Nespecifické složky buněčné

imunity

RNDr. Jan Lašťovička, CSc.

Ústav imunologie 2.LF UK, FN Motol

- Mechanizmy vrozené imunity fungují okamžitě

- Ihned následuje časná indukovaná odpověď

- Nevytvoří se imunologická paměť

- Specifická reakce je zahájena jen v případě, že infekce

překoná tyto nespecifické mechanizmy

Patogeny

- Viry, bakterie, houby, prvoci, červi

- Pronikají do těla různými cestami, množí se

a působí onemocnění různým způsobem

- Imunitní systém používá k jejich eliminaci

odlišné mechanizmy

Možné cesty průniku infekce

• Naše tělo je neustále vystaveno

mikroorganizmům přítomným v prostředí

• Kontakt na epiteliálních površích

• Na sliznicích dýchacích cest

• Na střevních sliznicích

• Na sliznicích genitálií

• Při poranění kůže (kousnutí hmyzem)

Antimikrobiální peptidy

Lysozym, fosfolipáza A (sliny)

Histatiny

Trávící enzymy

Lysolipidy

α a β-defensiny (intestinální)

Surfaktanty SP-A, SP-D

opsonizace

Odpověď na průnik mikroorganizmu je rozdělena na několik stádií:

- Lokální nespecifická odpověď se pokusí infekci zlikvidovat

- pokud se to nepodaří, je antigen transportován do lymfatických uzlin

- aktivují se specifické mechanizmy

Mechanizmy nespecifické imunity:

• Jsou založeny na rozpoznání chemických

struktur (hlavně sacharidů), na povrchu

mnoha různých mikroorganizmů, ale

nepřítomných na povrchu vlastních buněk

organizmu

Rozpoznávací mechanizmy fagocytů

• Struktury, které se nacházejí na povrchu mikroorganizmů, ale ne na vlastních nepoškozených buňkách

• Evolučně velmi konzervované antigeny nezbytné pro život mikroorganizmů – PAMP (pathogen associated molecular patterns)

• Endotoxiny (LPS) gramnegativních bakterií

• Peptidoglykany grampozitivních bakterií

• Glukany a manany kvasinek a plísní

• Povrchové fosfolipidy apoptotických buněk

• Tyto struktury jsou rovněž rozpoznávány humorálními složkami nespecifické imunity

Rozpoznávací mechanizmy fagocytů

Receptory, které tyto struktury rozpoznávají, se

označují jako pattern recognition receptors

(PRR):

• Manózový receptor

• Galaktózový receptor

• CD14

• TLR (Toll-like receptory)

• Scavangerové (uklízecí) receptory

• FC receptory

Nespecifické

rozpoznávání

pomocí Toll-like

receptorů: každý z

TLR receptorů

rozpoznává jeden

či více

mikrobiálních

antigenů přímou

interakcí s

molekulami na

jejich povrchu

Bakteriální LPS

poskytuje signál přes

TLR -4 a aktivuje

transkripční faktor

NFκB, který pak

aktivuje geny kódující

proteiny sloužící k

obraně proti infekci

(TNFα)

• Bakteriální

proteoglykany mohou

být rozpoznány buď

TLR receptory na

povrchu buněk nebo

NOD proteiny v

cytoplazmě

• Obě cesty vedou k

aktivaci transkripčního

faktoru NFκB a k

expresi prozánětlivých

genů

Opsonizace

• Působení složek humorální imunity

• Fc receptory fagocytů

• Komplementové receptory

• Proteiny akutní fáze:

• Lektin vážící manózu (MBL)

• C reaktivní protein (CRP)

• Sérový amyloid P

Salmonella typhi – její dlouhý bičík je rozpoznán Toll-like receptory

Fagocyty a fagocytóza

• Evolučně velmi starý proces

• Dva hlavní typy buněk - profesionální

fagocyty: neutrofilní a eozinofilní

granulocyty a monocyty (makrofágy)

Makrofágy jsou aktivované patogenními

mikroorganizmy, pohltí je a zahájí zánětlivou

odpověď

Makrofágy exprimují řadu receptorů pro

bakterální komponenty včetně receptorů pro

karbohydráty (manózový a glukanový

receptor), lipidy (LPS receptor) nebo jiné

bakteriální komponenty (Toll-like receptory).

Navázání bakterie na receptory stimuluje

fagocytózu a pohlcení bakterie do

intracelulárních váčků zvaných fagozómy,

kde jsou zničeny.

Signál přes některé receptory, jako např.

TLR, způsobí sekreci prozánětlivých

cytokinů jako IL-1β, IL-6 a TNF-α a lipidové

mediátory zánětu.

Proces fagocytózy

Likvidace pohlceného mikroorganizmu

• Baktericidní látky (bazické peptidy

defensiny)

• Hydrolytické enzymy (proteázy katepsiny,

lysozym, kyselé hydrolázy)

• Nízké pH (3,5 - 5)

• BPI (bactericidal permeability-increasing

protein)

Likvidace pohlceného mikroorganizmu

• Aktivace enzymů: NADPH-oxidáza, myeloperoxidáza, superoxid dismutáza

• Reaktivní kyslíkové intermediáty (ROI):

- superoxidový radikál O2- (molekula kyslíku

s připojeným elektronem)

- Singletový kyslík, H2O2 , hydroxylový radikál a chlornanové anionty Cl-

- ROI jsou používány hlavně pro likvidaci pohlcených extracelulárních patogenů

Likvidace pohlceného mikroorganizmu

• Oxid dusnatý (NO), produkovaný NO

syntázou

• Je hlavním nástrojem zabíjení

intracelulárních parazitů

• Baktericidní látky a ROI se mohou

uvolňovat i do okolních tkání

Oxidační vzplanutí je způsobeno přechodným zvýšením

spotřeby kyslíku během produkce mikrobicidních kyslíkových

metabolitů

Neutrofily tvoří první vlnu buněk, které

opouští cévy a vstupují do místa infekce

• V místě infekce jsou cévy rozšířené

• Leukocyty mohou být v kontaktu s

endotelem

• Endotel v místě infekce exprimuje pod

vlivem TNF-α a IL-8 selektiny, molekuly

ICAM-1 a ICAM-2

• Dochází k extravazaci (diapedéze)

neutrofilů

Infekce stimuluje makrofágy k produkci

cytokinů a chemokinů, které spouštějí

zánětlivou reakci

Bakteriální LPS

poskytuje signál přes

TLR -4 a aktivuje

transkripční faktor

NFκB, který pak

aktivuje geny kódující

proteiny sloužící k

obraně proti infekci

(TNF-α)

Aktivace Toll-like receptorů spouští produkci

prozánětlivých cytokinů a chemokinů a expresi

kostimulačních molekul

• Toll signalizační dráha vede také k

povrchové expresi kostimulačních molekul

• Tyto molekuly, nazývané B7.1 (CD80) a

B7.2 (CD86), jsou povrchové proteiny

exprimované makrofágy a DC v odpověď

na signál z TLR-4. Tyto molekuly pak

spolu s MHC II aktivují naivní T buňky

Bakteriální LPS přes Toll signální cestu

indukuje změny v Langerhansových

buňkách (nezralé dendritické bb).

- Stimuluje je k migraci do lymfatických uzlin

- Působí změny v expresi povrchových molekul

(CD80 , CD86 a MHC )

Tím je zahájena specifická imunitní reakce (stimulace

CD4 T-buněk).

Cytokiny uvolňované fagocyty

aktivují akutní fázi odpovědi

• TNF-α, IL-1β a IL-6: endogenní pyrogeny

• Zvýšení tělěsné teploty

• Syntéza proteinů akutní fáze

• C-reaktivní protein se váže na fosfocholin

na bakterální stěně, opsonizuje a spouští

komplementovou kaskádu

• Konečný efekt prozánětlivých cytokinů je

leukocytóza

TNF-α je důležitým cytokinem, který

kontroluje lokální obranu proti infekci, ale

pokud je uvolňován systémově, má

destruktivní účinky.

Cytokiny TNF-α, IL-1β a IL-6 mají široké spektrum biologických aktivit,

které pomáhají koordinovat odpověď organizmu na infekci

Interferony jsou antivirové proteiny produkované buňkami jako odpověď na virovou infekci.

Vážou se na interferonové receptory na buňkách a indukují syntézu proteinů inhibujících replikaci virů (oligoadenylát syntetáza, PKR kináza)

Poruchy fagocytózy

Chybějící nebo snížená tvorba oxidativních produktů fagocytujících buněk je příčinou závažného onemocnění chronické granulomatosy(chronic granulomatous disease, CGD).

Onemocnění se projevuje opakujícími se těžkými infekcemi, které způsobují bakterie, kvasinky i plísně. Obyčejně probíhají formou zápalu plic nebo abscesů kůže, tkání a orgánů.

Onemocnění je nejčastěji způsobené mutací genu kódujícího enzym fagocytární NADPH-oxidasu na chromozomu X, kdy tento enzym má sníženou nebo nulovou aktivitu.

Aktivovaná NADPH-oxidasa zdravých jedinců katalyzuje reakci, při níž NADPH* reaguje s kyslíkem za vzniku NADP+ a superoxidového radikálu O2-, ze kterého následnými reakcemi vzniká singletový kyslík, peroxid vodíku, hydroxylový radikál a chlornan. Tyto reaktivní oxidační meziprodukty jsou zodpovědné za ničení patogenů uvnitř fagocytů po jejich ingesci

Testování fagocytózy

• Testy ingesce

• Baktericidní test

• Testy oxidačního metabolizmu

• Chemiluminiscence

Testy ingesce

• Testují schopnost fagocytů pohltit cizorodý materiál

• Používané substráty: bakterie nebo kvasinky, mikrosférické hydrofilní partikule (MSHP), velikost 1μM

• Suspenze částic se inkubuje s krví pacienta, pak se zhotoví nátěr na sklíčko

• Fagocytární aktivita = podíl fagocytujících neutrofilů ze 100

• Fagocytární index = počet pohlcených částic na buňku

• Výpovědní hodnota testů ingesce v rutinní diagnostice je velmi malá – primární porucha fagocytózy neexistuje

• K výraznému snížení fagocytózy dochází jen u velmi těžkých klinických stavů

• Použití spíše pro výzkumné účely

• Pokud se použijí inertní partikule, testuje se nereceptorově zprostředkovaná fagocytóza

• Nezralé neutrofily nejsou schopny partikule pohltit

• Stafylokoky vyžadují opsonizaci sérovými Ig

• Kvasinky vyžadují opsonizaci komplementem C3b

• Patologické výsledky mohou odrážet i poruchy opsonizace

Testy ingesce

Baktericidní test

• Testuje všechny fáze fagocytózy včetně

usmrcení pohlceného mikroorganizmu

• Substrátem je živý mikroorganizmus: C.

albicans, S. aureus, Pseudomonas

• Hodnocení se provádí různými způsoby:

mikroskopicky, cytometricky

Testy oxidačního metabolizmu

• Nitroblue tetrazolium chlorid (NBT)

• iod nitroblue tetrazolium (INT)

• Testuje se kyslíkový metabolizmus granulocytů

(schopnost tvořit kyslíkové radikály) pomocí

schopnosti redukovat bezbarvé tetrazoliové soli

na tmavě modré formazány

• Odečítá se na sklíčku (mikroskopicky) nebo na

destičkách (fotometricky)

Chemiluminiscence

• Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí

• Fagocyty při oxidačním vzplanutí vytvářejí vysoce reaktivní kyslíkové metabolity. Během těchto procesů vznikají emise fotonů a to se projevuje chemiluminiscencí fagocytů. Toto chemické světlo se zesiluje luminolem a detekuje na chemiluminometru

Měření oxidačního vzplanutí

průtokovou cytometrií (FagoFlow)• Princip

• Test je založen na měření respiračního (oxidačního) vzplanutí granulocytů po jejich stimulaci inaktivovanými bakteriemi E. coli.

• Po ingesci bakterií je ve fagocytech aktivována NADP-oxidáza,která spustí respirační (oxidační) vzplanutí.

• Vznikající reaktivní meziprodukty uvnitř fagocytů oxidují dihydrorhodamin 123(DHR123) na fluorescenční produkt rhodamin 123, který je detekován průtokovým cytometrem.

Histogram populace stimulovaných granulocytů.

Vzorek byl inkubován s bakteriemi E. coli a DHR123.

Histogram populace kontrolních nestimulovaných

granulocytů po inkubaci s DHR123.

O2 NEZÁVISLÉ MECHANIZMY:

imunochemické stanovení defensinů

stanovení lysozymu

deficience specifických granul

Další testy nespecifické imunity

- adherence

- chemotaxe:

Rebuckovo kožní okénko (in vivo)

agarózový test (formylmethionylleucylfenylalanin)

Boydenova komůrka

(nitrocelulózový filtr)

AKTIVACE A ADHERENCE FAGOCYTUJÍCÍCH BUNĚK:

je testována schopnost adherovat k pevným povrchům

je testována přítomnost a denzita exprese adhezivních molekul

imunofluorescencí

LAD-I syndrom: - absence řetězce (CD18) integrinového heterodimeru LFA-1

CHEMOTAXE:orientovaný pohyb granulocytů v chemoatraktivním gradientu

migrace granulocytů pod agarózou

poruchy chemotaxe: - primární defekty: syndrom líných leukocytů- sekundární defekty: diabetes, popáleniny

Další testy nespecifické imunity

Test aktivace bazofilů:Bazofily společně s mastocyty jsou klíčovými

buňkami časné fáze alergické reakce

(vysokoafinitní receptor pro Fc fragment IgE)

Dochází k degranulaci a k expresi CD63

Možno měřit cytometricky

Další testy nespecifické imunity

Eozinofilní kationický protein (ECP)ECP patří mezi preformované granulární proteiny

eozinofilů, uvolňují se při aktivaci

Stanovujeme chemiluminiscencí