KATEDRA SPECIÁLNÍ PRODUKCE ROSTLINNÉ září 2014
prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D.Jihočeská univerzita v Českých BudějovicíchZemědělská fakulta, Katedra speciální produkce rostlinnéNa Sádkách 1780, 370 05 České Budějovice
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlinŘepka
Cíle a perspektivy šlechtění řepky ve vztahu k RB• využití metody androgeneze in vitro pro tvorbu homozygotních (izogenních) linií• možnost produkce haploidů androgenezí in vitro• podstatné zkrácení šlechtitelského procesu• rychlejší získávání výchozího šlechtitelského materiálu pro tvorbu nových odrůd• sekundární SE pro rychlé namnožení vybraných genotypů• vypracování metod selekce in vitro na buněčné úrovni a manipulace s protoplasty -
odolnost chorobám, změna spektra mastných kyselin, barva osemení...• možnost indukce vzniku mutantů a využití techniky TILLING• fúze protoplastů a technika embryo-rescue - tvorba resyntetizované řepky• možnost konstrukce zcela nových genotypů kulturních rostlin – GMO technologie
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• Řepka olejná je naší nejdůležitější olejninou, tento druh (resp. taxon, který
se pěstuje jako olejnina - Brassica napus subsp. napus) je spontánnímamfidiploidem, vzniklým na základě vzdálené hybridizace B. oleracea aB. campestris (B. rapa oleifera).
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
• B. napus• (řepka, canola, tuřín)• AACC 1200 Mb
• B. oleracea• (brokolice, zelí, květák,
růž. kapusta, kai-lan atd.)• CC 650 Mb
• B. rapa• (čínské zelí,
vodnice atd.)• AA 550 Mb
• B. juncea• (brukev sítinovitá/
hořčice sareptská)• AABB 1150 Mb
• B. carinata• (brukev kýlnatá/
hořčice habešská)• BBCC 1250 Mb
• B. nigra• (brukev černá/• hořčice černá)• BB 600 Mb
„triangle of U“Woo Jang-choon, 1935 (Nagaharu U)Morinaga (1934), U (1935)
Využití metod in vitro ve šlechtění řepkyTrendy ve šlechtění a šlechtitelské cíle:
• VÝNOS řepkového semene/oleje– výnosová stabilita– tolerance k abiotickým stresům (chladová/mrazová tolerance, suchovzdornost, využití živin
- NUE)– rezistence chorobám a škůdcům (Phoma, Cylindrosporium, Verticillium, Plasmodiophora,
Sclerotinia)• KVALITA oleje/pokrutin
– 00 kvalita (potravinářské využití oleje)– bio-nafta, oleochemie– odrůdy se specifickou skladbou MK (High oleic acid – Holl, High erucic acid – HEAR,
HELP...)– specifické využití v potravinářství – „zdravé potraviny“ (MK, protein), žlutosemennost
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Význam řepky, šlechtitelské cíle:
• značný nárůst pěstování řepky a spotřeby/konzumace řepkovéhooleje v ČR/Evropě od 70. let 20. století
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• Hlavní šlechtitelskou metodou je kombinační křížení a získání značně
široké genetické variability - výběry, hodnocení...
• Nové 00 řepky mají většinou základ v liniovém šlechtění, tím dochází alemnohdy k zúžení genetické základny odrůd a značná část výkonných odrůdje si dosti podobných
• Heterozní šlechtění – nesmírně významný trend, produkce hybridů jezaložena na systémech samčí sterility a autoinkompatibility
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• Z hlediska biologie kvetení patří B. napus k cizosprašným druhům, u
současných odrůd ale většinou již převažuje podíl samosprašných typů.Nicméně jistou cizosprašnost a tím i přítomnost „různých“ genotypů je třebamít na zřeteli i při odvozování tkáňové kultury - protože mnohé jevy in vitrojsou genotypově podmíněné a ne všechny genotypy dané odrůdy reagujístejně.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Hybridní šlechtění:
V současné době se pěstitelé řepky stávají svědky nádhernéhodobrodružství, počátku nové epochy v historii této kultury -zavádění hybridní řepky z laboratoří a pokusných políček naběžné plochy naší zemědělské praxe.
P. Baranyk, 1996
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Hybridní šlechtění:
Počátky hybridního šlechtění a systémy používané pro tvorbu hybridů
• Ogu-INRA (1968 – 1983) – kompozitní hybridy – 1994 (v ČR 1998)– komplexní a tříliniové hybridy– restaurované hybridy – 2000 (v ČR 2003)
• MSL Lembke (1982) – první hybridy v r. 1995 (v ČR 1998)• GMS SAFECROSS – Syngenta – 2007 (v ČR 2008)
• Prof. Fu Ting-Dong – tříliniový hybrid na bázi AI – 1975– ”0” hybrid na bázi Pol CMS – 1985
(1972 objevena CMS Pol)
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Hybridní šlechtění:
• Předpoklady pro úspěšné šlechtění hybridních odrůd... již na počátcích hybridního šlechtění jako klíčové bodybyly zmiňovány:• existence stabilního genetického systému zabraňujícího
samosprášení• dostupnost elitních genotypů poskytujících vysokou
heterozi• účinný přenos pylu mezi rodiči v polních podmínkách
• Řada teoretických studií, vývoj strategií pro hybridní šlechtění, komerční ověřování produkce osiva… v 80. ana počátku 90. let 20.stol.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• stabilizace a získání sterilních komponent systému Ogu-INRA = vzdálená
hybridizace, fúze protoplastů, SE, resyntéza, embryo-rescue techniky
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• Vzhledem k biologii kvetení, AI, určitému podílu cizosprašnosti, obtížně
geneticky založené rezistenci vůči chorobám, problematické možnostipřenosu CMS lze mnohé cíle jen velmi těžko dosáhnout jen při využitíklasických metod šlechtění.
• Biotehnoologické metody (jak KRE in vitro, tak i metody GI) by mělyvhodným způsobem napomoci překonat tyto obtíže a pomoci urychlit azkvalitnit šlechtitelský proces.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepkyVyužití biotechnologických metod lze spatřovat v:• rychlém namnožení materiálů cestou mikropropagece in vitro
– množení elitních rostlin - a získání geneticky uniformního potomstva, které může položit základ nové odrůdě - bez nebezpečí cizího sprášení při množení elitních rostlin nebo rodin,
– tvorba a množení materiálů pro syntetické odrůdy,– množení linií - 00 řepky,– množení materiálů pro testy rezistence
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• získávání homozygotních linií cestou androgeneze in vitro• jeví se jako velmi perspektivní metoda tvorby homozygotních linií, mnohem
rychlejší než klasickou cestou samosprašování rostlin• D.H. rostliny lze namnožit mikropropagací a využít v mutačním šlechtění,
rezistentním šlechtění, nebo zařadit do klasikého výběrového postupu,resp. do fáze zkoušení a výběru nejvýkonnějších potomstev
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• explantátové kultury řepky mají velkou perspektivu v oblasti mutačního
šlechtění - relativně jednoduchá identifikace mutantů, možnost namnoženímateriálů
• využití v rezistentním šlechtění - vytvoření selekčního systému in vitro -aplikace toxických látek (herbicidů, filtrátů Phoma, Sclerotinia, černí, plísní)- selekce buněk, které in vitro vykazují odolnost/zvýšenou toleranci
• problém bývá ale ten, že fenotypová proměnlivost indukovaná v in vitrokultuře je často nestabilní v dalších generacích a na úrovni celistvé rostlinyse nemusí projevit
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Genetický výzkum:
• TILLING
reverzni genetika(od znameho genu k fenotypu)
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepky• velmi perspektivní oblastí je využití metod GI u řepky - vnášení cizorodé
DNA pomocí A.t. nebo přímo do protoplastů, - geny rezistence glyfosátu adalším herbicidům, resistence hmyzím škůdcům (gen pro delta-endotoxinB.t.), změněná skladba aminokyselin v proteinu, změna skladby mastnýchkyselin v oleji
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Mikropropagace in vitro• První práce se týkaly rychého množení řepky pomocí internodálních řízků
(růst in vitro - řízkování - kořenění na mediu - převod do půdy).• V současné době se využívá regenerace rostlin z meristémů -
nejarovizovaných apikálních nebo axilárních meristémů, převod do in vitropodmínek na MS médiu - regenerace rostlin, rostlinky s pak převádí nakořenící médium a do půdy.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Mikropropagace in vitro• Regenerace rostlin cestou SE - rod Brassica je jeden z mála taxonů, kde
se vyskytuje sekundární SE• Sekundární somatická embrya (embryoidy) vznikají z epidermálních buněk
hypokotylu, z buněk somatických embryí, květních primordií, zygotickýchembryí. Z 20 - 60 % se vyvíjí v normální rostliny.
• Tuto metodu je možné využít k vegetativnímu množení žádoucíchgenotypů. Pokud se jedná o přímou SE, bez mezistádia kalusu, např.tvorba embryoidů na mladých hypokotylech nebo zygootických embryích, jezachována genetická identita a uniformita vzniklého potomstva. Zjištěnávariabilita mezi regenerovanými rostlinami pak nepřevyšuje variabilitu přiklonovém množení.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Kalusové a buněčné kultury, regenerace rostlin• Při kultivaci kalusů dochází ke zvýšení genetické variability, uvažuje se o
využití selekčně - mutačního systému in vitro.• K odvození kalusů dochází z listových segmentů, stonků i meristémů, částí
kořenů.• Regenerace rostlin v kalusové kultuře může probíhat cestou organogeneze
nebo SE. I v případě SE se v kalusové kultuře projevuje se větší úroveňgenetické variability u regenerovaných rostlin - buňky, ze kterých seembryoidy vyvářely jsou značně heterogenním systémem. Projevují secytologické, biochemické odchylky u regenerovaných rostlin, nárůst (širší)genetická a epigenetická variabilita.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Buněčné a protoplastové kulturyBuněčné kultury:• roztřepání kalusu v tekutém médiu, lze je použít v selekčním nebo
mutačně-selekčním systému in vitro - nutné pro tento postup je ověřený astabilní regenerační systém, jako nejvhodnější se jeví embryogenní genotyp- embryogenní kalus dává i „stabilní“ embryogenní suspenzní kulturuschopnou regenerace.
Protoplastové kultury:• úroveň regenerace rostlin z protoplastů je velice nízká, lze provádět různé
manipulace s protoplasty - tvorba syntetické řepky - fúze protoplastůpůvodních druhů. Cytoplasmatická hybridizace - do cytoplasmy Raphanusse přenášejí jádra B. campestris, B. napus (přenos CMS).
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Využití metod in vitro ve šlechtění řepkyEmbryokultury: • opět využití k dopěstování hybridních embryí po vzdálené hybridizaci -
B. napus x Raphanus sativus - přenos CMS, resyntéza řepky
• technika embryo rescue
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Embryokultury a protoplastové kultury• fúze protoplastů a tvorba resyntetizovaných genotypů
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
• embryo rescue – dopěstováníhybridních embryí pro vzdálenéhybridizaci
Genetický výzkum:
• hexaploidní řepka
Producing inter-specific hybrids between Brassica juncea (L.) Czern & Coss and B. oleracea (L.) to synthesize trigenomic (ABC) Brassica
Successful induction of trigenomic hexaploids from triploid hybrid of Brassica napusL. and B. nigra (L.) Koch
Breeding “Super Brassica” cultivars at hexaploid level
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Androgeneze in vitro• Pylová embryogeneze - vytváření haploidních embryí v prašníkové nebo
mikrosporové kultuře.
• Prašníkové kultury jsou jednodušší, pro stimulaci tvorby embryí se využívákultivace při vyšších teplotách (30-35°C), výběr embryogenních genotypů.Většinou jsou embryoidy - a posléze haploidní rostliny - získávány odjarních řepek, u ozimých je produkce haploidních embryí/rostlin nižší.
• Druhým způsobem získávání androgenetických haploidních (a pokolchicinaci diploidních - dihaploidních - double haploidních) linií jenavození pylové embryogeneze v pylové kultuře, tj. kultuře mikrospor.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Androgeneze in vitro
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Androgeneze in vitro
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
• využití biotechnologií – indukce tvorby haploidů a získávánídihaploidních rostlin
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Regenerace in vitro - organogeneze
Regenerace in vitro - organogeneze
Regenerace in vitro - embryogeneze
Regenerace in vitro - embryogeneze
Regenerace in vitro – embryogeneze a sekundární embryogeneze
Androgeneze in vitro• Kultury mikrospor.• Výhody této metody spočívají zejména ve zvýšení průměrného výnosu
embryí/rostlin na prašník (u kultur prašníků 0-8 embryí na nasazený prašníka u kultur mikrospor 80-200 na prašník), v odstranění interakcí prašníku smikrosporou (pylovým zrnem), snížení pracnosti, odstranění nebezpečíregenerace rostlin z diploidních pletiv prašníku a nitky. I tak zůstávávýtěžnost haploidních rostlin velmi malá - v prašníku je kolem 17000mikrospor.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Androgeneze in vitro• Kultury mikrospor.• Kritickým faktorem ovlivňujícím produkci embryí je kromě genotypu zřejmě i
počet prašníků/mikrospor v 1 ml média. Produkce haploidních embryí jezávislá i na dalších faktorech - fyziologický stav rostliny, místo odběruprašníků, fáze zralosti pylu (střední až pozdní jednojaderná fáze), chladovépředpůsobení. Optimalizací složení kultivačního média lze dosáhnout imasové tvorby sekundárních embryí - množení haploidní linie, regeneracerostlin ze získaných embryí je v 50 - 90 % úspěšná.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Androgeneze in vitro• Kultury mikrospor.• Mikrospory lze i uchovávat - metoda kryoprezervace suspenze mikrospor -
odstranění sezónnosti práce (pěstování rostlin ve skleníku, pozdní výsevy...a další způsoby roztažení pracovní špičky, kdy řepka kvete nevedou kúspěchu, v případě odběru prašníků v jinou dobu než je obvyklá dobakvetení slně snižuje schopnost regenerace).
• U regenerovaných rostlin se provádí cytologická kontrola počtuchromozómů - selekce na haploidní počet. Diploidizace haploidních rostlin -máčení mladých květních stonků v kolchicinu, injekce k vrcholovémumeristému – nyní byly tyto postupy nahrazeny používáním blokátorů tvorbyachromatického vřeténka přímo do kultivačního media.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Androgeneze in vitro• Kultury mikrospor.
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
Biotech canola, GM řepka
Biotechnologické metody ve šlechtění rostlin
Řepka
