Date post: | 31-Dec-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | wesley-pittman |
View: | 90 times |
Download: | 0 times |
Analytické metody
Vladimíra Kvasnicová
1. SPEKTROFOTOMETRIE
2. CHROMATOGRAFIE
3. POTENCIOMETRIE
4. VOLUMETRIE
Spektrofotometrie
spektrofotometr
Materiál používaný pro analýzu:
ROZTOK
PRINCIP
• interakce mezi stanovovaným analytem a
monochromatickým zářením
• část záření je absorbována
stanovovanou látkou, zbývající
záření je detekováno detektorem
• množství absorbovaného záření je přímo
úměrné množství analyzované látky
Spektrofotometrie je kvantitativní metoda:
stanovujeme
KONCENTRACI
koncentrace tmavší roztok absorpce
Důležité termíny
vzorek = analyzovaný roztok
neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci
standard = vzorek o známé koncentraci
blank = roztok neobsahující analyzovanou látku
chromofor = část struktury chemické látky,
která je schopna absorbovat
záření určité vlnové délky
fialová 380 – 450 nm
modrá 450 – 495 nm
zelená 495 – 570 nm
žlutá 570 – 590 nm
oranžová 590 – 620 nm
červená 620 – 750 nm
viz. http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum
Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum (2006)
Používané elektromagnetické záření
• barevné vzorky: viditelné (VIS)
• bezbarvé vzorky: UV záření
A /
„absorpční spektrum“
Komplementární barvy
SCHÉMA spektrofotometru
Které veličiny jsou měřeny?
TRANSMITANCE
= poměr intenzity záření vystupujícího z kyvety (I)
k intenzitě záření do kyvety vstupující (Io)
(tj. záření dopadající na detektor / původní záření)
T = I / Io
T = 0 – 1 nebo v procentech % (0 – 100 %)
Jak se vyjadřuje množství pohlceného záření?
veličina odvozená od transmitance: ABSORBANCE
A = - log10 T
= - log10 (I/I0) = log10 (I0/I) = log10 (1/T)
A = 0 – 1.0 (1.5 nebo více)
horní limit závisí na citlivosti detektoru
T prošlo (%) pohlceno (%) A
1 100 0 0
0.99 99 1 0.004
0.90 90 10 0.05
0.50 50 50 0.3
0.10 10 90 1.0
0.01 1 99 2.0
0.001 0.1 99.9 3.0
0.0001 0.01 99.99 4.0
T prošlo (%) pohlceno (%) A
1 100 0 0
0.99 99 1 0.004
0.90 90 10 0.05
0.50 50 50 0.3
0.10 10 90 1.0
0.01 1 99 2.0
0.001 0.1 99.9 3.0
0.0001 0.01 99.99 4.0
citlivosti detektoru
Zjištění koncentrace:
1. Lambert-Beerův zákon
2. Kalibrační křivka
3. Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorků
Zjištění koncentrace:
Lambert-Beerův zákon
A = x l x cnebo
T = 10- ( x l x c)
A = absorbance (A = -log T)
T = transmitance (T = 10-A)
= molární absorpční („extinkční“) koeficient
l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace
Kalibrační křivka
3 a více standardů
zpracovaných
stejnou metodou
lineární kalibrační
křivka
A = x l x c y = kx + q
Výpočet pomocí standardů
Ast = cst x l x Avz = cvz x l x
Ast / cst = l x Avz / cvz = l x
l x = l x
Ast / cst = Avz / cvz
cvz = Avz x (cst / Ast)
cvz = Avz x f
f = průměr všech (cst / Ast) použitých při experimentu
Cvičení1) Avz = 0,25 Cvz = ?
Ast = 0,40 Cst = 4mg / L
2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49.
neznámý vzorek: T = 0,55, Cvz = ? (v mg/L i mmol/L)
MW = 180g
3) standard proteinů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44
Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se
standardem.
Přesnost stanovení
absorpce ostatními látkami přítomnými
ve vzorku musí být eliminována:
BLANK (slepý pokus)
→ jeho absorbance se odečte od absorbance
vzorku výsledná absorbance odpovídá pouze
koncentraci analyzované látky
Spektrofotometrie v praktickém cvičení
„Stanovení koncentrace kreatininu v moči“
analyzovaný vzorek: vlastní moč
1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný
produkt chemickou reakcí
2. koncentrace kreatininu ve vzorku se
zjišťuje z naměřené absorbance pomocí
kalibrační křivky
Chromatografie
chromatograf
Všechny
chromatografické
techniky nejsou
instrumentální...
TLC chromatografie = úkol v praktiku
PRINCIP
Separace směsi různých látek je založena na
rozdílné distribuci látek mezi dvě
nemísitelné fáze:
• stacionární fáze (pevná nebo kapalná)
• mobilní fáze (kapalná nebo plynná)
Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázi
rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.
• pokud je „afinita“ látky k mobilní fázi vysoká,
látka putuje systémem rychleji než látka
s nižší afinitou
• pokud je „afinita“ látky ke stacionární fázi
vysoká, látka je ve stacionární fázi déle
zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji
než látka mající nižší afinitu
Obrázek převzat z http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006)
Co je cílem analýzy?
1. rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky
2. identifikovat látky (= kvalitativní analýza)
3. stanovit koncentraci přítomných látek
(= kvantitativní
analýza)
Klasifikace chromatografických technik
1) podle mobilní fáze
kapalinová chromatografie (LC)
plynová chromatografie (GC)
2) podle uspořádání
planární (rovinná) chromatografie
chromatografie v koloně
kapalinová
v koloně
„manuální“
chromatografie
kapalinová
v koloně
„instrumentální“
chromatografie
kapalinová planární
chromatografie
příklad:
Plynová chromatografie (GC)
Obrázek převzat z http://www.cofc.edu/~kinard/221LCHEM/ (listopad 2006)
3) podle fyzikálně-chemických interakcí
adsorpční chromatografie
rozdělovací chromatografie
gelová permeační chromatografie (GPC)
chromatografie na iontoměničních (IONEX)
afinitní chromatografie
Fyzikálně-chemické mechanismy separace
adsorpce rozpouštěnísítový efekt –
gelová chromatografie
iontová výměnaspecifická interakce-
afinitní chromatografieSnímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Vyhodnocení chromatogramu
Porovnání skvrn se
standardy:
Rf = a /b
Rf = retardační faktor
(„rate of flow“)
a = vzdálenost start-střed skvrny
b = vzdálenost start-čelo mobilní f.
1) planární chromatografie (př. TLC)
„b“
„a“
Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)
2) chromatografie v koloně (HPLC, GC)
Porovnání „píků“ se
standardy:
tR = retenční čas
identifikace látek
h = výška píku
koncentrace látek
„píky“
Chromatografie v praktickém cvičení
„ TLC lipofilních barviv“
= adsorpční planární kapalinová chromatografie
• mobilní fáze: toluen (nepolární)
• stacionární fáze: destička se silikagelem (polární)
• stadardy barviv → porovnání Rf
• neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva
„Demonstrace HPLC a GC“
HPLC
= High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
• normální nebo reverzní fáze• princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.)
GC
= Gas Chromatography(plynová chromatografie)
Potenciometrie
potenciometr
PRINCIP
Potenciometrie je elektrochemická metoda
založená na měření napětí elektrochemického
článku za bezproudého stavu.
dvě elektrody:
• indikační (měřící) elektroda
• referentní (srovnávací) elektroda
Schéma:
Elektrody
indikační elektrodajejí potenciál závisí na složení roztoku
referentní elektrodajejí potenciál je stabilní (konstantní, známý)
Měřit přímo potenciál jako takový nelze měříme rozdíl potenciálů (=napětí)
indikační elektrodyObrázek převzat z http://food.oregonstate.edu/images/ph/beck8.jpg (2006)
Nernstova rovnice
E = E0 + (RT/nF) ln aM
E = elektrodový potenciál
E0 = standardní elektrodový potenciál
R = molární plynová konstanta (8.314 J K-1 mol-1)
F = Faradayova konstanta (96 458 C mol-1)
T = absolutní teplota (25 0C = 298 K)
n = náboj stanovovaného iontu (M)
a = aktivita stanovovaného iontu
E = E0 + (RT/nF) ln aM
ln a = 2.303 log a; dosazeno za R, T a F
E = E0 + (0.059/n) log aM
! DŮLEŽITÉ !• elektrodový potenciál závisí na teplotě roztoku,
aktivitě („koncentraci“) a náboji stanovovaného iontu
• elektrodový potenciál nepotřebujeme počítat: ke kalibraci potenciometru používáme standardy
Obecná klasifikace elektrod
1) elektrody I. druhu (kovové nebo plynové)
2) elektrody II. druhu (kov + jeho nerozpustná sůl)
→ REFERENTNÍ ELEKTRODY
3) redoxní elektrody (Pt, Au)
4) membránové elektrody
→ ISE = iontově selektivní
elektr.
(stanovení iontů v medicíně: H+, Na+, K+, Cl-,...)
„Standardní vodíková elektroda“ (SHE)
• plynová elektroda
• její potenciál byl definován: ESHE = 0
za všech podmínek
REFERENTNÍ ELEKTRODA, ale v praxi se běžně nepoužívá
Referentní elektrody
kalomelová argent-chloridová
SHE
„Skleněná elektroda“
= ISE (H+)
stanovenípH
membránová electroda
Membránové elektrody na stanovení plynů
skleněnáelektroda
referentníe lektroda
tě losensoru
vnitřníe lektro lyt
perm eabilním em brána
analyzovanéprostředí
skleněnáelektroda
CO (g)2
perm eabilním em brána
analyzovanéprostředí
film e lytu
pH-m etr
CO +H O HCO +H+2 2 3-
elektroda používaná na stanovení CO2 v krvi
Potenciometrie v praktickém cvičení
„ Měření pH fosfátového pufru“
• roztoky fosfátového pufru o různém složení
• stanovení pH pomocí pH-metru
(= upravený potenciometr)
• kalibrace přístroje pomocí standardů
• skleněná kombinovaná elektroda („dvojče“)
Skleněná kombinovaná
elektroda
vnějšírefeferentníelektroda
stínění – přívodk vnější ref.elektrodě
vnitřní vodič – přívodk vnitřní ref.elektrodě
plnicíotvor
vnitřní referentníelektroda
solný můstek ( keramická frita)
skleněnámembrána
Skleněná kombinovaná
elektroda v praktiku
Volumetrie (= titrace, odměrná analýza)
Metoda založená na chemické reakci mezi analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem
byretas odměrným
roztokem
titrační baňka s naředěnýmanalyzovaným vzorkem
titrace= zjištění přesné
koncentrace vzorku
PRINCIP
K analyzované látce se pomocí byrety postupně přidává
roztok o známé koncentraci, a to tak dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického
poměru reagujících látek (= bod ekvivalence)
bod ekvivalence= reagující látky jsou ve stechiometrickém poměru daném chemickou rovnicí popisující probíhající reakci
Odměrný roztok (OR)
• známé, přesně definované složení
• jeho koncentraci lze přesně stanovit pomocí
stadardu o známé a neměnné koncentraci
• reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez
vedlejších reakcí
• reakci lze popsat chemickou rovnicí
• v bodě ekvivalence dochází „skokem“
k fyzikálně-chemické změně, kterou je možno
snadno indikovat
Zjištění přesné koncentrace OR
• titrací standardu o přesně známé koncentraci• porovnání teoretické (předpokládané, vypočítané)
spotřeby se skutečnou (aktuální, titrací zjištěnou):
Vt / Va = f
• f = faktor odměrného roztoku (0,900 – 1,100)
• aktuální konc. OR (= titr): ca = f x ct
• faktorem při výpočtu koncentrace vzorku násobíme teoretickou hodnotu koncentrace OR
Výpočet koncentrace vzorku
• založen na znalosti stechiometrie chemické reakce
a A + b B → c C + d D
a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n)
A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka
a / b = n(A) / n(B)
a / b = n(A) / n(B)
c = n / V → n = c x V
c = molární koncentrace (mol/l)
n = látkové množství (mol)
V = objem roztoku
a, b = stechiometrické koeficienty
a x n(B) = b x n(A)
a x cB x VB = b x cA x VA
a x cB x VB = b x cA x VA
• známe stechiometrii chemické reakce • známe koncentraci odměrného roztoku a jeho
objem spotřebovaný při dosažení bodu ekvivalence
• známe objem vzorku použitého pro analýzu
jediná neznámá je koncentrace vzorku
cB
Cvičení
1) spotřeba odměrného roztoku: 23,8 ml NaOH,(f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H2SO4; C = ?
2) spotřeba odměrného roztoku: 10ml KMnO4 (0,1M), vzorek: 20ml FeSO4 ; C = ? (mol/ L, % ),
MW = 152g
3) H3PO4 → Na2HPO4
vzorek: 20ml H3PO4 (C = 0,3M ), odměrný roztok: 0,2M NaOH V = ?
Titraci provádí jedna osoba:po kapkách přidává OR z byrety
za stálého promíchávání obsahu titrační baňky
Indikace bodu ekvivalence
1) pomocí indikátoru jednoduché, ale subjektivní hodnocení bod ekvivalence objemu OR po jehož přidání
změní titrovaný roztok trvale své zbarvení indikuje „první nadbytečnou kapku“ přidaného OR
ve skutečnosti je při změně zbarvení roztok „přetitrován“
2) pomocí přístroje (např. potenciometru) objektivní vyhodnocuje se TITRAČNÍ KŘIVKA
Titrační křivkatitrace kyseliny hydroxidem
odměrný roztok
indikátoryměřená veličina
titrace hydroxidu kyselinou
odměrný roztok
Klasifikace titrací
1) neutralizační (acidobazické) kyselina /báze• H+ + OH- → H2O
2) oxidačně-redukční (redox) ox./red. činidlo• oxidace: red → ox + e-
• redukce: ox → red + e-
3) srážecí př. AgNO3
• vznik nerozpustné sraženiny
4) komplexometrické př. EDTA• vznik koordinačně-kovalentní sloučeniny
Titrace v praktickém cvičení
„Stanovení acidity žaludeční šťávy“
• reaguje HCl ze žaludeční šťávy
• odměrný roztok: NaOH
→ neutralizační titrace (= alkalimetrie)
• indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový)
• z konc. HCl se vypočítá pH žaludeční šťávy
• zjišťuje se pH před a po stimulaci
(= na lačno a „po jídle“)
Návody na praktika+ teorie metod:
http://www.lf3.cuni.cz/chemie/
viz. Studium / praktika