0

160

320

480

640

800

0 250 500 750 1000

2x 4x

Relative fluorescence

Num

ber

of n

ucle

i

Pracovní metody v botanice:

karyologie + průtoková cytometrie

= studium buněčného jádra, zejména chromozómů

charakteristiky chromozómů:

- počet

- morfologie

- velikost (absolutní i relativní)

- barvitelnost

K a r y o l o g i eK a r y o l o g i eK a r y o l o g i eK a r y o l o g i e

- počet chromozómů (haploidní buňky: n

somatické buňky: 2n)

- základní chromozómové číslo (x)

- akcesorické (B) chromozómy

- polyploidie

- aneuploidie

- somatické mozaiky

- endopolyploidie

Počty chromozómůPočty chromozómůPočty chromozómůPočty chromozómů

Haplopappus gracilis2n = 4

Viola modesta2n = 4

Ophioglossum reticulatum2n = 96x = 1440

Sedum suaveolens - 2n = 80x = 640Voaniola gerardii - 2n = 50x = 596

Počty chromozómů - rekordyPočty chromozómů - rekordyPočty chromozómů - rekordyPočty chromozómů - rekordy

Stavba chromozómůStavba chromozómůStavba chromozómůStavba chromozómů

- centroméra, sekundární konstrikce, satelit

- difúzní centroméra

Morfologie chromozómůMorfologie chromozómůMorfologie chromozómůMorfologie chromozómů

- pericentrické inverze

- nerovnoměrné translokace

- delece, duplikace

- fúze

Změny tvaru chromozómůZměny tvaru chromozómůZměny tvaru chromozómůZměny tvaru chromozómů

- symetrický x asymetrický

(evoluce)

- bimodální

Charakteristiky karyotypuCharakteristiky karyotypuCharakteristiky karyotypuCharakteristiky karyotypu

- polyténní chromozómy

- B chromozómy

cévnaté > bezcévné

heterosporické > homosporické

nahosemenné > krytosemenné

bylinné typy > dřevnaté

Velikost chromozómůVelikost chromozómůVelikost chromozómůVelikost chromozómů

C-hodnota

velikost genomu

Arabidopsis thalianaC = 0.1 pg

Fritillaria assyriacaC = 127.4 pg

Obsah jaderné DNAObsah jaderné DNAObsah jaderné DNAObsah jaderné DNA

- euchromatin x heterochromatin

- pohlavní chromozómy

Barvitelnost chromozómůBarvitelnost chromozómůBarvitelnost chromozómůBarvitelnost chromozómů

- hypo-aneuploidie

- hyper-aneuploidie

A n e u p l o i d i eA n e u p l o i d i eA n e u p l o i d i eA n e u p l o i d i e

- ortopolyploidie x anortopolyploidie

- autopolyploidie x allopolyploidie

- výhody polyploidů

P o l y p l o i d i eP o l y p l o i d i eP o l y p l o i d i eP o l y p l o i d i e

Primula verticillata2n = 2x = 18

Primula floribunda2n = 2x = 18

Primula kewensis2n = 2x = 182n = 4x = 36

Allopolyploidie - PrimulaAllopolyploidie - PrimulaAllopolyploidie - PrimulaAllopolyploidie - PrimulaAllopolyploidieAllopolyploidieAllopolyploidieAllopolyploidie

Galeopsis pubescens2n = 2x = 16

Galeopsis speciosa2n = 2x = 16

Galeopsis tetrahit2n = 4x = 32

AllopolyploidieAllopolyploidieAllopolyploidieAllopolyploidie

AllopolyploidieAllopolyploidieAllopolyploidieAllopolyploidie

Dactylis polygama2n = 2x = 14

Dactylis glomerata2n = 2x = 28

AutopolyploidieAutopolyploidieAutopolyploidieAutopolyploidie

Tragopogon dubius2n = 2x = 12

Tragopogon porrifolius2n = 2x = 12

Tragopogon pratensis2n = 2x = 12

Tragopogon miscellus2n = 4x = 24

Tragopogon mirus2n = 4x = 24

Polytopní vznikPolytopní vznikPolytopní vznikPolytopní vznik

Buněčný cyklusBuněčný cyklusBuněčný cyklusBuněčný cyklus

Mitotické děleníMitotické děleníMitotické děleníMitotické dělení

Meiotické děleníMeiotické děleníMeiotické děleníMeiotické dělení

- výběr materiálu

1) předpůsobení1-bromnaftalen (nasycený roztok, 0,5 - 4 hod.)p-dichlorbenzen (bnasycený roztok, 3 - 5 hod)8-hydroxychinolin (0,002 M, 3 - 4 hod)kolchicin (0,01 - 0,5 %, 0,5 - 3 hod)

2) fixaceethanol : ledová kys. octová (3 : 1), 2 - 24 hod.

3) maceraceethanol : HCl (1 : 1), 1 - 3 min.1N - 2N HCl, 60°C, 5 - 15 min

4) barvenílakto-propion-orceinacetokarmín

Metody - roztlakové preparátyMetody - roztlakové preparátyMetody - roztlakové preparátyMetody - roztlakové preparáty

Metody - roztlakové preparátyMetody - roztlakové preparátyMetody - roztlakové preparátyMetody - roztlakové preparáty

Metody - průtoková cytometrieMetody - průtoková cytometrieMetody - průtoková cytometrieMetody - průtoková cytometrie

Příprava FCM vzorkůPříprava FCM vzorkůPříprava FCM vzorkůPříprava FCM vzorků

- rychlost

- jednoduchá příprava vzorků

- nedestruktivnost

- nevyžaduje mitoticky aktivní buňky

- detekce smíšených vzorků

Výhody průtokové cytometrie Výhody průtokové cytometrie Výhody průtokové cytometrie Výhody průtokové cytometrie

Využití průtokové cytometrieVyužití průtokové cytometrieVyužití průtokové cytometrieVyužití průtokové cytometrie

Analýza protoplastů(velikost, obsah DNA, RNA, proteinů, chlorofylu, alkaloidů, buněčný cyklus, syntéza buněčné stěny, třídění)

Analýza izolovaných jader (obsah DNA, poměr AT:CG bází, struktura chromatinu, obsah RNA, proteinů, třídění)

Analýza izolovaných chromozómů (velikost, centromerický index, obsah DNA, poměr AT:GC bází, třídění)

Botanické aplikaceBotanické aplikaceBotanické aplikaceBotanické aplikace

Podrobnější analýza jaderného genomu(velikost, složení genomu u allopolyploidů, odhad poměru AT:CG bází)

Analýza ploidního stupně(detekce nových ploidií, detekce heteroploidních kříženců, detekce endopolyploidie, detekce aneuploidie, určení pohlaví dioecických rostlin, detekce reprodukčního způsobu)

Další aplikace (struktura chromatimu, analýza buněčného cyklu, vliv radiace, třídění chromozómů)

Anthoxanthum2x - A. alpinum4x - A. odoratum

Empetrum2x - E. nigrum4x - E. hermaphroditum

Veronica hederifolia agg.2x - V. triloba4x - V. sublobata6x - V. hederifolia

Determinace druhů a jejich hybridůDeterminace druhů a jejich hybridůDeterminace druhů a jejich hybridůDeterminace druhů a jejich hybridů

Polypodium cambricum 2n = 2x = 74

Polypodium interjectum2n = 6x = 222

Polypodium vulgare 2n = 4x = 148

2x 6x

Determinace druhů a jejich hybridůDeterminace druhů a jejich hybridůDeterminace druhů a jejich hybridůDeterminace druhů a jejich hybridů

Empetrum - 3x

0

80

160

240

320

400

0 250 500 750 1000

2 x 3 x 4 x

R e la tiv e f lu o re sc e n c e

Num

ber

o f n

u cle

i

Dryopteris

0

70

140

210

280

350

0 250 500 750 1000

D . ca rthusiana

D . d ilatata

R e la tiv e f lu o re sc e n c e

Num

ber

of n

ucle

i

Determinace druhů a jejich křížencůDeterminace druhů a jejich křížencůDeterminace druhů a jejich křížencůDeterminace druhů a jejich kříženců

- Ranunculaceae s.l.

- vývojové centrum (Hypochaeris)

Otázky vyšších taxonomických kategoriíOtázky vyšších taxonomických kategoriíOtázky vyšších taxonomických kategoriíOtázky vyšších taxonomických kategorií

- objem jádra a buňky

- délka mitózy a meiózy

- hmotnost a objem semen

- minimální reprodukční doba

- fenologie

- parametry prostředí

- molekulární praxe (AFLP)

- fylogenetické analýzy

Obsah jaderné DNA - využitíObsah jaderné DNA - využitíObsah jaderné DNA - využitíObsah jaderné DNA - využití

0

240

480

720

960

1200

0 250 500 750 1000

H . p ilosella

H . caespitosum

R e la tiv e f lu o re sc e n c e

Num

ber

of n

ucle

i 2 n = 3 6

2 n = 3 6

Rozdíly v C - hodnotách

H. pilosella C = 1.74 pg H. lactucella C = 2.03 pg H. onegense C = 2.11 pg H. caespitosum C = 2.04 pg H. aurantiacum C = 1.93 pg H. bauhinii C = 1.97 pg

H. schultesii C = 1.80 pg (H. lactucella x H. pilosella) H. floribundum C = 2.04 pg (H. lactucella x H. caespitosum) H. brachiatum C = 1.78 pg (H. pilosella x H. bauhini)

stejný počet chromozómů rozdílná velikost genomu

Příbuzenské vztahyPříbuzenské vztahyPříbuzenské vztahyPříbuzenské vztahy

Analýza reprodukčního způsobuAnalýza reprodukčního způsobuAnalýza reprodukčního způsobuAnalýza reprodukčního způsobu

0

600

1200

1800

2400

3000

0 250 500 750 1000

2 x

3 x

R e la tiv e f lu o re sc e n c e

Num

ber

of n

ucle

i

0

200

400

600

800

1000

0 250 500 750 1000

Num

ber

of n

ucle

i

R e la tiv e f lu o re sc e n c e

3 x

6 x

Reprodukční způsobReprodukční způsobReprodukční způsobReprodukční způsob

Experimentální hybridizace 6x x 4x

Potomstvo:

6x (apomixie) 3x (haploidní partenogenéze) 5x (redukované gamety) 7x (redukovaná + neredukovaná gameta) 8x (neredukovaná + redukovaná gameta)

0

100

200

300

400

500

0 250 500 750 1000

R e la tiv e f lu o re sc e n c e

Num

ber

of n

ucle

i

6 x 8 x

0

160

320

480

640

800

0 250 500 750 1000

2x 4x

Relative fluorescenceN

umbe

r of

nuc

lei

Původ potomstvaPůvod potomstvaPůvod potomstvaPůvod potomstva

2x + 4x + 5x + 6x2x + 4x + 5x + 6x

2x + 3x + 4x2x + 3x + 4x

2x + 4x, 6x + 8x2x + 4x, 6x + 8x

Empetrum:Empetrum:

Campanula patula:Campanula patula:

Oxycoccus:Oxycoccus: GaleobdolonGaleobdolon

2x + 3x + 4x2x + 3x + 4x

Hieracium (echioides)Hieracium (echioides)

2x + 3x + 4x2x + 3x + 4x

AnthoxanthumAnthoxanthum

< < 2x + 2x2x + 2x (2x + 4x) (2x + 4x)

Studium smíšených populacíStudium smíšených populacíStudium smíšených populacíStudium smíšených populací

4x

2x

3x

Krkonoše

2x 2x + 3x 3x 4x

*

*

*

**

**

A

B

*

Mumlavská hora Jeřábí louka100 m

Empetrum

2x + 3x + 4x

Studium smíšených populacíStudium smíšených populacíStudium smíšených populacíStudium smíšených populací

- proužkování

- FISH, GISH

Další technikyDalší technikyDalší technikyDalší techniky