TECHNIKY PCR

transcript

TECHNIKY PCR

PCR - polymerase chain reaction

-polymerázová řetězová reakce

Outline

Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymeráza

Princip procesu PCR

Optimalizace PCR

Typy PCR

Aplikace PCR a využití v praxi

Komponenty nukleových kyselin

http://ntri.tamuk.edu/cell/nucleic.html

Nukleotid DNAdeoxyguanosid monofosfát (dGMP)

“Koncept párování bazí je striktně konzervativní“

From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M http://ntri.tamuk.edu/cell/dna.html

Cytosine Guanine

Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr

konce dsDNA nejsou stejné

jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární

DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena

5’ end 3’ end

5’ end3’ end

Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována

Singer, M., and P. Berg. 1991. Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49

Tm je závislá na: složení bazí rozpouštědle

iontové sílepH

délce DNA

DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/collaboration.html

separace řetězců syntéza krátkých

RNA primerů syntéza dvou

nových DNA helixů

podílí se enzymy:DNA primáza helikázaDNA polymerázaDNA ligáza SSB-proteiny

Vlastnosti DNA polymerázy

1. POLYMERÁZOVÁ AKTIVITA

Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec

Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec.

2. 3'-5' exonukleázová aktivita -opravná funkce “proofreading”

3. 5´exonukleázová aktivita - odštěpuje RNA primer

DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym

1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerázy - DNA polymerase I

in vitro polymeráza vyžaduje pouze:4 deoxynukleotidy trifosfátydsDNA templátprimer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH

DNA Polymeráza

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro

TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG

5’ 3’

3’ 5’

TTGAGAAAGGAATAAGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG3’ 5’

5’ 3’Forward primer

5’ 3’

3’ 5’

DNA POL

5’ 3’

3’ 5’

TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC TCTTTAGCTCATATACG

3’ 5’

5’ 3’

Reverse primer

5’ 3’

3’ 5’

DNA POL

GCATATACTCGATTTCT5’ 3’

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro

PCR: Co to je?

Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA

Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika)

The idea

Ghobind Khorana 1971

Kary Mullis 1983

poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce

Řetězová reakce vychází z DNA replikace

Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty

potřeba silného enzymu (polymerázy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách

Polymeráza izolovaná z termofilní bacterie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymeráza

Jak funguje PCR

PCR komponenty

Templátová DNA

vzorek k amplifikaci

Primery

krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace

dATP, dTTP, dCTP, dGTP

volné stavební jednotky DNA

Thermostabilní DNA polymeráza (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)

Proces PCR

Application

Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu

Proces

Problémy:

PCR je velmi citlivá na kontaminace

Častý problém - nespecifická amplifikace

Polymeráza pracuje i při nízských teplotách (e.g., během nastavování reakce)

“Hot start” PCR je řešení

Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu

“Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici: …gacgt, …gacga, …gacgg, …gacgc)

“Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech

Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí

Navrhování primerů

Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé

Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA

3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze

Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát)

Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2

Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm

Vyvarovat se repetitivním sekvencím

Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery

Navrhování primerů

Příklad navržení primerů:

Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci

Cílová sekvence: (priming místo podtrženo):

5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’

Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’

Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’

Praktické provedení PCR

PCR se provádí v termocyklerech

kovový blok z ušlechtilého kovusnadné programovánívyhřívané víko

objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL

složení:

• Templátová DNA 1-1000ng

• Primery 10 -20 pmols

• 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl

• MgCl2 0.5 -3.0 mM

• 50 ųM každého nukleotidu dATP, dGTP, dTTP, dCTP

• 2 jednotky Taq polymerázy

Počáteční denaturace 94oC 3-5 min

denaturace 94oC 30 sec

annealing ~55oC 30 sec

prodlužování 72oC 1min/kilobáze

počet cyklů 25-35 x

agarozováelektroforéza

PCR Optimalizace

Složka Nízká specificita

Vysoká specificita

AnnealingTeplota - Tm

Enzym, Primer

pH nespecificky

Formamid

Nespecifická amplifikace

Základní typy PCR

RT PCR (reverse transcriptase PCR)

vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT

jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dTrandom hexamer primer

hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů

vychází z RT-PCR

používá se k hledání celé sekvence nového genu

nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu

vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)

RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends)

inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA

asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond

amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA

SEKVENCOVÁNÍ DNA•automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR•jednozkumavková reakce•PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)•dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery•velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře•fluorometr s automatickým vyhodnocením

multiplex PCR více amplifikací v jedné

zkumavce

lékařská diagnostika

nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR

zvyšování specificity PCR

long PCR amplifikace dlouhých úseků, polymerázové kokteily –

např. Klenowův fragment + Pfu polymeráza

Pwo polymeráza z Pyroccocus woesei

DNA polymeráza 5´-3´exonukleázováaktivita

3´-5´exonukleázováaktivita

délkaproduktu

f rekvence chyby

Taq + 3 kb 8.0 x 10-6

Pfu + 3 kb 1.3 x 10-6

Pwo + 3 kb 5.3 x 10-7

long PCR koktej l + + 20 kb 2.0 x 10-6

in situ RT PCR lokalizace translace a exprese

real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu

využití fluorescence interkalačních barviv (etBr)

fluorometr je součástí termocykleru

DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ

1. detekce virových a bakteriálních onemocnění

DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ

2. detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA)

- AS PCR alelicky specifická PCRprimer navžen tak, že mutace odpovídá konci primeru

fragmety DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji

- Real time PCRpomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci

Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecív genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator

KRIMINALISTIKAVNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT

ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného

původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství

průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu)

identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin.

skot ovce prase koza TEST

EVOLUČNÍ BIOLOGIEORNITOLOGIE

TECHNIKY PCR

Documents