Obranné mechanismy rostlin vinterakcích...

transcript

Obranné mechanismy rostlin v interakcích hostitel-patogen

Aleš Lebeda

Michaela Sedlářová

Katedra botanikyPřírodovědecká fakultaUniverzita Palackého

Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc-Holice

PDF vytvořeno zkušební verzí pdfFactory Pro www.fineprint.cz

Struktura přednášky1. Rostlinné patosystémy2. Infekční cyklus3. Životní strategie patogenních „hub“4. Obranné mechanismy5. Základní kompatibilita resp. inkompatibilita6. Teorie „gen-proti-genu“, rozdělení R-genů7. Modelový patosystém Lactuca spp. - Bremia lactucae

7.1. Mechanismy rezistence u Lactuca spp.7.2. Životní cyklus a infekční struktury Bremia lactucae7.3. Vliv faktorů prostředí na vývoj patogenu7.4. Kvalitativní a kvantitativní aspekty tvorby infekčních struktur B. lactucae7.5. Šlechtění na rezistenci vůči plísni salátové7.6. Nevratné poškození membrán7.7. Oxidativní stres – AOS, antioxidační enzymy7.8. Fenolické látky v obranných procesech7.9. Vliv patogenu na cytoskelet hostitele7.10. Hypersenzitivní reakce7.11. Cytokininy a reprodukce patogenu

8. Souhrn9. Poděkování

Katedra botaniky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci

Trojúhelník a čtyřúhelník choroby

Fáze a subfáze infekčního cyklu

Kůdela et al., 1989

Posloupnost procesů během infekce a jejich terminologie

Kůdela et al., 1989

Životní strategie patogenních „hub“(lze vymezit fakultativní a obligátní formy)

Biotrofní Hemibiotrofní Nekrotrofní

Phytophthora infestans

Fusarium

Exobasidium vaccinii

- během životního cyklubio-, nekro-, saprotrofní fáze

- dlouhou dobu nedochází k narušení buněčné stěny

- saprofáze redukována

- napadají a rychle usmrcují živé buňky – enzymy, toxiny

- narušení BS, protoplastu, metabolismu

- mohou existovat jakosaprotrofové

- napadají živé buňky- invaginace plazmatické membrány

- rovnováha s hostitelem- speciální forma parazitismu

- chemická (enzymatická)

- mechanickápřímá = přes buněčnou stěnunepřímá

- poranění- přirozené otvory:

stomata, lenticely, hydatody, nektária

Způsoby penetrace

Uromyces viciae-fabae

Bremia

Magnaporthe

stimulativní(obligátní biotrofní parazité – v počátečních fázích

svého vývoje: podpora růstu, zvýšení počtu organel)

„green islands“- typické před. pro biotrofní bakterie, viry(nerovnováha kinetinu)

Katedra botaniky a Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci

Vlivy patogenu resp. infekce na buňku

nárůst počtu mitochondrií a ribozómů

nutné zvýšení syntézy proteinů, intenzivnější respirace

respirace + oxidační procesy + degradace látek

uvolnění chemické energie na pokrytí biosyntéz

Životaschopnost rostlinné buňky závisí na: - fungující vakuole- intaktním vezikulárním transportu

degenerativní (nekrotrofní a v pozdních fázích i někteří obligátní

biotrofní parazité:narušení cytoskeletu, organel, membrán)

Beta vulgaris –Fusarium oxysporumHordeum vulgare -

Blumeria graminis

- pasivní (strukturní)fyzikální bariery proti průniku patogenu

preformované: buněčná stěna, vosky, kutikula, fenolické látkyindukované: lignifikace, suberinizace, depozice kalózy

Obranné mechanismy rostlin

- aktivní (fyziologické, biochemické)produkce látek toxických pro patogen

sekundární metabolity (specifické podle hostitele a patogenu): alkaloidy, saponiny, antokyany, fenoly, taniny, melaniny, aromatické AK

proteinyextenziny (bohaté na hydroxyprolin)PR-proteiny (glukanasy, chitinasy, peroxidasy)

Základní inkompatibilita(interakce nehostitel-nepatogen)

Nespecifická inkompatibilita- kompatibilita

Preformované obranné mechanismy; iniciace obecných obranných reakcí

Obecné metabolické a genetické obranné mechanismy

Schéma konceptu základní inkompatibility a základní kompatibility(Lebeda, 1984)

Rostlina - mikroorganismus

Základní kompatibilita(hostitel-patogen)

Obecné obranné mechanismy neúčinné

Specificky diferencovaná inkompatibilita- kompatibilita

Specificky nediferencovaná inkompatibilita- kompatibilita

Vysoce specifické metabolické a genetické adaptace hostitele

Specifický komplex metabolických a genetických

obranných mechanismů

Odezva na infekci a případný rozvoj či potlačení projevů choroby primárně závisí

na genetické výbavě obou partnerů

Teorie „gen-proti-genu“ (Flor, 1946 resp. 1947)

- geny „rezistence“ (u hostitelské rostliny) resp. „avirulence“ (u patogenu) kódují proteiny důležité pro rozpoznání (buněčné receptory resp. molekuly elicitorů)

- platnost tohoto předpokladu byla potvrzena později klonováním genů avirulence různých patogenů (Keen, 1990)

Model koevoluce hostitele a patogenu

Klasifikace R-genů podle

struktury a funkce

(Tör et al., 2003)

Interakce Lactuca spp. - Bremia lactucae

L. sativa, plané druhy rodu Lactuca a některých příbuzných rodů jsou charakterizovány rasově specifickou (RS), rasově nespecifickou (RNS) a polní rezistencí (FR)

Z Lactuca spp., blízce příbuzných L. sativa, je pouze u L. saligna předpokládána nehostitelská rezistence (NR)- faktory nejsou příliš dobře známy- nehostitelská rezistence není primárně asociována s HR

Variabilita mechanismů rasové specificity je podmíněna variabilitou genů kódujících- epikutikulární vosky - enzymy- cytoskelet - IMD- HR - fenoly

Výsledkem je rozdílné načasování potlačení růstu houby

Na rasově nespecifické a polní rezistenci se podílí řada mechanismů- roli hraje i ontogenetický stupeň vývoje a podmínky prostředí

Specifita interakcí rostlina-patogen je různorodý a komplikovaný fenomén

Možné mechanismy rezistence L. sativa a planých Lactuca spp. vůči Bremia lactucae (Lebeda et al., 2000)

Section/subsection Response to B. lactucae from Possible resistance Lactuca spp. L. sativa L. serriola mechanisms Lactuca Lactuca

L. aculeata +/– +/– RS L. altaica +/– +/– RS L. dregeana +/– +/– RS L. livida + + RS? L. saligna +/– (–) RS, NR? L. sativa +/– +/– RS, FR L. serriola +/– +/– RS, RNS, FR L. virosa +/– +/– RS, FR

Cyanicae L. perennis +/– – RS L. tenerrima +/– +/– RS

Section Response to B. lactucae from Possible resistance Lactuca spp. L. sativa L. serriola mechanisms Phaenixopus L. viminea

Mulgedium L. taraxacifolia

L. tatarica +/– (–)/– RS Lactucopsis L. aurea

L. quercina +/– * RS Tuberosae L. indica

Micranthae L. undulata

African group L. capensis

L.homblei – – ? North American group L. biennis

Možné mechanismy rezistence L. sativa a planých Lactuca spp. vůči Bremia lactucae (Lebeda et al., 2000)

Vliv teploty na efektivitu některých genů rezistence (Dm genů) u Lactuca sativa a L. serriola vůči Bremia lactucae(modifikováno podle Judelson a Michelmore, 1992)

Lactuca spp. Temperature/reaction type B. lactucaecultivar/accession Dm gene 5 oC 10 oC 15 oC 22 oC isolate (race)

L. sativaCapitan Dm11 + -* - - Avr11: CG1, SF5

+ + + + avr11: CS9, CS12Fila Dm11 + -* - - Avr11: SF5Empire Dm13 -* - - - Avr13: CS12

+ + + + avr13: CS9 UCDM14 Dm14 - - - - Avr14: CG1

+ + + + avr14: CS9, CS12

L. serriolaPIVT 1309 Dm15 +** - - - Avr15: CS12

+ + + + avr15: CS9, SF3LSE/18 Dm16 + +** +** - Avr16: CS9, SF3

+ + + + avr16: CS12LSE/57/15 Dm7 + + - - Avr7: SF5Hilde x L. serriola Dm11 + -* - - Avr11: CG1, SF5

- = incompatible reaction * = visible necrosis without sporulation+ = compatible reaction (profuse sporulation) ** = sparse sporulation

depozice sporklíčenítvorba primárních a sekundárních inf. strukturpenetracekolonizace infikovaných rostlinných pletivspecifické reakce na dané infekční agens

proces rozpoznání(recognition)

Hodnocení jevů:KvalitativněSemikvantitativněKvantitativně (Lebeda, 1988b)

Po kontaktu parazitické/patogenní houby s rostlinou se odehrává kaskáda jevů

Vývoj Bremia lactucae v pletivu kompatibilní hostitelské rostliny

Infekční struktury patogenu

Načasování fází infekce a tvorby infekčních struktur Bremia lactucae u náchylných genotypů salátu (Sargent et al., 1973)

Hodiny po inokulaci (hpi)

Stadium vývoje patogenu

0 Inokulace

1-2 Klíčení konidie

2-3 Růst klíčního vlákna a tvorba apresoria

Penetrace a vývoj primárního vezikulu

4-13 Zvětšování sekundárního vezikulu

13 a později

První dělení jader, invaze do okolních buněk a pletiv haustorii a intracelulárními hyfami

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Dny po inokulaci

ní in

3 týdny

4 týdny

5 týdnů

6 týdnů

Vliv stáří semenáčků Lactuca spp. na klíčení Bremia lactucae (Dickinson a Crute, 1974)

0 5 10 15 20 25 30

Teplota (°C)

Klíč

ení (

Vliv teploty na klíčení Bremia lactucae (Sargent, 1976)

0123456789

0 10 20 30

Teplota (°C)

Vliv teploty na penetraci semenáčků L. sativa(cv. Avondefiance) konidiemi Bremia lactucae

(Maclean and Tommerup, 1979)

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60%

Leaf disc

Cotyledons

Incidence of germination

GreatLakes

Iceberg

0 50 100 150

Leaf disc

Cotyledons

Length of germ tube (um)

Great LakesIceberg

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Leaf disc

Cotyledons

Incidence of appressorium formation

Great LakesIceberg

Vliv ontogenetického stáří hostitele:rozdíly v parametrech vývoje Bremia lactucae (rasa NL 15)

6 h po inokulaci (modif. podle Lebeda a Reinink, 1991)

tvorba apresoriídélka klíčních vláken

klíčení

Great Lakes = RSRIceberg = high level of FR

Kvalitativní a kvantitativní aspekty tvorby infekčních struktur Bremia lactucae

Diversity in formation of Bremia lactucae infection structures in L. sativa and wild Lactuca spp. genotypes representing nonhost and host-parasite interactions

and different types of resistance mechanisms resp. (compiled according to Lebeda and Reinink (1991, 1994); Lebeda et al., 2000, Lebeda et al., 2004)

Interaction Type of resistance

Lactuca spp. (cultivar/accession)

Response to B. lactucae / Sporulation

Relative frequency of occurrence and size of infection structures

(48 hpi) intensity (%)

(14 dpi)/ PV/D SV HY/L HA

Nonhost resistance L. saligna (LSA/6) – /0 1/12.3 1 0 0 Host resistance /susceptibility Race specific Cobham Green + /100 4/15.4 4 4/174 4 Dandie + /100 4/14.8 4 2/156 1 Valmaine – /0 4/12.0 1 1/18 0 L. saligna (CGN 5147) – /0 3/11.8 1 1/38 0 L. serriola (PIVT 1168) – /0 2/14.5 1 1/18 0 L. virosa (LVIR/57/1) (–) /2 3/14.9 3 1/42 1 Race nonspecific L. serriola (PI 281876) (–)/21 4/15.0 4 2/82 2 Field resistance Iceberg + /75 3/13.1 2 1/102 1

Inoculation: races CS9 and NL5; Intensity of sporulation (0-100); Relative frequency (0-4) and size ofinfection structures: PV/D = primary vesicle / diameter (μm), SV = secondary vesicle, HY / L = intercellularhyphae / length (μm ), HA = haustoria formation

Diversity in phenotypic and microscopic plant tissue (epidermal and subepidermal cells) response to B.lactucae of L. sativa and wild Lactuca spp. genotypes representing nonhostand host-parasite interactions and different types of resistance mechanisms resp. (compiled

according to Lebeda and Reinink (1991, 1994); Lebeda et al., 2000, Lebeda et al., 2004)

Interaction Type of resistance

Lactuca spp. (cultivar/accession)

Degree of tissue response (48 hpi)

Phenotypic expression of response to B. lactucae (14 dpi)

HR NNC SEN DSEN

Nonhost resistance L. saligna (LSA/6) – 0.04 1.00 0.34 1.25 Host resistance /susceptibility Race specific Cobham Green – 0.77 1.04 0 0 Dandie – 0.06 1.00 0.10 1.00 Valmaine – 0.26 1.07 0 0 L. saligna (CGN 5147) – 0.04 2.00 0 0 L. serriola (PIVT 1168) – 0.78 1.00 0.18 1.53 L. virosa (LVIR/57/1) N, SE, SS 0.96 1.06 0.27 1.65 Race nonspecific L. serriola (PI 281876) N, SE 0.87 1.05 0.22 1.53 Field resistance Iceberg – 0.13 1.07 0 0

N = necrotic response, SE = sporulation only along the leaf dics cut surface, SS = sparse sporulation on the discsurface; HR = hypersensitive response (number of necrotic cells/infection site), NNC = mean number of necroticepidermal cells per infection site with a necrotic response, SEN = subepidermal necrosis, DSEN = degree of SEN (0-3) Inoculation: races CS9 and NL5

Šlechtění salátu na rezistenci vůči plísni salátové (B. lactucae)

LIBUSA

Fyziologické změny působené patogeny

1/ Permeabilita napadených buněk (membrány, strukturní změny BS)2/ Metabolismus vody v napadených rostlinách 3/ Minerální výživa (absorpce, transport)4/ Fotosyntéza (obsah, funkce pigmentů)5/ Respirace (zvýšená intenzita; enzymy glykolýzy)6/ Oxidativní stres (aktivní formy kyslíku, antioxidační enzymy)7/ Syntéza proteinů (PR-proteiny, enzymy) – „na úkor zásobních látek“8/ Metabolismus fenolických látek (akumulace)9/ Fytohormony (obsah a zastoupení aktivních/neaktivních forem)

Rozdíly v načasování nevratného poškození membrán (IMD) determinovaných různými geny rezistence vůči plísni salátové

(podle Mansfield et al., 1997)

Aktivní formy kyslíku

Místa vzniku: chloroplasty, mitochondrie, membrány peroxisomů, glyoxysomů, mikrozomů

Účinky - negativní: peroxidace lipidů, poškození struktury proteinů (enzymů), NK, lipidů

- pozitivní: signalizace, genová regulace

singletový kyslík (1O2), superoxid (O˙- 2), peroxid vodíku (H2O2), hydroxylový radikál (OH-)

HOSTITEL• Přímé antimikrobiální účinky• Signální molekula v regulaci aktivity genů zodpovědných za syntézu

- PR-proteinů- fenolických látek- fytoalexinů

• Zesíťování prekurzorů polyfenolických látek – lignifikace BS• HR

PATOGEN• Signalizace – rozpoznání v inkompatibilních interakcích?• Penetrace? štěpení komponent buněčné stěny, membrán

Katalasa - L. saligna CGN 05271

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

0hai 6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96hai

Katalasa - L. serriola PIVT 1309

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

Katalasa - L. virosa NVRS 10.001 602

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

L. serriola PIVT1309 L. saligna CGN 05271 L. virosa NVRS 10.001502

(nkat/1g)

Katalasa - L. sativa Mariska

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

Katalasa - L. serriola LSE/18

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

L. sativa UCDM2 L. sativa Mariska L. serriola LSE/18

Katalasa - L. sativa UCDM 2

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

Kontrola Infikovaná rostlina

Spektrofotometrické stanovení aktivity katalasy (E.C. 1.11.1.6)

náchylný náchylný

rezistentnírezistentní

rezistentní

silně rezistentní

Cévní svazky

Histochemická lokalizace POX

Lokalizace v penetrované buňce

Spektrofotometrické stanovení aktivity g-POX (EC 1.11.1.7)

POX - L.sativa UCDM2

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

0 6 12 18 24 36 48 96

L. sativa UCDM2

POX - L.sativa Mariska

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

0 6 12 18 24 36 48 96

L. sativa Mariska

POX- L. virosa NVRS 10.001 602

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

0 6 12 18 24 36 48 96

L. virosa NVRS 10.001502

náchylný rezistentní silně rezistentní

Kontrola Infikovaná rostlina

Izoenzymy SOD(E.C. 1.15.1.1)

L. virosa NVRS 10.001 602L. saligna CGN 05271

- aktivita SOD nebyla zaznamenána- superoxid nebyl histochemicky detekován- v izoenzymovém spektru nebyly pozorovány

změny po infekci B. lactucae

6hai 12hai 24hai 48hai

K i K i K i K i

Histochemická lokalizace H2O2

Periplazmatický prostor Během penetrace patogenu Větší rozsah v pozdějších fázích

Spektrofotometrické stanovení obsahu H2O2

c H2O2 - L.sativa UCDM2

6hai 12hai 18hai 24hai 36hai 48hai 96haiHai

L. sativa UCDM2

c H2O2 - L. sativa Mariska

L. sativa Mariska

c H2O2 - L. virosa H58 - 0958

L. virosa NVRS 10.001502

náchylný rezistentní silně rezistentní

- obecně inhibitory enzymů - jejich tvorba v rostlině indukována poraněním,

infekcí- přítomny u rezistentních i náchylných genotypů,

liší se kvalitativně a kvantitativně- antibiotické účinky- strukturní polymery - zesílení buněčné stěny,

lignituber v místě penetrace- irreversible membrane damage (IMD) - autofluorescentní fenoly - de novo syntéza

během HR

Fenolické látky

Autofluorescence fenolů v infikované buňce

Detekované látky

Lactuca spp. genotypy Reakce s NL16 Fenoly Taniny Lignin Kalóza

L. sativa Cobham Green kompatibilní -/+ - - +++ Mariska inkompatibilní +++ - - ++

L. serriola LSE/18 kompatibilní - - - +++

L. saligna CGN 05271 inkompatibilní - - - +

L. virosa NVRS 10.001 602 inkompatibilní +++* - - +

STUPNICE: - žádný signál+ slabá exprese v hostitelských buňkách ++ středně silný signál+++ silná akumulace * = reakce kromě penetrované buňky i ve 2-3 okolních

Fenolické látky – histochemická detekce

Lokalizacemísto penetrace periplazmatický prostor invaginovaná plazmalema okolo haustorií

MT basket

24haiL. sativaUCDM2

MT patches

48haiL. serriolaPIVT 1309

L. serriolaLSE/18

48haiL. sativaMariska

Cytoskelet – imunohistochemická detekce

Změny mikrotubulárního cytoskeletu epidermálních buněk Lactuca spp. inkompatibilních resp. kompatibilních s Bremia lactucae

vzhledem ke stadiu infekce (Sedlářová, Lebeda a Binarová, 1999)

Inkompatibilní interakce

Kompatibilní interakce

Tvorba apresoria a penetrace

- agregace MT pod apresoriem - tvorba MT „cables“ v penetrovaných buňkách

- žádné detekovatelné změny

Tvorba primárního a sekundárního vezikulu

- tvorba MT „basket“ kolem vezikulů

Proces HR a nekróza epidermálních buněk

- tvorba „patches“ (signál ve formě lokálních shluků) - depolymerizace MT v celé buňce

- autofluorescence fenolů

penetrace

L. serriola PIVT 1309-12 hai-laktoglycerol-WU

HR – histochemická detekce

L. virosa H 58-0958-48 hai-chloralhydrát

HR – histochemická detekce

rezistentní

L. sativa Cobham Green

5.den 7.den 9.den 11.den

)) mT-PmT-0MeOR-PMeOR-0DMSOH2O

L.serriola LSE/18

5.den 7.den 9.den 11.den

) mT-P

MeOR-P

MeOR-0

L. serriola LSE/18

7.den 9.den 13.den

) mT-P

MeOR-P

MeOR-0

Vliv koncentrace exogenně aplikovaných cytokininůna časový průběh sporulace B. lactucae

c(CK)=10-5M c(CK)=10-4M

LSE/18

mT – meta-topolinMeOR – metoxybenzylaminopurin-ribosidDMSO - dimetylsulfoxid

DMSO MeOR mT voda

Vliv exogenní aplikace cytokininůna intenzitu sporulace B. lactucae

L. sativa Cobham Green L. serriola LSE/18

Výsledky Bonferoniho testu mnohonásobných porovnávání výnosu spor, 14dai

Předpokládaný sled procesů vedoucích k obranné reakci buňky po napadení biotrofním patogenem

InfekceProdukce genotypově-specifických elicitorů - signalizace

Primární rozpoznáníAktivace odpovědi

De novo syntéza proteinů v penetrovaných buňkáchIMD a uvolňování fenolických látek

Uvolnění endogenních elicitorůAkumulace fenolů vázaných s BS

Sekundární signalizaceSekundární rozpoznání

Transkripce mRNA kontrolujících biosyntézu ligninových prekurzorů v okolních buňkáchDepozice ligninu v místě a okolí infekce

Hypersenzitivní reakce, rozpad jádraOxidativní procesy

Depozice strukturních látek zesilujících buněčné stěnyKyselina benzoová, salicylová, jasmonová, etylenPR proteiny a další proteiny spojené s obranou

LypoxygenázyFytoalexiny

Obranné mechanismy hostitele vyvolané infekcí patogenuje možno studovat hierarchicky na řadě úrovní

biologické organizace:

Organismus

Orgán

Pletivo

Buňka

Fyziologické procesy

Molekulární struktura

Všechny tyto úrovně se více či méně podílejí na výsledném projevu interakce, přičemž jedna úroveň projevu velmi úzce souvisí s další, vzájemně na sebe

navazují a podmiňují se.

PoděkováníP. Binarová (UEB AV ČR Olomouc) - cytoskelet

L. Luhová (K.biochemie PřF UP Olomouc) - AOSM. Výtisková (studentka) - CK, M. Duchoslav (KB PřF UP Olomouc) - statistika

MSM 153100010 „Stresová a patologická biologie, biochemie a bioenergetika rostlin “GAČR 522/02/D011 „Cytologické a biochemické aspekty interakcí rostlin a patogenů

(model Lactuca spp.-Bremia lactucae)“MZe ČR 75/2004 „Národní program využití genofondu mikrooganismů a drobných živočichů“

a mnoho dalších…

Pro cestu do neznáma jsou pochybnosti a diskuse

nezbytné.Jestliže chceme vyřešit problém, jaký se nám ještě nikdy vyřešit nepodařilo, musíme ponechat dveře

do neznáma pootevřené.

(R. Feynman)

Obranné mechanismy rostlin vinterakcích...

Documents