Stránky praktika

transcript

Stránky praktika

http://web.natur.cuni.cz/zoologie/biodiversity/

(http://www.natur.cuni.cz/~muncling)

Kde se dozvědět více?

• Kurz Computational Genomics(Marc VanRanst)Bioinformatics bookmarks(http://www.kuleuven.ac.be/rega/mvr/bioinformatics.htm)

• Úvod do bioinformatiky/Základy bioinformatiky(F. Cvrčková)

• Molekulární ekologie(letní semestr, populační genetika, analýza paternity)

Databáze sekvencí

Primární databáze DNA sekvencíRefSeqGenomové databáze

Primární databáze DNA sekvencíInternational Nucleotide Sequence Databases (INSD)

GenBank(National Center for

Biotechnology Information)USA

DNA Data Bank of Japan (DDBJ)

(National Institute of Genetics)Japan

European Nucleotide Archive

(European Bioinformatics Institute)Europe

Your submission Your submission

Your submission

RefSeq: Databáze unikátních sekvencí

Provozována NCBI Kurátorovaná databáze založená na sekvencích získaných z

primárních databázích Unikátní sekvence genu/transkriptu/proteinu pro jednotlivé

organismy/ekomorfy/varianty

Genomové databáze

Skladují anotované assembly celých genomů + veškerá metadata asociovaná se sekvencemi nebo geny/transkripty/ proteiny: Sekvence, geny, transkripty, proteiny, proteinové rodiny, paralogy,

orthology, mezidruhové alignmenty, genové exprese, varianty (SNPs), repetitivní elementy, mikrosatelity, strukturální změny, genová regulace, fenotypy apod.

http://www.ensembl.org/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://genome.ucsc.edu/

Genomové databáze

Veškerá data jou vzájemně propojena pomocí identifikátorů a pozic v genomech:

Sekvence Gen Transkript Exprese Funkce

http://www.ensembl.org/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://genome.ucsc.edu/

Manipulace se sekvencemi

Uchovávání sekvencíAlignmentBLAST

Uchovávání sekvencí

• Sekvence uchovávány ve formě textu v klasickém textovém souboru (možno editovat v notepadu, textpadu, apod. nebo ve specifických programech určených k manipulaci a editaci sekvencí – např. BioEdit)

• V textových souborech uchovávány ve specifickém tvaru:

– FASTA (.fa, .fas, .fasta)

– GenBank (.gb)

• V každém souboru 1 i více sekvencí

>gi|148832288|gb|EF443167.1| Rhinopoma hardwickei haplotype 2949 cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial

ATGACCCACATCCGAAAATCCCACCCCTTATTCAAAATTATCAACGACTCATTCATCGACCTACCAGCTCCATCAAACATTTCCTCCTGATGAAATTTTGGGTCCCTACTAGGTATTTGTTTAGCTGTACAAATCTTAACAGGACTGTTCCTAGCAATACATTATACATCAGATACCACAACCGCCTTCTACTCTGTTACCCATATCTGCCGAGACGTAAATTACGGCTGAATCCTACGTTACCTCCATGCCAACGGAGCATCCATATTCTTCATCTGCCTATTTATACATGTAGGCCGAGGCATCTATTACGGCTCATACCTATTCACAGAAACATGAAACATTGGCATTATCCTTCTATTCGCCGTAATAGCAACAGCATTCATAGGCTATGTCCTCCCA

>gi|...

ATGA...

Pouze velmi základní informace o sekvenci – formát určen primárně k manipulaci se sekvencemi

LOCUS EF443167 402 bp DNA linear MAM 15-OCT-2007DEFINITION Rhinopoma hardwickei haplotype 2949 cytochrome b gene, partial cds; mitochondrial.ACCESSION EF443167VERSION EF443167.1 GI:148832288KEYWORDS .SOURCE mitochondrion Rhinopoma hardwickii (Lesser mouse-tailed bat) ORGANISM Rhinopoma hardwickii Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Chiroptera; Microchiroptera; Rhinopomatidae; Rhinopoma.REFERENCE 1 (bases 1 to 402) AUTHORS Hulva,P., Horacek,I. and Benda,P. TITLE Molecules, morphometrics and new fossils provide an integrated view of the evolutionary history of Rhinopomatidae (Mammalia: Chiroptera) JOURNAL BMC Evol. Biol. 7, 165 (2007) PUBMED 17868440 REMARK Publication Status: Online-OnlyREFERENCE 2 (bases 1 to 402) AUTHORS Hulva,P. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (18-FEB-2007) Zoology, Charles University, Vinicna 7, Prague, 2 12843, Czech RepublicFEATURES Location/Qualifiers source 1..402 /organism="Rhinopoma hardwickii" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:124756" /haplotype="2949" CDS 1..>402 /codon_start=1 /transl_table=2 /product="cytochrome b" /protein_id="ABR14084.1" /db_xref="GI:148832289" /translation="MTHIRKSHPLFKIINDSFIDLPAPSNISSWWNFGSLLGICLAVQ ILTGLFLAMHYTSDTTTAFYSVTHICRDVNYGWILRYLHANGASMFFICLFMHVGRGI YYGSYLFTETWNIGIILLFAVMATAFMGYVLP"ORIGIN 1 atgacccaca tccgaaaatc ccacccctta ttcaaaatta tcaacgactc attcatcgac 61 ctaccagctc catcaaacat ttcctcctga tgaaattttg ggtccctact aggtatttgt 121 ttagctgtac aaatcttaac aggactgttc ctagcaatac attatacatc agataccaca 181 accgccttct actctgttac ccatatctgc cgagacgtaa attacggctg aatcctacgt 241 tacctccatg ccaacggagc atccatattc ttcatctgcc tatttataca tgtaggccga 301 ggcatctatt acggctcata cctattcaca gaaacatgaa acattggcat tatccttcta 361 ttcgccgtaa tagcaacagc attcataggc tatgtcctcc ca//

GenBank Formát uchovává

velmi detailní informaci o sekvenci – určen k uchovávání sekvencí vč. veškerých informací asociovaných se sekvencí

Výpis genů v sekvenci

DEFINITION

Databázové přístupové číslo

ACCESSION

VERSION

Verze dané sekvence

KEYWORDS

Pod kterými klíčovými slovy ji lze najít

SOURCE

Organismus + zařazení v systému

REFERENCE

Článek(y), kde byla daná sekvence publikována + autoři

FEATURES

Podrobný popis jednotlivých genů včetně jejich pozic – např. počátek a konec kódující sekvence, sekvence proteinu + XREFS

Pozice genu v rámci sekvence

ORIGIN

Sekvence

Konec sekvence

Příklad

GenBank na stránkách NCBI – ve vyhledávání možnosti “Nucleotide” - GenBank + RefSeq

Vyhledávání podle rodového názvu “Mammuthus”

Velké množství záznamů – omezit výběr pouze na neredundantní databázi RefSeq

Celý genom – použít webový formulář k výběru pouze sekvence cytochromu b (pozice v části SOURCE – CDS)

Vyhledejte sekvence cytochromu b ze všech druhů mamutů, které byly osekvenovány (jaké druhy?)

Exportujte protein-kódující část do FASTA formátu a uložte na počítač

Postup:

Porovnání sekvencí: Alignment Porovnání/přiřazení dvou a více sekvencí Při alignmentu předpokládána homologie sekvencí Využívány různé typy algoritmů = různé předpoklady

Sekvence se shodují

Sekvence se liší

Sekvence chybí

• Pairwise Alignment (2 sekvence)– Globální (Needleman-Wunsch):

• Zhruba stejně dlouhé sekvence

• Snaží se přiřadit od začátku až do konce sekvence

– Lokální (Smith-Waterman):• Jen nejlépe shodující se místa obou sekvencí

• Sekvence různě dlouhé

Např. BioEdit http://www.ebi.ac.uk/http://www.bioinformatics.org/sms2/index.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment

Typy alignmentů

• Multiple Alignment– Více sekvencí– Hledá konzervativní místa– ClustalW, Muscle, T-coffee

Např. BioEdit,http://www.ebi.ac.uk/,http://www.bioinformatics.org/sms2/index.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_sequence_alignment

Uchovávání alignmentů

Podobně jako v případě sekvencí – v textových souborech ve specifickém formátu

Různé formáty: nejčastěji formát programu ClustalW (.aln) lze také jako multiple FASTA Phylip (.phy), NEXUS (.nex) – odpoledne Nově SAM (Sequence Alignment/Map format) – velké

celogenomové alignmenty

Základní BLAST – prohlédávání celé databáze pomocí

nukleotidové sekvence

Vyhledávání v jednotlivých referenčních

genomech

Vložit sekvenci

Zvolit “Others”

Zvolit databázi, ve které chceme BLASTovat

Příklad 1

Vyhledejte sekvence nejpodobnější cytochromu b mamuta z tří jiných druhů

Vytvořte multiple FASTA soubor Proveďte multiple alignment stažených

sekvencích

BLAST na NCBI – „nucleotide blast” option - “reference genomic sequences” databáze (nonredundantní genomické sekvence)

Stáhnout protein-kódující sekvence cytochromu b Vytvořit v libovolném textovém editoru multiple FASTA soubor Provést multiple alignment (na EBI – na webu, BioEdit – na počítači)

EBI (www.ebi.ac.uk) – services – DNA & RNA – Clustal2W BioEdit – Accessory Applications – ClustalW Multiple Alignment

Postup:

Příklad 2Úloha ze života

• BLAST ke zjištění zdroje kontaminace – např. sekvenuji mamuty – nezdá se mi jedna se sekvencí

Postup:

Jedna ze dvou sekvencí na stránkách praktika

BLAST - “nucleotide blast” option

Navržení primerů pro PCR

Maskování repeatůDesign primerůIn Silico PCR (e-PCR)

http://www.repeatmasker.org/

Maskování repeatů: RepeatMasker

•Umožní vyhledat a „zakrýt“ oblasti, které jsou v genomu ve větším počtu (mikrosatelity, retrotranspozony a transpozony)

•Umožní nám to při navrhování primerů se vyvarovat nespecifickým amplifikacím při PCR

•Pouze ale organismy, které jsou buď již osekvenovány anebo jsou jim blízce příbuzné (retrotransposony a transposony) X mikrosatelity lze maskovat u jakýchkoliv organismů

Zamaskovaná sekvence

• Pomocí N nebo použitím malých písmen (většina programů určených pro analýzu sekvencí s nimi umí pracovat)

>MusY.1ACACTTTTTCTTTTGCATAATGCTGTGTGGAGATTTTGCAGACAGCATTGCTGTAAAATGCAGAGTAATTTCTGTAATGAGCTTGTGAAATATTGACTATTATGGCCCTCTCTAAGCATGGCTTTAATTATATTCTAGCACAGCAGCTTCTCTGGGGATACTCAGGTCAGATCACTGACTGAATGTTGTGTTCATTTGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCATTTGTTGGTGTGCTGAATTCTGTTTTGTTTTGCTTTTAACCTAACTAGCTAGAAATTCTGTCAATCTTTTTTCCTTCCTAGAAAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAAACACAGGCTTT

RepeatMasker

RepeatMaskerVložit nukleotidovou sekvenci

Vybrat organismus

RepeatMasker

Výstup analýzy RepeatMaskeru

RepeatMasker

Výstup analýzy RepeatMaskeru

Design primerů:Primer3, Primer3Plus

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/

TCCGAAAATCCCACCAATTATCAACGACTCATTC

TGCG{CGCTAAGA<CTCCT>AA[CACACACACA]CGGAATTAGGGAAC}TT

Included RegionTargetExcluded Region

Maskování repeatů

Koncentrace Mg2+ Koncentrace dNTPs

Rozestup primerů => délka amplifikované oblasti

Elektronická PCR (e-PCR)

• Vezme dvojici primerů a zkouší, zda-li by PCR ve známém genomu amplifikovala pouze námi požadovanou oblast nebo i jiné oblasti

• Server UCSC (http://www.genome.ucsc.edu/)

• Lze i na NCBI

Organismus AssemblyF a R primery

Příklad

• Sekvence mikrosatelitů z myšího Y chromosomu na stránkách praktik (vytvořte multiple FASTA)

• Zamaskujte mikrosatelity pomocí RepeatMaskeru

• Navrhněte kolem nich primery v Primer3

• Zjistěte, které z těchto primerů jsou dále použitelné pomocí e-PCR

Pozice genů v genomu

Genomický koordinátový systém – založený na fyzické pozici nukleotidů v rámci většího celku (např. kontigu, chromozomu)

Tvoří pak tzv. fyzickou mapu (v base pairs: bp)

– např. u myši je začátek chromozomu na centromeře (pozice 1)

– např. gen SRY chrY:1,918,381-1,919,568 (přibližná pozice pak 1.9 Mb)

Jiné mapy: cytogenetická mapa, genetická mapa (cM)

Assembly

Verze koordinátového systému Počáteční verze genomu postrádají hůře sekvenovatelné

oblasti – jsou zaplněny Nky, ale postupně dochází k neustálému zpřesňování genomické sekvence = zpřesňování fyzické mapy

Rozdíl ve fyzikální pozici genů mezi různými assembly (až několik Mb)

Adh5 (Alcohol dehydrogenase 5)

chr3: 138,443,093-138,455,499chr3:138,106,057-138,118,463

GRCm38NCBIM37

Genomové prohlížeče Ensembl, UCSC, NCBI Nejvíce user-friendly asi Ensembl...

Příklad

Najděte tyto informace o genu Adh5 v myším genomu: Počet transkriptů, typ transkriptu? Kolik exonů má kanonický transkript? Jaká proteinová rodina (ID)? Kolik druhů dostupných na Ensembl má alespoň jeden ortholog tohoto

genu? Ve kterém taxonu dostupném na Ensembl je největší počet homologů

tohoto genu? Získejte protein-kódující sekvence genu (vždy kanonický transkript) pro

všechny hlodavce na Ensemblu, exportujte je do FASTA formátu, proveďte alignment

BioMart

• Při práci s více geny – efektivní získávání dat

• Pracuje na principu filtru – lze nastavit parametry výběru tzn. filtrovat na základě:

– pozice v genomu

– ID genů (konverze ID z různých databází)

– genové rodiny

– orthology

– paralogy

– ...

• Výstup lze uložit jako .txt, .csv nebo .xls soubor

BioMart (Ensembl)

Dababáze

Dataset = organismus

Verze se aktualizuje každé cca 2-3 měsíce

Důležité: pamatovat si verzi se kterou pracuji!!!

Parametry výběru: kritéria definující set genů

Požadovaná data ve výstupu

Propojení s daty z jiných organismů (pokročilé)

Kritéria výběru: pozice v genomu

Výběr atributů ve výstupu

Seznámení s BioMartem

Na základě jakých všech kritérií je možné filtrovat?

Jaká data lze na BioMartu získat – možnosti atributů?

Příklad 1• Oblast na chromosomu 11 (23 – 25 Mb) byla asociována s

reprodukční izolací mezi dvěma druhy myši domácí. Cílem je získat seznam protein-kódujících genů v této oblasti a vybrat kandidáty pro další výzkum (předpoklad: rychle se vyvíjející se geny mají větší pravděpodobnost být zodpověné za vznik reprodukční bariéry).

• Postup:– Získejte seznam genů včetně jména a popisu spolu s pozicí v

genomu, orthologů u potkana a informace o rychlosti molekulární evoluce mezi potkanem a myší z oblasti chr11:23000000-25000000

– Exportujte data do excelové tabulky seřaďte geny nejvíce kandidátních po nejméně kandidátní, určete kandidáty

Příklad 2• Získejte protein-kódující sekvence všech genů z rodiny

tzv. hlavních močových proteinů (Major Urinary Proteins) v genomu myši a proveďte multiple alignment

• Postup:– Získejte ID rodiny MUPs

– Použijte BioMart k získání protein-kódujících sekvencí MUPů a exportujte je do FASTA souboru

Stránky praktika

Documents