Post on 24-May-2015
transcript
Praktikum 2
Buněčný cyklus
Mitóza
Referát
Konfokální mikroskopie
Konfokální
mikroskop
Test
• 6 minut
• Uveďte své jméno, kruh a verzi
• Nepište nic do zadání!
• 1 i více správných odpovědí, v případě
nejasností lze doplnit krátký komentář.
• Poslední otázka je zaměřena na krátkou
odpověď.
Skripta – str.13 – 3.3Úkol 2: Změny koncentrace DNA během
buněčného cyklu• Graf dokumentuje početní
distribuci buněk kostní dřeně ve vztahu ke koncentraci jaderné DNA.
• Buňky byly obarveny fluorescenčním barvivem, které se váže na DNA, a s využitím průtokové cytometrie (FACS) rozděleny podle své koncentrace DNA.
Úkol 2: zadání• Vysvětlete, proč se ve
vzorku vyskytují buňky o různé koncentraci DNA.
• Objasněte, proč není početní rozdělení buněk rovnoměrné a proč má křivka dva vrcholy.
• Lze z grafu vyčíst relativní dobu trvání jednotlivých fází buněčného cyklu ?
Buněčný cyklus
interfáze
M
Buněčný cyklus
G1G2
S
M
Buněčný cyklus
syntéza DNA
S
G2
G1
M
G0 - fáze
Kontrolní body buněčného cyklu
Skripta – str.13 – 3.3 Úkol 2 – zadání
• Vysvětlete, proč se ve vzorku vyskytují buňky o různé koncentraci DNA.
• Objasněte, proč je početní rozdělení buněk nerovnoměrné a proč má křivka dva vrcholy.
• Lze z grafu vyčíst relativní dobu trvání jednotlivých fází buněčného cyklu ?
Úkol 2 – řešení
S
0
po
čet
bu
něk
G1
G2 + M
x xRelativní koncentrace DNA na buňku
1x 2x
Úkol 2 - závěr• Vycházíme z předpokladu, že
kostní dřeň obsahuje buňky, které se nacházejí v různých fázích buněčného cyklu, nikoli však ve fázi G0.
• Vrchol A – buňky v G1 fázi – mají poloviční koncentraci oproti buňkám v G2 a M fázi – vrchol B.
• Oblast mezi dvěma vrcholy – buňky v S fázi (mají rozdílnou koncentraci DNA, proto nevytvářejí nápadný vrchol).
S
0
po
čet
bu
něk
G1
G2 + M
Relativní koncentrace DNA na buňku
1x 2x
Ukázky vyšetření „DNA-ploidie“
Aneuploidie u Barrettova jícnu
Barrettův jícen - prekanceróza
Aneuploidie v Barrettově jícnu
Aneuploidní buňky
Jiný výsledek – linie nádorových buněk
Zvýšený podíl buněk v S-fázi
svědčí o intenzivní proliferaci
Mitóza
• Jaderné dělení
– Profáze
– (Prometafáze)
– Metafáze
– Anafáze
– Telofáze
• Buněčné dělení
– cytokineze
Str. 14 – 3.5 Úkol 3: Pozorování fází mitózy v buňkách kořínků cibule
• Preparáty byly připraveny z vrcholů kořínků cibule kuchyňské (Allium cepa).
• Kořínky byly po fixaci ve směsi ethanol – kyselina octová (3 : 1) přeneseny na krátkou dobu do roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 1 mol.dm-3 (ohřátého na 60ºC) a pak na 30 – 90 minut do Schiffova reagens (roztok fuchsinu odbarvený oxidem siřičitým).
• Struktury obsahující DNA se vyloučeným fuchsinem zbarvily fialově.
Princip Feulgenovy nukleární reakce.
• Kyselou hydrolýzou
DNA dochází
k odštěpení bází
• Volné aldehydické
skupiny deoxyribózy
oxidují redukovaný
fuchsin na původní
fialovou formu.
Pozorování fází mitózy v buňkách kořínků cibule
• Prohlédněte pod mikroskopem roztlakový preparát kořínků cibule barvený Feulgenovou reakcí a najděte v něm dělící se buňky.
• K vyhledání buněk použijte objektiv o zvětšení 5-10x, k pozorování mitózy je nevhodnější objektiv 40x – 45x. Najděte a podle předložených fotografií určete jednotlivé fáze mitózy.
Mitóza v koříncích cibule
Pozorování fází mitózy v buňkách kořínků cibule
• Spočítejte cca 20-30 dělících se buněk a stanovte tzv. mitotický diferenciál, tj. zastoupení buněk v jednotlivých fázích mitózy (tj. v profázi, metafázi, anafázi a telofázi). Podíly buněk v jednotlivých fázích zapište do tabulky.
• Po vyplnění tabulky srovnejte údaje a zjistěte, zda jsou počty buněk v jednotlivých fázích přibližně stejné anebo buňky v určité fázi popř. fázích převažují. Vysvětlete své výsledky.
Mitotický diferenciál
Fáze mitózy Průběžný počet Celkový počet
ProfázeMetafáz
eAnafázeTelofáz
e
12
4
6
3
Str. 11 – 2.7 Úkol 4: Pozorování metafázních chromozomů z buněk
kostní dřeně myši• Pro získání preparátů byly čerstvě
usmrceným myším odpreparovány femury a z nich výplachem získána kostní dřeň. Ta byla přenesena do hypotonického roztoku a dále zpracována stejně jako buňky periferní krve (viz předchozí praktika).
• Skla s chromozomy byla obarvena roztokem Giemsa-Romanowski.
Pozorování chromozomů z buněk kostní dřeně myši
• Pozorujte chromozomy kostní dřeně myši na trvalém preparátu. K vyhledání buněk použijte objektiv o zvětšení 5-10x, k pozorování chromozomů nejlépe objektiv 40 – 45x.
• Obraz v mikroskopu srovnejte s přiloženou fotografií (zobrazuje chromozomy při zvětšení cca 1000x).
• Spočítejte, kolik chromozomů obsahuje somatická buňka myši. Použijte fotografii nebo spočtěte chromozomy přímo v zorném poli mikroskopu.
• Určete, který typ (popř. které typy) chromozomů je přítomen (popř. jsou přítomny) v buňkách myši
Myší chromozomy
Výsledky úkolů
Úkol 3 - mitóza
• Mitotický diferenciál
– Buňky v různých fázích mitózy mají rozdílné
zastoupení.
– Nejvíce buněk lze nalézt v profázi – tato fáze
trvá nejdéle.
Mitóza u nádorových buněkPorucha regulace buněčného cyklu vede ke vzniku
nádorových buněk. Ty se zpravidla vyznačují vysokou mitotickou aktivitou, která může mít za následek poruchy
rozchodu (nondisjunkce) chromozomů.
Chromozomy myši
telocentrické chromozomy
Myší chromozomy
10
10
11
9
celkem 40 chromozomů
Karyotyp myši - samice
Význam studia myších chromozomů
– testování mutagenity (genotoxicity)
Laboratorním myším byla aplikována látka s předpokládanými mutagenními účinky. Na každém obrázku jsou chromozomy z jedné myší somatické buňky. Zjistěte a popište chromozomové aberace,
které lze na nich pozorovat.
tetraploidie zlom
Příští praktika
• Praktická cvičení – kapitola 4: Meióza,
gametogeneze – str. 16 – 19
• Klinická cytogenetika I. – kapitola 6 – str. 38 – 43
• Referát: Etické otázky asistované reprodukce
• Test – mikroskopy, buněčný cyklus, mitóza,
základní poznatky o struktuře DNA a její replikaci
Na shledanou!
Fluorescence Activated Cell Sorter
• přístroj, jenž měří koncentraci DNA v každé buňce podle intenzity fluorescence – tzv. průtoková cytometrie
• Tento postup se mimo jiné používá také k měření koncentrace DNA v buňkách pacientů s hematologickými malignitami, popř. s nádory prsu, močového měchýře a střeva.
zpět k úkolu 1
Profáze
zpět
Metafáze
zpět
Anafáze
zpět
Telofáze
zpět
Cytokineze
zpět