31
Analýza proteinů SDS PAGE elektroforézou
Analýza proteinů SDS PAGE elektroforézou
http://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4&feature=fvwrel
http://www.youtube.com/watch?v=pnBZeL8nFEo
Molekulárně biologická diagnostika
Diagnostika na úrovni DNA, RNA a proteinů
Analýza genomu, transkriptomu, proteomu, příp. metabolomu
Analýza kvalitativní i kvantitativní
Studium přítomnosti proteinů v Studium přítomnosti proteinů v buňkách (analýza proteomu)buňkách (analýza proteomu)
Metody pro stanovení fyzické přítomnosti proteinů:
• polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE)• westernový přenos• imunoprecipitace• imunohistochemie• izoelektrická fokusace• dvourozměrná elektroforéza v
polyakrylamidovém gelu• chromatografie• fluorescenční a elektronová mikroskopie• průtoková cytometrie
Nejpoužívanější techniky - proteiny Elektroforéza
– 1D– 2D
ELISA Rentgenová krystalografie NMR Hmotnostní spektroskopie Chromatografie (HPLC)
SDS-PAGE(= sodium dodecylsulphate-
polyacrylamide gel electrophoresis)
-metoda pro separaci proteinů dle jejich velikosti
Proč používat akrylamidový gel k separaci proteinů?
Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix
Ideální pro separaci proteinů
Menší velikost pórů než u agarosy
Proteiny jsou menší než
intaktní chromoz. DNA
Gel je vytvořen polymerací akrylamidu a N´,N´-methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného.
Molekulová hmotnost proteinů
velikost měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kDa)
Dalton = jednotka atomové hmotnosti
= přibližně se rovná hmotnosti (1,66 x
10 -27 g)
Průměrná aminokyselina = 110 Da
Průměrný nukleotidový pár = 649 Da
Akrylamidový gel
akrylamid
N,N‘ - methylenbisakrylamid
Akrylamidový gel
Katalyzátor TEMEDN,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiaminCAS 110-18-9
Zdroj volných radikálů APS
amonium persulfát (NH4)2S2O8
(peroxodisíran amonný)
CAS 7727-54-0
Akrylamidový gel
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
•SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent
–solubilizuje a denaturuje proteiny
–dodává proteinům negativní náboj
Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu
•Zvýšená teplota denaturuje
proteiny
O
S
O
O
O
-
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH3
SDS
-proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti
Separace proteinů v akrylamidovém gelu
Příprava gelu
Jednotlivé kroky experimentu
*Příprava polyakrylamidových gelů*Příprava vzorků pro SDS-PAGE*Povaření vzorků při 95C po dobu 4 min. *Aplikace vzorků na gel *Vlastní elektroforesa probíhá při konstantním napětí *Barvení gelu pomocí Coomassie Blue vs blotting *Odbarvení gelu MetOH/HOAc
Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE?
*Tris pufr utváří vhodné pH*DTT (100mM)*SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující proteinům negativní náboj*Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení *“Bromophenol Blue“ barvivo umožňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)
Praktické zhotovení gelu
Připravíme ELFO skla Složíme elektroforetické komůrky pro nalití gelů Připravíme základní roztok pro dělicí gel, přidáme k němu
TEMED a APS pro zahájení polymerace Naneseme gel do elektroforetické komůrky, zarovnáme
hladinu redestilovanou vodou a necháme tuhnout (min. 45 min).
Připravíme roztok pro zaostřovací gel, přidáme k němu TEMED a APS
Nanášíme jej do elfo komůrky na povrch dělicího gelu a vsadíme hřeben pro vytvoření jamek a necháme jej tuhnout (min. 45 min)
Odstraníme hřeben, uvolníme elfo komůrky s gelem
Do elektroforetické nádoby nalejeme elfo pufr Stojan s elfo komůrkami s připravenými gely vložíme do elfo
nádoby, doplníme elektroforetický pufr Naneseme vzorky (před nanášením se musí povařit se
vzorkovým pufrem při 90-100C po dobu 5 min)
Doplníme elfo pufr a zapneme zdroj (80V po 0,5-1hod, 120 V po 1-1,5 hod)
Ukončení elektroforézy po doběhnutí elfo barviva na konec dělicího gelu
Rozděláme elfo komůrky, vyndáme gely a: - barvíme - přeneseme proteiny na nitrocelulózovou membránu a
blotujeme…
SDS-PAGE standardy
Protein Kalibrované MW v Tris-HCl gelu
Myosin 201,179 -galactosidáza 120,284 Bovinní sérový albumin 100,236 Ovalbumin 55,925 Anhydráza 38,289 Soyben trypsin inhibitor 29,678 Lysozym 20,669 Aprotinin 6,969
Denaturované vzorky jsou naneseny na gel
Podmínky pro elektroforézu:
•15 min, 100 V
•1 – 1,5 hod 150 V
Princip dělení, Laemliho pufrový systém
Různé pH „stacking“ a „resolving“ gelu
Tris-Cl pufr, glycinový running pufr
Iontové složky Laemliho systému
Glycin → nižší pohyblivost než Cl- ionty
↑ odpor v Gly oblasti Ohmův zákon V=I*RStejné I → ↑ V
SDS-proteiny - mobilita mezi Gly - Cl-, „chyceny“ a zaostřovány v tenké
oblasti gradientu el. napětí
Zvýšení mobility Gly iontů v pufru o vyšším pHPohybují se před komplexy SDS-protein
Snížení mobility proteinů v důsledku vstupu do koncentrovanějšího gelu
Dělení proteinů na základě jejich velikosti (molekulární hmotnosti)
Iontové složky Laemliho systému
glycin
Nativní PAGEBlue Native (BN)-PAGE - využívá Coomassie blue → negativní náboj, nedenaturační Clear Native (CN)-PAGE - nedenaturační,dělení proteinů na základě náboje, velikosti a konformace→ kombinace různých pufrů a gelů
Acidický Erytropoetin vystaven působení vyšší teploty → dimerizace
Spojení BN a SDS-PAGE
- analýza komplexů
K vizualizaci proteinů dochází v roztoku Coomasie blue.
25 kDa
20 kDa
15 kDa
50 kDa
37 kDa
10 kDa
75 kDa
Redukující PLB (5% merkaptoethanol), 3 µl vzorku s pufrem 1:1 15 % gel, 150V, 57 min, Marker – BioRad #161-0374, dual color, 1 µl,
Barvení stříbrem
