Post on 21-Dec-2021
transcript
STŘEDOŠKOLSKAacute ODBORNAacute ČINNOST 2008 2009
Obor O3 ndash Chemie
Detekce biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
ndash Novaacute cesta diagnostiky plicniacutech
onemocněniacute
Erika Gedeonovaacute Septima B
Sportovniacute gymnaacutezium Kladno Plzeňskaacute 3103 Kladno
Středočeskyacute kraj
Miacutesto vypracovaacuteniacute VŠCHT Praha UacuteOT Vedouciacute praacutece Ing Kamila Syslovaacute
Doc Ing Petr Kačer PhD
2
Prohlašuji že jsem předloženou praacuteci vypracovala samostatně pod vedeniacutem Doc Ing Petra
Kačera PhD a Ing Kamily Sysloveacute a uvedla jsem veškerou použitou literaturu v seznamu
literatury
helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Poděkovaacuteniacute Zde bych raacuteda poděkovala všem kteřiacute mi s vypracovaacuteniacutem praacutece jakyacutemkoli způsobem pomohli
Můj diacutek patřiacute na prvniacutem miacutestě Ing Kamile Sysloveacute a Doc Ing Petru Kačerovi PhD za vedeniacute
praacutece a všestrannou pomoc při jejiacutem zpracovaacuteniacute
Daacutele bych chtěla poděkovat prof Ing Liboru Červeneacutemu DrSc za možnost pracovat v jeho
kolektivu
Nemohu opominout RNDr Marii Pokornou organizaacutetorku školniacuteho kola kteraacute mi pomohla
s administrativniacutemi zaacuteležitostmi a RNDr Hanu Vokounovou mou učitelku chemie
3
Anotace Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduch (KVV) spočiacutevaacute v kvantifikaci přiacutetomnyacutech specifickyacutech
laacutetek tzv bdquobiomarkerůldquo jejichž koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacutech patologickyacutech dějů
v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech vyacuteznamně zvyacutešena (oproti fyziologickeacutemu stavu) což je signaacutelem pro
zahaacutejeniacute terapie
Předklaacutedanaacute praacutece se zabyacutevaacute vyacutevojem multimarkeroveacuteho screeningu KVV pro identifikaci a
kvantifikaci řady vyacuteznamnyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu ‐ 8‐isoprostan prostaglandin E2
prostaglandin D2 malondialdehyd a 4 ‐ hydroxynonenal
Principem vyvinutyacutech metod je kombinace vhodneacute separačniacute techniky ndash imunoextrakce a
extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) s vysoce selektivniacute a citlivou detekčniacute metodou hmotnostniacute
spektrometriiacute Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute jednotlivyacutech markerů v KVV lze charakterizovat
vysokou přesnostiacute a spraacutevnostiacute niacutezkou chybou stanoveniacute a niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace
Nediacutelnou součaacutestiacute praacutece byla i klinickaacute studie (realizovanaacute ve spolupraacuteci s 1 LF UK) kteraacute ověřila
vhodnost metody pro diferenciaacutelniacute neinvazivniacute diagnostiku oxidativniacuteho stresu
4
Obsah
Obsah 4 1 Seznam zkratek 5 2 Uacutevod 6 3 Teoretickaacute čaacutest 7
31 Kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu (KVV) 7 311 Složeniacute KVV 7 312 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 8
32 Oxidativniacute stres 9 321 Markery oxidativiacuteho stresu 9 322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu 15
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV 17 331 Extrakce biomarkerů 17 332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry) 18
34 Pracovniacute hypoteacuteza 19 4 Metodika praacutece 20
41 Chemikaacutelie a pomůcky 20 42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu 21 43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV 21
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza 22 46 Klinickaacute studie 24
5 Vyacutesledky a Diskuze 25 51 Odběr KVV 26 52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami 26 53 HPLCMS metoda 26
531 Extrakčniacute metody 29 532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty 29 533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE 31
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 31 541 Klinickaacute studie 32
6 Zaacutevěr 33 7 Seznam literatury 34
5
1 Seznam zkratek
8‐iso‐PGF2α 8‐isoprostan 8‐iso prostaglandin F2α API atmospheric pressure ionization (ionizace za atmosferickeacuteho tlaku)
Aλ absorbance při vlnoveacute deacutelce λ b tloušťka vrstvy (cm) c laacutetkoveacute koncentrace (mol l‐1) CID Collision Induced Dissociation (kolizně indukovanaacute disociace) COX enzym cyklooxygenaacuteza ESI electrospray ionizacion (elektrosprejovaacute ionizace) GC‐MS plynovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem HNE 4‐hydroxynonenal HPLC‐MS vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem
spektrometrem HPLC‐UV vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie s UV detekciacute KVV kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MDA malondialdehyd MeMDA methylmalondialdehyd MRM Multiple Reaction Monitoring PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandin E2 PGD2 Prostaglandin D2
RE relative error (relativniacute chyba) RSD relative standard deviation (relativniacute směrodatnaacute odchylka) ROS reactive oxygen species (reaktivniacute kysliacutekoveacute čaacutestice) SPE Solid Phase Extraction (extrakce na pevneacute faacutezi) TMP 1133‐tetramethoxypropan TXA2 thromboxan A2
VFN všeobecnaacute fakultniacute nemocnice
ε molaacuterniacute absorpčniacute koeficient (l mol‐1 cm‐1)
μ skutečneacute přidaneacute množstviacute
x průměr stanoveneacute koncentrace
6
2 Uacutevod
Sledovaacuteniacute specifickyacutech molekul produkovanyacutech organismem při patologickyacutech procesech je
v dnešniacute době součaacutestiacute moderniacute leacutekařskeacute diagnostiky Běžně se setkaacutevaacuteme s analyacutezou laacutetek v krevniacute
plazmě a moči Vyacutesledky ziacuteskaneacute analyacutezou těchto tělniacutech tekutin jsou odrazem procesů odehraacutevajiacuteciacutech
se v raacutemci celeacuteho organismu a k lokalizaci patologickeacuteho procesu se využiacutevajiacute jen v omezeneacute miacuteře
přiacutepadně pouze jako doplněk dalšiacutech diagnostickyacutech metod K vyšetřeniacute nemociacute plic a dyacutechaciacutech cest
(např diagnostika bronchiaacutelniacuteho astmatu asbestoacutezy silikoacutezy ad) se v běžneacute praxi použiacutevaacute celaacute řada
diagnostickyacutech metod ktereacute jsou v naprosteacute většině metodami invazivniacutemi (bronchiaacutelniacute biopsie
bronchoalveolaacuterniacute lavaacutež) přiacutepadně semi‐invazivniacutemi (metoda indukovaneacuteho sputa) ty jsou pro
pacienta zatěžujiacuteciacute u dětiacute a seniorů mohou byacutet dokonce až stresovou zaacuteležitostiacute Včasnaacute diagnostika
plicniacutech onemocněniacute ovšem hraje důležitou roli z hlediska zahaacutejeniacute uacutečinneacute terapie a minimalizace
poškozeniacute organismu pacienta
Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu je poměrně novou metodou jež představuje
alternativniacute cestu kterou lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute a pro pacienta nezatěžujiacuteciacute
Složeniacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu koresponduje s ději odehraacutevajiacuteciacutemi se bezprostředně
v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech odkud se do něj dostaacutevaacute celaacute řada specifickyacutech laacutetek
Princip analyacutezy kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu spočiacutevaacute v kvantifikaci specifickyacutech laacutetek
pro uvedenaacute onemocněniacute ndash tzvbdquobiomarkerůldquo ktereacute se vyskytujiacute v uvedeneacute tělniacute tekutině a jejichž
koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacuteho patologickeacuteho procesu v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech
vyacuteznamně zvyacutešena K analyacuteze dechoveacuteho kondenzaacutetu se použiacutevajiacute biochemickeacute metody nebo metody
využiacutevajiacuteciacute vysoce citliveacute a specifickeacute techniky na baacutezi hmotnostniacute spektrometrie V současneacute době se
problematika využitiacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako zdroje biomarkerů plicniacutech
onemocněniacute nachaacuteziacute ve stavu kdy byla popsaacutena celaacute řada metodik stanoveniacute biomarkerů ovšem
vyacutesledky uvedenyacutech studiiacute vykazujiacute značnyacute rozptyl danyacute opomenutiacutem důležityacutech specifickyacutech faktorů
ktereacute je nutneacute respektovat při zpracovaacuteniacute a naacutesledneacute analyacuteze teacuteto tělniacute tekutiny
Předklaacutedanaacute praacutece si kladla za ciacutel postihnout a kvantifikovat parametry ktereacute mohou byacutet
zdrojem v literatuře uvaacuteděnyacutech rozporuplnyacutech vyacutesledků a vypracovat protokol zpracovaacuteniacute
dechoveacuteho kondenzaacutetu a stanoveniacute specifickyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu (8‐isoprostan
malondialdehyd 4‐hydroxynonenal prostaglandin D2 a prostaglandin E2) metodou hmotnostniacute
spektrometrie Vyacutesledkem experimentaacutelniacute činnosti v teacuteto oblasti je vypracovaacuteniacute metody kombinujiacuteciacute
extrakci biomarkerů s dostatečně citlivou a selektivniacute detekčniacute metodou ndash hmotnostně‐
spektrometrickou analyacutezou kteraacute umožňuje kvantifikaci těchto specifickyacutech laacutetek
3 T
31 K
311 S
vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu
vydechojež kores
(metaboidentifik
O
zvyacutešeneacute může si
Teoretick
ondenzaacutet
Složeniacute KV
Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec
mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo
ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa
olity kyselinyovaacuteno viacutece n
Obraacutezek 1 Sc
Z pmakap
V KVV bylkoncentraciignalizovat p
kaacute čaacutest
t vydechov
VV
ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]
cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)
y detekovaacuteni při patologplicniacute onem
vaneacuteho vz
dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo
m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me
noveacute) pepti
ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p
ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap
7
zduchu (K
e 15‐25 m3
neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy
vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech
eacute biomolekuesech odehpř asthma
KVV)
vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s
apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z
y DNA ad
chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd
uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale
aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb
rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b
organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal
omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute
neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr
vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn
plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a
ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov
hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem
ondenzaacutet tekutiny
kosanoidy niacutemu dni
a strhaacutevajiacute erosoloveacute
kytujiacute ve aacute hladina vinu plic
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
2
Prohlašuji že jsem předloženou praacuteci vypracovala samostatně pod vedeniacutem Doc Ing Petra
Kačera PhD a Ing Kamily Sysloveacute a uvedla jsem veškerou použitou literaturu v seznamu
literatury
helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Poděkovaacuteniacute Zde bych raacuteda poděkovala všem kteřiacute mi s vypracovaacuteniacutem praacutece jakyacutemkoli způsobem pomohli
Můj diacutek patřiacute na prvniacutem miacutestě Ing Kamile Sysloveacute a Doc Ing Petru Kačerovi PhD za vedeniacute
praacutece a všestrannou pomoc při jejiacutem zpracovaacuteniacute
Daacutele bych chtěla poděkovat prof Ing Liboru Červeneacutemu DrSc za možnost pracovat v jeho
kolektivu
Nemohu opominout RNDr Marii Pokornou organizaacutetorku školniacuteho kola kteraacute mi pomohla
s administrativniacutemi zaacuteležitostmi a RNDr Hanu Vokounovou mou učitelku chemie
3
Anotace Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduch (KVV) spočiacutevaacute v kvantifikaci přiacutetomnyacutech specifickyacutech
laacutetek tzv bdquobiomarkerůldquo jejichž koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacutech patologickyacutech dějů
v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech vyacuteznamně zvyacutešena (oproti fyziologickeacutemu stavu) což je signaacutelem pro
zahaacutejeniacute terapie
Předklaacutedanaacute praacutece se zabyacutevaacute vyacutevojem multimarkeroveacuteho screeningu KVV pro identifikaci a
kvantifikaci řady vyacuteznamnyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu ‐ 8‐isoprostan prostaglandin E2
prostaglandin D2 malondialdehyd a 4 ‐ hydroxynonenal
Principem vyvinutyacutech metod je kombinace vhodneacute separačniacute techniky ndash imunoextrakce a
extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) s vysoce selektivniacute a citlivou detekčniacute metodou hmotnostniacute
spektrometriiacute Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute jednotlivyacutech markerů v KVV lze charakterizovat
vysokou přesnostiacute a spraacutevnostiacute niacutezkou chybou stanoveniacute a niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace
Nediacutelnou součaacutestiacute praacutece byla i klinickaacute studie (realizovanaacute ve spolupraacuteci s 1 LF UK) kteraacute ověřila
vhodnost metody pro diferenciaacutelniacute neinvazivniacute diagnostiku oxidativniacuteho stresu
4
Obsah
Obsah 4 1 Seznam zkratek 5 2 Uacutevod 6 3 Teoretickaacute čaacutest 7
31 Kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu (KVV) 7 311 Složeniacute KVV 7 312 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 8
32 Oxidativniacute stres 9 321 Markery oxidativiacuteho stresu 9 322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu 15
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV 17 331 Extrakce biomarkerů 17 332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry) 18
34 Pracovniacute hypoteacuteza 19 4 Metodika praacutece 20
41 Chemikaacutelie a pomůcky 20 42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu 21 43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV 21
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza 22 46 Klinickaacute studie 24
5 Vyacutesledky a Diskuze 25 51 Odběr KVV 26 52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami 26 53 HPLCMS metoda 26
531 Extrakčniacute metody 29 532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty 29 533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE 31
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 31 541 Klinickaacute studie 32
6 Zaacutevěr 33 7 Seznam literatury 34
5
1 Seznam zkratek
8‐iso‐PGF2α 8‐isoprostan 8‐iso prostaglandin F2α API atmospheric pressure ionization (ionizace za atmosferickeacuteho tlaku)
Aλ absorbance při vlnoveacute deacutelce λ b tloušťka vrstvy (cm) c laacutetkoveacute koncentrace (mol l‐1) CID Collision Induced Dissociation (kolizně indukovanaacute disociace) COX enzym cyklooxygenaacuteza ESI electrospray ionizacion (elektrosprejovaacute ionizace) GC‐MS plynovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem HNE 4‐hydroxynonenal HPLC‐MS vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem
spektrometrem HPLC‐UV vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie s UV detekciacute KVV kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MDA malondialdehyd MeMDA methylmalondialdehyd MRM Multiple Reaction Monitoring PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandin E2 PGD2 Prostaglandin D2
RE relative error (relativniacute chyba) RSD relative standard deviation (relativniacute směrodatnaacute odchylka) ROS reactive oxygen species (reaktivniacute kysliacutekoveacute čaacutestice) SPE Solid Phase Extraction (extrakce na pevneacute faacutezi) TMP 1133‐tetramethoxypropan TXA2 thromboxan A2
VFN všeobecnaacute fakultniacute nemocnice
ε molaacuterniacute absorpčniacute koeficient (l mol‐1 cm‐1)
μ skutečneacute přidaneacute množstviacute
x průměr stanoveneacute koncentrace
6
2 Uacutevod
Sledovaacuteniacute specifickyacutech molekul produkovanyacutech organismem při patologickyacutech procesech je
v dnešniacute době součaacutestiacute moderniacute leacutekařskeacute diagnostiky Běžně se setkaacutevaacuteme s analyacutezou laacutetek v krevniacute
plazmě a moči Vyacutesledky ziacuteskaneacute analyacutezou těchto tělniacutech tekutin jsou odrazem procesů odehraacutevajiacuteciacutech
se v raacutemci celeacuteho organismu a k lokalizaci patologickeacuteho procesu se využiacutevajiacute jen v omezeneacute miacuteře
přiacutepadně pouze jako doplněk dalšiacutech diagnostickyacutech metod K vyšetřeniacute nemociacute plic a dyacutechaciacutech cest
(např diagnostika bronchiaacutelniacuteho astmatu asbestoacutezy silikoacutezy ad) se v běžneacute praxi použiacutevaacute celaacute řada
diagnostickyacutech metod ktereacute jsou v naprosteacute většině metodami invazivniacutemi (bronchiaacutelniacute biopsie
bronchoalveolaacuterniacute lavaacutež) přiacutepadně semi‐invazivniacutemi (metoda indukovaneacuteho sputa) ty jsou pro
pacienta zatěžujiacuteciacute u dětiacute a seniorů mohou byacutet dokonce až stresovou zaacuteležitostiacute Včasnaacute diagnostika
plicniacutech onemocněniacute ovšem hraje důležitou roli z hlediska zahaacutejeniacute uacutečinneacute terapie a minimalizace
poškozeniacute organismu pacienta
Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu je poměrně novou metodou jež představuje
alternativniacute cestu kterou lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute a pro pacienta nezatěžujiacuteciacute
Složeniacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu koresponduje s ději odehraacutevajiacuteciacutemi se bezprostředně
v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech odkud se do něj dostaacutevaacute celaacute řada specifickyacutech laacutetek
Princip analyacutezy kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu spočiacutevaacute v kvantifikaci specifickyacutech laacutetek
pro uvedenaacute onemocněniacute ndash tzvbdquobiomarkerůldquo ktereacute se vyskytujiacute v uvedeneacute tělniacute tekutině a jejichž
koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacuteho patologickeacuteho procesu v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech
vyacuteznamně zvyacutešena K analyacuteze dechoveacuteho kondenzaacutetu se použiacutevajiacute biochemickeacute metody nebo metody
využiacutevajiacuteciacute vysoce citliveacute a specifickeacute techniky na baacutezi hmotnostniacute spektrometrie V současneacute době se
problematika využitiacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako zdroje biomarkerů plicniacutech
onemocněniacute nachaacuteziacute ve stavu kdy byla popsaacutena celaacute řada metodik stanoveniacute biomarkerů ovšem
vyacutesledky uvedenyacutech studiiacute vykazujiacute značnyacute rozptyl danyacute opomenutiacutem důležityacutech specifickyacutech faktorů
ktereacute je nutneacute respektovat při zpracovaacuteniacute a naacutesledneacute analyacuteze teacuteto tělniacute tekutiny
Předklaacutedanaacute praacutece si kladla za ciacutel postihnout a kvantifikovat parametry ktereacute mohou byacutet
zdrojem v literatuře uvaacuteděnyacutech rozporuplnyacutech vyacutesledků a vypracovat protokol zpracovaacuteniacute
dechoveacuteho kondenzaacutetu a stanoveniacute specifickyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu (8‐isoprostan
malondialdehyd 4‐hydroxynonenal prostaglandin D2 a prostaglandin E2) metodou hmotnostniacute
spektrometrie Vyacutesledkem experimentaacutelniacute činnosti v teacuteto oblasti je vypracovaacuteniacute metody kombinujiacuteciacute
extrakci biomarkerů s dostatečně citlivou a selektivniacute detekčniacute metodou ndash hmotnostně‐
spektrometrickou analyacutezou kteraacute umožňuje kvantifikaci těchto specifickyacutech laacutetek
3 T
31 K
311 S
vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu
vydechojež kores
(metaboidentifik
O
zvyacutešeneacute může si
Teoretick
ondenzaacutet
Složeniacute KV
Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec
mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo
ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa
olity kyselinyovaacuteno viacutece n
Obraacutezek 1 Sc
Z pmakap
V KVV bylkoncentraciignalizovat p
kaacute čaacutest
t vydechov
VV
ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]
cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)
y detekovaacuteni při patologplicniacute onem
vaneacuteho vz
dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo
m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me
noveacute) pepti
ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p
ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap
7
zduchu (K
e 15‐25 m3
neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy
vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech
eacute biomolekuesech odehpř asthma
KVV)
vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s
apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z
y DNA ad
chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd
uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale
aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb
rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b
organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal
omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute
neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr
vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn
plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a
ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov
hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem
ondenzaacutet tekutiny
kosanoidy niacutemu dni
a strhaacutevajiacute erosoloveacute
kytujiacute ve aacute hladina vinu plic
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
3
Anotace Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduch (KVV) spočiacutevaacute v kvantifikaci přiacutetomnyacutech specifickyacutech
laacutetek tzv bdquobiomarkerůldquo jejichž koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacutech patologickyacutech dějů
v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech vyacuteznamně zvyacutešena (oproti fyziologickeacutemu stavu) což je signaacutelem pro
zahaacutejeniacute terapie
Předklaacutedanaacute praacutece se zabyacutevaacute vyacutevojem multimarkeroveacuteho screeningu KVV pro identifikaci a
kvantifikaci řady vyacuteznamnyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu ‐ 8‐isoprostan prostaglandin E2
prostaglandin D2 malondialdehyd a 4 ‐ hydroxynonenal
Principem vyvinutyacutech metod je kombinace vhodneacute separačniacute techniky ndash imunoextrakce a
extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) s vysoce selektivniacute a citlivou detekčniacute metodou hmotnostniacute
spektrometriiacute Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute jednotlivyacutech markerů v KVV lze charakterizovat
vysokou přesnostiacute a spraacutevnostiacute niacutezkou chybou stanoveniacute a niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace
Nediacutelnou součaacutestiacute praacutece byla i klinickaacute studie (realizovanaacute ve spolupraacuteci s 1 LF UK) kteraacute ověřila
vhodnost metody pro diferenciaacutelniacute neinvazivniacute diagnostiku oxidativniacuteho stresu
4
Obsah
Obsah 4 1 Seznam zkratek 5 2 Uacutevod 6 3 Teoretickaacute čaacutest 7
31 Kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu (KVV) 7 311 Složeniacute KVV 7 312 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 8
32 Oxidativniacute stres 9 321 Markery oxidativiacuteho stresu 9 322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu 15
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV 17 331 Extrakce biomarkerů 17 332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry) 18
34 Pracovniacute hypoteacuteza 19 4 Metodika praacutece 20
41 Chemikaacutelie a pomůcky 20 42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu 21 43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV 21
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza 22 46 Klinickaacute studie 24
5 Vyacutesledky a Diskuze 25 51 Odběr KVV 26 52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami 26 53 HPLCMS metoda 26
531 Extrakčniacute metody 29 532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty 29 533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE 31
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 31 541 Klinickaacute studie 32
6 Zaacutevěr 33 7 Seznam literatury 34
5
1 Seznam zkratek
8‐iso‐PGF2α 8‐isoprostan 8‐iso prostaglandin F2α API atmospheric pressure ionization (ionizace za atmosferickeacuteho tlaku)
Aλ absorbance při vlnoveacute deacutelce λ b tloušťka vrstvy (cm) c laacutetkoveacute koncentrace (mol l‐1) CID Collision Induced Dissociation (kolizně indukovanaacute disociace) COX enzym cyklooxygenaacuteza ESI electrospray ionizacion (elektrosprejovaacute ionizace) GC‐MS plynovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem HNE 4‐hydroxynonenal HPLC‐MS vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem
spektrometrem HPLC‐UV vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie s UV detekciacute KVV kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MDA malondialdehyd MeMDA methylmalondialdehyd MRM Multiple Reaction Monitoring PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandin E2 PGD2 Prostaglandin D2
RE relative error (relativniacute chyba) RSD relative standard deviation (relativniacute směrodatnaacute odchylka) ROS reactive oxygen species (reaktivniacute kysliacutekoveacute čaacutestice) SPE Solid Phase Extraction (extrakce na pevneacute faacutezi) TMP 1133‐tetramethoxypropan TXA2 thromboxan A2
VFN všeobecnaacute fakultniacute nemocnice
ε molaacuterniacute absorpčniacute koeficient (l mol‐1 cm‐1)
μ skutečneacute přidaneacute množstviacute
x průměr stanoveneacute koncentrace
6
2 Uacutevod
Sledovaacuteniacute specifickyacutech molekul produkovanyacutech organismem při patologickyacutech procesech je
v dnešniacute době součaacutestiacute moderniacute leacutekařskeacute diagnostiky Běžně se setkaacutevaacuteme s analyacutezou laacutetek v krevniacute
plazmě a moči Vyacutesledky ziacuteskaneacute analyacutezou těchto tělniacutech tekutin jsou odrazem procesů odehraacutevajiacuteciacutech
se v raacutemci celeacuteho organismu a k lokalizaci patologickeacuteho procesu se využiacutevajiacute jen v omezeneacute miacuteře
přiacutepadně pouze jako doplněk dalšiacutech diagnostickyacutech metod K vyšetřeniacute nemociacute plic a dyacutechaciacutech cest
(např diagnostika bronchiaacutelniacuteho astmatu asbestoacutezy silikoacutezy ad) se v běžneacute praxi použiacutevaacute celaacute řada
diagnostickyacutech metod ktereacute jsou v naprosteacute většině metodami invazivniacutemi (bronchiaacutelniacute biopsie
bronchoalveolaacuterniacute lavaacutež) přiacutepadně semi‐invazivniacutemi (metoda indukovaneacuteho sputa) ty jsou pro
pacienta zatěžujiacuteciacute u dětiacute a seniorů mohou byacutet dokonce až stresovou zaacuteležitostiacute Včasnaacute diagnostika
plicniacutech onemocněniacute ovšem hraje důležitou roli z hlediska zahaacutejeniacute uacutečinneacute terapie a minimalizace
poškozeniacute organismu pacienta
Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu je poměrně novou metodou jež představuje
alternativniacute cestu kterou lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute a pro pacienta nezatěžujiacuteciacute
Složeniacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu koresponduje s ději odehraacutevajiacuteciacutemi se bezprostředně
v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech odkud se do něj dostaacutevaacute celaacute řada specifickyacutech laacutetek
Princip analyacutezy kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu spočiacutevaacute v kvantifikaci specifickyacutech laacutetek
pro uvedenaacute onemocněniacute ndash tzvbdquobiomarkerůldquo ktereacute se vyskytujiacute v uvedeneacute tělniacute tekutině a jejichž
koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacuteho patologickeacuteho procesu v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech
vyacuteznamně zvyacutešena K analyacuteze dechoveacuteho kondenzaacutetu se použiacutevajiacute biochemickeacute metody nebo metody
využiacutevajiacuteciacute vysoce citliveacute a specifickeacute techniky na baacutezi hmotnostniacute spektrometrie V současneacute době se
problematika využitiacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako zdroje biomarkerů plicniacutech
onemocněniacute nachaacuteziacute ve stavu kdy byla popsaacutena celaacute řada metodik stanoveniacute biomarkerů ovšem
vyacutesledky uvedenyacutech studiiacute vykazujiacute značnyacute rozptyl danyacute opomenutiacutem důležityacutech specifickyacutech faktorů
ktereacute je nutneacute respektovat při zpracovaacuteniacute a naacutesledneacute analyacuteze teacuteto tělniacute tekutiny
Předklaacutedanaacute praacutece si kladla za ciacutel postihnout a kvantifikovat parametry ktereacute mohou byacutet
zdrojem v literatuře uvaacuteděnyacutech rozporuplnyacutech vyacutesledků a vypracovat protokol zpracovaacuteniacute
dechoveacuteho kondenzaacutetu a stanoveniacute specifickyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu (8‐isoprostan
malondialdehyd 4‐hydroxynonenal prostaglandin D2 a prostaglandin E2) metodou hmotnostniacute
spektrometrie Vyacutesledkem experimentaacutelniacute činnosti v teacuteto oblasti je vypracovaacuteniacute metody kombinujiacuteciacute
extrakci biomarkerů s dostatečně citlivou a selektivniacute detekčniacute metodou ndash hmotnostně‐
spektrometrickou analyacutezou kteraacute umožňuje kvantifikaci těchto specifickyacutech laacutetek
3 T
31 K
311 S
vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu
vydechojež kores
(metaboidentifik
O
zvyacutešeneacute může si
Teoretick
ondenzaacutet
Složeniacute KV
Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec
mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo
ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa
olity kyselinyovaacuteno viacutece n
Obraacutezek 1 Sc
Z pmakap
V KVV bylkoncentraciignalizovat p
kaacute čaacutest
t vydechov
VV
ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]
cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)
y detekovaacuteni při patologplicniacute onem
vaneacuteho vz
dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo
m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me
noveacute) pepti
ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p
ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap
7
zduchu (K
e 15‐25 m3
neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy
vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech
eacute biomolekuesech odehpř asthma
KVV)
vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s
apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z
y DNA ad
chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd
uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale
aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb
rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b
organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal
omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute
neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr
vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn
plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a
ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov
hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem
ondenzaacutet tekutiny
kosanoidy niacutemu dni
a strhaacutevajiacute erosoloveacute
kytujiacute ve aacute hladina vinu plic
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
4
Obsah
Obsah 4 1 Seznam zkratek 5 2 Uacutevod 6 3 Teoretickaacute čaacutest 7
31 Kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu (KVV) 7 311 Složeniacute KVV 7 312 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 8
32 Oxidativniacute stres 9 321 Markery oxidativiacuteho stresu 9 322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu 15
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV 17 331 Extrakce biomarkerů 17 332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry) 18
34 Pracovniacute hypoteacuteza 19 4 Metodika praacutece 20
41 Chemikaacutelie a pomůcky 20 42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu 21 43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 21 45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV 21
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza 22 46 Klinickaacute studie 24
5 Vyacutesledky a Diskuze 25 51 Odběr KVV 26 52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami 26 53 HPLCMS metoda 26
531 Extrakčniacute metody 29 532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty 29 533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE 31
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu 31 541 Klinickaacute studie 32
6 Zaacutevěr 33 7 Seznam literatury 34
5
1 Seznam zkratek
8‐iso‐PGF2α 8‐isoprostan 8‐iso prostaglandin F2α API atmospheric pressure ionization (ionizace za atmosferickeacuteho tlaku)
Aλ absorbance při vlnoveacute deacutelce λ b tloušťka vrstvy (cm) c laacutetkoveacute koncentrace (mol l‐1) CID Collision Induced Dissociation (kolizně indukovanaacute disociace) COX enzym cyklooxygenaacuteza ESI electrospray ionizacion (elektrosprejovaacute ionizace) GC‐MS plynovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem HNE 4‐hydroxynonenal HPLC‐MS vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem
spektrometrem HPLC‐UV vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie s UV detekciacute KVV kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MDA malondialdehyd MeMDA methylmalondialdehyd MRM Multiple Reaction Monitoring PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandin E2 PGD2 Prostaglandin D2
RE relative error (relativniacute chyba) RSD relative standard deviation (relativniacute směrodatnaacute odchylka) ROS reactive oxygen species (reaktivniacute kysliacutekoveacute čaacutestice) SPE Solid Phase Extraction (extrakce na pevneacute faacutezi) TMP 1133‐tetramethoxypropan TXA2 thromboxan A2
VFN všeobecnaacute fakultniacute nemocnice
ε molaacuterniacute absorpčniacute koeficient (l mol‐1 cm‐1)
μ skutečneacute přidaneacute množstviacute
x průměr stanoveneacute koncentrace
6
2 Uacutevod
Sledovaacuteniacute specifickyacutech molekul produkovanyacutech organismem při patologickyacutech procesech je
v dnešniacute době součaacutestiacute moderniacute leacutekařskeacute diagnostiky Běžně se setkaacutevaacuteme s analyacutezou laacutetek v krevniacute
plazmě a moči Vyacutesledky ziacuteskaneacute analyacutezou těchto tělniacutech tekutin jsou odrazem procesů odehraacutevajiacuteciacutech
se v raacutemci celeacuteho organismu a k lokalizaci patologickeacuteho procesu se využiacutevajiacute jen v omezeneacute miacuteře
přiacutepadně pouze jako doplněk dalšiacutech diagnostickyacutech metod K vyšetřeniacute nemociacute plic a dyacutechaciacutech cest
(např diagnostika bronchiaacutelniacuteho astmatu asbestoacutezy silikoacutezy ad) se v běžneacute praxi použiacutevaacute celaacute řada
diagnostickyacutech metod ktereacute jsou v naprosteacute většině metodami invazivniacutemi (bronchiaacutelniacute biopsie
bronchoalveolaacuterniacute lavaacutež) přiacutepadně semi‐invazivniacutemi (metoda indukovaneacuteho sputa) ty jsou pro
pacienta zatěžujiacuteciacute u dětiacute a seniorů mohou byacutet dokonce až stresovou zaacuteležitostiacute Včasnaacute diagnostika
plicniacutech onemocněniacute ovšem hraje důležitou roli z hlediska zahaacutejeniacute uacutečinneacute terapie a minimalizace
poškozeniacute organismu pacienta
Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu je poměrně novou metodou jež představuje
alternativniacute cestu kterou lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute a pro pacienta nezatěžujiacuteciacute
Složeniacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu koresponduje s ději odehraacutevajiacuteciacutemi se bezprostředně
v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech odkud se do něj dostaacutevaacute celaacute řada specifickyacutech laacutetek
Princip analyacutezy kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu spočiacutevaacute v kvantifikaci specifickyacutech laacutetek
pro uvedenaacute onemocněniacute ndash tzvbdquobiomarkerůldquo ktereacute se vyskytujiacute v uvedeneacute tělniacute tekutině a jejichž
koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacuteho patologickeacuteho procesu v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech
vyacuteznamně zvyacutešena K analyacuteze dechoveacuteho kondenzaacutetu se použiacutevajiacute biochemickeacute metody nebo metody
využiacutevajiacuteciacute vysoce citliveacute a specifickeacute techniky na baacutezi hmotnostniacute spektrometrie V současneacute době se
problematika využitiacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako zdroje biomarkerů plicniacutech
onemocněniacute nachaacuteziacute ve stavu kdy byla popsaacutena celaacute řada metodik stanoveniacute biomarkerů ovšem
vyacutesledky uvedenyacutech studiiacute vykazujiacute značnyacute rozptyl danyacute opomenutiacutem důležityacutech specifickyacutech faktorů
ktereacute je nutneacute respektovat při zpracovaacuteniacute a naacutesledneacute analyacuteze teacuteto tělniacute tekutiny
Předklaacutedanaacute praacutece si kladla za ciacutel postihnout a kvantifikovat parametry ktereacute mohou byacutet
zdrojem v literatuře uvaacuteděnyacutech rozporuplnyacutech vyacutesledků a vypracovat protokol zpracovaacuteniacute
dechoveacuteho kondenzaacutetu a stanoveniacute specifickyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu (8‐isoprostan
malondialdehyd 4‐hydroxynonenal prostaglandin D2 a prostaglandin E2) metodou hmotnostniacute
spektrometrie Vyacutesledkem experimentaacutelniacute činnosti v teacuteto oblasti je vypracovaacuteniacute metody kombinujiacuteciacute
extrakci biomarkerů s dostatečně citlivou a selektivniacute detekčniacute metodou ndash hmotnostně‐
spektrometrickou analyacutezou kteraacute umožňuje kvantifikaci těchto specifickyacutech laacutetek
3 T
31 K
311 S
vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu
vydechojež kores
(metaboidentifik
O
zvyacutešeneacute může si
Teoretick
ondenzaacutet
Složeniacute KV
Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec
mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo
ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa
olity kyselinyovaacuteno viacutece n
Obraacutezek 1 Sc
Z pmakap
V KVV bylkoncentraciignalizovat p
kaacute čaacutest
t vydechov
VV
ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]
cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)
y detekovaacuteni při patologplicniacute onem
vaneacuteho vz
dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo
m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me
noveacute) pepti
ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p
ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap
7
zduchu (K
e 15‐25 m3
neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy
vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech
eacute biomolekuesech odehpř asthma
KVV)
vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s
apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z
y DNA ad
chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd
uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale
aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb
rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b
organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal
omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute
neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr
vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn
plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a
ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov
hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem
ondenzaacutet tekutiny
kosanoidy niacutemu dni
a strhaacutevajiacute erosoloveacute
kytujiacute ve aacute hladina vinu plic
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
5
1 Seznam zkratek
8‐iso‐PGF2α 8‐isoprostan 8‐iso prostaglandin F2α API atmospheric pressure ionization (ionizace za atmosferickeacuteho tlaku)
Aλ absorbance při vlnoveacute deacutelce λ b tloušťka vrstvy (cm) c laacutetkoveacute koncentrace (mol l‐1) CID Collision Induced Dissociation (kolizně indukovanaacute disociace) COX enzym cyklooxygenaacuteza ESI electrospray ionizacion (elektrosprejovaacute ionizace) GC‐MS plynovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem HNE 4‐hydroxynonenal HPLC‐MS vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem
spektrometrem HPLC‐UV vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie s UV detekciacute KVV kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MDA malondialdehyd MeMDA methylmalondialdehyd MRM Multiple Reaction Monitoring PG Prostaglandin PGE2 Prostaglandin E2 PGD2 Prostaglandin D2
RE relative error (relativniacute chyba) RSD relative standard deviation (relativniacute směrodatnaacute odchylka) ROS reactive oxygen species (reaktivniacute kysliacutekoveacute čaacutestice) SPE Solid Phase Extraction (extrakce na pevneacute faacutezi) TMP 1133‐tetramethoxypropan TXA2 thromboxan A2
VFN všeobecnaacute fakultniacute nemocnice
ε molaacuterniacute absorpčniacute koeficient (l mol‐1 cm‐1)
μ skutečneacute přidaneacute množstviacute
x průměr stanoveneacute koncentrace
6
2 Uacutevod
Sledovaacuteniacute specifickyacutech molekul produkovanyacutech organismem při patologickyacutech procesech je
v dnešniacute době součaacutestiacute moderniacute leacutekařskeacute diagnostiky Běžně se setkaacutevaacuteme s analyacutezou laacutetek v krevniacute
plazmě a moči Vyacutesledky ziacuteskaneacute analyacutezou těchto tělniacutech tekutin jsou odrazem procesů odehraacutevajiacuteciacutech
se v raacutemci celeacuteho organismu a k lokalizaci patologickeacuteho procesu se využiacutevajiacute jen v omezeneacute miacuteře
přiacutepadně pouze jako doplněk dalšiacutech diagnostickyacutech metod K vyšetřeniacute nemociacute plic a dyacutechaciacutech cest
(např diagnostika bronchiaacutelniacuteho astmatu asbestoacutezy silikoacutezy ad) se v běžneacute praxi použiacutevaacute celaacute řada
diagnostickyacutech metod ktereacute jsou v naprosteacute většině metodami invazivniacutemi (bronchiaacutelniacute biopsie
bronchoalveolaacuterniacute lavaacutež) přiacutepadně semi‐invazivniacutemi (metoda indukovaneacuteho sputa) ty jsou pro
pacienta zatěžujiacuteciacute u dětiacute a seniorů mohou byacutet dokonce až stresovou zaacuteležitostiacute Včasnaacute diagnostika
plicniacutech onemocněniacute ovšem hraje důležitou roli z hlediska zahaacutejeniacute uacutečinneacute terapie a minimalizace
poškozeniacute organismu pacienta
Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu je poměrně novou metodou jež představuje
alternativniacute cestu kterou lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute a pro pacienta nezatěžujiacuteciacute
Složeniacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu koresponduje s ději odehraacutevajiacuteciacutemi se bezprostředně
v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech odkud se do něj dostaacutevaacute celaacute řada specifickyacutech laacutetek
Princip analyacutezy kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu spočiacutevaacute v kvantifikaci specifickyacutech laacutetek
pro uvedenaacute onemocněniacute ndash tzvbdquobiomarkerůldquo ktereacute se vyskytujiacute v uvedeneacute tělniacute tekutině a jejichž
koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacuteho patologickeacuteho procesu v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech
vyacuteznamně zvyacutešena K analyacuteze dechoveacuteho kondenzaacutetu se použiacutevajiacute biochemickeacute metody nebo metody
využiacutevajiacuteciacute vysoce citliveacute a specifickeacute techniky na baacutezi hmotnostniacute spektrometrie V současneacute době se
problematika využitiacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako zdroje biomarkerů plicniacutech
onemocněniacute nachaacuteziacute ve stavu kdy byla popsaacutena celaacute řada metodik stanoveniacute biomarkerů ovšem
vyacutesledky uvedenyacutech studiiacute vykazujiacute značnyacute rozptyl danyacute opomenutiacutem důležityacutech specifickyacutech faktorů
ktereacute je nutneacute respektovat při zpracovaacuteniacute a naacutesledneacute analyacuteze teacuteto tělniacute tekutiny
Předklaacutedanaacute praacutece si kladla za ciacutel postihnout a kvantifikovat parametry ktereacute mohou byacutet
zdrojem v literatuře uvaacuteděnyacutech rozporuplnyacutech vyacutesledků a vypracovat protokol zpracovaacuteniacute
dechoveacuteho kondenzaacutetu a stanoveniacute specifickyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu (8‐isoprostan
malondialdehyd 4‐hydroxynonenal prostaglandin D2 a prostaglandin E2) metodou hmotnostniacute
spektrometrie Vyacutesledkem experimentaacutelniacute činnosti v teacuteto oblasti je vypracovaacuteniacute metody kombinujiacuteciacute
extrakci biomarkerů s dostatečně citlivou a selektivniacute detekčniacute metodou ndash hmotnostně‐
spektrometrickou analyacutezou kteraacute umožňuje kvantifikaci těchto specifickyacutech laacutetek
3 T
31 K
311 S
vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu
vydechojež kores
(metaboidentifik
O
zvyacutešeneacute může si
Teoretick
ondenzaacutet
Složeniacute KV
Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec
mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo
ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa
olity kyselinyovaacuteno viacutece n
Obraacutezek 1 Sc
Z pmakap
V KVV bylkoncentraciignalizovat p
kaacute čaacutest
t vydechov
VV
ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]
cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)
y detekovaacuteni při patologplicniacute onem
vaneacuteho vz
dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo
m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me
noveacute) pepti
ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p
ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap
7
zduchu (K
e 15‐25 m3
neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy
vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech
eacute biomolekuesech odehpř asthma
KVV)
vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s
apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z
y DNA ad
chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd
uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale
aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb
rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b
organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal
omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute
neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr
vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn
plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a
ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov
hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem
ondenzaacutet tekutiny
kosanoidy niacutemu dni
a strhaacutevajiacute erosoloveacute
kytujiacute ve aacute hladina vinu plic
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
6
2 Uacutevod
Sledovaacuteniacute specifickyacutech molekul produkovanyacutech organismem při patologickyacutech procesech je
v dnešniacute době součaacutestiacute moderniacute leacutekařskeacute diagnostiky Běžně se setkaacutevaacuteme s analyacutezou laacutetek v krevniacute
plazmě a moči Vyacutesledky ziacuteskaneacute analyacutezou těchto tělniacutech tekutin jsou odrazem procesů odehraacutevajiacuteciacutech
se v raacutemci celeacuteho organismu a k lokalizaci patologickeacuteho procesu se využiacutevajiacute jen v omezeneacute miacuteře
přiacutepadně pouze jako doplněk dalšiacutech diagnostickyacutech metod K vyšetřeniacute nemociacute plic a dyacutechaciacutech cest
(např diagnostika bronchiaacutelniacuteho astmatu asbestoacutezy silikoacutezy ad) se v běžneacute praxi použiacutevaacute celaacute řada
diagnostickyacutech metod ktereacute jsou v naprosteacute většině metodami invazivniacutemi (bronchiaacutelniacute biopsie
bronchoalveolaacuterniacute lavaacutež) přiacutepadně semi‐invazivniacutemi (metoda indukovaneacuteho sputa) ty jsou pro
pacienta zatěžujiacuteciacute u dětiacute a seniorů mohou byacutet dokonce až stresovou zaacuteležitostiacute Včasnaacute diagnostika
plicniacutech onemocněniacute ovšem hraje důležitou roli z hlediska zahaacutejeniacute uacutečinneacute terapie a minimalizace
poškozeniacute organismu pacienta
Analyacuteza kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu je poměrně novou metodou jež představuje
alternativniacute cestu kterou lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute a pro pacienta nezatěžujiacuteciacute
Složeniacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu koresponduje s ději odehraacutevajiacuteciacutemi se bezprostředně
v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech odkud se do něj dostaacutevaacute celaacute řada specifickyacutech laacutetek
Princip analyacutezy kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu spočiacutevaacute v kvantifikaci specifickyacutech laacutetek
pro uvedenaacute onemocněniacute ndash tzvbdquobiomarkerůldquo ktereacute se vyskytujiacute v uvedeneacute tělniacute tekutině a jejichž
koncentračniacute hladina je v důsledku probiacutehajiacuteciacuteho patologickeacuteho procesu v dyacutechaciacutech cestaacutech a pliciacutech
vyacuteznamně zvyacutešena K analyacuteze dechoveacuteho kondenzaacutetu se použiacutevajiacute biochemickeacute metody nebo metody
využiacutevajiacuteciacute vysoce citliveacute a specifickeacute techniky na baacutezi hmotnostniacute spektrometrie V současneacute době se
problematika využitiacute kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako zdroje biomarkerů plicniacutech
onemocněniacute nachaacuteziacute ve stavu kdy byla popsaacutena celaacute řada metodik stanoveniacute biomarkerů ovšem
vyacutesledky uvedenyacutech studiiacute vykazujiacute značnyacute rozptyl danyacute opomenutiacutem důležityacutech specifickyacutech faktorů
ktereacute je nutneacute respektovat při zpracovaacuteniacute a naacutesledneacute analyacuteze teacuteto tělniacute tekutiny
Předklaacutedanaacute praacutece si kladla za ciacutel postihnout a kvantifikovat parametry ktereacute mohou byacutet
zdrojem v literatuře uvaacuteděnyacutech rozporuplnyacutech vyacutesledků a vypracovat protokol zpracovaacuteniacute
dechoveacuteho kondenzaacutetu a stanoveniacute specifickyacutech biomarkerů oxidativniacuteho stresu (8‐isoprostan
malondialdehyd 4‐hydroxynonenal prostaglandin D2 a prostaglandin E2) metodou hmotnostniacute
spektrometrie Vyacutesledkem experimentaacutelniacute činnosti v teacuteto oblasti je vypracovaacuteniacute metody kombinujiacuteciacute
extrakci biomarkerů s dostatečně citlivou a selektivniacute detekčniacute metodou ndash hmotnostně‐
spektrometrickou analyacutezou kteraacute umožňuje kvantifikaci těchto specifickyacutech laacutetek
3 T
31 K
311 S
vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu
vydechojež kores
(metaboidentifik
O
zvyacutešeneacute může si
Teoretick
ondenzaacutet
Složeniacute KV
Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec
mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo
ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa
olity kyselinyovaacuteno viacutece n
Obraacutezek 1 Sc
Z pmakap
V KVV bylkoncentraciignalizovat p
kaacute čaacutest
t vydechov
VV
ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]
cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)
y detekovaacuteni při patologplicniacute onem
vaneacuteho vz
dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo
m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me
noveacute) pepti
ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p
ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap
7
zduchu (K
e 15‐25 m3
neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy
vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech
eacute biomolekuesech odehpř asthma
KVV)
vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s
apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z
y DNA ad
chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd
uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale
aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb
rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b
organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal
omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute
neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr
vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn
plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a
ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov
hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem
ondenzaacutet tekutiny
kosanoidy niacutemu dni
a strhaacutevajiacute erosoloveacute
kytujiacute ve aacute hladina vinu plic
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
3 T
31 K
311 S
vzduchuvedle ds dostatea řada dna epitese v tomPřiacutekladetěkavyacutechdostaacutevajvzduchu
vydechojež kores
(metaboidentifik
O
zvyacutešeneacute může si
Teoretick
ondenzaacutet
Složeniacute KV
Každyacute člov se nachaacutezejusiacuteku kysliacutekečnou tenziacute alšiacutech organlu plic a dyacutec
mto přiacutepadě m laacutetek obh laacutetek rozpujiacute jako aeros v bronšiacutech aZkondenzo
ovaneacuteho vzdusponduje s dKVV obsa
olity kyselinyovaacuteno viacutece n
Obraacutezek 1 Sc
Z pmakap
V KVV bylkoncentraciignalizovat p
kaacute čaacutest
t vydechov
VV
ěk během djiacute ve dvou faacuteku oxidu upar při tělesickyacutech laacutetekchaciacutech cest sčiacutetajiacute a tiacutemohacujiacuteciacute KVustnyacutech ve vsoloveacute čaacutestica bronchioleovaacuteniacutem tohouchu (KVV) ději odehraacutevahuje celou y arachidonnež 200 [3]
cheacutema obohacovrchu plicniacutecleacute kapičky kpičky)
y detekovaacuteni při patologplicniacute onem
vaneacuteho vz
dne vydechnziacutech ndash v plynuhličiteacuteho osneacute teplotě a V plynneacute frspolu s vodo
m se odpařiacute iVV touto cevodě (vazoakce ktereacute jsoch (obraacutezek oto vzduchu kteraacute odraacutežajiacuteciacutemi se bezřadu z me
noveacute) pepti
ceniacute vydechovch skliacutepků a dktereacute unaacutešiacute p
ny specifickeacutegickyacutech proceocněniacute (nap
7
zduchu (K
e 15‐25 m3
neacute a v kapaloxidu uhelna atmosfeacuterickakci se nachou vytvaacuteřejiacute laacutetky ktereacuteestou jsou ktivniacute peptidou strhaacutevaacuteny1) se ziacuteskaacute kaiacute složeniacute brozprostředně ediciacutenskeacuteho idy enzymy
vaneacuteho vzducyacutechaciacutech cestproud vydech
eacute biomolekuesech odehpř asthma
KVV)
vzduchu Laacuteneacute (ve forměnateacuteho a oxkeacutem tlaku ‐ vaacuteziacute i ve voděbinaacuterniacute systeacuteeacute jsou za norleukotrieny dy enzymy y z povrchu s
apalnaacute matronchoalveolaacutev pliciacutech a dyacutehlediska z
y DNA ad
chu laacutetkami zt se odpařujiacute thovaneacuteho vzd
uly (tzv bioraacutevajiacuteciacutech sebronchiale
aacutetky obsaženě aerosolů) [xidu dusnatvoda peroxiě nerozpustneacutem Tenze parmaacutelniacutech poda prostanoDNA proteisliznice turb
rice označovaacuterniacute extracelyacutechaciacutech cesajiacutemavyacutech kteryacutech b
organismu těkaveacute laacutetky (duchu (kapal
omarkery) ke v pliciacutech Jeoxidativniacute
neacute ve vydech[1] V plynneacuteteacuteho přiacutetomid vodiacuteku uhneacute biomolekuar biomolekdmiacutenek maacutelooidy Molekuiny a soli) seulentniacutem pr
vaacutena jako kouaacuterniacute plicniacute staacutech [2] laacutetek ‐ eikbylo k dnešn
plynnaacute faacuteze) alnaacute faacuteze ndash a
ktereacute se vysejich zvyacutešenaacutestres rakov
hovaneacutem eacute faacutezi jsou mny laacutetky hlovodiacuteky uly ktereacute ul a vody o těkaveacute uly maacutelo e do KVV rouděniacutem
ondenzaacutet tekutiny
kosanoidy niacutemu dni
a strhaacutevajiacute erosoloveacute
kytujiacute ve aacute hladina vinu plic
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
cystickouzahaacutejeniacute
cestaacutech
312 O
vydechočaacutestiacute konaacutedobka
stanoven
přiacutetomnyacuteJednocepotencioz nejdůlemeacutedia do
odběr přlabilniacutech
vydecho
Ob
u fibroacutezu a diacute uacutečinneacute teraVyacutehodou Ka nikoliv v c
Odběr kond
Na speciaovaneacuteho vzduondenzaacutetoru a a chladiacuteciacute a
ny vysokeacute
yacutech v KVV stnyacute ventil sonaacutelniacute znečežitějšiacutech čaacutesosahovat růzK dosaženiacute
ři teplotě ‐1 laacutetek jakyacutemBěhem odb
ovaacuteniacute nosem
braacutezek 2 Scheacute
dalšiacute) Včasnpie a minimaKVV je že oeleacutem těle ja
denzaacutetu vyd
alizovanyacutech uchu (obraacutezevydechovanparatura Uacutek
koncentrace
Možnaacute kontsloužiacute k oddčištěniacute kondstiacute kondenzaacuteznyacutech teplotnižšiacutech tepl
10degC až ‐20degmi jsou prostaběru kteryacute t je pacientov
eacutema kondenz
naacute diagnostikalizace poškoodraacutežiacute procesak je tomu v
dechovaneacute
klinickyacutech ek 2) kteryacute neacuteho vzduckolem lapače
e biomarker
taminace sliděleniacute vdechdenzovaneacutehaacutetoru je chla ktereacute pak oot se použiacutevC Tato niacutezkaglandiny letrvaacute obvykle vi nasazen n
zaacutetoru pro od
8
ka uvedenyacutecozeniacute paciensy odehraacutevapřiacutepadě jinyacutec
ho vzduchu
pracovištiacutechzkapalniacute aerhu je naacuteuste slin je zam
rů (např le
nami se zjišovaneacuteho a vo vzduchu diciacute systeacutem ovlivňujiacute mnovaacute chladiacuteciacute pkaacute teplota jeeukotrieny a15 ndash 20 minosniacute klips
běr KVV
h onemocněta jiacuteciacute se vyacutelučch tělniacutech te
u
h se ziacuteskaacutevrosoloveacute čaacutestek lapač sezeniacute kontam
eukotrieny
šťuje stanovvydechovaneacute
čaacutesticemikteryacute může
ožstviacute zachycrotiproudovyacute důležitaacute praldehydy ad nut lze ziacuteska
ěniacute hraje důl
čně v pliciacutechkutin (v moč
vaacute KVV postice a laacutetky slin jednoceminace slina
8‐iso Prosta
veniacutem aktiviteacuteho vzduchuz vnějšiacuteho podle typu
cenyacutech laacutetekyacute okruh [5] o kvantitativ at 2 ndash 3 ml K
ležitou roli z
přiacutepadně dči krevniacute plaz
omociacute kondz plynneacute faacutezestnyacute ventilmi neboť v
aglandin F2α
ty slinneacute αminusu a tiacutem se e
prostřediacute použiteacuteho c umožňujiacuteciacute vniacute uchovaacuteniacute
KVV Aby se
z hlediska
dyacutechaciacutech změ)
enzaacutetoru ze Hlavniacute l sběrnaacute nich byly
α ad) [4]
minusamylasy eliminuje Jednou
hladiacuteciacuteho
provaacutedět iacute tepelně
zamezilo
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
9
32 Oxidativniacute stres
Oxidativniacute stres je proces spojenyacute se vznikem velkeacuteho množstviacute ROS (reaktivniacute kysliacutekoveacute
čaacutestice ‐ reactive oxygen species) ktereacute atakujiacute biomolekuly přiacutetomneacute v organismu a naacutesledně
způsobujiacute jejich oxidaci Mezi ROS se řadiacute volneacute radikaacutely kysliacuteku s volnyacutem nepaacuterovyacutem elektronem
(∙HOˉ HO2∙ RO∙ RO2∙ O2ˉ ) a laacutetky ktereacute nemajiacute nepaacuterovyacute elektron a vznikajiacute přeměnami z volnyacutech
radikaacutelů ‐ peroxid vodiacuteku a kyselina chlornaacute Volneacute radikaacutely jsou v organismu tvořeny přirozenou
metabolickou drahou (likvidace fagocytovanyacutech organismů signalizačniacute vyacuteznam v buňce
mitochondriaacutelniacute dyacutechaacuteniacute) při patologickyacutech poškozeniacutech (narušeniacute antioxidačniacute ochrany) nebo jako
důsledek působeniacute xenobiotik (exhalace z průmyslu kouřeniacute) [6]
Buňky disponujiacute obsaacutehlou řadou antioxidačniacutech mechanismů (inaktivujiacuteciacute peroxidy enzymy
a proteiny) ktereacute zabraňujiacute tvorbě ROS tiacutem eliminujiacute jejich možnyacute ničivyacute efekt v organismu Životnost
ROS v organismu je omezena na kraacutetkyacute časovyacute interval což je přiacutečinou absence citliveacute a přesneacute
analytickeacute metody pro jejich stanoveniacute Kvůli tomuto probleacutemu je řada představ o působeniacute ROS
nedokonalaacute či nevyjasněnaacute Neniacute jasneacute zda ROS vyvolaacutevajiacute daneacute onemocněniacute nebo jsou‐li pouze
formovaacuteny v důsledku nemoci [6]
Nestabilita ROS vede k tomu že se hledajiacute stabilnějšiacute biomarkery pro oxidativniacute stres ktereacute
by pomohly objasnit mechanismy působeniacute různyacutech xenobiotik [7] např krystalickyacute oxid křemičityacute
vlaacuteknityacute azbest dioxiny a řada dalšiacutech
321 Markery oxidativiacuteho stresu
Z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS vznikaacute 8‐iso PGF2α oxidaciacute dalšiacutech mastnyacutech
kyselin (předevšiacutem ω-6 a ω-3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin) vznikajiacute konjungovaneacute dieny
alkany aldehydy nasyceneacute a nenasyceneacute ketony ad (obraacutezek 3)
Velkou většinu produktů oxidace mastnyacutech kyselin lze charakterizovat cytotoxickyacutemi
a genetoxickyacutemi vlastnostmi Daneacute biomarkery jsou stabilnějšiacute než ROS a lze jejich koncentrace měřit
v tělniacutech tekutinaacutech (plazma moč a KVV) V současneacute době se jako možneacute markery oxidativniacuteho
stresu lipidů monitoruje vedle vyacuteskytu 8‐iso PGF2α i malondialdehyd (MDA) 4‐hydroxynonenal (HNE)
PGD2 a PGE2
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
10
R
OOH
R
R O OOR O
R OOH
OH
OH
COOH
OH
CH2
NH2 COOH
OH
O
N
N
N
N
O
NH2
O
H
HOH
OH OH
ROS
8-hydroxy guanosin
H2O2
lipidoveacute peroxidy
oxidace aminokyselin
o - tyrosin
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehydn-aldehydy
nenasyceneacute aldehydy
8-iso PGF2αoxidace nukleovyacutech
kyselin
oxidace kyseliny arachidonoveacute
oxidace mastnyacutech kyselin
Obraacutezek 3 Produkty působeniacute volnyacutech radikaacutelů v organismu
3211 Prostaglandiny (PG)
Prostaglandiny patřiacute do skupiny eikosanoidů tedy laacutetek obsahujiacuteciacute dvaceti uhliacutekatyacute řetězec
PG jsou všudypřiacutetomneacute lipidy ktereacute se podiacuteliacute na řadě fyziologickyacutech ale i patologickyacutech procesech
odehraacutevajiacuteciacutech se v organismu
Prostaglandiny mohou vznikat několika způsoby Biologicky nejaktivnějšiacute jsou však
metabolity kyseliny arachidonoveacute (prostaglandin E2 (PGE2) prostaglandin D2 (PGD2) a thromboxan
A2) Kyselina arachidonovaacute je viacutecesytnaacute mastnaacute kyselina vaacutezaacutenaacute v membraacutenovyacutech fosfolipidech
odkud může byacutet působeniacutem enzymů nebo volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů uvolněna do organismu
Cesta kyseliny arachidonoveacute katalyzovanaacute cyklooxygenaacutezou (COX) upřednostňuje synteacutezu
prostaglandinů a thromboxanů Isoprostany se v tomto přiacutepadě mohou vyskytovat pouze jen jako
vedlejšiacute produkty V prvniacutem kroku přeměny kyseliny arachidonoveacute dochaacuteziacute působeniacutem COX
k navaacutezaacuteniacute dvou molekul kysliacuteku a vzniku bicyklickeacuteho endoperoxidoveacuteho prostaglandinu G2 (PGG2)
jehož hydroperoxidovaacute skupina se enzymem peroxid reduktaacuteza redukuje na hydroxylovou skupinu
prostaglandinu H2 (PGH2) Enzym coklooxygenaacutezy je v organismu přiacutetomen v několika možnyacutech
izomerickyacutech formaacutech ‐ COX‐1 (jejiacutem uacutekolem je udržovat fyziologickou hladinu prostanoidů pro
homeostatickou regulaci organismu) a COX‐2 kteraacute je zodpovědnaacute za průběh zaacutenětliveacute reakce [8]
Osud prekursoru PGH2 (obraacutezek 4) zaacutevisiacute na miacutestě vzniku a přiacutepadneacute aktivitě dalšiacutech enzymů
Přiacutemou přeměnou PGH2 vznikaacute thromboxan A2 (katalyzovaacuteno enzymem thromboxan A synthetaacuteza)
PGD2 (enzym prostaglandin D synthetaacuteza) PGE2 (enzym prostaglandin E synthetaacuteza) PGF2α (enzym
prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza) a prostacyklin (enzym prostacyklin synthetaacuteza) PGF2α
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
11
se v organismu vytvaacuteřiacute i redukciacute ketonickeacute skupiny PGE2 enzymem prostaglandin E 9‐ketoretuktaacuteza
PGA2 a PGB2 vznikajiacute postupnou metabolizaciacute PGE2 u ktereacuteho nejprve proběhne dehydratace ve
vodneacutem roztoku albuminu na PGA2 jež je naacutesledně izomerizovaacuten na PGB2 Vodnyacute roztok albuminu se
uplatňuje i při dehydrataci PGD2 na PGJ2
Fyziologickyacutem uacutekolem prostaglandinů je podiacutelet se na homeostatickeacute regulaci traacuteviciacute
oběhoveacute vylučovaciacute a dyacutechaciacute soustavy a uplatňujiacute se i v obdobiacute těhotenstviacute a porodu Při
patologickyacutech pochodech se s prostaglandiny můžeme setkat při zaacutenětech kardiovaskulaacuterniacutech
onemocněniacutech rakovině a oxidativniacutem stresu
Jejich biologickaacute aktivita je daacutena interakciacute se specifickyacutem G‐proteinovyacutem receptorem a
ovlivněniacutem lokaacutelniacute funkce ostatniacutech hormonů v cirkulaci Receptory se klasifikujiacute podle selektivity
k danyacutem prostaglandinům PGE2 se předevšiacutem vaacuteže na EP receptory PGI2 aktivuje IP receptory PGF2α
interaguje s FP receptory pro PGD2 se v organismu vyskytujiacute DP receptory a s TP receptory
přednostně vytvaacuteřiacute aktivniacute komplex thromboxany ale byacutevajiacute aktivovaacuteny i PGD2 PGF2α a 8‐iso PGF2α
Jednotliveacute prostanoidy navaacutezaacuteniacutem na odpoviacutedajiacuteciacute receptor v určiteacutem miacutestě ovlivňujiacute řadů procesů
Nejdůležitějšiacute prostaglandiny PGD2 a PGE2 se podiacutelejiacute na bronchokonstrikci draacuteždiacute dyacutechaciacute
cesty a tiacutem indukujiacute vznik kašle znaacutesobujiacute efekt působeniacute histaminu a zvyšujiacute produkci hlenu
v dyacutechaciacutech cestaacutech a lze je označit za promotory alergickeacute reakce
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
12
OO
COOH
OOH
OO
COOH
OH
O
COOH
OH
OH
O
COOH
OHOH
O
OHOH
COOHOH
OH
COOH
OH
OO
OH
COOH
COOH
O
COOH
OH
COOH
OH
O
O
COOH
OH
Prostaglandin G2
Prostaglandin H2
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Prostaglandin I2
Kyselina arachidonovaacute
Prostaglandin F2α
Thromboxan A2
COX
Prostaglandin A2
Prostaglandin B2
Prostaglandin J2
1
2
3
4
5
6 7
8
9
Peroxidreduktaacuteza
2 O2
Obraacutezek 4 Biosynteacuteza prostanoidů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem enzymu coklooxygenaacutezy (COX)
Přeměna nestabilniacuteho meziproduktu prostaglandinu H2 na přiacuteslušneacute prostaglandiny probiacutehaacute za přiacutetomnosti enzymů 1 ‐ prostaglandin H 911‐endoperoxid reduktaacuteza 2 ‐ prostaglandin E synthetaacuteza 3 ‐ prostaglandin E 9‐ketoreduktaacuteza 4 ‐ dehydratace 5 ‐ izomeraacuteza 6 ‐ thromboxan A synthetaacuteza 7 ‐ prostaglandin D synthetaacuteza 8 ‐ dehydratace 9 ‐ prostacyklin synthetaacuteza
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
13
3212 Isoprostany
Isoprostany vznikajiacute neenzymatickou peroxidaciacute membraacutenově vaacutezaneacute kyseliny arachidonoveacute
působeniacutem ROS (obraacutezek 5) Vyacutesledkem reakce arachidonoveacuteho radikaacutelu s molekulou kysliacuteku jsou
možneacute čtyři peroxyl radikaacutely kyseliny arachidonoveacute Peroxyl radikaacutely po podstoupeniacute intramolekulaacuterniacute
cyklizaci a navaacutezaacuteniacute druheacute molekuly kysliacuteku vytvaacuteřiacute čtyři regioizomery bicyklickyacutech endoperoxidů
isoprostanů G2 Vyacutesledkem čaacutestečneacute redukce iso‐PGG2 jsou isoprostany seacuterie E2 a D2 uacuteplnou redukciacute
ziacuteskaacuteme isoprostany F2α
COOH
COOH COOH COOH
COOHO O
COOHO O
COOH
O O COOH
O O
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
OO
COOHOOH
OO
COOH
OOH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
COOHOHOH
OH COOH
OH
OH
OH
O2
O2O2
O2
O2O2
O2 O2
Kyselina arachidonovaacuteROS
ROSROS
[H]
[H]
[H]
[H]
VI IV
IIIVObraacutezek 5 Mechanismus vzniku F2α isoprostanů z kyseliny arachidonoveacute působeniacutem ROS
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
14
Isoprostany se vyskytujiacute v pliciacutech kardiovaskulaacuterniacutem a lymfatickeacutem systeacutemu v centraacutelniacute
nervoveacute soustavě a v ledvinaacutech Největšiacute biologickaacute aktivita byla prokaacutezaacutena u 8‐iso PGF2α kteryacute
v organismu může způsobit vazokonstrikci ceacutev a bronchů vyacuterazně redukovat průtok krve ledvinami a
ovlivňovat agregaci krevniacutech destiček
3213 Malondialdehyd a 4 ndash hydroxynonenal
Jednaacute se o konečneacute produkty oxidace ω‐6 a ω‐3 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
(obraacutezek 6) 4‐ hydroxynonenal a malondialdehyd způsobujiacute naacutesledneacute poškozeniacute zaacutekladniacutech
stavebniacutech organismu (nukleoveacute kyseliny aminokyseliny a biacutelkoviny) a proto lze jejich vlastnosti
označit za genetoxickeacute (poškozeniacute DNA RNA a i translačniacutech a transkripčniacutech mechanismů) a
cytotoxickeacute (projevuje se poškozeniacutem buněk a jejich naacuteslednyacutem možnyacutem zaacutenikem)
R
OOH
R
R O
OO
R O
R O
OH
R
OOHO
RO
OH
R
OOH
O
R O
RR
R
O
R
R
O
RR R
O
konjugovaneacute dieny alkany
malondialdehyde
n-aldehydy
4-hydroxyalk-2-en-1-al 2-hydroxylalkan-1-al
4-hydroperoxyalk-2-en-1al
alk-2en-1-al
2-hydroperoxyalkan-1al
nasyceneacute ketony
nenasyceneacute ketony
ω-3 a ω-6 polynenasyceneacutemastneacute kyseliny
Obraacutezek 6 Scheacutema oxidace ωminus3 a ωminus6 polynenasycenyacutech mastnyacutech kyselin
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
15
322 Oxidativniacute stres a poškozeniacute organismu
3221 Expozice dioxiny
Jako dioxiny je souhrnně označovaacuteno 210 chemickyacutech laacutetek ze dvou skupin laacutetek odborně nazyacutevanyacutech polychlorovaneacute dibenzo‐p‐dioxiny (PCDDs) a polychlorovaneacute dibenzofurany (PCDFs) Mezi bdquonejvyacuteznamnějšiacuteldquo zaacutestupce se řadiacute 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxin (TCDD ‐ obraacutezek 7) kteryacute patřiacute mezi jedny z nejjedovatějšiacutech laacutetek (40kraacutet jedovatějšiacute než kyanid draselnyacute)
Dioxiny jsou vysoce toxickeacute laacutetky nebezpečneacute již ve stopovyacutech koncentraciacutech Jsou to laacutetky ktereacute se kumulujiacute v tukovyacutech tkaacuteniacutech organismů Jejich dlouhodobyacutem působeniacutem na organismus dochaacuteziacute k poškozeniacute imunitniacuteho a nervoveacuteho systeacutemu ke změnaacutem v endokrinniacutem systeacutemu (zejmeacutena štiacutetneacute žlaacutezy) a reprodukčniacutech funkciacute Ve vysokyacutech akutniacutech koncentraciacutech způsobujiacute dioxiny zaacuteněty kůže (alergickaacute dermatitida chlorakneacute) při vdechnutiacute vyvolaacutevaacute zaacuteněty sliznice a plicniacute tkaacuteně což může končit i smrtiacute Dalšiacutemi nejviacutece postiženyacutemi orgaacuteny jsou oči jaacutetra a ledviny Při nižšiacutech chronickyacutech daacutevkaacutech způsobujiacute poškozeniacute plicniacutech epitelů podiacutelejiacute se na vzniku oxidativniacuteho stresu z ktereacuteho se naacutesledně může vyviacutejet rakovinneacute onemocněniacute Převaacutežnaacute většina dioxinů se do organismu
dostaacutevaacute potravou inhalaciacute ze vzduchu nebo při styku s kůžiacute [9]
O
O Cl
ClCl
Cl
2378-tetrachlordibenzo- p-dioxin
Obraacutezek 7 Struktura 2378‐tetrachlordibenzo‐ p‐dioxinu (TCDD)
Dioxiny obecně vznikajiacute jako vedlejšiacute produkt průmysloveacute vyacuteroby ktereacute se uacutečastniacute chlor
(vyacuteroba PVC běleniacute buničiny chlorem ad) Nejvyacuteznamnějšiacutem zdrojem dioxinů jsou však v dnešniacute době předevšiacutem spalovny kde vznikajiacute neuacuteplnou oxidaciacute 12‐dichlorbenzenu což je přiacutečinou jejich vyacuteskytu v kouřovyacutech plynech technologicky nedořešenyacutech spaloven komunaacutelniacuteho odpadu obsahujiacuteciacuteho chlorovaneacute plasty předevšiacutem polyvinylchlorid (PVC)
Cl
Cl
OO
Cl
Cl O
OCl
Cl
Cl
Cl+ +
oxidace
TCDD
2 2 H2O+
Rovnice 1 Vznik TCDD hořeniacutem o‐dichlorbenzenu
V minulosti se můžeme setkat s několika přiacuteklady expozice lidiacute dioxiny V 60 letech Spolana
Neratovice zahaacutejila vyacuterobu chlorovanyacutech pesticidů včetně složky pro Agent Orange (směs pesticidů 24‐dichlorfenoxyoctoveacute kyseliny a 245‐trichlorfenoxyoctoveacute kyseliny kteryacute byl americkou armaacutedou
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
16
použiacutevaacuten v průběhu Vietnamskeacute vaacutelky) Při vyacuterobě chlorovanyacutech pesticidů byly dioxiny (předevšiacutem TCDD) nežaacutedouciacute vedlejšiacute laacutetkou Vyacuteskyt těchto laacutetek v provozech zapřiacutečinil řadu vaacutežnyacutech onemocněniacute velkeacuteho počtu zaměstnanců a je spojovaacuten s vysokou uacutemrtnostiacute zaměstnanců Spolany na rakovinu koncem 60 let minuleacuteho stoletiacute
3222 Expozice oxidem křemičityacutem
Silikoacuteza plic je typickeacute onemocněniacute profesionaacutelniacuteho původu ktereacute je vyvolaacuteno inhalaciacute prachu s obsahem krystalickeacuteho oxidu křemičiteacuteho jakožto hlavniacute složkou zemskyacutech mineraacutelů Při inhalaci se do alveol dostaacutevajiacute čaacutestice ze kteryacutech většina je vykašlaacutena nepatrnaacute čaacutest prachu však přechaacuteziacute v makrofaacuteziacutech stěnou alveolu do intersticia odkud je dopravovaacutena do miacutezniacutech uzlin Činnostiacute makrofaacutegů vznikaacute drobnyacute zaacutenět kteryacute se opakovanou inhalaciacute oxidu křemičiteacuteho postupně zvětšuje Nemoc se vyviacutejiacute 15 ndash 20 let a může vyuacutestit až v rakovinu plic
3223 Expozice azbestem
Azbestoacuteza je profesionaacutelniacute plicniacute onemocněniacute ktereacute vznikaacute v důsledku nadměrneacuteho vystaveniacute azbestovyacutech vlaacuteken Azbestovaacute vlaacutekna jsou zanesena proudem vdechovaneacuteho vzduchu až do alveol Vyacutesledkem je aktivace alveolaacuterniacutech makrofaacutegů a rozvoj zaacutenětliveacuteho procesu Přesnyacute mechanismus tohoto působeniacute neniacute znaacutem ale vyacuteznamnou roli hraje tvar azbestovyacutech vlaacuteken a jejich relativniacute nezničitelnost Inhalovanaacute vlaacutekna mohou v pliciacutech přetrvaacutevat řadu let Pro svůj charakteristickyacute tvar ndash uacutezkeacute a dlouheacute vlaacutekno ndash nemohou byacutet zcela fagocytovaacutena makrofaacutegy a tak jedno vlaacutekno po dlouhou dobu aktivuje řadu makrofaacutegů To vede k uvolňovaacuteniacute některyacutech enzymů a hlavně volnyacutech kysliacutekovyacutech radikaacutelů ktereacute poškozujiacute okolniacute plicniacute tkaacuteň Nebezpečnost inhalace azbestoveacuteho prachu spočiacutevaacute předevšiacutem ve zvyacutešeniacute rizika vzniku plicniacuteho karcinomu
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
17
33 Metody stanoveniacute biomarkerů v KVV
Složitost matrice KVV spojenaacute s velkyacutem počtem rozdiacutelnyacutech biomarkerů a rozmanitost dnešniacutech analytickyacutech metod naacutem daacutevaacute nepřeberneacute množstviacute kombinaciacute stanoveniacute V řadě praciacute bylo popsaacuteno stanoveniacute prostaglandinů a isoprostanů v různyacutech tělniacutech tekutinaacutech (krevniacute plazma moč mozkomiacutešniacute mok a KVV) s využitiacutem rozdiacutelnyacutech analytickyacutech metod jako je RIA (Radioimmunoassay) [10] EIA (Enzyme Immunoassay) [11] ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [12] přiacutepadně GC‐MS [13] nebo LC‐MS [14] Biochemickyacutemi metodami lze stanovit řaacutedově nižšiacute koncentrace laacutetek než jakyacutech je dnes dosahovaacuteno použitiacutem hmotnostně‐spektrometrickyacutech metod (GC‐MS LC‐MS) nicmeacuteně meze detekce těchto instrumentaacutelniacutech metod se v průběhu posledniacuteho desetiletiacute dostaly na uacuteroveň piko‐ femto‐ přiacutepadně attomolů což je plně postačujiacuteciacute pro detekci většiny biologicky aktivniacutech laacutetek vyskytujiacuteciacutech se v lidskeacutem organismu [6] Spojeniacute kapalinoveacute přiacutepadně plynoveacute chromatografie s hmotnostniacutem spektrometrem poskytuje oproti biochemickyacutem metodaacutem nejenom kvantitativniacute informaci ale rovněž i informaci strukturniacute (kvalitativniacute) kteraacute je při využitiacute MS technik vysoce specifickaacute Tiacutem jsou vyloučeny falešně pozitivniacute či negativniacute vyacutesledky ktereacute se v důsledku ldquozkřiacuteženyacutech reakciacuteldquo vyskytujiacute u imunochemickyacutech nebo enzymatickyacutech metod
Měřeniacute koncentrace MDA a HNE v řadě praciacute probiacutehaacute s využitiacutem spojeniacute kapalinoveacute chromatografie s UV nebo fluorescenčniacute detekciacute Nediacutelnou součaacutestiacute jejich stanoveniacute je derivatizace Tento způsob stanoveniacute se vyznačuje velice niacutezkou selektivitou k danyacutem analytům a k možneacutemu zkresleniacute vyacutesledků dalšiacutemi aldehydy přiacutetomnyacutemi v matrici neboť tyto metody neposkytujiacute strukturniacute informaci
Proces stanoveniacute eikosanoidů HNE a MDA v KVV při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce je možneacute rozdělit do třiacute čaacutestiacute V prvniacutem kroku se provaacutediacute odběr KVV (viz kapitola kondenzaacutet vydechovaneacuteho vzduchu) Z biologickeacute matrice se před samotnou hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezou analyty extrahujiacute a zakoncentrovaacutevajiacute přiacutepadně se provaacutediacute jejich derivatizace
331 Extrakce biomarkerů
Extrakce biomolekul z komplexniacute biologickeacute matrice se provaacutediacute z důvodu (1) zakoncentrovaacuteniacute (2) kompatibility rozpouštědla s mobilniacute faacuteziacute LC a (3) eliminace rušiveacuteho efektu matrice Jako extrakčniacute metody je možno použiacutet např specifickou extrakci laacutetky založeneacute na imunitniacute reakci antigenu s protilaacutetkou a nespecifickeacute odstraněniacute soliacute extrakciacute na pevneacute faacutezi (SPE ndash Solid Phase Extraction)
3311 Imunoseparace
Princip imunoseparačniacutech metod je založen na imunitniacute odpovědi organismu kde imunitniacute reakce probiacutehaacute na zaacutekladě vytvořeniacute komplexu antigen ndash protilaacutetka Antigen je pro organismus strukturně ciziacute laacutetka vyvolaacutevajiacuteciacute tvorbu přiacuteslušneacute specifickeacute protilaacutetky kteraacute je schopna vychytaacutevat danyacute antigen a proto lze reakce mezi antigenem a protilaacutetkou charakterizovat jako vysoce specifickou Tedy pokud je k dispozici specifickaacute protilaacutetka může byacutet při použitiacute vhodneacute laboratorniacute techniky provedena extrakce sledovaneacuteho antigenu z biologickeacuteho vzorku kvantitativně
Pro separaci vytvořeneacuteho komplexu antigen ‐ protilaacutetka z biologickyacutech matric musiacute byacutet protilaacutetka zakotvena na nosiči kteryacute umožniacute bezprobleacutemovou separaci z tělniacutech tekutin (pomociacute
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
18
odstředěniacute ndash např Sepharosa 4B v magnetickeacutem poli ndash magnetickeacute mikro‐ a nanočaacutestice [6] nebo různeacute druhy destiček) při zachovaacuteniacute dostatečneacute vazebneacute kapacity pro antigen
3312 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Princip extrakce na pevneacute faacutezi vychaacuteziacute z kapalinoveacute chromatografie (použiacutevajiacute se i obdobneacute stacionaacuterniacute faacuteze ‐ např silikagelovyacute nosič modifikovanyacute oktadecylovou ethylovou cyklohexylovou aj skupinou) Funkčniacute skupiny sorbentu a rozpouštědla interagujiacute s laacutetkami z roztoku a zadržujiacute analyty Naacuteslednyacutem vymytiacutem se ze SPE kolonky ziacuteskaacute analyt (nečistoty zachyceny) nebo se z kolony nejprve vymyjiacute nečistoty a použitiacutem dalšiacuteho rozpouštědla se ziacuteskaacute analyzovanaacute laacutetka SPE extrakci lze
charakterizovat jako jednoduchou nenaacuteročnou metodu o tom svědčiacute i jejiacute časteacute použitiacute [15]
Obraacutezek 8 Scheacutema extrakce na pevneacute faacutezi (SPE) ‐ SPE kolona se před naneseniacutem vzorku (B) zaktivuje
vhodnyacutem rozpouštědlem (A) Nezadržovaneacute složky se ze SPE kolonky vymyjiacute (C) a nakonec se
provede vymytiacute zadrženyacutech molekul (D)
332 Hmotnostniacute spektrometrie (MS = mass spectrometry)
Nedaacutevnyacute bouřlivyacute vyacutevoj v oblasti LC‐MS umožňuje dnes bezprobleacutemovou separaci a paralelniacute detekci velmi niacutezkyacutech koncentraciacute analytů i ve značně komplexniacutech matriciacutech Z tohoto důvodu stejně jako pro svou vysoce specifickou strukturniacute informaci se LC‐MS staacutevaacute metodou prvniacute volby v analyacuteze laacutetek v biologickyacutech matriciacutech Stanoveniacute pikogramovyacutech množstviacute v komplexniacute tělniacute tekutině je řešitelnyacute probleacutem metodou LC‐MS a to i z hlediska budouciacute rutinniacute praxe
Vysokouacutečinnaacute kapalinovaacute chromatografie (High Performance Liquid Chromatography‐HPLC) se použiacutevaacute předevšiacutem pro analyacutezu maacutelo těkavyacutech a tepelně labilniacutech laacutetek Vysokeacute selektivity separace se dosahuje vhodnou volbou chromatografickyacutech faacutezovyacutech systeacutemů Nejčastěji se využiacutevaacute kapalinovaacute chromatografie s reverzniacutemi faacutezemi kde stacionaacuterniacute faacuteze kolony je tvořena silikagelem kteryacute může byacutet modifikovaacuten nepolaacuterniacutemi oktadecylovyacutemi skupinami a mobilniacute faacuteziacute nejčastěji ze směsi polaacuterniacutech rozpouštědel ‐ voda methanol a acetonitril s přiacutedavkem pufrů
Při využitiacute hmotnostně‐spektrometrickeacute detekce se analyzovaneacute laacutetky musejiacute převeacutest do plynneacute faacuteze a iontoveacuteho stavu S objevem technik umožňujiacuteciacutech ionizaci za atmosfeacuterickeacuteho tlaku (API ndash athmospheric pressure ionization) je možneacute proveacutest tento převod i u tepelně labilniacutech laacutetek Mezi nejvyužiacutevanějšiacute API techniky patřiacute ionizace elektrosprejem (ESI ndash elektrospray ionozation) za kterou
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
19
byla v roce 2002 udělena Nobelova cena za chemii Johnu B Fennovi ESI se řadiacute mezi měkkeacute ionizačniacute techniky vyznačujiacuteciacute se zachovaacuteniacutem molekuloveacuteho piacuteku při minimaacutelniacutem počtu vzniklyacutech fragmentů molekuly Kombinace ESI ionizace s vhodnyacutem analyzaacutetorem (jednoduchyacute nebo trojityacute kvadrupoacutel iontovaacute past) je vhodnou detekčniacute technikou pro kvantitativniacute stanoveniacute laacutetek Trojityacute kvadrupoacutel a iontovaacute past vedle kvantitativniacute informace přinaacutešiacute při praacuteci v MSn moacutedu (pro trojityacute kvadrupoacutel maximaacutelně MS2 častěji označovaacuten MSMS) i kvalitativniacute informaci o sledovaneacute molekule Hmotnostniacute spektrometr s trojityacutem kvadrupoacutelem využiacutevaacute vysoce selektivniacute MRM (multiple reaction monitoring) moacuted kde na prvniacutem kvadrupoacutelu Q1 se izoluje quasi‐molekulaacuterniacute ion (deprotonovanyacute molekulaacuterniacute ion [M‐H]‐ pro negativniacute ionizaci a pro pozitivniacute ionizaci např protonovanyacute ion [MH]+) přiacuteslušneacute molekuly kteryacute je použit jako prekursor (rodičovskyacute ion) pro naacuteslednou kolizně‐indukovanou disociaci (CID) V kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 dochaacuteziacute k selektivniacutemu rozpadu molekuly za vzniku dceřineacuteho spektra z ktereacuteho se na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izoluje specifickyacute dceřinyacute ion s nejvyššiacute abundanciacute [6]
34 Pracovniacute hypoteacuteza
Ciacutelem předklaacutedaneacute praacutece je sledovaacuteniacute hladin biomarkerů oxidativniacuteho stresu v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu jako tělniacute tekutině kteraacute odraacutežiacute bezprostředniacute děje odehraacutevajiacuteciacute se v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech
V experimentaacutelniacute čaacutesti bude vypracovanaacute analytickaacute metoda pro kvantitativniacute i kvalitativniacute
stanoveniacute 8‐iso PGF2α malondialdehydu 4‐hydroxynonenalu PGD2 a PGE2 Nediacutelnou součaacutestiacute metody by měly byacutet separačniacute kroky (imunoseparace extrakce na pevneacute faacutezi) a samotneacute stanoveniacute vysoce přesnou a selektivniacute metodou HPLC‐ESI‐MSMS Jistaacute pozornost je věnovaacutena stabilitě sledovanyacutech markerů za podmiacutenek odběru skladovaacuteniacute a zpracovaacuteniacute KVV
Vyvinutaacute analytickaacute metoda bude testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech s ciacutelem porovnaacuteniacute koncentračniacutech hladin biomarkerů pacientů s diagnostikovanyacutem onemocněniacutem a zdravyacutech jedinců Veškeraacute ziacuteskanaacute data budou statisticky vyhodnocena
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
20
4 Metodika praacutece
41 Chemikaacutelie a pomůcky
Naacutezev čistota vyacuterobce 8‐iso Prostaglandin F2α (8‐iso‐PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin D2 ge 99 Cayman Chemical USA
8‐iso Prostaglandin F2β (8‐iso‐PGF2β) ge 98 Cayman Chemical USA
8‐iso15(R)‐Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2α (PGF2α) ge 99 Cayman Chemical USA
Prostaglandin F2β (PGF2β) ge 99 Cayman Chemical USA
15(R)‐Prostaglandin F2α (15(R)‐PGF2α) ge 98 Cayman Chemical USA
11b‐Prostaglandin F2α (11b‐PG F2α) ge 99 Cayman Chemical USA
[3344 2H4] 8‐iso Prostaglandin F2α ge 98 Cayman Chemical USA
4‐Hydroxynonenal (HNE) ge 98 Cayman Chemical USA
[9 9 9 2H3] 4‐Hydroxynonenal (HNE‐d3) ge 99 Cayman Chemical USA
8 ndash isoprostane Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Prostaglandin E2 Affinity Sorbent Cayman Chemical USA
Argon 50 SAID Českaacute republika
Vzduch technickyacute SAID Českaacute republika
Dusiacutek technickyacute SAID Českaacute republika
Methanol LCMS Riedel de Haeumln Německo
Acetonitril LCMS Riedel de Haeumln Německo
Voda LCMS Riedel de Haeumln Německo
Ethanol HPLC Merkc Německo
Amoniak 28 ‐niacute roztok Aldrich USA
1133‐Tetramethoxypropan 99 Aldrich USA
3‐(Dimethylamino)‐2‐methyl‐2‐propenal 99 Aldrich USA
2‐Propanol ge999 Riedel de Haeumln Německo
Aceton ge998 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina mravenčiacute 999 Riedel de Haeumln Německo
Kyselina chlorovodiacutekovaacute pa Penta Českaacute republika
Hydroxid sodnyacute pa Penta Českaacute republika
Uhličitan sodnyacutebezvodyacute pa Penta Českaacute republika
Škrob Zulkowsky Merk Německo
35‐Dinitrosalicylovaacute kyselina ge98 Fluka Švyacutecarsko
Bond elut ndash C18 ndash hmotnost sorbentu 100 mg velikost čaacutestic 40μm objem 1ml (varian USA)
Hypercarb Thermo 100 x 21 mm x 5 microm s předkolonou Hypercarb (Thermo Electron Corporation
USA)
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
21
42 Synteacuteza standardu malondialdehydu a methylmalondialdehydu
Pro synteacutezu standardu malondialdehydu byl použit 1133‐tetramethoxypropan (TMP) kteryacute byl kysele hydrolyzovaacuten 60 minut při teplotě 40 degC Reakčniacute směs byla naacutesledně neutralizovaacutena (pH 7) roztokem uhličitanu sodneacuteho Pro přiacutepravu zaacutesobniacuteho roztoku o koncentraci cca 10 mM bylo použito 17ml TMP a 10 ml 01 M kyseliny chlorovodiacutekoveacute
Methylmalondialdehyd (MeMDA) byl připraven zahřiacutevaacuteniacutem 05 g 3‐dimethylamino‐2 methyl‐2‐propenalu s 02 g hydroxidu sodneacuteho v 07 ml vody Reakce se provaacuteděla při teplotě 70degC do vymizeniacute faacuteziacute (cca 3 hodiny) Při ochlazovaacuteniacute roztoku se začaly tvořit biacuteleacute krystaly Ze suspenze bylo odpařeno rozpouštědlo za sniacuteženeacuteho tlaku a ziacuteskaneacute krystaly byly promyty směsiacute rozpouštědel aceton2‐propanol (5050 ‐ VV) a acetonethanol (5050 ndash VV)
Přesnaacute koncentrace MDA a MeMDA byla stanovena využitiacutem UVVis spektrofotometru na
zaacutekladě Lambertova‐Beerova zaacutekona podle ktereacuteho je hodnota absorbance Aλ při vlnoveacute deacutelce λ přiacutemo uacuteměrnaacute laacutetkoveacute koncentraci c (mol l‐1) V přiacutepadě jedineacute absorbujiacuteciacute laacutetky v roztoku platiacute
rovnice Aλ = ελbc kde ελ (l mol‐1 cm‐1) představuje molaacuterniacute absorpčniacute koeficient při daneacute vlnoveacute deacutelce a b (cm) tloušťku vrstvy kterou prochaacuteziacute paprsek (v tomto přiacutepadě b = 1cm) Absorbance pro MDA
byla měřena při vlnoveacute deacutelce λ = 267 nm kdy molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε267 maacute hodnotu 31800 l mol‐1 cm‐1 Pro stanoveniacute koncentrace připraveneacuteho roztoku MeMDA bylo využito vlnoveacute deacutelky
λ = 274 nm jejiacute molaacuterniacute absorpčniacute koeficient ε274 odpoviacutedaacute hodnotě 29900 l mol‐1 cm‐1
43 Odběr kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
KVV byl ziacuteskaacutevaacuten prostřednictviacutem kondenzaacutetoru vydechovaneacuteho vzduchu EcoScreen (Jaeger
Německo) na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute VFN a 1 LF UK Bezprostředně po odběru vzorku bylo do 1 ml
KVV přidaacuteno 250 pg 8 ‐iso PGF2α‐d4 500 pg HNE‐d3 a 500 pg MeMDA a vzorek byl zmražen při teplotě
‐80 degC
44 Stanoveniacute α‐amylasy v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Enzymatickaacute reakce α‐amylasy obsaženeacute v KVV byla provaacuteděna při teplotě 37 degC smiacutechaacuteniacutem
KVV a 1 ‐niacuteho škrobu v poměru 12 Po 40 minutaacutech byla přidaacutena 35‐dinitrosalicylovaacute kyselina a
směs byla zahřaacutetaacute na teplotu 90 C (5 minut) kdy došlo k denaturaci α‐amylasy a redukci 35‐
dinitrosalyciloveacute kyseliny přiacutetomnyacutemi redukujiacuteciacutemi cukry Koncentrace vznikleacuteho produktu reakce
byla stanovena měřeniacutem absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm
45 Stanoveniacute koncentrace biomarkerů v KVV
4511 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute extrakce byla provaacuteděna naacutesledujiacuteciacutem postupem k 1ml KVV označeneacutemu
vnitřniacutemi standardy bylo přidaacuteno 50 microl každeacuteho z imunoafinitniacuteho sorbentu Suspenze byla třepaacutena
(60 minut) při 480 otmin Naacutesledně byl sorbent separovaacuten odstředěniacutem (500 otmin 5 min)
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
22
Separovaneacute sorbenty byly promyty (2 x 1 ml deionizovanou vodou) K promytyacutem sorbentům byl
přidaacuten studenyacute methanol (2 x 05 ml miacutechaacuteniacute 5 minut odstředěniacute 2500 otmin) Spojeneacute
methanolickeacute podiacutely byly podrobeny odpařeniacute methanolu proudem dusiacuteku Zbytek po odpařeniacute byl
rozpuštěn v 50 microl mobilniacute faacuteze a byla provedena LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
4512 Extrakce na pevneacute faacutezi (SPE)
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na Bond elut C18 (oktadecylovaacute kartridg) Před
samotnyacutem naneseniacutem vzorku KVV s vnitřniacutem standardem byla kolona zaktivovaacutena promytiacutem 5 x 1ml
methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě Na zaktivovanou kolonu byl
nanesen 1 ml KVV Matrice KVV z kartridge SPE kolony byla odstraněna 3 x 1ml vody Zadrženeacute laacutetky
byly z kolonky eluovaacuteny 1 ml methanolu Ziacuteskanaacute frakce methanolu byla odpařena proudem dusiacuteku
do sucha Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou byl zbytek po odpařeniacute rozpuštěn v 50 ml mobilniacute
faacuteze
452 LC‐ESI‐MSMS analyacuteza
LC‐ESI‐MS byla realizovaacutena v systeacutemu vybaveneacutem dvěma vysokotlakyacutemi pumpami Varian
ProStar 210 (Varian USA) autosamplerem Varian 410 (Varian USA) Chromatografickeacute děleniacute vzorku
(nastřikovaneacute množstviacute 20 μl) bylo realizovaacuteno na koloně Hypercarb Thermo (Thermo USA)
100 x 21 mm x 5 microm s použitiacutem mobilniacute faacuteze o složeniacute voda s pH upravenyacutem amoniakem na hodnotu
105 (rozpouštědlo A) a methanol s acetonitrilem v poměru 6040 (VV) s přidanyacutem amoniakem
(01 )(rozpouštědlo B) v gradientoveacutem uspořaacutedaacuteniacute (tabulka 1) Průtok mobilniacute faacuteze byl 150 μlmin
Chromatografickaacute kolona byla temperovaacutena na teplotu 30degC Na kolonu bylo nastřikovaacuteno 20 μl
vzorku Přiacutestroj byl vybaven trojityacutem kvadrupoacutelovyacutem analyzaacutetorem Varian 1200L (Varian USA) Při
měřeniacute bylo použito negativniacute elektrosprejoveacute ionizace (ESI‐) v MRM moacutedu Reakce kolizně‐
indukovaneacute disociace argonem pro jednotliveacute analyty jsou zachyceny v tabulce 2 Podmiacutenky na
hmotnostniacutem spektrometru byly naacutesledujiacuteciacute napětiacute na kapilaacuteře ‐70 V tlak kolizniacuteho plynu argonu
02 Pa napětiacute na jehle ‐4500 V teplota sušiciacuteho plynu 300 degC (dusiacutek 117 kPa) a teplota zamlžovaciacuteho
plynu 50 degC (vzduch 345 kPa) Data byla měřena a zpracovaacutevanaacute využitiacutem softwaru Varian MS
Workstation verze 652 (Varian USA)
Tabulka 1 Složeniacute mobilniacute faacuteze chromatografickeacute separace 8‐iso PGF2a
Čas (min) rozpouštědlo A () rozpouštědlo B()
000 70 30 1000 70 30 2500 5 95 5500 5 95 6000 70 30 7000 70 30
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
23
Tabulka 2 Kolizně disociačniacute reakce analytů pro MRM moacuted MS
Analyt MRM reakce Kolizniacute energie
(mz rarr mz) (eV)
8‐iso PGF2α 353 rarr 193 275 8‐iso PGF2α‐d4 357 rarr 197 275 PGE2 355 rarr 293 230 PGD2 355 rarr 275 150 MDA 71 rarr 42 135 MeMDA 87 rarr 58 160 4‐HNE 155 rarr 137 110 4‐HNE ndash d3 158 rarr 140 110
4521 Validace metody
Vyvinuteacute extrakčniacute metody byly charakterizovaacuteny naacutesledujiacuteciacutemi validačniacutemi parametry limit
detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ přesnost spraacutevnost a vyacutetěžnost
Limit detekce odpoviacutedaacute nejmenšiacute koncentraci analytu ve vzorku pro kterou je analytickyacute
signaacutel statisticky vyacuteznamně odlišnyacute od šumu U separačniacutech metod se použiacutevaacute k vyacutepočtu meze
detekce velikost hodnoty signaacutelu slepeacuteho pokusu Opakovanou analyacutezou blanku (n =10) byly určeny
průměrneacute hodnoty a směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu Limit detekce byl pak spočiacutetaacuten jako
průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu zvětšeneacuteho o trojnaacutesobek směrodatneacute odchylky
Limit kvantifikace představuje nejmenšiacute množstviacute analytu ve vzorku ktereacute může byacutet
stanoveno s předem zadanou nejistotou LOQ byl určen jako průměrnaacute hodnota slepeacuteho pokusu ke
ktereacute byl přičten desetinaacutesobek směrodatneacute odchylky slepeacuteho pokusu
Přesnost metody je definovaacutena jako těsnost shody ziacuteskaneacute koncentrace se skutečnou
hodnotou Jednaacute se tedy o statisticky vyacuteznamnou rozdiacutelnost mezi ziacuteskanou a skutečnou hodnotou
kteraacute se vyjadřuje relativniacute směrodatnou odchylkou RSD (relative standard deviation) jež se počiacutetaacute
podle vztahu RSD = sx x 100 () kde sx představuje směrodatnou odchylku a x je průměr daneacute
stanoveneacute koncentrace
Spraacutevnost metody vyjadřuje odchylku vyacutesledku od referenčniacute hodnoty a udaacutevaacute se pomociacute
relativniacute chyby (RE ndash relative error) Relativniacute chyba byla počiacutetaacutena vzorcem RE = ( x ndash μ) μ100 () μ
představuje skutečneacute přidaneacute množstviacute a x je průměr daneacute stanoveneacute koncentrace
Vyacutetěžnost udaacutevaacute poměr koncentrace analytu ziacuteskaneacuteho danou analytickou metodou k přijateacute
referenčniacute hodnotě (k znaacutemeacutemu přidaneacutemu množstviacute analytu)
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
24
46 Klinickaacute studie
Klinickaacute studie se sklaacutedala z diferenciaacutelniacute diagnostiky nemociacute spojenyacutech s oxidativniacutem stresem
a kontrolniacute skupiny U všech dobrovolniacuteků byly sledovaacuteny hladiny biomarkerů oxidativniacuteho stresu ndash
8 ‐ iso PGF2α PGE2 PGD2 HNE a MDA Tato studie byla provedena u 120 jedinců s onemocněniacutem
azbestoacutezy nebo silikoacutezy (věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute asbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn 6 let) u 33
pacientů s expoziciacute dioxiny (věk 69 + 5 let) a u 103 jedinců kontrolniacute skupiny (věk 65 plusmn 7)
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
25
5 Vyacutesledky a diskuze
Analyacuteza biomarkerů obsaženyacutech v KVV je poměrně novou rychle se rozviacutejejiacuteciacute oblastiacute v oboru
leacutekařskeacute diagnostiky Diagnostika založenaacute na stanoveniacute markerů oxidativniacuteho stresu však neniacute triviaacutelniacute zaacuteležitostiacute což dokazuje absence standardizovanyacutech metod pro jejich stanoveniacute přestože metod pro kvalitativniacute i kvantitativniacute analyacutezu prokazujiacuteciacutech možnost diferenciaacutelniacutech diagnostik těchto metod byla v literatuře publikovaacutena celaacute řada [16] Důvodem chybějiacuteciacute standardizovaneacute metody je předevšiacutem nerespektovaacuteniacute niacutezkeacute stability markerů za laboratorniacutech podmiacutenek přiacutetomnost enzymů zodpovědnyacutech za jejich odbouraacutevaacuteniacute v matrici KVV a chemickeacute změny odehraacutevajiacuteciacute se v průběhu zpracovaacuteniacute vzorku
Vyvinuteacute metody pro stanoveniacute hladin sledovanyacutech biomarkerů v KVV probiacutehaly podle scheacutematu zachyceneacuteho na obraacutezku 9 a snažily se respektovat veškeraacute vyacuteše uvedenaacute omezeniacute
SPEImunoseparace
Odběr KVV
Přaacutedavek vnitřniacutechstandardů
Separace HNE MDA
HPLC-ESI-MSMSanalyacutezy
Kvalitativniacute a kvantitativniacutestanoveniacute biomarkerů
Diagnoacuteza
8-iso PGF2α--d4HNE-d3MeMDA
Separace 8-iso PGF2α PGD2a PGE2
SPE
Stanoveniacute kontaminaceslinami
Obraacutezek 9 Scheacutema metody pro stanoveniacute biomarkerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
26
51 Odběr KVV
Odběr KVV byl provaacuteděn na Klinice nemociacute z povolaacuteniacute 1 LF UK a VFN vybaveneacute zařiacutezeniacutem pro
jeho odběr Vzhledem k citlivosti biomarkerů k celeacute řadě faktorů je ideaacutelniacute ihned po odběru proveacutest
označeniacute vzorku isotopicky značenyacutem vnitřniacutem standardem Princip standardizace izotopicky
značenyacutem analogem spočiacutevaacute v zcela identickeacutem fyzikaacutelniacutem chemickeacutem a biologickeacutem chovaacuteniacute
znaacutemeacuteho množstviacute standardu kteryacute při hmotnostně‐spektrometrickeacute analyacuteze vykazuje v důsledku
nahrazeniacute vodiacuteku deuteriem odlišneacute chovaacuteniacute v detektoru umožňujiacuteciacute velice přesneacute provedeniacute
kvantifikace a zaacuteroveň monitorovaacuteniacute změn ve složeniacute vzorku k nimž došlo v průběhu jeho zpracovaacuteniacute
Pro MDA byl z důvodu absence deuterovaneacuteho analogu zvolen jako vnitřniacute standard MeMDA kteryacute
se vyznačuje podobnyacutemi chemicko‐fyzikaacutelniacutemi vlastnostmi
52 Stanoveniacute kontaminace kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu slinami
Po odběru vzorku KVV se provaacuteděl test na kontaminaci slinami ke ktereacute by mohlo dojiacutet
v důsledku špatně provedeneacuteho odběru neboť ve slinaacutech se vyskytuje vyacuteznamneacute množstviacute
sledovanyacutech biomarkerů Zjištěniacute kontaminace je možneacute proveacutest prostřednictviacutem stanoveniacute aktivity
enzymu α-amylaacutezy kteraacute se detekuje na zaacutekladě koncentrace uvolněneacuteho redukujiacuteciacuteho cukru
z rozštěpeneacuteho škrobu Redukujiacuteciacute cukr při zahřaacutetiacute redukuje přidanou 35‐dinitrosalicylovou kyselinu
na 3‐amino‐5‐nitrosalicylovou kyselinu Koncentrace vznikleacute 3‐amino‐5‐nitrosalicyloveacute kyseliny se
stanovuje na zaacutekladě absorbance při vlnoveacute deacutelce λ = 530 nm Pro všechny vzorky klinickeacute studie byla
stanovena aktivita α-amylasy v KVV pod 01 vzhledem k jejiacute aktivitě ve slinaacutech Pokud by tato
aktivita byla vyššiacute matrice by byla znehodnocena a daacutele nezkoumaacutena
53 HPLCMS metoda
Kapalinovaacute chromatografie pro separaci prostaglandinů a aldehydů byla realizovaacutena na
koloně Hypercarb s gradientovyacutem složeniacutem mobilniacute faacuteze z rozpouštědel ‐ vody methanolu
acetonitrilu a amoniaku Vyvinutaacute HPLC metoda sloužila nejen k odděleniacute laacutetek od čela analyacutezy aby
v důsledku přiacutepadneacute koeluce soliacute a endogenniacutech složek matrice nedochaacutezelo k potlačeniacute signaacutelu
hmotnostniacuteho detektoru v důsledku negativniacuteho vlivu na ionizaci ale rovněž k separaci jednotlivyacutech
prostaglandinů a aldehydů Pro stanoveniacute 8‐iso PGF2α při použitiacute nespecifickeacute separačniacute metody SPE
bylo nutno oddělit biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α (obraacutezek 10) aby detekovanaacute
koncentrace 8‐iso PGF2α nebyla zkreslena dalšiacutemi diastereomery ktereacute by se eluovaly se shodnyacutem
retenčniacutem časem neboť u nich neniacute možneacute proveacutest hmotnostně‐spektrometrickou separaci
Chromatogram separovanyacutech laacutetek a přiacuteslušnyacutech diastereomerů za podmiacutenek uvedenyacutech
v experimentaacutelniacute čaacutesti je zachycen na obraacutezku 11
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
27
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
8-iso PGF2 β8-iso-15(R) PGF2 α
8-iso PGF2 α
PGF2 β
15(R)-PGF2 α PGF2 α 11-β-PGF2 α
Obraacutezek 10 Biologicky aktivniacute diastereomery 8‐iso PGF2α
Obraacutezek 11 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
28
OH
O
OH
COOH
O
OH
OH
COOH
Prostaglandin D2Prostaglandin E2
Obraacutezek 12 Struktura prostaglandinu D2 a prostaglandinu E2
Hmotnostně‐spektrometrickaacute detekce byla realizovaacutena negativniacute elektrosprejovou ionoizaciacute
(ESI‐) ve vysoce selektivniacutem MRM moacutedu Na kvadrupoacutelu Q1 byl izolovanyacute deprotonovanyacute molekulaacuterniacute
iont [M‐H]‐ přiacuteslušneacuteho analytu kteryacute byl použit jako prekursor pro naacuteslednou kolizně‐indikovanou
disociaci v kolizniacute cele kvadrupoacutelů Q2 (obraacutezek 13) kde dochaacutezelo k selektivniacutemu rozpadu molekuly
za vzniku dceřineacuteho spektra ze ktereacuteho byl na třetiacutem kvadrupoacutelu Q3 izolovaacuten specifickyacute dceřinyacute ion
s nejvyššiacute četnostiacute Kolizniacute energie a dalšiacute parametry hmotnostniacuteho spektrometru byly optimalizovaacuteny
z hlediska ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti vyvinuteacute metody (viz experimentaacutelniacute čaacutest)
Obraacutezek 13 MS a MSMS spektra sledovanyacutech analytů
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
29
531 Extrakčniacute metody
Vzhledem k velmi niacutezkeacute koncentraci biomarkerů v komplexniacute matrici KVV je vhodneacute
sledovaneacute laacutetky před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou separovat a proveacutest jejich zakoncentrovaacuteniacute
Za tiacutemto uacutečelem byla testovaacutena imunoseparace imunoafinitniacutemi sorbenty a extrakce na pevneacute faacutezi
(SPE) Použiteacute metody se odlišujiacute předevšiacutem selektivitou k danyacutem analytům Extrakce založenaacute na
reakci antigen ndash protilaacutetka se vyznačuje vyššiacute selektivitou Tato vysoce specifickaacute reakce umožňuje
odděleniacute nejen organickyacutech metabolitů od soliacute přiacutetomnyacutech v KVV jako je tomu i při extrakci na pevneacute
faacutezi ale i od dalšiacutech metabolitů kyseliny arachidonoveacute Daneacute separačniacute metody byly optimalizovaacuteny
z hlediska maximaacutelniacute vyacutetěžnosti k sledovanyacutem laacutetkaacutem
532 Extrakce afinitniacutemi sorbenty
Imunoafinitniacute separace byla realizovaacutena přiacutedavkem sorbentu do 1 ml KVV Veškereacute parametry
imunoextrakce s použitiacutem afinitniacutech sorbentů pro prostaglandiny byly optimalizovaacuteny vzhledem
k ziacuteskaacuteniacute maximaacutelniacute vyacutetěžnosti separace
Typickyacute průběh imunoextrakce je znaacutezorněn na obraacutezku 14 (pro 8‐iso PGF2α obdobneacute byly
ziacuteskaacuteny i pro dalšiacute prostaglandiny) kde je zachycena zaacutevislost doby imunoextrakce na separovaneacutem
množstviacute Z grafu je zřejmeacute že s prodlužujiacuteciacutem se časem imunoextrakce dochaacuteziacute k naacuterůstu
separovaneacuteho množstviacute 8‐iso PGF2α z KVV nicmeacuteně naproti tomu dochaacuteziacute k rozkladu laacutetek v důsledku
negativniacuteho vlivu teploty (25 degC) na jejich stabilitu Po dosaženiacute maxima separovaneacuteho množstviacute v 60
minutě začiacutenaacute převažovat proces degradace
Obraacutezek 14 Stanoveniacute optimaacutelniacute doby imunoextrakce 8‐iso PGF2α
Nemeacuteně důležityacutem parametrem je poměr množstviacute imunoafinitniacuteho sorbentu k 8‐iso PGF2α
k objemu KVV (množstviacute 8‐iso PGF2α v KVV se v klinickyacutech vzorciacutech pohybuje v intervalu 10 ‐100 pg1 ml) Zaacutevislost množstviacute imunoextrakčně separovanyacutech 8‐iso PGF2α na jeho množstviacute
původně přiacutetomneacutem v KVV je zachyceno na obraacutezku 15 z něhož je zřejmeacute že uvedenaacute zaacutevislost maacute
charakter adsorpčniacute isotermy na ktereacute je možneacute formaacutelně vymezit dvě oblasti V prvniacute oblasti
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140
Čas imunoextrakce min
Relativniacute koncentrace
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
30
s lineaacuterniacute zaacutevislostiacute se s rostouciacutem množstviacutem biomarkerů v matrici zvyšuje i množstviacute vznikleacuteho
komplexu antigen‐protilaacutetka (zvětšenaacute pracovniacute oblast) zatiacutemco v druheacute nelineaacuterniacute oblasti
se vyskytuje velkeacute množstviacute 8‐iso PGF2α pro kteryacute neniacute přiacutetomneacute dostatečneacute množstviacute volnyacutech
protilaacutetek na povrchu sorbentu Z hlediska přesnosti metody bylo v klinickyacutech analyacutezaacutech použiacutevaacuteno
50 μl sorbentu což odpoviacutedaacute imunoextrakčniacute separaci probiacutehajiacuteciacute v lineaacuterniacute čaacutesti zaacutevislosti
Vazba antigen ndash protilaacutetka byla naacutesledně rozvolněna metanolem Ziacuteskanyacute vzorek 8‐iso PGF2α byl před naacutestřikem na systeacutem LC‐ESI‐MSMS upraven odpařeniacutem methanolu proudem dusiacuteku a
naacutesledně zbylyacute odparek byl naředěn 50 μl mobilniacute faacuteze Uvedenyacutem postupem bylo možneacute separovat
viacutece než 85 v klinickeacutem vzorku přiacutetomnyacutech 8‐iso PGF2α V tabulce 3 jsou uvedeny validačniacute hodnoty (limit detekce ndash LOD limit kvantifikace ndash LOQ spraacutevnost přesnost a vyacutetěžnost) pro imunoafinitniacute
extrakci prostaglandinů
Obraacutezek 15 Zaacutevislost množstviacute separovaneacuteho 8‐iso PGF2α na jeho přidaneacutem množstviacute
0
200
400
600
800
0 500 1000 1500 2000 2500
Detekovaneacute množstviacute
8-iso PGF2α pg
Přidaneacute množstviacute 8-iso PGF2α pg
y = 08683xR2 = 09986
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250 300
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
31
Tabulka 3 Validačniacute parametry pro prostaglandiny pro imunoafinitniacute metodu
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2
LOD (pgml KVV) 1 1 1
LOQ (pgml KVV) 5 6 5
Spraacutevnost RE () ‐160 ‐174 ‐185
Přesnost RSD () 95 107 115
Vyacutetěžnost () 84 82 85
533 Extrakce na pevneacute faacutezi ‐ SPE
Extrakce na pevneacute faacutezi byla provaacuteděna na koloně s C18 (oktadecylovou) kartridgiacute obsahujiacuteciacute
100 mg sorbentu na ktereacute byla testovaacutena separace 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 v množstviacute 10 až 2500 pg
a HNE MDA v množstviacute 750‐2500pgml Zaacutevislost vyextrahovaneacuteho množstviacute těchto laacutetek na
původniacutem množstviacute přiacutetomneacutem ve vzorku KVV byla na zvoleneacutem intervalu lineaacuterniacute Po zaktivovaacuteniacute
kolony (promytiacute 5 x 1ml methanolu a 3 x 1ml 005 M roztokem kyseliny mravenčiacute ve vodě) a naneseniacute
vzorku na kolonu byla řada laacutetek (hlavně soliacute) z matrice KVV vymyta 2 x 1ml vody Analyty byly
z kartridge eluovaacuteny methanolem (1ml) Dalšiacute eluce methanolu (frakce sbiacuteraneacute vždy po 1ml)
obsahovaly množstviacute sledovanyacutech laacutetek pod limitem detekce Před samotnou LC‐ESI‐MSMS analyacutezou
byl methanolickyacute podiacutel odpařen proudem dusiacuteku dosucha a ziacuteskaneacute laacutetky naacutesledně byly rozpuštěny
v 50 μl mobilniacute faacuteze
Tabulka 4 Validačniacute parametry pro analyty pro extrakci na pevneacute faacutezi (SPE)
8‐iso PGF2α PGD2 PGE2 MDA HNE
LOD (pgml KVV) 2 2 2 21 26
LOQ (pgml KVV) 9 10 12 32 39
Spraacutevnost RE () ‐93 ‐97 ‐95 ‐71 ‐75
Přesnost RSD () 106 117 125 76 84
Vyacutetěžnost () 921 901 918 923 918
54 Stabilita markerů v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu
Většina biomarkerů obsaženyacutech v KVV je znaacutema jako maacutelo stabilniacute laacutetky Primaacuterniacute snahou při
vyacutevoji metody pro stanoveniacute těchto laacutetek v KVV bylo postihnout jejich chovaacuteniacute v uvedeneacute biologickeacute
matrici a naleacutezt postup přiacutepravy vzorku vhodneacuteho pro hmotnostně‐spektrometrickou analyacutezu
umožňujiacuteciacute zachytit koncentraci analytů bezprostředně po odebraacuteniacute vzorku KVV (matrice s majoritniacutem podiacutelem vody) bezprostředně po odběru vykazuje hodnotu pH
v rozmeziacute 72 ‐ 77 Hodnota pH KVV se však v kraacutetkeacutem časoveacutem intervalu snižuje (pH = 60 ndash 65) jako
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
32
důsledek absorpce CO2 ze vzduchu což může byacutet jednou z přiacutečin změn ktereacute se v uvedeneacute matrici
odehraacutevajiacute po jejiacutem odebraacuteniacute Při uchovaacuteniacute KVV pod inertniacute atmosfeacuterou (argon) nebyla pozorovaacutena
změna pH nicmeacuteně v přiacutepadě sledovanyacutech analytů se tento parametr nejevil jako zaacutesadniacute Rovněž
nebyl prokaacutezaacuten vliv světla na jejich stabilitu Parametrem kteryacute vyacuteznamně ovlivňuje obsah těchto
biomarkerů je teplota
Jako zaacutesadniacute parametr ovlivňujiacuteciacute stabilitu 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 se ukaacutezal vliv teploty
Citlivost 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 k teplotě je nejviacutece patrnyacute u teplot nad 0degC (4degC a 25degC) jak
v mobilniacute faacutezi tak v matrici KVV kde jsou pravděpodobně rozklady laacutetek urychleny přiacutetomnostiacute
enzymů způsobujiacuteciacute jejich odbouraacutevaacuteniacute Uacutebytek prostaglandinů po 6 hodinaacutech se při teplotě 25degC
sniacutežil z původniacute koncentrace na 456plusmn 7 a při teplotě 4degC byl zaznamenaacuten uacutebytek na hodnotu
672plusmn49 původniacute koncentrace Z důvodu uskladněniacute byly testovaacuteny teploty ‐20 a ‐ 80degC
Teplota ‐ 20degC se ukaacutezala vhodnaacute jen pro kraacutetkodobějšiacute skladovaacuteniacute (po 30 dnech uacutebytek o
219 plusmn 46) zatiacutemco při ndash 80 degC je možneacute vzorky skladovat až 180 dnů (uacutebytek o 1236 plusmn 45)
Zlomovou teplotou pro stabilitu laacutetek je zřejmě převedeniacute vodneacute matrice z pevneacuteho do kapalneacuteho
stavu (teplota 0 degC) S ohledem na uvedenou skutečnost byl posuzovaacuten parametr bdquocyklus
rozmrazovaacuteniacute ‐ zmrazovaacuteniacuteldquo Při každeacutem obratu uvedeneacuteho cyklu dochaacuteziacute ke sniacuteženiacute množstviacute
prostaglandinů o 8‐9 z jejich původniacuteho množstviacute v KVV
Sledovaneacute aldehydy se oproti 8‐iso PGF2α PGD2 a PGE2 dajiacute označit za stabilniacute laacutetky
v prostřediacute KVV (vodneacute prostřediacute s pH pohybujiacuteciacute se v intervalu 6‐8) a použiteacute mobilniacute faacuteze za
laboratorniacute teploty Při teplotě 25 degC v obou matriciacute byl po šesti dnech zaznamenaacuten uacutebytek MDA do
63 plusmn 21 a HNE do 114 plusmn 23 z původniacuteho množstviacute laacutetky ve vzorku Jako vhodnou skladovaciacute
teplotu lze použiacutet ‐ 20degC po dobu nepřesahujiacuteciacute jeden měsiacutec u obou laacutetek (rozpad 104 plusmn 35 laacutetek
po 3 měsiacuteciacutech skladovaacuteniacute okolo 303 plusmn 46 laacutetek) a teplotu ‐80 degC na dobu přesahujiacuteciacute i 90 dnů (po
90 dnech zaznamenaacuten uacutebytek 106 plusmn 21 MDA a 143 plusmn 36 HNE) Cyklus rozmrazeniacute‐zmrazeniacute se
vyacuterazněji nepromiacutetl do stability laacutetek (po pěti cyklech ubylo 91 plusmn 31 MDA a 134 plusmn 36 HNE)
541 Klinickaacute studie
Hladiny markerů oxidativniacuteho stresu jedinců s azbestovounebo silikoacutezou (120 jedinců s
diagnoacutezou azbestoacutezy nebo silikoacutezy věk 68 plusmn 8 průměrnaacute doba působeniacute azbestu nebo křemiacuteku 25 plusmn
6 let) byly srovnaacuteny s jedinci po expozici dioxiny (věk 69 + 5 let) a s kontrolniacute skupinou (103 jedinců
věk 65 plusmn 7 let) Mezi jednotlivyacutemi skupinami byly prokaacutezaacuteny statisticky vyacuteznamneacute rozdiacutely pro všechny
sledovaneacute biomarkery oxidativniacuteho stresu Hladina 8‐iso PGF2α byla pro pacienty s azbestovounebo silikoacutenovou expoziciacute 637 + 106 pgml KVV pro PGD2 55 + 115 pgml KVV pro PGE2 61 + 122 pgml
KVV pro MDA 31 + 06 ngml KVV a pro HNE 112 + 21 ngml KVV U osob s expoziciacute dioxinu byly
ziacuteskaacuteny naacutesledujiacuteciacute hodnoty pro 8‐iso PGF 2α 50 + 128 pgml KVV pro PGD2 72 + 114 pgml KVV pro
PGE2 85 + 78 pgml KVV pro MDA 40 + 05 ngml KVV a pro HNE 33 + 26 ngml U zdravyacutech jedinců
byly detekovaacuteny koncentrace pro 8‐iso PGF 2α pohybujiacuteciacute se v intervalu 376 + 136 pgml KVV pro
PGD2 21 + 14 pgml KVVpro PGE2 45 + 64 pgml KVV pro MDA 15 + 08 ngml KVV a HNE 66 + 16
ngml KVV
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
33
6 Zaacutevěr
Předklaacutedanaacute praacutece je orientovaacutena do oblasti medicinaacutelniacute diagnostiky a zabyacutevaacute se vyacutevojem metodiky stanoveniacute důležityacutech markerů plicniacutech onemocněniacute V raacutemci experimentaacutelniacute činnosti byla
vyvinuta metoda pro detekci a kvantifikaci prostaglandinu E2 a D2 8‐iso‐PGF2α 4‐hydroxynonenalu a malondialdehydu jako potenciaacutelniacutech biomarkerů plicniacutech onemocněniacute v kondenzaacutetu vydechovaneacuteho vzduchu Stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin v matrici KVV umožňuje neinvazivně monitorovat děje odehraacutevajiacuteciacute se bezprostředně v pliciacutech a dyacutechaciacutech cestaacutech nezaacutevisle na procesech probiacutehajiacuteciacutech v celeacutem organismu jak je tomu při stanoveniacute těchto laacutetek v krevniacute plazmě nebo moči
Ačkoliv v nedaacutevneacute době byla vyvinuta řada metod pro jejich stanoveniacute v KVV a byla prokaacutezaacutena možnost diferenciaacutelniacute diagnostiky oxidativniacuteho stresu neexistuje do současnosti standardizovanyacute postup pro stanoveniacute jejich koncentračniacutech hladin
Princip vyvinuteacute metody spočiacutevaacute na kombinaci vhodneacute extrakčniacute techniky (SPE imunoseparace) s vysoce selektivniacute a přesnou detekčniacute metodou hmotnostniacute spektrometrie
Jako zvoleneacute extrakčniacute techniky byly použiacutevaacuteny imunoafinitniacute extrakce a extrakce na pevneacute faacutezi Jednotliveacute separačniacute techniky se lišiacute specifitou k daneacutemu analytu Nejvyššiacute selektivitou se vyznačuje imunoseparace založenaacute na reakci antigenu s přiacuteslušnou protilaacutetkou Při využitiacute SPE je daleko většiacute důraz kladen na samotnou analytickou metodu kterou zde byla kapalinovaacute
chromatografie spojenaacute s hmotnostniacutem spektrometrem Detekce 8‐iso PGF2α byla ještě ztiacutežena možnyacutem ovlivněniacutem vyacutesledku biologicky aktivniacutemi diastereomery přiacutetomnyacutemi v KVV Za použitiacute vhodneacute kolony a mobilniacute faacuteze se podařil i tento probleacutem uacutespěšně vyřešit
Vyvinutou analytickou metodu lze charakterizovat niacutezkyacutemi limity detekce a kvantifikace niacutezkou chybou stanoveniacute vysokou přesnostiacute a vysokou selektivitou
Vyvinutaacute metoda pro detekci biomarkerů v KVV byla testovaacutena na klinickyacutech vzorciacutech kde byla prokaacutezaacutena možnost použitiacute teacuteto metody v klinickeacute praxi Byl prokaacutezaacuten statisticky vyacuteznamnyacute rozdiacutel mezi korelaciacute hladiny biomarkerů a poškozeniacutem dyacutechaciacutech cest a plic Tuto metodu lze charakterizovat jako zcela neinvazivniacute pro diagnostiku oxidativniacuteho stresu
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175
34
7 Seznam literatury
1 Scheideler L Manke HG Schwulera U Inacker O Hammerle H American Review
Respiratory Disease (1993) s 148 778
2 Montuschi P Barnes J P Trends in Pharmacological Sciences (2002) s 23 232
3 Čaacutep P Pehal F Petrů V Musil J Alergie (2001) s 3 275
4 Zakrzewski J T Barnes N C Costello J F Piper P J American Review Respiriratory
Disease (1987) s 136 779
5 Horvaacuteth I Hunt J Barnes P J European Respiratory Journal (2005) s 26 523
6 Syslovaacute K Vyacutevoj neinvazivniacute diagnostiky asthma bronchiale metodou kombinujiacuteciacute
immunoafinitniacute separaci s hmotnostně spektrometrickou detekciacute (2008)
7 Zwert L L Meermann J H N Commandeur N M Vermeulen N P E Free Radical Biology
and Medicine (1999) s 26 202
8 Babaev V R Ding L Reese J Morrow J D Breyer M D Dey S K Fazio S Linton MacRae
F Circulation (2006) s 113108
9 httparnikaorgdioxin (2722009)
httpwebujepcznicovaostatnihtm (2722009)
10 Reynolds HY Lung (2000) s 178 271
11 Holz O Kips J Magnussen H European Respiratory Journal (2000) s 16 355
12 Antczak A Montuschi P Kharitonov S A Gorski P Barnes P J American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine (2002) s 166 301
13 Baraldi E Carraro S Alinovi R Pesci A Ghiro L Bodini A Piacentini G Zacchello F
Zanconato S Thorax (2003) s 58 505
14 Gonzalez‐Reche L M Musiol A K Muumller‐Lux A Kraus T Gen TJ Occupat Med Tox 1
(2006) s 5
15 Biacutelkovaacute Z Mazurovaacute J Churaacuteček J Horaacutek D Turkovaacute J The Journal of Chromatography A
(1999) s 852 141
16 Hanazawa T Kharitonov S A Barnes P J American Journal of Respiratory and Critical
Care Medicine (2001) s 162 1175