Uživatelský manuál PneumoPlex Verze_10_2017 1 Real time PCR detekce bakterií Legionella pneumophila+micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis In vitro diagnostikum -80 až -20°C Viz. obal RT-PPX-050 Viz. obal POPIS SOUPRAVY Real Time Multiplex assay pro detekci Legionella pneumophila a Legionella micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis. Diagnostický kit je určen pro molekulárně biologickou diagnostiku hlavních původců respiračních onemocnění. Doporučeným výchozím materiálem je BAL a výtěr nosohltanu. Souprava obsahuje pozitivní kontrolu (STD), která zahrnuje cílové sekvence všech detekovaných agens. Biologický materiál je doporučeno zpracovávat některým z klasických komerčních postupů purifikace DNA, souprava byla optimalizována pro izolaci nukleových kyselin pomocí QIAmp DNA Mini Kit/QIAGEN. SKLADOVÁNÍ Soupravu je doporučeno skladovat při teplotě -20 o C (případně nižší), zvláště citlivá k vyšším teplotám je polymeráza. Je nutné zamezit zbytečnému opakovanému rozmrazování reagencií, které může snižovat jejich stabilitu. PMX II a IC PMX II jsou citlivé na světlo, je doporučeno zkumavky vystavovat osvětlení jen na dobu nezbytně nutnou k přípravě analýzy. OBECNÁ DOPORUČENÍ PRO PCR DIAGNOSTIKU PCR je vysoce citlivá metoda schopná zachytit i velmi malé množství nukleové kyseliny, které může sloužit jako templát pro amplifikaci a způsobit kontaminaci analýzy. Zdrojem kontaminací PCR mohou být zejména: laboratorní stůl, příslušenství a pipety kontaminované z předchozí izolace nukleových kyselin kontakt mezi vzorky PCR produkty z předchozí analýzy STD/pozitivní kontroly
Transcript
Uživatelský manuál PneumoPlex
Verze_10_2017
1
Real time PCR detekce bakterií Legionella pneumophila+micdadei, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis
In vitro diagnostikum
-80 až -20°C
Viz. obal
RT-PPX-050
Viz. obal
POPIS SOUPRAVY
Real Time Multiplex assay pro detekci Legionella pneumophila a Legionella micdadei, Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydia pneumoniae a Bordetella pertussis. Diagnostický kit je určen pro molekulárně
biologickou diagnostiku hlavních původců respiračních onemocnění. Doporučeným výchozím materiálem je
BAL a výtěr nosohltanu. Souprava obsahuje pozitivní kontrolu (STD), která zahrnuje cílové sekvence všech
detekovaných agens. Biologický materiál je doporučeno zpracovávat některým z klasických komerčních
postupů purifikace DNA, souprava byla optimalizována pro izolaci nukleových kyselin pomocí QIAmp DNA Mini
Kit/QIAGEN.
SKLADOVÁNÍ
Soupravu je doporučeno skladovat při teplotě -20oC (případně nižší), zvláště citlivá k vyšším teplotám je
polymeráza. Je nutné zamezit zbytečnému opakovanému rozmrazování reagencií, které může snižovat jejich
stabilitu. PMX II a IC PMX II jsou citlivé na světlo, je doporučeno zkumavky vystavovat osvětlení jen na dobu
nezbytně nutnou k přípravě analýzy.
OBECNÁ DOPORUČENÍ PRO PCR DIAGNOSTIKU
PCR je vysoce citlivá metoda schopná zachytit i velmi malé množství nukleové kyseliny, které může sloužit jako
templát pro amplifikaci a způsobit kontaminaci analýzy.
Zdrojem kontaminací PCR mohou být zejména:
laboratorní stůl, příslušenství a pipety kontaminované z předchozí izolace nukleových kyselin
kontakt mezi vzorky
PCR produkty z předchozí analýzy
STD/pozitivní kontroly
Uživatelský manuál PneumoPlex
Verze_10_2017
2
Diagnostiku pomocí molekulárně genetických analýz mohou provádět pouze kvalifikované osoby k tomuto
účelu školené a profesně způsobilé. Za chybné výsledky způsobené neodbornou manipulací se soupravou
výrobce neručí.
Doporučená fyzická izolace prostorů/oblastí pro:
purifikaci nukleových kyselin
přípravu reagencií pro amplifikaci
vlastní PCR analýzu a hodnocení
Jednotlivé oblasti musí být vybaveny přístroji a pomůckami, které jsou speciálně určené pro daný prostor
(místnost nebo laminární box), je nutné pomůcky používat pouze v odpovídajícím prostoru a nepřenášet je
mezi vytyčenými oblastmi.
Extrakce nukleových kyselin a příprava PCR reagencií musí být prováděny ve vyhrazeném biohazardním boxu a
PCR laminárním boxu nebo jiném sterilním místě, které je vybaveno UV lampou. Před použitím by mělo být
příslušenství vyzářeno minimálně 15min. UV světlem, doporučuje se použití látek degradujících DNA/RNA
(Termi-DNA-Tor, apod.).
Pro skladování je doporučeno fyzicky oddělit do jednotlivých krabiček reagencie pro extrakci nukleových
kyselin, přípravu PCR reakce, zejména však je nutné umístit do oddělených prostor pozitivní kontroly!, které
bývají nejčastějším zdrojem kontaminace.
Při manipulaci s reagenciemi a příslušenstvím je doporučeno:
dodržet striktně prostorovou izolaci jednotlivých postupů
nepoužívat expirované ani jinak znehodnocené výrobky
reagencie mohou být na čistém místě rozalikvotovány pro denní použití a náležitě uskladněny
používat roztoky RNase/DNase free a sterilní špičky s filtrem
před a po analýze použít chemickou DNA-dekontaminační metodu pro všechny povrchy, pipety,
stojánky a příslušenství případně vyzářit prostory UV lampami
zabránit tvorbě aerosolu
používat jednorázové rukavice a pravidelně je měnit
po každé proceduře vyprázdnit nádoby na biologický odpad
při extrakci nukleových kyselin a přípravě PCR se doporučuje nechávat ve stojánku mezi zkumavkami
mezery, aby se snížilo riziko vzniku kontaminace mezi vzorky
při přípravě PCR pipetovat v pořadí: 1.negativní kontrola, 2.analyzované vzorky, 3.pozitivní kontrola
Uživatelský manuál PneumoPlex
Verze_10_2017
3
LIKVIDACE ZBYTKU SOUPRAVY
S jednotlivými komponentami soupravy a se spotřebním materiálem je doporučeno zacházet jako s infekčním
materiálem. Odpad je vhodné uložit do nádob určených pro likvidaci infekčního biologického materiálu.
SOUPRAVA OBSAHUJE:
Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků:
Mastermix pro detekci L.pneumophila+micdadei, M.pneumoniae, Ch.pneumoniae, B.pertussis
PMXI (550µl)
PMXII (22µl)
PMXIII (55µl)
Taq polymeráza (30µl)
ddH2O (400µl)
PP STD (55µl) – pozitivní kontrola
Amplifikační reagencie pro přípravu Real Time PCR analýzy 50 vzorků:
Mastermix pro detekci Interní kontroly
IC PMXI (550µl)
IC PMXII (22µl)
IC PMXIII (400µl)
IC Taq polymeráza (22µl)
IC STD (28µl) – interní pozitivní kontrola
POTŘEBNÉ REAGENCIE A SPOTŘEBNÍ MATERIÁL, KTERÉ SOUPRAVA NEOBSAHUJE:
Izolační souprava
Sterilní špičky s filtrem
Zkumavky objemu 1,5-2ml pro přípravu Mastermixu
Zkumavky SmartCycler nebo PCR 0,2 ml
POTŘEBNÉ PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ
Biohazardní box, PCR box
Pipety s nastavitelným objemem 0,5 - 1000µl
Vortex, chladicí blok
Centrifuga s minimálním odstředivým zrychlením 14.000 x g
Termoblok nebo vodní lázeň nastavitelná na 56oC
Real Time Cycler – souprava byla optimalizována pro přístroje SmartCycler/Cepheid a RotorGene/Qiagen
Lednička, mrazák
Uživatelský manuál PneumoPlex
Verze_10_2017
4
BIOLOGICKÝ MATERIÁL
Doporučeným materiálem je BAL, nasofaryngeální výtěr, sputum. Biologický materiál je doporučeno uchovávat
při 0o až 4oC a okamžitě zpracovat (do 24h). Je-li to nutné, vzorek je možné zamrazit a dlouhodoběji uchovávat
při -20oC. Předpokládaná citlivost : 10E1-10E2/ml.
PURIFIKACE DNA Z BALU, VÝTĚRU A SPUTA
Doporučené komerční kity pro zpracování výše uvedených vzorků:
QIAamp DNA Mini Kit(50) REF: QIA-51304
QIAamp DNA Mini Kit(250) REF: QIA-51306
Vzorky je doporučeno zpracovat dle návodu výrobce konkrétní soupravy. Takto zpracovaný vzorek lze přímo
použít pro amplifikaci či skladovat v lednici při teplotě 2-8oC po dobu 24h, pro delší skladování je doporučena
teplota -20o až -80oC.
PŘÍPRAVA REAL TIME PCR ANALÝZY
Po samovolném rozmrazení všechny zkumavky potřebné k přípravě analýzy důkladně zvortexujte (je nevhodné
roztoky vystavovat vyšší teplotě než pokojové, z důvodu rychlejšího rozmrazení!).
Následně napipetujte do čisté sterilní eppendorf zkumavky (1,5-2ml) všechny komponenty v odpovídajícím
objemu nutném pro přípravu Mastermixu pro daný počet vzorků (n+1) a navýšený o 1x negativní a 1x pozitivní
kontrolu dle protokolu:
Příprava PPX Mastermixu: Příprava IC Mastermixu:
PCR/1 reakce (20µl)
2 µl izolátu DNA
10 µl PMX I
0,4 µl PMX II
1 µl PMX III
6,2 µl ddH2O
0,4 µl Taq polymeráza (5U/µl)
20 µl objem jednoho vzorku
PCR/1 reakce (20µl)
1,5 µl izolátu DNA/templát
0,5 µl IC STD
10 µl IC PMX I
0,4 µl IC PMX II
7,2 µl IC PMX III
0,4 µl IC Taq polymeráza (5U/µl)
20 µl objem jednoho vzorku
Uživatelský manuál PneumoPlex
Verze_10_2017
5
Zkumavky s oběma Mastermixy důkladně promíchejte.
Připravte si odpovídající množství SMART/PCR zkumavek do chlazeného bloku pro každý Mastermix (1 sada
zkumavek pro PPX Mastermix, 1 sada zkumavek pro IC Mastermix) a následně napipetujte 18 µl Mastermixu do
připravených zkumavek pro každý vzorek. Doporučujeme nejdříve napipetovat negativní kontroly (ddH2O či TE
pufr), poté připravené izoláty a jako poslední pozitivní kontroly – STD = plazmid obsahující cílové sekvence DNA
všech detekovaných bakteriálních agens. Po přidání negativní kontroly, vzorku či pozitivní kontroly zkumavku
okamžitě uzavřete, aby nebylo zvyšováno riziko kontaminace mezi jednotlivými zkumavkami. Následně
zkumavky krátce centrifugujte cca 5-10 sec a vložte do cykléru.
NASTAVENÍ PROTOKOLU REAL TIME PCR REAKCE V SMARTCYCLER SOFTWARE:
V menu software v záložce „Define protocol“ → „New protocol“ se vytvoří teplotně časový profil analýzy:
pro oba Mastermixy
Následně se zadá počet testovaných vzorků a definuje se jejich umístění v konkrétních pozicích cykléru.
Přes ikonu „Start Run“ se spustí analýza.
Hodnoty Threshold pro jednotlivé optické kanály:
Channel 1 (FAM) 50 RFU
Channel 2 (Cy3/HEX) 30 RFU
Channel 3 (TxR/ROX) 10 RFU (pro Interní kontrolu 30 RFU)!
![Matematika pro real-time grafikupepca/lectures/pdf/hwmath.pdfhomogenní souřadnice [ x, y, z, w ] se převádějí na běžné kartézské souřadnice vydělením (je-li w≠0) [](https://static.dokumenty.site/doc/80x56/609b0226e163d93dbe50041b/matematika-pro-real-time-grafiku-pepcalecturespdf-homogenn-souadnice-x.jpg)
