:uje:- rozmnožování bakterií, rychlost růstu, vitalitu- intenzitu a charakter metabolizmu- odolnost buněk ke zvýšených teplotám- kyselé pH (<4,0) zabraňuje klíčení spór- změna dostupnosti kovových iontů v alkalickém
prostředí
Vliv má nejen nízká hodnota pH, ale i druh kyselin, které se na snížení hodnoty podílely.
DDěělenleníí potravin dle pHpotravin dle pH
Aktivita vody Aktivita vody -- aaww
Aktivita vodyAktivita vody- je definována jako poměr parciálního tlaku vodní
páry nad potravinou (p) k parciálnímu tlaku vodnípáry nad čistou vodou (p0) při dané teplotě:
paw =
p0- množství vody dostupné pro mikroorganizmy pro
chemické reakce buněk- optimální hodnota pro většinu mikroorganizmů
aw>0,98
Aktivita vody Aktivita vody -- aaww
BakterieBakterie
halofilní x halotolerantní
xerofilní x xerotolerantní
osmofilní x osmotolerantní
Aktivita vody Aktivita vody -- aaww
SnSníížženeníí aktivity vody:aktivity vody:• odstranění využitelné vody sušením, uzením,
odpařením, mražením
• zvýšení obsahu tuku
• zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) → zvýšeníosmotického tlaku (hypertonické prostředí) →difuze vody z buňky do prostředí → zastavenímetabolizmu až smrt buňky
Aktivita vody Aktivita vody -- aaww
PotravinyPotraviny• lehce kazitelné (více než 0,95)• středně kazitelné (0,95-0,92)• málo kazitelné (pod 0,91)
Důležitá je kombinace aw s ostatními faktory ovlivňujícími přežívání MO v potravinách.
Aktivita vody Aktivita vody -- aaww
Redox potenciRedox potenciáál l -- EEhh
OxidaOxidaččnněě redukredukččnníí potencipotenciáál prostl prostřřededíí- je rozdíl potenciálu mezi platinovou (kovovou)
elektrodou umístěnou do daného prostředí a standardní vodíkovou elektrodou.
oxidaceoxidacelláátka redukovantka redukovanáá lláátka oxidovantka oxidovanáá + + nn elektronelektronůů
redukceredukce
SnSníížženeníí redox potenciredox potenciáálu:lu:- přidání redukujících látek- růst aerobních mikroorganismů- vakuové balení, atd.
Redox potenciRedox potenciáál l -- EEhh
Textura potravinyTextura potraviny
PPřřirozenirozenéé krytkrytíí povrchu potravinpovrchu potravin- skořápka vajec, skořápky ořechů, kůže, vazivová
pouzdra orgánů, povázka masa, kůrka chleba, atd.
PPřříítomnost tomnost antibakteriantibakteriáálnlnííchchlláátek (tek (biocidbiocidůů) v potravin) v potravinááchch
• Některé potraviny obsahují přirozenéantimikrobiální látky (koření, minerální oleje, česnek, hořčice, med)
• Kravské mléko obsahuje laktoferrin, laktoperoxidázový systém, lysozym, kasein
• Vejce lysozym, conalbumin, ovotransferrin, avidin
AntimikrobiAntimikrobiáálnlníí enzymyenzymy
Jsou hojně rozšířeny v přírodě a hrají důležitou roli při obranných mechanizmech živých mikroorganizmů proti infekcím.
HydrolHydroláázyzy – degradují klíčové struktury buněčných stěn (peptidoglykan)
OxidoreduktOxidoreduktáázyzy – vytváří reaktivní molekuly, kterérozrušují vitální proteiny v buňce.
AntimikrobiAntimikrobiáálnlníí enzymyenzymy
Bakteriolytické1.1. NN--acetylhexosaminidacetylhexosaminidáázyzy katalyzují štěpení
glukosidických vazeb sacharidů peptidoglykanu2.2. NN--acetylmuramylacetylmuramyl--LL--alaninamidalaninamidáázyzy katalyzují
štěpení mezi sacharidovou a peptidovou částípeptidoglykanu
3.3. EndopeptidEndopeptidáázyzy hydrolyzují peptidové vazby peptidoglykanu
4.4. OstatnOstatníí – chitinázy, ß-glukanázy
AntimikrobiAntimikrobiáálnlníí enzymyenzymy
Bakteriolytické
LysozymLysozym je aktivní především u G pozitivních bakterií.
AntimikrobiAntimikrobiáálnlníí enzymyenzymy
OxidoreduktOxidoreduktáázyzy
GlukozooxidGlukozooxidáázyzy jsou produkovány některými plísněmi, podstata cytotoxicity spočívá v tvorbě peroxidu vodíku (oxidace glukózy na kys. glukonovou a H2O2)
LaktoperoxidLaktoperoxidáázyzy se vyskytují např. ve slinách, mléce(oxidace thiokyanátu na hyperthiokyanát)
LaktoferrinLaktoferrin je glykoprotein tvořící komplexy s iontyželeza
VnVněějjšíší faktoryfaktory
• Teplota• Složení atmosféry• Relativní vlhkost vzduchu• Čas
TeplotaTeplota
• Je jedním z hlavních faktorů vnějšího prostředí, který ovlivňuje rychlost rozmnožování (přežívání) bakterií
• Rozeznáváme 3 základní body teplotyminimminimáálnlníí teplotuteplotuoptimoptimáálnlníí teplotuteplotumaximmaximáálnlníí teplotuteplotu
RozdRozděělenleníí bakteribakteriíí podle podle vztahu k teplotvztahu k teplotěě
Mikroorganizmy dělíme do skupin podle nároků na teplotu při které se rozmnožují a metabolizují
PsychrofilnPsychrofilníí bakterie (12bakterie (12--15 15 °°C)C)PsychrotrofnPsychrotrofníí bakterie (25bakterie (25--30 30 °°C)C)MezofilnMezofilníí bakterie (30bakterie (30--40 40 °°C)C)TermofilnTermofilníí bakterie (50bakterie (50--70 70 °°C)C)
Vliv vysokých teplotVliv vysokých teplot
Smrtící účinek vysokých teplot (letální teplota)
• je nejnižší teplota, při které dochází za určitý čas k usmrcení (70 °C/10 minut) • denaturace bílkovin, inaktivace enzymů, narušení DNA a cytoplazmatické membrány
• je závislá na: druhu mikroorganismujeho fyziologickém stavukoncentraci buněk v prostředícharakteru prostředí
TermorezistenceTermorezistence
Stupeň odolnosti mikroorganizmů je závislý na:
• fyziologickém stavu bakterií• jejich genetické výbavě• množství bakterií• obsahu vody v substrátu
• množství ochranných látek (lipidy, proteiny, sacharidy)
SterilizaceSterilizace
• jednorázové použití teploty nad 100 °C
• sterilizace je definována jako kombinace teploty a času
• sterilizaci potravin přežívají některé spóry (rody Bacillus a Clostridium)
• praktická (obchodní) sterilita x absolutní sterilita
STERILIZOVANÉ POTRAVINY MOHOU OBSAHOVAT SPÓRY!
PasteracePasterace
Správně provedená pasterace zaručí:
• devitalizaci patogenních mikroorganismů(M. tuberculosis)
• devitalizaci podstatné části saprofytické mikroflóry (vegetativních buněk)
• zachování původních fyzikálních, chemických, výživových a senzorických vlastností
PASTEROVANÉ POTRAVINY OBSAHUJÍMIKROORGANISMY!
Vliv nVliv níízkých teplotzkých teplotNižší než optimální teploty přežívá většina mikroorganizmůdlouhou dobu. Přenesou-li se však z optimálních teplot do teploty kolem 0 °C dochází k chladovchladovéému mu ššokuoku.
Při pomalpomaléém zmrazovm zmrazováánníí bunbuněěkk na teploty pod 0 °C ze z vnitro i mimobuněčné vody tvoří velké krystaly ledu, kterébuňku nevratně poškozují.
Při rychlrychléém zmrazovm zmrazováánníí bunbuněěkk na teploty -30 °C – 180 °C se tvoří mikrokrystalky ledu, které buňky poškozují jen minimálně.
Po rozmrazení se potraviny rychleji kazí (poškozeníživočišných i rostlinných pletiv krystaly vody)
SloSložženeníí atmosfatmosfééryry
Skladování potravin v řízené atmosféře plynů máochranný účinek
• VakuovVakuověě balenbalenéé potravinypotraviny (v obalech nepropustných pro kyslík)• COCO22 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silnéoxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků
RelativnRelativníí vlhkost prostvlhkost prostřřededíí
Vysoká relativní vlhkost ovlivňuje aw potraviny (význam balení)
Čím vyšší je teplota, tím nižšímusí být relativní vlhkost prostředí a naopak
ČČasas
Čím delší je doba expozice, tím výraznější je účinek
VnitVnitřřnníí faktoryfaktory VnVněějjšíší faktoryfaktory
Technologie pTechnologie přřekekáážžekek
Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, kterémusí mikroorganizmy překonat.I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesíleníúčinku. Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musímikroorganizmy vyvinout.
PrediktivnPrediktivníí mikrobiologiemikrobiologie
Vychází ze znalostí vnitřních a vnějších faktorů
• Predikce růstu• Pravděpodobnostní modely• Kinetické modelování
PoPoččááteteččnníí popoččet LM et LM 101044 CFU CFU Teplota Teplota 20/1020/10°°CCpH 7pH 7 aaw w 0,9970,997
Predikce rPredikce růůstu stu –– modelovmodelováánníítyp ztyp záákusekkusek
•• Vliv dalVliv dalšíších faktorch faktorůů na na mikroorganizmy v potravinmikroorganizmy v potravinááchch
PovrchovPovrchovéé napnapěěttíí
• Některé mikroorganizmy se špatnou smáčitelnostíbuněk rostou v tekutinách ve formě blanky (křísu)
• Povrchové napětí prostředí snižujeme přídavkem povrchově aktivních látek (tenzidů)
ZZáářřeneníí
Elektromagnetické vlnění různých délek se značně liší svými účinky na mikroorganizmy
•• InfraInfraččervenervenéé – nemá přímé letální účinky (teplo!)•• ViditelnViditelnéé svsvěětlotlo – ovlivňuje pozitivně i negativně
některé aktivity buněk•• UltrafialovUltrafialovéé – má silně mutagenní a letální účinky (malá pronikavost)
•• IonizaIonizaččnníí zzáářřeneníí-- má silně mutagenní a letálníúčinky (vysoká pronikavost)
Hydrostatický tlakHydrostatický tlak
Většina mikroorganizmů se rozmnožuje za normálního atmosférického tlaku.
Zvýšení tlaku na 10-20 MPa rozmnožování zpomaluje a 30-40 MPa zcela zastavuje.
Některé bakterie se dobře rozmnožují i při tlaku 60 MPa – barofilnbarofilníí x x barotolerantnbarotolerantníí (v hlubinách moří)
UltrazvukUltrazvuk
UltrazvukUltrazvukjsou zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz, na bakterie působí letálně pouze při vysoké intenzitě.
KavitaKavitaččnníí ultrazvukultrazvukv důsledku kmitání vzniká prudká pulzace buněčných membrán a cytoplazmy (letální účinek)
Citlivé k ultrazvuku jsou především tyčinky a vlákna, koky jsou odolnější
MechanickMechanickéé vlivyvlivy
Vysoká odolnost mikroorganizmů je způsobena pevnou buněčnou stěnou a malými rozměry
K destrukci buněk dochází:• opakovaným pomalým zamrazováním a roztáváním (odolnost enzymů)
• ošetření vysokým tlakem• třepání s abrazivním materiálem
PPůůsobensobeníí antimikrobiantimikrobiáálnlníích lch láátektek
Některé látky přítomné v prostředí mají na mikroorganizmy nepříznivý vliv v důsledku svého specifického složení (antimikrobiální).
MikrobistatickMikrobistatickéé- látky zastavující rozmnožování mikroorganizmů
MikrobicidnMikrobicidníí– látky usmrcující mikroorganizmy
Vliv koncentrace (účinek stimulační)
Podle mechanizmu Podle mechanizmu úúččinku dinku děěllííme me antimikrobiantimikrobiáálnlníí lláátkytky
Látky poškozující strukturu bustrukturu buňňkyky nebo její funkci (např. buněčná stěna, cytoplazmatická membrána, ribozomy)
Látky působící na mikrobimikrobiáálnlníí enzymyenzymy (oxidační činidla, chelatační látky, těžké kovy, antimetabolity)
Látky reagujreagujííccíí s DNAs DNA (např. chemické mutageny –alkylační nebo dezaminační činidla, cytostatika)
CCíílovlováá mmíísta psta půůsobensobeníí AML na AML na bakteribakteriáálnlníí bubuňňkuku
DezinfekDezinfekččnníí lláátkytky
Sanitace = čištění a dezinfekce
Čištění – odstranění nečistot a zbytků organického materiálu
Dezinfekce – odstranění mikroorganismů.
Teplota a doba působení čistících a dezinfekčních prostředků!
DezinfekDezinfekččnníí lláátkytky
• buněčná stěna - poškození• cytoplazmatická membrána – indukce difuze látek
z buňky, inhibice enzymů CM, oslabeníelektrochemického potenciálu CM
• cytoplazma – koagulace enzymů, ribozomů, NK
DezinfekDezinfekččnníí mechanizmusmechanizmus- oxidace, hydrolýza, tvorba solí s bílkovinami,
koagulace bílkovin, změny permeability, poškozeníenzymatického systému, mechanická disrupce.
AnorganickAnorganickéé slouslouččeninyeniny
SilnSilnéé kyseliny a silnkyseliny a silnéé zzáásadysady- poškozují BS a CM x poškozují povrchy zařízení
HaHaššenenéé vváápnopno- dezinfekce stěn, kvasných kádí, atd.
UhliUhliččitan sodný, fosforeitan sodný, fosforeččnan sodný, nan sodný, polyfosfpolyfosfáátyty- odstranění zbytků tuků a bílkovin x polyfosfáty
ekologicky nežádoucí (eutrofizace vod)
Oxid siOxid siřřiiččitýitý- síření ovocných a vinných polotovarů, síření sudů,
sklepů, atd.
AnorganickAnorganickéé slouslouččeninyeniny
Oxid uhliOxid uhliččitýitý- uchovávání ovocných šťáv
OrganocOrganocííniniččititéé slouslouččeniny eniny -- LastanoxyLastanoxy- antifugální účinek, nátěry stěn, omítek, atd.
SlouSlouččeniny chleniny chlóóruru- plynný chlór – dezinfekce vody- chlorové vápno – desinfekce podlah, skladovacích
ploch- chloramin – směsné čistící prostředky, velmi časté
použití v lékařství i potravinářství
AnorganickAnorganickéé slouslouččeninyeniny
JodovJodovéé preparpreparáátyty- Jodonal M – desinfekce mléčné žlázy
Peroxid vodPeroxid vodííkuku- sterilizace korunkových uzávěrů, obalů z plastu
(kelímky, tetrapakové obaly,atd.), sýrařství
OrganickOrganickéé slouslouččeninyeniny
OrganickOrganickéé kyseliny kyseliny –– konzervace potravinkonzervace potravin- kyselina benzoová- kyselina sorbová (plísně)- kyselina mravenčí (kvasinky, plísně)
Kyselina Kyselina peroctovperoctováá -- PersterilPersteril
PovrchovPovrchověě aktivnaktivníí lláátkytky- mýdla (sodné soli vyšších MK)- kvartérní amoniové báze (Ajatin, Septonex)
AntibiotikaAntibiotika- nisin (konzervace potravin)
LaboratornLaboratorníí mmetodyetodynepřímépřímé
1. kultivační2. mikroskopické3. imunologické4. molekulárně
biologické
1. impedanční2. konduktometrické3. metabolická
aktivita4. redukce barviv
KultivaKultivaččnníí metodymetodyMetoda plotnová je používána pro průkaz (kvalita) nebo
stanovení počtu (kvantita) určitých skupin, rodu nebodruhu bakterií
VýhodyVýhody•• vysokvysokáá citlivostcitlivost -- REFERENREFERENČČNNÍÍ METODAMETODA (ISO, EN)(ISO, EN)
NevýhodyNevýhody•• dlouhdlouháá dobadoba do do dosadosažženeníí výsledkvýsledkůů•• kvantitakvantita je je vyjvyjááddřřenaena jakojako CFU (KTJ) ne CFU (KTJ) ne popoččtemtem
bakteribakteriíí
KultivaKultivaččnníí metodymetody
Variantou klasické kultivační metody pro stanovení počtu(kvantita) určitých skupin nebo rodu bakterií jsou
•• SpirSpiráálovlováá plotnovplotnováá metodametoda•• PetrifilmyPetrifilmy•• HygikultyHygikulty
KultivaKultivaččnníí metodymetody-- spirspiráálovlováá plotnovplotnováá metodametoda
Malé množství vzorku (35 µl) je nanášeno na rotujícíPetriho misku tryskou spirálovitě ve směru od středumisky k její periferii. Pomocí šablony (manuálně) nebolaseru (automaticky) je odečítán počet CFU (KTJ) namisce a ten je přepočten na výchozí objem inokula.
VýhodyVýhody• automatizace, eliminace chyb způsobenýchlidským faktorem
NevýhodyNevýhody• vysoké pořizovací náklady
KultivaKultivaččnníí metodymetody-- PetrifilmyPetrifilmy
Petrifilmy jsou destičky potažené kultivačnímimédii ve formě gelu. Destičky se inokulují 1 ml naředěného vzorku a inkubují v termostatu.
VýhodyVýhody• destička je opatřena mřížkou pro snazší počítání
kolonií• speciální indikátory zbarvují narostlékolonie a tím je zvýrazňují
KultivaKultivaččnníí metodymetody-- HygikultyHygikulty
Hygikult je plastová destička oboustranně pokrytákultivačním médiem, umístěná ve sterilní nádobce.
Je určen k rychlému monitorování úrovně mikrobiálníkontaminace v potravinářských provozech.
VýhodyVýhody• snadnost použití mimo laboratoř
NevýhodyNevýhody• sortiment destiček je omezen pouze na indikátorové
mikroorganizmy
MembrMembráánovnováá filtracefiltrace
Metoda slouží k zakoncentrování bakterií
• kultivační metoda• mikroskopiefiltry z nylonu, PVC, polykarbonátu, polyesteru, kovu
VýhodyVýhody• filtrací většího objemu lze zvýšit citlivost metody• teplý agar nepoškozuje bakterie
MikroskopickMikroskopickéé metodymetodyKlasickKlasickéé metodymetody -- stanovení počtu bakterií po obarvení
preparátuModernModerníí metodymetody - epifluorescencepifluorescencespojuje metodu filtrace a fluorescenční mikroskopie
PrincipPrincip spočívá ve vazbě fluorochromového barviva naDNA (RNA) mikrobů (DEFT, BACTOSCAN)
VýhodyVýhody• rychlost provedeníNevýhodyNevýhody• metoda detekuje i mrtvé buňky
ImunologickImunologickéé metodymetody
Princip metody ELISA ELISA Enzymaticky značená specifická protilátka je
vázána na vhodný povrch (mikrotitračnídestička).
Za přítomnosti antigenu (specifické bakterie) vzniká komplex AgAbAgAb. .
Ten je možné detekovat buď přímo spektrofotometricky nebo vizualizovatkonjugátem.
ImunologickImunologickéé metodymetody
VýhodyVýhody - automatizace- rychlost- vyšetření velkých sérií
vzorků
NevýhodyNevýhody – vyšší náklady na vyšetření- skríningová metoda
VyuVyužžititíí – detekce bakteriálních patogenů- detekce bakteriálních toxinů
ImunomagnetickImunomagnetickááseparaceseparace
PrincipPrincipjsou-li v substrátu přítomny sledované bakterie, vážíse na super-para-magnetické částice obalenéspecifickou protilátkou. Komplexantigen - protilátka se odseparujepomocí magnetu a dále zpracuje.
VýhodyVýhodyzkracuje dobu kultivacezachycuje i subletálně poškozené buňky
ImunomagnetickImunomagnetickáá separaceseparace
PolymerPolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakcereakcePrincipPrincipPrincip PCR je založen na využití DNA polymerázy pro
opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly DNA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy(primery), které nasedají na templátovou DNA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA.
PCR je velice citlivá metoda umožňující detekci jedinébuňky.
Mnohonásobné amplifikace je dosaženo opakováním třízákladních kroků - denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken
PolymerPolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakce reakce Vysvětlení základních pojmů
•• templtempláátt – DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců. Pro reakci PCR se používágenomová DNA o koncentraci přibližně 10 ug/ml.
• DNA polymeráza – termostabilní enzym používaný k syntéze nové DNA ve směru 5´-3´ podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru až po jeho konec. Enzym Taq DNA, který se nejčastěji používápro PCR, je izolován z bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 °C. Enzym zůstává při této teplotě aktivní až 40 minut.
• dNTP - nukleotidtrifosfáty (adenin, guanin, cytosin a thymin)
PolymerPolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakce reakce Vysvětlení základních pojmů
• primery – jsou oligonukleotidy (obvykle 20-25 bazí) , které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a kterévymezují úsek templátu, který bude amplifikován
• master mix – reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce. Je složena z koncentrovaného pracovního pufru obsahujícího hořečnaté ionty zajišťujícího vhodné podmínky pro aktivitu polymerázy, směsi dNTP, polymerázy, specifických primerů a vody.
• termocykler ((teplotní cyklátor) - je zařízení, ve kterém za optimálních teplotních podmínek probíhá PCR reakce.
• marker – velikostní standard, používá se k odhadu velikostí DNA produktů na základě pohyblivosti v agarózovém gelu
TurbidimetrieTurbidimetrie
Podstata Podstata Bakterie v průběhu množení tvoří v tekutém vzorku
zákal. Metoda využívá měření změn intenzity zákalu média v závislosti na čase.
Intenzita zákalu je závislá na počáteční koncentraci mikroorganizmů.
Využití – k měření celkového počtu mikroorganizmů(aerobních i anaerobních)
PrPrůůtokovtokováá cytometriecytometrie
Podstata Podstata Metoda vyjadřuje kvantitativní fotometrické stanovení
fluorochromu navázaného na specifické bakterie.Buněčná suspenze po obarvení prochází kapilárou přes
trysku, kde je laserem ozářena. Intenzita excitovaného světla vyjadřuje kvantitu specifických bakterií.
VyuVyužžititíí – rychlá detekce technologicky významných a patogenních bakterií. Výsledky nejsou porovnatelnése standardními metodami (CFU)
ImpedanImpedanččnníí metodametoda
Metabolická činnost bakterií mění složení kultivačního média, což vede ke změnám vodivosti.
Systém je složen ze dvou elektrod ponořených do živného média. Ty jsou připojeny na zdroj střídavého proudu a měříme jimi impedanci. Stoupající vodivost vede k poklesu impedance.
VýhodyVýhody - automatizaceNevýhody Nevýhody – vyšší cena přístroje
- při smíšených kulturách nestandardnívýsledky
VyuVyužžititíí – indikátorové skupiny mikroorganizmů
MetabolickMetabolickáá aktivitaaktivita
BioluminiscencBioluminiscenceeATP je zdrojem energie všech živých buněk. Podstata
metody spočívá v reakci ATP s enzymem luciferluciferáázouzou vázanou na luciferinluciferin.
Tři tvorbě luciferin-adenylátového komplexu se z ATP uvolňuje pyrofosfát.
Za přítomnosti kyslíku dochází k uvolnění světla, jehožintenzita je závislá na výchozím množství ATP.
PouPoužžititíí – rychlá detekce mikrobiální kontaminace v potravinářských provozech (HACCP)
EnzymatickEnzymatickáá aaktivitaktivita
RedukceRedukce barvivbarvivResazurinový test je založen na průkazu
bakteriálních reduktáz. Ty redukujíresazurin rezorufin hydrorezorufinmet. modř leukoforma
Rychlost barevné změny je závislá na množstvímikroorganizmů.
VyuVyužžititíí – rychlá detekce CPM v mléce nebo mase
IDENTIFIKACEIDENTIFIKACE - zařazení neznámých kmenů (druh, poddruh)
TYPIZACETYPIZACE - zařazení neznámých kmenů pod úroveň druhu
FINGERPRINTINGFINGERPRINTING - vzájemné porovnání kmenů jednoho druhu poddruhu nebo variety
Metody typizaceMetody typizace
Kategorie typizaKategorie typizaččnníích metod ch metod -- fenotypovfenotypováá charakteristikacharakteristika
BIOTYPIZACEBIOTYPIZACE - zkoumání vlastností kultur na základěbiochemických vlastností (API, Enterotest, Stafytest atd.)
REZISTENCE k antibiotikREZISTENCE k antibiotikůůmm - zkoumání citlivosti kultur k antimikrobiálním látkám (disková difuznímetoda, MIC)
SSÉÉROTYPIZACE ROTYPIZACE - nejstarší typizační technika, sklíčková, mikrozkumavková, Ag O:H:K
Kategorie typizaKategorie typizaččnníích metod ch metod -- genotypovgenotypováá charakteristikacharakteristika
1. GeneraceGenerace - analýza plazmidové DNA- restrikční analýza plazmidové DNA
2. GeneraceGenerace - restrikční analýza chromozomální DNA- hybridizací s próbami- ribotypizace
3. GeneraceGenerace - PFGE- typizační metody na bázi PCR (RAPD, REP PCR)
4. GeneraceGenerace - DNA sekvenování
RestrikRestrikččnníí analýza analýza plazmidovplazmidovéé DNADNA
RE RE - sekvenčně specifická nukleáza, která štěpídsDNA ve specifických sekvencích vytvářením dvouřetězcových zlomů
PulznPulzníí gelovgelováá elektroforelektroforééza (PFGE)za (PFGE)
Makrorestrikční analýza bakteriálního genomu, technika určená pro separaci molekul DNA o velikosti až 12Mb, při níž dochází ke změně směru elektrického pole.
Molekuly DNA putujípohybem cik-cak v závislosti na pulzním čase a napětí
PulznPulzníí gelovgelováá elektroforelektroforééza za (PFGE)(PFGE)
Rare cutting endonukleázy-RE vzácně štěpící –rozpoznávají a štěpí sekvence, kterése v genomové DNA vyskytujízřídka a vytváří dlouhé restrikčnífragmenty (XbaI, SpeI,SmaI,NotI)
Metoda PCR detekující polymorfizmus DNA za použitíjediného krátkého oligonukleotidového primeru, který se na cílovou DNA váže v náhodných místech. Výsledkem je soubor amplikonů charakteristický pro daný mikroorganizmus
Podle délky primerů rozlišujeme metody: AP-PCR (Arbitrary primed PCR) 18-24 merRAPD 10 merDAF (DNA amplification fingerprinting) 5-8 mer
RandomlyRandomly amplifiedamplified polymorficpolymorfic DNADNA((polymerpolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakce nreakce nááhodnhodnáá -- RAPD)RAPD)