Post on 26-Jan-2016
description
transcript
Ubikvitinový systém pro degradaci proteinů a některé z jeho funkcí při kontrole BC
AVRAM HERSHKO
• 1937 Karcag, Maďarsko
• 1950 Izrael
• Faculty of Medicine at the Technion in Haifa
• 2004 Nobelova cena za chemii
• University of California, San Francisco• Mechanismus indukce syntésy tyrosin-
aminotransferasy (TAT) vlivem steroidních hormonů v kultivovaných jaterních buňkách
• Degradace TAT (1969-71)
Gordon Tomkins
• 1939 izotopové značení 15N-Leucin
• Méně než 1/3 izotopů nalezeno v moči => většina zabudována do proteinů tkání
• Stálá váha zvířat – dynamická výměna proteinů
• Degradace abnormálních a poškozených proteinů
Rudolf Schönheimer
(BRD, 1898-1941)
První pokus
• Výměna média – rychlý pokles
• Poločas rozpadu 2-3h
• Degradace zastavena inhibitory tvorby energie v buňce (KF a další)
• Potvrzovalo studii Simpsona o spotřebě En. při uvolňování AMK z proteinů v játrech
• Nepřímý důkaz, En. nutná pro udržení kyselého pH v lysozomu
• Pohlcení lysozomem ne, degradace TAT vyžaduje specifický enzym
• Spotřeba ATP ( neobvyklý proces – existence intracelulárního proteolytického systému)
• Hledání příčin potřeby energie v Izraeli• Využití klasické biochemie - Reakce buněčných lyzátů ve zkumavkách
věrohodně reprodukující procesy- Frakcionace a oddělování komponent- Čištění a charakterizace komponent- Rekonstrukce systému z izolovaných
přečištěných jednotek
Proerytroblast → Basofilní erytroblast → Polychromatofilní erytroblast → Ortochromatický erytroblast → Retikulocyt → Erytrocyt
Proteolytický systém z lyzovaných retikulocytů závislý na ATP
(1977)
Alfred Goldberg
Joseph Etlinger
• Rozdělení lyzátu do 2 frakcí na diethylaminoethyl (DEAE-) celulóze
• Frakce 1 obsahuje látky neadsorbované - hemoglobin (vyčištění)
• Frakce 2 uvolněná solným roztokem, obsahuje nehemoglobinové proteiny
• Samostatně frakce nejevily aktivitu, opětovnou kombinací počala ATP-dependentní degradace
• Aktivní složka ve frakci 1 byla malá, teplotně stabilní molekula
• Pojmenovaná APF-1 (ATP-dependent Proteolysis Factor 1)
• Identita APF-1 a ubikvitinu potvrzena 1980 Wilkinsnem
Aaron Ciechanover
Irvin Rose
Izolace a charakterizace komponent ATP-dependent proteolytic system from reticulocyt lysates
Ubikvitin – funkce a vazba• První izolace Goldsteinem při zkoumání
hormonů brzlíku• Postupně objeven ve všech tkáních a všech
eurkaryotických organismech (ubiqity = všudypřítomný)
• Funkce neznámá• Malá molekula z frakce 1 = domněnka regulační
podjednotky neznámého enzymu z frakce 2
• Radioaktivně označený ubikvitin byl přidán k frakci 2 za přítomnosti i nepřítomnosti ATP• Gelovou chromatografií bylo zjištěno spojení s velkou vysokomolekulární látkou • Navázán kovalentní peptidovou vazbou• Ubikvitin se váže na velké množství proteinů (SDS-page)
• Ubikvitin označený 125I byl inkubován s neoznačenými lysozomy a naopak a po rozdělení • Ubikvitin se váže na substrát, který má být rozložen ATP-dependentním proteolitickým systémem (např. lysozomem)
Původní předpoklad
Jak je ubikvitin navázán na proteiny?10 let práce, podstata návrhu správně
Sled 3 enzymů – E1: ubikvitin aktivující– E2: přepravce ubivitinu– E3: ubikvitin ligasa
Funkce enzymů
• E1 zajistí aktivaci karboxylového konce glycinového zbytku ubikvitinu pomocí ATP a následuje připojení aktivovaného ubikvitinu do thiolového vazebného místa enzymu E1 thioleserovou vazbou
• Transacylací je aktivovaný ubikvitin přesunut do SH místa enzymu E2, který přenese ubikvitin až k – NH2 skupině cílového proteinu
• Navázání na protein probíhá pomocí enzymu E3, který je substrátově specifický
• Velký počet E3 enzymů
• Proteiny s navázanými řetězci ubikvitinů jsou rozloženy v proteozomovém komplexu (26S)
• Ubikvitin je uvolněn ubikvitin-C-terminální hydrolasou nebo isopeptidasou
http://plantsubq.genomics.purdue.edu/plantsubq/images/26S_Proteasome.png
1990 Jak je degradace specifických buněčných proteinů obstarávána ubikvitinovým systémem v selektivních a
regulovaných dějích?
- Pozitivně regulující jednotka Cdc2 (Cdk1)
- Komplex Cdk1-cyklin B = MPF, podporuje vstup do mitosy
- Inaktivace MPF = degradace cyklinu B, nutné pro opuštění mitosy
Jaký je systém degradace cyklinu B a proč pouze na konci mitosy?
Mechanismus degradace cyklinu B a objeveni APC/C komplexu
Cyklin B
Spisula solidissima (Surf clam)
• Produkce velkého počtu oocytů
• Luca a Ruderman vytvořili bezbuněčný systém z oplozených oocytů, který reprodukoval specifická stádia BC degradace mitotických cyklinů
• Pomoc Roberta Palazza, Leonarda Cohen, Joan Ruderman.
Joan Ruderman
(USA)
Frakcionace systému prokázala výskyt dvou komponent důležitých pro navázání ubikvitinu k cyklinu B (E2-C, E3-like activity)
E3-like activity: 1500 kDa komplex, který váže ubikvitin na mitotické cykliny, oscilující v BC, inaktivní v interfázi a aktivní na konci mitosy. K aktivitě potřebuje přítomnost MPF (Cdk1-cyclin B).
Název ubikvitnové ligasy cyklosom
Podobná zjištění:
• Kirschner team – Xenopus eggs
Anaphase-Promoting Complex
• Nasmyth team – Yeast
Anphase-Promoting Complex / cyclosome = APC/C
Degradace mnoha regulátorů BC
(securin – inhibitor počátku anafáze)
Kontrolní bod dělícího vřeténka
(dovoluje rozchod chromatid pouze po řádném připojení na vřeténko)
Degradace Cdk inhibitoru p27Kip1
p27 způsobuje zastavení buňky v G1-fázi,
zabraňuje vstupu do S (inhibuje Cdk2-cyklin A
a Cdk2-cyklin E)
p27Kip1 univerzální inhibitor pro všechny
cyklin-Cdk komplexy
Prokázána degradace p27 ubikvitinovým systémemPokusy pro identifikaci ubikvitin-ligasového systému označujícího p27 k degradaci, in vitro na HeLa buňkách
• p27 se vázal na uvikvitin v extraktu rostoucích buněk více než v buňkách „uzamčených“ v G1
• Prokázána nutnost fosforylace p27 na T187, komplexem Cdk2-cyklin E pro ligaci p27-ubikvitin in vitro => kompetentní systém in vitro se stejnými pochody jako in vivo
Identifikace enzymu E3 – ubikvitinové ligasy
Přepoklad nutné přítomnosti SCF (Skp1-Cullin1-F-box protein) kvůli fosforylaci p27 substrátu
Michele Pagano
SCF komplexy
- velká rodina ubikvitin-protein ligáz
- variabilní F-box podjednotka rozpoznává příslušný fosforylovaný proteinový substrát
Objev Skp2 proteinu (S-phase kinase-associated protein 2) = specifický F-boxu pro SCF, který připojuje ubikvitin k p27
Navázání ubikvitinu na p27• Vyvázání Skp2 protilátkou z extraktu proliferujících buněk = zrušení
vazné aktivity p27-ubikvitin
• Dodaná rekombinantní vyčištěná Skp2 kompletně obnovila navázání ubikvitinu na p27
• In vitro důkaz: vazba p27 na Skp2 závisí na fosforylaci p27 na T187 (In vivo popsal Pagano lab) => Skp2 je specifický a limitující faktor SCF komplexu, který předurčuje p27 k degradaci
• Oscilace Skp2 v BC: v G1 velmi nízký, roste před vstupem do S a dále jen klesá
• Pokus o sestavení komlexu z jednotlivých komponent (Cullin, Skp1,Skp2, Roc1, Cdk/cyclin E, E1 a E2)
• Chyběla Cks1 (cyklin kinase subjunit 1)• Patří do konzervativní rodiny proteinů Suc1/Cks, jako
jediný z rodiny váže Cdk k fosforylovanému proteinu• Pro regulaci BC nezbytná
Rodina Suc1/Cks a Cks1• Pouze Cks1 podmiňuje vazbu p27-ubikvitin v uměle
poskládaném systému přečištěných komponent• Ostatní Suc1/Cks proteiny mají vazebná místa pro Cdk a
aniontové vazebné místo• Cks1 se dokáže navázat na Skp2 a podporuje spojení Skp2 s
fosforylovaným p27 na T187• Cks1 má tři vazebná místa, všechna nutná k asociaci Skp2 na
T187-fosforylovaný p27
Apeluje na propojení genetiky s biochemií!