Mimojaderné genetické elementy

Genom plastidů a mitochondrií

Vlastnosti semiautonomních organel

• ohraničení dvouvrstevnou membránou

• množení dělením

• vlastní DNA a ribozomy (70S)– syntéza malé části vlastních proteinů– přesun genů do jaderného genomu

• endosymbiotického původu

• úloha v energetickém metabolismu

Původ plastidů a mitochondrií

Gillham 1994 *Pozn.: strom eukaryot byl modernizován

Funkce plastidů fotosyntéza

– konverze světelné energie– asimilace uhlíku

redukce sulfátu a nitritu syntéza škrobu syntéza mastných kyselinsyntéza aminokyselinsyntéza nukleotidůsyntéza pigmentů

+ syntéza nukleových kyselin, proteinů

Mitochondrie

Vnitřní membrána: - dýchací řetězec- ATP syntáza

Matrix:- Krebsův cyklus

- tvorba ATP a uhlíkových skeletů pro anabolické dráhy- disipace přebytku redukovaných koenzymů- další role v indukci PCD, skladování Ca2+

Primární, sekundární a terciární endosymbióza– různé počty membrán (příp. nukleomorf)

Primární (1,6 mld let): - Glaucophyta- Rhodophyta - Chlorofyta

Sekundární:- Euglenophyta- Chlorarachniophyta- Chromalveolata

Glaucophyta

Endosymbiózy

(Keeling 2010)

Proč vznikla primární endosymbióza se sinicí jen jednou?- na vzniku se mohl podílet další partner (nitrobuněčný parazit Chlamydie)

- vyšší výskyt původem Chlamydiových proteinů (např.plastid nukleoid asociované proteiny)

- potenciální problémy s využitím sacharidů produkovaných sinicí po jejím pohlcení

(Ball et al. 2013)

Transientní endosymbióza(plž Elysia chlorotica)

- aktivní chloroplasty řasy Vaucheria

chloroplasty zůstávají aktivní po dobu 8 měsíců(jak fungují???)

gen kódující protein MSP (PsbO) přítomen v genomu plže !!!

(Rumpho et al. 2008 PNAS)

ale zřejmě extrachromozomálně!(pokud vůbec)

(Bhattacharya et al. 2013) Rumpho M. et al., 2000

Reprodukce organel - dělením

Lopez-Juez E., 2007

PLASTIDY:Kombinace prokaryotickéhoFtsZ a eukaryotického dynaminového kroužku

Vnitřní:1. FtsZ 2. FtsZ + dynamin3. Dynamin

Vnější: Dynamin (role ER?)

MITOCHONDRIE: u vyšších rostlin asi FtsZ chybí, další faktory, role ER

Stromuly chloroplastů (tubulární útvary) - komunikace s jinými organelami (ER, mitochondrie?)

Schattat M et al. Plant Cell 2012;24:1465-1477

Hanson M, Sattarzadeh A. Plant Cell 2013;25:2774-2782: … a přece se přenášejí (?)

- výměna genetického materiálu a proteinů?

Plastom a chondriomversus jaderný genom

---- 87

Funkce genů v plastomu (a chondriomu)

+ geny pro rRNA a tRNA (u mitochondrií řada chybí – z plastidu, jádra)

Lokalizace proteinů kódovaných jádrem (predikce Target P u Arabidopsis – Emanuelsson et al., J Mol Biol)

Mitochondrie ~ 10% (cca 2500 genů)

Plastidy ~ 14% (cca 3500 genů)

Celkem cca 1/4 genů nutná pro fungování organel

- mnoho z těchto genů ale primárně nepochází z daného endosymbionta (tj. původem jsou jaderné či z druhého endosymbionta)

- mnoho genů (proteinových produktů) využito pro jiné funkce v buňce- duální targetování (GS2, Fd-GOGAT)

Leister D., TRENDS in Genetics 19: 47, 2003.

Osudy genů endosymbionta

Arabidopsis

nukleom: cca 26 tis.plastom: 87

bílkovin v plastidu: ~ 3500

Předpokládaný endosymbiont cca 4500 genů(analogie dnešní sinice:

cca 3000 – 7000 genů)

- možnost komplexnější regulace exprese genů a buněčných aktivit - možnost využití genů pro druhotné funkce- vyšší mutační rychlost v organelách (x jádru – pohlavní množení)

- nemožnost rekombinace (opravy mutací) ALE zachované geny jsou vysoce konzervované (možnost rekombinace mezi molekulami)

- nemožnost „bezpečného testování nových mutací“

Předpokládané příčiny přenosu organelových genů do jádra

Produkty přenesených genů musí být importovány zpět do příslušné organely (jsou-li tam potřeba)!

Inaba and Schnell; Biochem J (2008)

majoritně:TOC-TIC translokony = kanály + chaperony!(mitochondrie: TOM-TIM)

Transitní peptid: 30-100 amk(2-4 tis. proteinů),

Transport proteinů do plastidu

OM – outer membraneER-CP – glykoproteinyUncleaved TP

Transport do tylakoidů

Lumen: prokaryotické transportní systémy Tylakoidní membrána – spontánní inkorporace (společně s plastidově

kódovanými proteiny)

Recentní funkční přesuny genů do jádra

(získá-li protein transitní peptid, může postupně vymizet z organelového

genomu)

• Fúze se signální sekvencí genu, jehož produkt je již importován

• Příklad: mitochondriální Rps11 paralogy rýže kódované jádrem využívají signální sekvence Cox,

a podjednotky mitochondriální ATPázy

(zbytky mt genu jsou stále transkribovány)

Kadowaki et al., EMBO J. 1996

Recentní funkční přesuny

• Inzerce do genu, jehož produkt je importován, a alternativní sestřih zachovávající též původní produkt

• Příklad: mitochondriální Rps14 kódovaný jádrem u rýže v genu pro sdhB sukcinátdehydrogenázu B

Kubo et al., PNAS 96:9207, 1999

Proč si organely některé geny udržely?

Většinou transmembránové proteiny – problém s transportem či

balením

Přenos DNA z organel do jaderného genomu je stále aktivní proces!!!

- rostlinné jaderné genomy obsahují velké množství organelové (plastidové) DNA- i z recentních integrací (kopie celých plastidových genomů)- u rýže a kukuřice velké množství (rýže přes 800 kbp)

Přenosy genů z organel

v experimentálních podmínkách u tabáku pozorována velmi vysoká frekvence přenosu

transgenu z plastidu do jádra

- v somatických buňkách 1 z 18.000- v pylu (degradace plastidů!) 1 z 11.000- ve vaječných buňkách 1 z 250.000

Dědičnost organelové DNA

Dědičnost zpravidla uniparentální (většinou z mateřské buňky) několik mechanismů, nejasné:

• Chlamydomonas, otcovská organelová DNA eliminována pravděpodobně vlivem metylace na replikační schopnost organelového genomu (jinak metylace DNA ani RNAi v organelách neprobíhá)

• některé vyšší rostliny – otcovské plastidy eliminovány při oplodnění

• nahosemenné rostliny – paternální přenos plastidů

Plastidová DNA (cpDNA)

• dsDNA, cirkulární (základní forma)• obsah G-C zpravidla nižší než v jádře• bez histonů, navázána řada (druhotně)

strukturních proteinů (ptNAP – plastid nucleoid associated proteins), organizace do nukleoidů

• 20-40 plastidů/jaderný genom• velké množství kopií (~30-100) na plastid• tvoří 10-20% celkové DNA v listech

- v průběhu ontogeneze listů se snižuje - nemizí!

Typický cp genom – základní uspořádání

kruhová molekula DNA rozdělena na „long“ a „short“ oblasti (LSC a SSC) jedinečné oblasti,odděleny IR

rRNA (rrn) a tRNA (trn) geny (uspořádání v clusterech připomíná uspořádání v E. coli)

rekombinace mezi repeticemi (oddělují LSC a SSC) vede k převrácení SSC

Strukturní komplexita plastidové DNA

Table 1. Frequency of Different cpDNA Structures across All Experiments in Three Species

No. of Observations

Structurea Arabidopsis Tobacco Pea

Circular 126 (42%) 524 (45%) 59 (25%) Linear 68 (23%) 250 (22%) 85 (36%) Bubble/D-loop 25 (8%) 67 (6%) 5 (2%) Lassolike 34 (11%) 115 (10%) 21 (9%) Unclassifiedb 44 (16%) 203 (17%) 66 (28%) a Each classification represents all molecules of that type regardless of size. b DNA fibers that were coiled or folded and could not be classified

[Lilly et al. Plant Cell. 13:245]

Velikost plastidového genomu

• 70 - 300kb

• vyšší rostliny 120 – 200 kb

• nezelené – redukovaný

(rafflesia – zřejmě zcela chybí)

Velikost genomu mitochondrií

• S. cerevisiae 84 kb• savci 16 kb

(produkty podobné)

• vyšší rostliny stovky tisíc kb (x řasy – malý chondriom 16 kb) mechanismus evoluce:

ekonomizace u řas či nárůst u vyšších rostlin

Genom mitochondrií

Genom mitochondrií

kukuřice (Zea mays):několik kruhových molekul:

„master“ molekula (570 kb): - subgenomické kruhové molekuly odvozené od „master“

subgenomické vznikají rekombinací mezi stejnými repeticemi (šipky)

Komplexita mt DNA- důvod?

Backert et al. Trends Plant Sci 2:478

Lineární a lasovité (sigmoidální) molekuly vznikají replikací valivou kružnicí

Exprese chloroplastového genomu většinou uspořádání do operonů – kotranskripce

- další zpracování na dílčí úseky(stabilní ribonukleoproteinové jednotky)

plastidy vyšších rostlin asi 30 transkripčních jednotek (vymezeny promotorem a terminátorem)

- dvě polymerázy PEP, NEP (plastid, nucleus-encoded pol.)

- promotory pro PEP podobné bakteriálním (sekvence –10 a –35)

- většinou promotory pro obě polymerázy

transkript není až na výjimky modifikován čepičkou ani polyadenylován, u některých dochází k editaci (velmi zřídka)

psbB

psbT psbH

petB

Intron

Intron

petD

psbN

Polycistronní RNA

Monocistronní RNA

transkripční jednotkyplastidového genomu

Model exprese psbB operonu

Barkan A. Plantphysiol 2011;155:1520-1532

- významná role pentatricopeptide-repeat proteinů (i v editování)

Transkripční regulace exprese u chloroplastů

1. celková (NEP→PEP)– exprese většiny genů se zvyšuje / snižuje ve

stejném okamžiku

2. genově specifická regulacesigma faktory pro PEP

př.psbD/psbC promotor reaguje na světlo

Kontrola exprese chloroplastové DNA- PEP a NEP - vzájemná regulace, překryvné, (ne)zastupitelné

- jaderně kódované sigma faktory PEP komplexu (transkripci většinou spouští více ; AtSIG5 např. při různých stresech )

σ

Exprese mitochondriálního genomu

- jen NEP, regulace velmi komplexní (i počty kopií)- transkript není modifikován čepičkou ani polyadenylován

- transkripty velmi často „editovány“

RNA Editing– objeven právě u mitochondrií rostlin (>600 pozic)– i u některých chloroplastových genů vyšších rostlin (>40 pozic)

Definice: jakýkoli proces (kromě sestřihu), který způsobí změnu v RNA sekvenci, tak že je odlišná od komplementární sekvence DNA

Editace transkriptů v organelách

• mnoho mitochondriálních transkriptů editováno (tRNA, i protein kódující)

• „editozóm“ (klíčová role PPR proteinů) – sekvenčně specifická vazba na RNA!, guide RNA u rostlin nepotvrzena!

• Význam: nástroj zvyšování flexibility genomu, regulace exprese či evoluční past?

přeměna C na U

-pravděpodobně cytosin deamináza (možná C-terminální DYW doména PPRs)

Introny organel

• Stejný gen v různých druzích může mít různé introny ve stejné pozici

• Stejné nebo podobné introny nacházeny v nepříbuzných genech a druzích (introny I. a II. typu)

• Neobvyklá distribuce a fylogenetická analýza potvrzují, že byly získávány a ztráceny v celém průběhu evoluce

Jaderný a organelové genomy se doplňují (procházejí koevolučními změnami)

omezená kompatibilita genomu a plastomu u mezidruhových hybridů pupalky Oenothera sp. (biparentální přenos plastidů)

- regulace exprese, - editace, …

Genes Encoded in the Chloroplast Genomes in Higher Plants

Gene Designation Gene Product I. Genetic System Chloroplast RNA genes

rDNA Ribosomal RNAs (16S, 23S, 4.5S, 5S)trn Transfer RNAs (30 species)

Gene transcriptionrpoA, B, C RNA polymerase , , ’ subunitsssb ssDNA-binding protein

Protein synthesisrps2,3,4,7,8,11 30S ribosomal proteins (CS) 2, 3, 4, 7, 8, 11rps12, 14, 15, 16, 18, 19 CS12, 14, 16, 18, 19rpl2, 14, 16, 20, 22 50S ribosomal proteins (CL) 2, 14, 16, 20, 22infA Initiation factor I

II. Photosynthesis Photosynthetic proteins

rbcL RUBISCO large subunitatpA, B, E ATP synthetase CF1, , subunitsatpF, H, I ATP synthetase CF0I, III, IV subunitspsaA, B, C Photosystem I A1, A2, 9-kDa proteinpsbA, B, C, D, E Photosystem II D1, 51 kDa, 44 kDa, D2, Cytb559-9kDapsbF, G, H, I Photosystem II Cytb559-4kDa, G, 10Pi, I proteinspetA, B, D Electron transport Cytf, Cytb6, IV subunits

Respiratory proteinsndhA, B, C, D NADH dehydrogenase (ND) subunits 1, 2, 3, 4ndhE, F NDL4L, 5

III. Others Maturase matK

Protease clpPEnvelope membrane protein cemA

Regulace jaderných genů, jejichž produkty se uplatňují v plastidech

signály od plastidu směrem k jádru „zasahují“ promotorové oblasti genů, které se účastní odpovědi na světlo

- reakce na měnící se (a často stresové) podmínky- plná exprese podmíněna přítomností funkčních plastidů

(při špatném vývoji nebo poškození plastidů jsou jaderné geny pro proteiny fotosyntézy exprimovány velmi slabě)

Signály:- prekurzor biosyntézy chlorofylu - funkční plastidová genová exprese (při přechodu

z heterotrofie na autotrofii) - komponenty elektronového transportu fotosyntézy - redox signalizace (Trx, GSH, askorbát, …) - metabolity - ROS