Post on 30-Dec-2015
description
transcript
Horizontální elektroforéza na agarovém gelu
MUDr. Michal Jurajda
ÚPF LF MU
Agarózový gel
Agarózový gel
Příprava agarózového gelu
• Připravit navážku agarózy
• Za míchání smísit s potřebným množstvím pufru
• Zvážit
• Rozvařit
• Doplnit na původní hmotnost dest. Vodou
• Zchladit a přidat EtBr.
Nalévání agarózy
• Připravit nalévací misku (olepit páskou nebo umístit do „formičky“, nasadit hřebínek a zkontrolovat jeho vzdálenost ode dna.
• Umístit na vodorovnou podložku.
• Nalít agarózu o teplotě cca 40 ºC.
• Nechat zchládnout a odstranit hřebínek a pásku
Příprava TBE pufru
• 61,8g kys. borité
• 121,0g TRIS báze
• 7,5g EDTA
• Doplnit do 1000ml destilovanou vodou
• pH 8,0
Nanášecí pufr
• Ficoll– zvyšuje hustotu roztoku, drží roztok na dně
jamky
• bromfenolová modř– vizualizuje roztok při nanášení a migruje v
elektrickém poli
• 300 μl bromfenolové modři 0,125% + 30ml vodného roztoku ficollu 15-20%
Barvení DNA v gelu
• Ethidium bromid
• Zásobní roztok 5mg/ml
• Pracovní koncentrace 0,5-1 μg/ml
• (1-2 μl zásobního roztoku / 10 ml agarózy)
Intenzita elektrického pole
• Obecně 2-10V/cm
• Nejčastěji používáme intenzitu 2-4V/cm
• !pozor! intenzita elektrického pole se počítá ze vzdálenosti elektrod, nikoliv z rozměrů gelu
Pohyb DNA při elektroforéze
• Elektrické pole
• Difúzní pohyb
+
-
Vizualizace a archivace obrazu
Elektroforéza v agarovém gelu
Jak zajistit co nejlepší výsledek?
• Nenanášet velké množství DNA
• Nepoužívat zbytečně vysoké napětí
• Volit správný druh a koncentraci agarózy
• Recyrkulace pufru
• Chladit elektroforézu