1 vod

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

2.1 M

jednotka se bude vnovat podrobn

Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

technologie vzniku,

Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu

Tak si v

2 Princip

DNA mikroip je

imobilizovanch rovnomrn

(obvykle v

Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se

mikroipu a tm dochz k

oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

kvantifikuj.

Nejastji se

Men zmn v

pomoc

Detekci strukturnch zmn genomu

jednonukleotidov polymorfizmy

D

D

neznmch

Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v

vod

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

Mikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

jednotka se bude vnovat podrobn

Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

technologie vzniku,

Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu

Tak si v tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

Princip a rozdlen

DNA mikroip je

imobilizovanch rovnomrn

(obvykle ve form

Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se

mikroipu a tm dochz k

oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

kvantifikuj.

ejastji se pouv k

Men zmn v

pomoc cDNA)

Detekci strukturnch zmn genomu

jednonukleotidov polymorfizmy

Detekci vazebnch mst protein na DNA

Detekci alternati

neznmch

Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v

Obrzek

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

jednotka se bude vnovat podrobn

Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

technologie vzniku, jak probh kvantifikace men a

Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu

tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

a rozdlen

DNA mikroip je mikroip sloen z

imobilizovanch rovnomrn

cDNA) ve

Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se

mikroipu a tm dochz k jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm

oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

pouv k

Men zmn v hladinch genov exprese

cDNA) expresnDetekci strukturnch zmn genomu

jednonukleotidov polymorfizmy

azebnch mst protein na DNA

alternativnho

neznmch nebo nepredikovanch transkript

Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v

Obrzek 1 Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

jednotka se bude vnovat podrobnji jejich

Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

jak probh kvantifikace men a

Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu

tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

a rozdlen DNA mikroip

mikroip sloen z

imobilizovanch rovnomrn na pevn

vzorku (Obr. 1)

Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se

jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm

oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

hladinch genov exprese

expresn mikroipyDetekci strukturnch zmn genomu

jednonukleotidov polymorfizmy)

azebnch mst protein na DNA

ho sestihu (exon junction nepredikovanch transkript

Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v

Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.

1

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

jejich nejrozenj skupin

Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

jak probh kvantifikace men a

Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu

tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

DNA mikroip

mikroip sloen z krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)

pevn podklad,

(Obr. 1).

Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se pruj sjejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm

oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

hladinch genov exprese (gene

mikroipy Detekci strukturnch zmn genomu (zmny v

) arrayCGH, SNP azebnch mst protein na DNA ChIP

exon junction nepredikovanch transkript

Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v

Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

nejrozenj skupin

Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

jak probh kvantifikace men a jak vznik

Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu

tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

DNA mikroip

krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)

podklad, pouvan

pruj s komplementrnmijejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm

oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s pomoc UV skeneru jako signl,

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

gene expression profiling

pot kopi gen, nebo

arrayCGH, SNP arraysChIP-on-chip

exon junction arrays) nebo pesnounepredikovanch transkript (tiling arrays

Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v nsledujc kapitole.

Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

nejrozenj skupin DNA mikroipKrom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

vznik zkladn datov matice

Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu analzy jejich dat.

tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)

pouvan k detekci DNA n

komplementrnmijejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm

pomoc UV skeneru jako signl,

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

expression profiling

pot kopi gen, nebo

arrays chip

nebo pesnou

tiling arrays)

nsledujc kapitole.

Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

mikroip. Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen

zkladn datov matice

analzy jejich dat.

tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)

detekci DNA nebo RNA

komplementrnmi etzci sond na jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm

pomoc UV skeneru jako signl,

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

expression profiling, detekce RNA

pot kopi gen, nebo

nebo pesnou detekci

nsledujc kapitole.

Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.

Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole

ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov

Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen podle

zkladn datov matice.

tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.

krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)

ebo RNA

etzci sond na

jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm

pomoc UV skeneru jako signl,

kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl

RNA

2.1 Zkladn kroky DNA mikroipovho experimentu

Pro sprvnou analzu dat DNA mikroip je nutn znt kroky, kter vedou k vytvoen

finln datov matice.

1. Vroba mikroipovho sklka Zpsob vroby a tedy typ samotnho mikroipu pmo ovlivuje zpsob analzy jeho

dat.

2. Pprava vzorku Nejprve se ze vzorku, kter m bt analyzovn, vyizoluj molekuly, kter chceme

studovat (DNA nebo mRNA). Molekula mRNA je pepsna do cDNA a amplifikovna

pouitm RT-PCR. DNA je amplifikovna pomoc PCR. Amplifikovan DNA (nebo

cDNA) je pak oznaena fluorescennm barvivem (nejastji Cy3 nebo Cy5), a to bu

pmo, nebo nepmo. U nepmho znaen je nejprve do cDNA vlenna reagujc

skupina (obvykle primrn amin), a pak je v oddlen reakci pipojeno k tto skupin

fluorescenn barvivo.

3. Hybridizace Dvouetzcov molekula DNA (cDNA) je denaturovna teplotou okolo 100C. Pi

tto teplot vodkov vazby, kter dr komplementrn pry bz a tud helixov etzce

pohromad, jsou perueny a roubovice se velmi rychle oddluje do dvou samostatnch

etzc. Za specifickch podmnek je denaturace DNA reverzibiln (vratn). U mikroipu

se tedy nastol podmnky Fluorescenn oznaen jednoetzcov DNA m tendenci vzat

se s komplementrnmi etzci sondy na mikroipu, vytv tak samostatn dvouetzcov

hybrid (duplex). Tento proces se nazv hybridizace.

4. Skenovn a kvantifikace 5. Normalizace

Tento posledn krok m za cl odstranit z dat zdroje nedoucho umu a

systematickch odchylek a sjednotit rozdlen expres u vech mikroip.

Nsledujc videa znzoruj proces DNA mikroipovho experimentu: MAXANIM

YOUTUBE animace

Nsledujc video ukazuje princip rznch typ mikroip (vetn proteinovch ip)

YOUTUBE rozdly mezi ipy

2.2 Vroba DNA mikroipovho sklka

Mikroipov sklka jsou vyrbna bu komern nebo na zakzku v jednotlivch

laboratoch. Vhodou komernch DNA mikroip je jejich vysok kvalita. Vtina

spolenost nabz celogenomov DNA mikroipy navren pro nejvce studovan organismy,

jako jsou lovk, my, krysa, nebo kvasinky. Mnoho spolenost tak nabz specializovan

ipy, kter jsou vhodn ke konkrtnjm vzkumm (ipy rakoviny tlustho steva, ipy

rakoviny prsu,).

Na druh stran, zakzkov vroba mikroip umouje specifick design i vrobu v malch

serich. To ovem vyaduje laborato, kter m mikroipovou tiskrnu nebo spotovac

zazen k vrob ipu.

Existuje nkolik technik, kter se pouvaj k vrob mikroip, snad nejvce pouvan je

spotovn a in-situ syntza. Dal je technika BeadArray

Spotovn - Sondy (oligonukleotidy, cDNA klony) o velikosti 500-5000 pr bz jsou syntetizovny jet dve, ne jsou naneseny na povrch ipu, a pak jsou umstny do spot na

povrch mikroipu. Tato procedura je vykonvna robotickou rukou s jemnmi jehlami.

Bhem procesu potisku jsou jehly vnoeny do ndob obsahujcch sondy (jedna jehla na jednu

sondu), kter jsou pak peneseny a natisknuty do uren oblasti na povrchu sklka. Jeliko

lze sondy a tiskov msta jednodue pizpsobovat, je tato technika celosvtov pouvna k

vrob zakzkovch mikroip vzkumnmi tmy ve vlastnch laboratoch.

Nsledujc video ukazuje spotujcho mikroipovho robota v akci:

http://www.youtube.com/watch?v=Pjr1Oyc0KrY&feature=related

Speciln pstup je technika BeadArray od firmy Illumina, kter sondy neumstuje na spoty

pmo na sklko, nbr na mikroskopick kuliky. Ty jsou pak nhodn umstny na povrch

mikroipu s malmi prohlubnmi.

In situ syntza - Tato metoda syntetizuje krtk sekvence sond (oligonukleotidy) pmo na sklku a je zaloena na fotolitografick syntze. Pi tto metod se pouv svtlo a

svtlocitliv ltky, kter maskuj nukleotid. V kadm kroku dochz k navzn jednoho typu

nukleotidu pouze na ty sondy, kter byli svtlem odmaskovny za pomoci selektivn mky

(Pease et al., 1994). Po navzn nukleotidu se opt vechny zamaskuj pomoc svtlocitliv

ltky a cel proces se opakuje a km vechny sondy nedoshnou svou konenou dlku.

Hezkou demonstraci celho procesu lze vidt na tomto videu:

http://www.youtube.com/watch?v=ui4BOtwJEXs&feature=related

2.3 Rozdlen mikroip

Mikroipy meme dlit podle

typu vrobn technologie (Affymetrix, Illumina, Agilent) dlky sond na mikroipu (cDNA mikroipy a oligonukleotidov mikroipy) potu vzork, kter jsou na jeden mikroip hybridizovny (jednokanlov vs

dvoukanlov, nebo i vcekanlov)

typu organismu, pro kter je mikroip navren

Rozdlen podle dlky sond a potu kanl odr zpsob jejich vroby a zrove pmo

ovlivuje zpsob odhadu umu a metody prav zkladnch datovch matic.

cDNA mikroipy sondami jsou 500-5000 pr bz dlouh cDNA klony vybranho

genu nebo znm sekvence. Obvykle jsou syntetizovny jet pedtm, ne jsou pouitm

spotovacho robota imobilizovny na pevn povrch metodou spotovn. Vhodou tchto

dlouhch sond je, e jejich specificita k jednotlivm clovm genm a v ppad spn

hybridizace s clovou vzorkovou DNA meme tm jist pedpokldat, e se opravdu jedn

o danou sekvenci. Nevhodou u tchto mikroip je, e nen znm pesn poet sond na

kadm spotu, a proto signl jednotlivch sond nen porovnatel jak mezi jednotlivmi spoty

v rmci mikroipu, tak mezi mikroipy rznch vzork. Z tohoto dvodu se na cDNA

mikroipy obvykle hybridizuj dva vzorky narz, odlien fluorescennm barvivem (dvoukanlov experiment). V jednom kanlu hybridizujeme vzorku, kterou studujeme, ve

druhm pak referenn DNA, kter by mla bt stejn pro vechny vzorky v studii. Ppadn

signl nespecifick sond se odhaduje

Tento typ ip produkuje komern napklad firma

Oligonukleotidov mikroipy

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.

mohou bt

zaruuje stejn

referennho vzorku

pli krtk

(nejastji 11)

otevenho techo rmce

probeset

sekvenci.

GeneChip

2.4 Design dvoukanlovch cDNA experiment

3 Skenovn amatice

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

emitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.

signl nespecifick sond se odhaduje

Tento typ ip produkuje komern napklad firma

Oligonukleotidov mikroipy

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.

mohou bt spotovny nap i

zaruuje stejn mnostv

referennho vzorku

krtk, aby byly

(nejastji 11) odpovdalo rznm

otevenho techo rmce

probeset) jsou pak

sekvenci. Nejbnj ipy v

GeneChip-->), obvykle zvan

Design dvoukanlovch cDNA experiment

Skenovn amatice

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.

signl nespecifick sond se odhaduje

Tento typ ip produkuje komern napklad firma

Oligonukleotidov mikroipy

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.

spotovny nap i

mnostv sondy v

referennho vzorku. Tyto mikroipy jsou proto

byly specifick,

odpovdalo rznm

otevenho techo rmce (obr. 2)

pak v dal analze

Nejbnj ipy v tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,

>), obvykle zvan

Obrzek 2

Design dvoukanlovch cDNA experiment

Skenovn a kvantifikace signlu

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.

signl nespecifick sond se odhaduje rznmi

Tento typ ip produkuje komern napklad firma

Oligonukleotidov mikroipy - zde jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.

spotovny nap ipem ve vy hustot

sondy v kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace

Tyto mikroipy jsou proto

specifick, proto je cel systm navren tak,

odpovdalo rznm stem sekvence znmho nebo pedpokldanho

(obr. 2). Men

dal analze sumarizovny

tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,

>), obvykle zvan Affymetrix

2 Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu

Design dvoukanlovch cDNA experiment

kvantifikace signlu

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.

rznmi algoritmy

Tento typ ip produkuje komern napklad firma Agilent

de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.

pem ve vy hustot

kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace

Tyto mikroipy jsou proto pouze

je cel systm navren tak,

stem sekvence znmho nebo pedpokldanho

Men vech sond odpovdajc jedn sekvenci

sumarizovny do jednoho sla pedstavujcho danou

tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,

Affymetrix ipy. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.

Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu

Design dvoukanlovch cDNA experiment

kvantifikace signlu

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.

algoritmy z pozad

Tento typ ip produkuje komern napklad firma Agilent.

de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch. Vhodou tchto sond je, e

a pomrn pesn. In

kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace

pouze jednokanlov.

je cel systm navren tak,

stem sekvence znmho nebo pedpokldanho

vech sond odpovdajc jedn sekvenci

do jednoho sla pedstavujcho danou

tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,

. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.

Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu

Design dvoukanlovch cDNA experiment

kvantifikace signlu, vytvoen zkladn datov

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

pozad prostoru

de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

Vhodou tchto sond je, e

a pomrn pesn. In-situ syntza

kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace

jednokanlov. Tyto

je cel systm navren tak, aby vce tchto sond

stem sekvence znmho nebo pedpokldanho

vech sond odpovdajc jedn sekvenci

do jednoho sla pedstavujcho danou

tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,

. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.

Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu

, vytvoen zkladn datov

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

prostoru v okol spotu.

de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

Vhodou tchto sond je, e

situ syntza

kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace

Tyto sondy jsou ov

vce tchto sond

stem sekvence znmho nebo pedpokldanho

vech sond odpovdajc jedn sekvenci (anglicky

do jednoho sla pedstavujcho danou

tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,

. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.

Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu.

, vytvoen zkladn datov

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

spotu.

de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi

krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ

Vhodou tchto sond je, e

situ syntza

sondy jsou ovem

vce tchto sond

(anglicky

do jednoho sla pedstavujcho danou

tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,

. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.

, vytvoen zkladn datov

Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch

skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu

mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv

mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze

vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,

3.1 cDNA mikroipy

Kad fl

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

dvoukanlovch

fluoresc

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

sekvencem

dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.

3.1.2 Kvantifikace signluPo skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.

obrazu je obvykle v

Kvantifikac

1. Lokalizace

2. Segment

3. Kvantifika

Lokalizace center spot

(anglicky

jejich prmru.

jakou sekvenci (sondu

cDNA mikroipy

Kad fluorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

dvoukanlovch cDNA mikroip

fluorescennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

sekvencemi. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.

Obrzek

vantifikace signluPo skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.

obrazu je obvykle v

fikaci signlu

Lokalizace

Segmentace

Kvantifikace signlu

Lokalizace center spot

(anglicky grid) je

jejich prmru. Normln jej

jakou sekvenci (sondu

cDNA mikroipy

uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

DNA mikroip

ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.

Obrzek 3 Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip

vantifikace signlu Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.

obrazu je obvykle v softvrovej vbave skeneru.

signlu pedchz dva kroky

center spot

ace - nalezen

ce signlu

Lokalizace center spot se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka

speciln datov soubor,

Normln jej

jakou sekvenci (sondu) kad spot obsahuje.

uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

DNA mikroip (Obr. 3)

ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.

Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip

Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.

softvrovej vbave skeneru.

pedchz dva kroky

er spot

nalezen spot, odlen intensity

na spotu i na pozad

se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka

speciln datov soubor,

Normln jej dodv vrobce cDNA mikroipu, spolu s

) kad spot obsahuje.

uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

(Obr. 3). Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm

ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.

Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip

Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.

softvrovej vbave skeneru.

pedchz dva kroky, kter slou k

spot, odlen intensity

na spotu i na pozad

se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka

speciln datov soubor, kter obsahue informace o

v vrobce cDNA mikroipu, spolu s

) kad spot obsahuje.

uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm

ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.

Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip

Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.

slou k identifikaci

spot, odlen intensity spot od

se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka

kter obsahue informace o

v vrobce cDNA mikroipu, spolu s

uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm

ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.

Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip

Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl. Program pro analzu

identifikaci spot a pozad:

od pozad

se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka

kter obsahue informace o rozmstnn spot a

v vrobce cDNA mikroipu, spolu s

uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm

ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip.

Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

Program pro analzu

spot a pozad:

se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka

rozmstnn spot a

v vrobce cDNA mikroipu, spolu s informac o tom,

uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost

umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u

. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm

ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm

fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na

mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi

i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a

Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak

Program pro analzu

se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka

rozmstnn spot a

informac o tom,

Tyto informace pak slou

Existuje

Pevnze sky o

postup je nevhodn v

Adaptivn kruhzvl. Problematick v

Adpaptivn tvar spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

intenzity pixel v

Adaptivn histogramspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit

bimodln rozdlen

histogramu) a spotu (prmr cca

Po segmentaci nsleduje

intensity pixel)

Pipomeme si, e

sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.

rozliujeme pojem

spotu. Protoe ale v

1) k referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako

hodnot intenzit pixel ve spotu. Medin

chybm v

Kvantifikacezahrnuje tak signl nespecifick hybr

pedstavujc nedouc um.

Tyto informace pak slou

Existuje vce algoritm

Pevn kruhze sky o

postup je nevhodn v

Adaptivn kruhzvl. Problematick v

Adpaptivn tvar spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

intenzity pixel v

Adaptivn histogramspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit

bimodln rozdlen

histogramu) a spotu (prmr cca

Po segmentaci nsleduje

intensity pixel) na pozad i ve spotu

Pipomeme si, e

sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.

rozliujeme pojem

Protoe ale v

referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako

odnot intenzit pixel ve spotu. Medin

chybm v segmentaci

Kvantifikace intenzity zahrnuje tak signl nespecifick hybr

pedstavujc nedouc um.

Tyto informace pak slou jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.

algoritm segmentace, nejastj

kruh (anglicky ze sky o pozici a prmru

postup je nevhodn v ppad spot odlinho prmru (celkem bn).

Adaptivn kruh (anglicky zvl. Problematick v

Adpaptivn tvar (adaptive shapespot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

intenzity pixel v okol.

Adaptivn histogramspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit

bimodln rozdlen

histogramu) a spotu (prmr cca

Po segmentaci nsleduje samotn

na pozad i ve spotu

Pipomeme si, e celkov fluorescence

sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.

rozliujeme pojem intenzita spotu

Protoe ale v dalch analzch potme s

referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako

odnot intenzit pixel ve spotu. Medin

segmentaci, nebo k

Obrzek

intenzity pozadzahrnuje tak signl nespecifick hybr

pedstavujc nedouc um.

jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.

segmentace, nejastj

(anglicky fixed circle

pozici a prmru spotu

ppad spot odlinho prmru (celkem bn).

(anglicky adaptive circle

zvl. Problematick v ppad spo

adaptive shape

spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

okol. Doke pesn uri

Adaptivn histogram (adaptive hspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit

bimodln rozdlen identifikuje

histogramu) a spotu (prmr cca v

samotn kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne

na pozad i ve spotu.

fluorescence spotusond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.

intenzita spotu, kter je definovn jako souet intenzit pixel v

dalch analzch potme s

referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako

odnot intenzit pixel ve spotu. Medin je

nepravidelnm tvarm

Obrzek 4 Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.

pozad je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu zahrnuje tak signl nespecifick hybridizace, ppadn jinch zlouenin na sklku

jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.

segmentace, nejastj jsou

fixed circle) jednodue

spotu, vechny spoty

ppad spot odlinho prmru (celkem bn).

adaptive circle)

ppad spot nekruhovho tvaru.

adaptive shape) po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje

spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

Doke pesn urit i spoty nepravidelnho tva

adaptive histogram)

spotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit

identifikuje pixely pozad (prmr

v 80 percentil

kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne

spotu je proporcionsond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.

, kter je definovn jako souet intenzit pixel v

dalch analzch potme s po

referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako

je vhodnj, protoe je robustnj k

nepravidelnm tvarm

Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.

je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu

idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku

jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.

jednodue fixn ur spoty

, vechny spoty tak maj stejnou

ppad spot odlinho prmru (celkem bn).

prmr

t nekruhovho tvaru.

po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje

spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

t i spoty nepravidelnho tva

) ur tvercov region kolem centra

spotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit

pixely pozad (prmr

80 percentilu histogramu).

kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne

je proporcionln mnostv hybridizovanch

sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku. U kvantifikace proto

, kter je definovn jako souet intenzit pixel v

pomry intenzit studovanho vzorku (kanl

referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako

vhodnj, protoe je robustnj k

nepravidelnm tvarm spot (obr. 4).

Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.

je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu

idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku

jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.

ur spoty na zklad inform

tak maj stejnou

ppad spot odlinho prmru (celkem bn).

prmr je odhadovn pro kad spot

t nekruhovho tvaru.

po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje

spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

t i spoty nepravidelnho tva

ur tvercov region kolem centra

spotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit

pixely pozad (prmr v

histogramu).

kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne

ln mnostv hybridizovanch

U kvantifikace proto

, kter je definovn jako souet intenzit pixel v

mry intenzit studovanho vzorku (kanl

referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako prmrvhodnj, protoe je robustnj k

(obr. 4).

Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.

je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu

idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku

jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.

na zklad inform

tak maj stejnou velikost

ppad spot odlinho prmru (celkem bn).

je odhadovn pro kad spot

po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje

spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

t i spoty nepravidelnho tvaru.

ur tvercov region kolem centra

kde se pedpokld

v 5-20 percentil

kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne

ln mnostv hybridizovanch

U kvantifikace proto

, kter je definovn jako souet intenzit pixel v regionu

mry intenzit studovanho vzorku (kanl

prmr, nebo medinvhodnj, protoe je robustnj k ppadnm

je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu

idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku ve

na zklad informac

velikost. Tento

je odhadovn pro kad spot

po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje

spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn

ur tvercov region kolem centra

kde se pedpokld

20 percentilu

kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne

ln mnostv hybridizovanch

regionu

mry intenzit studovanho vzorku (kanl

medin ppadnm

je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu

ve

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

region spot. V

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

Existuj rzn metody kvantifikace pozad

Obrzek

Vtina program pro analzu obrazu vyuv

principem je odhad intenzity

zobrazuje

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic

Metoda

spot, ze kterch pak

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v

tohoto novho obrazu.

(robustnj vi

Obrzek

Ve zmnn metody

studie naznauj, e intenzita signl

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

region spot. V analze se pak kvantifikovna hodnota pozad

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

Existuj rzn metody kvantifikace pozad

Lokln metoda

Morfologick oteven (

Konstantn/globln

Obrzek 5 Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu

Vtina program pro analzu obrazu vyuv

principem je odhad intenzity

zobrazuje regiony, kter

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic

Metoda morfologickspot, ze kterch pak

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v

tohoto novho obrazu.

(robustnj vi ppadnm loklnm extrmm

Obrzek 6 Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA

Ve zmnn metody

studie naznauj, e intenzita signl

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

analze se pak kvantifikovna hodnota pozad

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

Existuj rzn metody kvantifikace pozad

metoda (local background

Morfologick oteven (

Konstantn/globln metoda

Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu

Vtina program pro analzu obrazu vyuv

principem je odhad intenzity jako medin pixel

, kter pouvaj

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic

orfologickho otevenspot, ze kterch pak spoty odstran

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v

tohoto novho obrazu. Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln

ppadnm loklnm extrmm

Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA

Ve zmnn metody operuj s odhadem

studie naznauj, e intenzita signl

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

analze se pak kvantifikovna hodnota pozad

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

Existuj rzn metody kvantifikace pozad

local background

Morfologick oteven (morphological opening

metoda (constant/global background

Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu cDNA mikroipu.

Vtina program pro analzu obrazu vyuv

jako medin pixel

pouvaj ti rzn metody.

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic

oteven (obr. 6spoty odstran a vytvo

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v

Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln

ppadnm loklnm extrmm

Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA

operuj s odhadem

studie naznauj, e intenzita signlu na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

analze se pak kvantifikovna hodnota pozad

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

Existuj rzn metody kvantifikace pozad:

local background)

morphological opening

constant/global background

Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu cDNA mikroipu.

Vtina program pro analzu obrazu vyuv lokln metodu odhadu pozad. jako medin pixel z malch region v

rzn metody.

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic

(obr. 6) pouv tvercov

vytvo nov

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v

Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln

ppadnm loklnm extrmm).

Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA mikroipu.

operuj s odhadem signlu pozad v

u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

analze se pak kvantifikovna hodnota pozad

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

morphological opening)

constant/global background

Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu cDNA mikroipu.

lokln metodu odhadu pozad. malch region v

rzn metody. GenePix a QuantArray neberou v vahu

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranici spotu.

v tvercov element

nov obraz, kter je odhadem pozad celho

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v

Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln

Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA

pozad v okol spotu. Nicmn, nkter

u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

analze se pak kvantifikovna hodnota pozad obvykle odet

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

constant/global background)

Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu

lokln metodu odhadu pozad. malch region v okol spotu.

GenePix a QuantArray neberou v vahu

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

i spotu.

elementy o rozmrech nkolika

kter je odhadem pozad celho

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v

Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln

Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA

okol spotu. Nicmn, nkter

u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

obvykle odet od hodnot

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu

lokln metodu odhadu pozad. Jejm spotu. Obrzek

GenePix a QuantArray neberou v vahu

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

o rozmrech nkolika

kter je odhadem pozad celho

sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v centru spotu

Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln

Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA

okol spotu. Nicmn, nkter

u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy

Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence

od hodnot

signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit

finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.

Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu

Jejm

Obrzek 5

GenePix a QuantArray neberou v vahu

pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm

o rozmrech nkolika

kter je odhadem pozad celho

centru spotu

Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln

Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA

okol spotu. Nicmn, nkter

u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy

pro mRNA jinho organismu, ne pro kter je sklko ureno a kde by tedy nemlo vbec

dochzet k hybridizaci se vzorkem) bv ni ne v okol spot. Proto by hodnota pozad

mla bt spe odhadnuta jako konstanta pro vechny spoty (konstantn/globln metoda), nejlpe jako prmr intenzit spot negativn kontroly. V ppad, e tyto kontroly na sklku

nejsou, doporuuje se signl pozad odhadnout jako tet percentil rozdlen signl vech

spot.

Ne vichni se ale shoduj na tom, zda je nutno odetn pozad vbec provdt. Obecn se

uznv i postup, pi kterm se signl pozad vbec neodet.

Lokln a globln metoda odetn pozad m vt vliv na spoty s nzkou expres (a tedy

nzkm signlem), v porovnn s metodou morfologickho oteven nebo bez odetn, take

u tchto spot je obtn rozliit mezi opravdovm signlem a umem.

3.1.2 Parametry kontroly kvality

V idelnm ppad maj spoty stejnou velikost, jsou opravdu rovnomrn rozloeny, mra

hybridizace (ppadn nastaven skeneru) nevystila v saturaci pixel na spotech a segmentace

probhla bezchybn. Ve skutenosti to vak tak nen, a proto program analzy obrazu

generuje informaci o kvalit jednotlivch spot a jejich men.

Tyto informace jsou pak soust vstupn zkladn datov matice, a slou k vytvoen

promnn Flags, kter obsahuje kategorie kvality ve form kvalitativn promnn kdovan

obvykle celoselnmi hodnotami. Kategorie kvality jsou ureny na zklad pravidel bu

defaultn nastavench programem, nebo manuln uivatelem.

Parametry kvality nejastji zahrnuj:

Cirkularitu spotu

Poet pixel ve spotu

Prmr spotu (v pixelech)

Poet/procento saturovanch pixel

Pomr intenzity signlu a umu (pozad) anglicky signal to noise ratio

b-hodnotu: podl pixel pozad s intensitou men ne je medin intensity spotu

p-skre: jak velice se odliuje centrum spotu od skou pedepsan pozice

Program pro analzu obrazu obvykle nechv uivateli monost vizuln inspekce vsledku

segmentace a manulnho oznaen nekvalitnch spot. Pklady nekvalitnch a kvalitnch

spot ukazuje obrzek 7.

Obrzek

3.1.3 Zkladn datov matice

Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako

specifickm formtem, v zvislosti

jedna zkladn datov matice.

Napklad data z GenePix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

tabulkovm editorem.

Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl

experimentu a

spolen

reprezentuj rzn promnn.

identifikan slo

dal identifikace

pozice spotu na mikroipu

obvykl)

informace o

intens

medin, smrodatn odchylka)

intensita

medin, smrodatn odchylka)

dal odvozen charakteristiky

dvma kanly, )

Z dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn

signl spotu mezi kvantifikaci hodnot

rozmez

analzy proto tyto hodnoty

nuly se ped logaritmovanm

dvou kanl

Obrzek 7 A) Saturovan spot, B) Koblihov spot,

Zkladn datov matice

Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako

specifickm formtem, v zvislosti

jedna zkladn datov matice.

Napklad data z GenePix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

tabulkovm editorem.

Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl

experimentu a softvru

spolen pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

reprezentuj rzn promnn.

identifikan slo

dal identifikace

pozice spotu na mikroipu

obvykl)

informace o

intensita signlu spotu

medin, smrodatn odchylka)

intensita signlu pozad

medin, smrodatn odchylka)

dal odvozen charakteristiky

dvma kanly, )

dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn

signl spotu mezi kvantifikaci hodnot

rozmez 0 a 65 536

analzy proto tyto hodnoty

nuly se ped logaritmovanm

dvou kanl je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do

A) Saturovan spot, B) Koblihov spot,

Zkladn datov matice

Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako

specifickm formtem, v zvislosti

jedna zkladn datov matice.

Napklad data z GenePix softvru

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

tabulkovm editorem.

Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl

softvru pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace

pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

reprezentuj rzn promnn.

identifikan slo sondy na spotu

dal identifikace (pozice na chromozomu, symbol genu, ..)

pozice spotu na mikroipu

informace o kvalit spotu

ita signlu spotu

medin, smrodatn odchylka)

signlu pozad

medin, smrodatn odchylka)

dal odvozen charakteristiky

dvma kanly, )

dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn

signl spotu mezi dvma kanly.kvantifikaci hodnot svtlosti

65 536. Rozloen tchto hodnot je tedy

analzy proto tyto hodnoty transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva

nuly se ped logaritmovanm nahrazuje nula slem jedna

je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do

A) Saturovan spot, B) Koblihov spot, kruhovho tvaru

Zkladn datov matice

Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako

specifickm formtem, v zvislosti od typu pouitho softwaru

jedna zkladn datov matice.

softvru pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl

pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace

pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

Pro cDNA ipy to jsou zpravi

sondy na spotu

(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)

pozice spotu na mikroipu (bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je

spotu (viz 3.1.2

ita signlu spotu (pro vechny

medin, smrodatn odchylka)

signlu pozad (pro vechny

medin, smrodatn odchylka)

dal odvozen charakteristiky (logaritmus intenzit, logaritmus podlu

dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn

dvma kanly. Vzhledem ksvtlosti pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat

Rozloen tchto hodnot je tedy

transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva

nahrazuje nula slem jedna

je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do

A) Saturovan spot, B) Koblihov spot, C) Spot nekruhovho tvaru, D) kruhovho tvaru

Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako

typu pouitho softwaru

pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl

pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace

pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

Pro cDNA ipy to jsou zpravi

(vlastn kad mikroipov platform

(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)

(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je

viz 3.1.2 parametry kontroly kvality

vechny kanly) a odvozen

pro vechny kanly) a odvozen

(logaritmus intenzit, logaritmus podlu

dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn

Vzhledem k tomu, e

pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat

Rozloen tchto hodnot je tedy

transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva

nahrazuje nula slem jedna

je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do

C) Spot nekruhovho tvaru, D) kruhovho tvaru

Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako

typu pouitho softwaru. Pro kad mikroip

pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podle typu mikroipovho

pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace

pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

Pro cDNA ipy to jsou zpravidla:

(vlastn kad mikroipov platform

(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)

(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je

parametry kontroly kvality

kanly) a odvozen

kanly) a odvozen

(logaritmus intenzit, logaritmus podlu

dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn

tomu, e u mikroip dochz ke

pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat

Rozloen tchto hodnot je tedy siln zeikmen

transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva

nahrazuje nula slem jedna. Logaritmus pomru intensit spot

je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do dalch analz

C) Spot nekruhovho tvaru, D)

Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako textov soubor

. Pro kad mikroip

pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

e typu mikroipovho

pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace

pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

dla:

(vlastn kad mikroipov platform

(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)

(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je

parametry kontroly kvality)

kanly) a odvozen statistiky (stedn hodnota,

kanly) a odvozen statistiky

(logaritmus intenzit, logaritmus podlu

dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn logaritmus podlu intenzit u mikroip dochz ke

pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat

zeikmen zprava

transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva

Logaritmus pomru intensit spot

dalch analz

C) Spot nekruhovho tvaru, D) Kvalitn spot

textov soubor se

. Pro kad mikroip vznik

pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

e typu mikroipovho

pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace

pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

(vlastn kad mikroipov platform), ppadn i

(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je

(stedn hodnota,

(stedn hodnota,

(logaritmus intenzit, logaritmus podlu intenzit mezi

logaritmus podlu intenzit u mikroip dochz ke

pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat

zprava. Pro vechny

transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva. V ppad

Logaritmus pomru intensit spot

dalch analz. Oznauje

Kvalitn spot

se

vznik

pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix

pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo

pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace jsou

pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce

ppadn i

(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je

(stedn hodnota,

(stedn hodnota,

mezi

logaritmus podlu intenzit

pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat v

. Pro vechny

ppad

Logaritmus pomru intensit spot

. Oznauje se

, (1)

Kde R pedstavuje intensitu kanlu obsahujcho studovan vzorek (nejastji Cy5, tedy

erven) a G intensitu kanlu referennho vzorku (nejastji Cy3, tedy zelen).

Pklady zkladnch datovch soubor k nalezen zde:

GenePix [odkaz na soubor]

Agilent [odkaz na soubor]

3.2 Oligonukleotidov mikroipy

U jednokanlovch oligonukleotidovch mikroip je pouita pouze jedna vlnov dlka a

vytvoen je pomoc UV skeneru pouze jeden obraz. U Affymetrix mikroip je tento obraz ve

formtu DAT, a je zpracovn v softvru firmy Affymetrix.

3.2.1 Kvantifikace signlu

U tchto ip jsou vechny spoty tvercov a tesn plhaj, ke kontrole kvality

hybridizace (ve smyslu jej specificity) se proto pouv prov systm sond (na odhad pozad

jako u cDNA mikroip). Pro kad spot na ipu obsahujc sondu perfektn komplementarity

k clov sekvenci (anglicky perfect match probe, zkratka PM) existuje spot obsahujc stejnou

sondu, avak se zamnenm nekomplementrnm nukleotidem na 13 pozici (anglicky

mismatch probe, zkratka MM, obr. 2). Nekomplementrn sonda m intenzitu signlu

nespecifick hybridizace, kter v zvislosti od algoritmu kvantifikace me nebo nemus bt

zapotna do odhadu signlu sondy.

3.2.2 Parametry kontroly kvality Affymetrix softvr po analze obrazu svch GeneChip ip poskytuje nkolik parametr

kontroly kvality, a to

prmrn signl pozad variabilitu procento ptomnch sond (podle algoritmu Affymetrix) 3/5 pomr mra kvality RNA, vypotena jako pomr signlu sond kontrolnch

gen pro b-actin a GADPH

3.2.3 Zkladn datov matice

Kvantifikace intenzit probh pomoc specilnho Affymetrix softvru za vzniku zkladn

datov matice, kter se ukld do souboru s pponou .CEL. Tento soubor obsahuje

identifiktory a intenzity PM i MM spot (sond), spolu s dalmi informacemi o kvalit dat.

Tyto data obvykle doprovz soubor CDF, kter obsahuje dal informaci o sondch, a to

konkrtn, do kter sady sond pat a jestli je PM nebo MM.

Na rozdl od cDNA mikroip, spot (tedy sonda) reprezentuje pouze st clov sekvence,

proto pro dal analzy je potebn hodnoty sond ze kad sady sumarizovat. Podobn jako u

cDNA mikroip dochz k logaritmovn hodnot intenzit signl, avak pouze v jednom

kanlu. Hodnota M je potna specilnmi funkcemi s pomoc PM (a ppadn i MM). U

oligonukleotidovch mikroip tedy lze M definovat jako

,, (2)

Kde f pedstavuje funkci pslunou metodm MAS5, RMA nebo dChip, kter si popeme

ble ve vukov jednotce 3.

V nsledujc, tet vukov jednotce se budeme vnovat pravm zkladnch datovch matic,

od dalch kontrol kvality pes jejich normalizaci a po vytvoen finlnho datovho souboru.

Doporuen literatura

Yang, Y. H., Buckley, M. J., Dudoit, S. and Speed, T. P. (2001), Comparisons of methods for image analysis on cDNA microarray data. Technical report #584, Department of Statistics, University of

California, Berkeley.

Yang, Y. H., Buckley, M. J. and Speed, T. P. (2001), Analysis of cDNA microarray images. Briefings in bioinformatics, 2 (4), 341-349 [http://www.maths.usyd.edu.au/u/jeany/Papers/imagereviewBIB.pdf]

Draghici, S. (2001) Data Analysis Tools For DNA Microarrays. Chapman & Hall/CRC. Gentleman, R., Carey V.J., Huber, W., Irizarry, R.A., Dudoit, S. (2005). Bioinformatics and

Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. Springer.

McLachlan, G., Do, K., Ambroise, Ch. (2004). Analyzing microarray gene expression data. Wiley Series in Probability and Statistics. John Wiley & Sons, Inc.