Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii

Výuková prezentace z:Lékařské mikrobiologie

Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009

• Soubor znaků s rozdílnou diskriminačníhodnotou

• Základní problémy– Minimum morfologických znaků– Podobné antigeny– Genomová nestabilita – mutace, plasmidy

Princip identifikace

• Přímá diagnostika– Přímý průkaz přítomnosti mikroba (kultivace)

nebo jeho částí (antigen, DNA)

• Nepřímá diagnostika– Průkaz specifické imunitní reakce proti

mikrobovi (specifické protilátky)

• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

Principy diagnostiky

• Přímé diagnostické metody– Odběr z postiženého orgánového systému –

ideálně pouze málo invazivní (stěr z tonsil, sputum, krev, moč, mozkomíšní mok)

• Nepřímé diagnostické metody– Průkaz protilátek v séru, vzácněji např. v

mozkomíšním moku

• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ODBĚR

Odběr materiálu

• Klasické metody přímé diagnostiky– Mikroskopické vyšetření– Kultivační vyšetření

• Pokročilé metody přímé diagnostiky– Specifické testy– Biochemické testy– Detekce antigenu– Citlivost k ATB

• Moderní metody přímé diagnostiky– Detekce DNA

Přímá diagnostika

• Světelná mikroskopie– Nativní (nefixované a nebarvené

preparáty) pozorované fázovým kontrastem nebo v zástinu – slouží jen k popisu základní morfologie

– Fixované a barvené preparáty• Rozdělení podle vlastností buněčné stěny

– Gramovo barvení (Gram pozitivní a negativní)– Ziehl-Neelsenovo barvení (Acidorezistentní)

Klasická přímá diagnostika

Klasická přímá diagnostika

VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE BAKTERIE A MIKROSKOPIE

• Kultivace na kultivačních půdách– Obecné kultivační půdy – roste na nich většina

mikrobů– Selektivní kultivační půdy – jsou vhodné pro růst

konkrétního skupiny nebo druhu– Diagnostické kultivační půdy – lze jimi prokázat

určitou vlastnost mikroba (zkvašování cukru)– Speciální kultivační půdy – vhodné k růstu náročných

druhů, které nelze běžně kultivovat– Na pevných půdách (agarech) hodnotíme morfologii

kolonií, na tekutých (bujónech) typ růstu

Klasická přímá diagnostika

Klasická přímá diagnostika

VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE KULTIVACE

• Mikroskopické a kultivační vyšetření– Výhody

• Snadné• Levné• Není náročné na technické vybavení

– Nevýhody• Vyžaduje interpretaci zkušeným pracovníkem

Klasická přímá diagnostika

• Specifické testy– Po interpretaci výsledků mikroskopického a

kultivačního vyšetření– Odliší od sebe příbuzné a vzájemně podobné

mikroby– Jsou založeny na specifických chemických

vlastnostech či kultivačních podmínkách• Chemické vlastnosti – průkaz oxidázy, katalázy• Kultivační vlastnosti – CAMP, satelitismus,

rozpustnost ve žlučových solích

Pokročilá přímá diagnostika

Pokročilá přímá diagnostika

VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

• Biochemické testy– Jsou založeny na schopnosti bakterií metabolizovat

různé substráty (cukry, aminokyseliny aj.)– Většina bakterií umí zpracovat pouze konkrétní

substráty kombinace substrátů typická pro bakterii biochemický profil

– Komerčně vyráběné testové sady s diagnostickými půdami pro určité skupiny bakterií

• Enterobakterie – fermentující Gram neg. tyčky• Nefermentující Gram neg. Tyčky

– Pro snazší hodnocení zpracování substrátu změna barvy diagnostické půdy

Pokročilá přímá diagnostika

Pokročilá přímá diagnostika

Biochemické vlastnosti bakterií čeledi Enterobacteriacae (tzv. „Krátká pestrá řada“)

indol laktóza sacharóza manitol glukóza ureáza Simons SIM

+ - + - + - + - + + plyn

- + - + - + - HS

Pozn.

1 Test na produkci indolu - Kovácsovo činidlo (podobné Ehrlichovu činidlu); test je pozitivní při přítomnosti červené vrstvičky na hladině

2-4

Test štěpení (utilizace) laktózy, sacharózy a manitolu - indikátorem je bromthymolová modř

5 Test štěpení glukózy - ve Wassermanově zkumavce (je široká), v ní menší zkumavka - tzv. „plynovka“ - pokud je v ní bublina vzduchu, znamená to, že bakterie štěpí glukózu za vzniku plynu

6 Test na produkci ureázy (tzn. schopnost štěpit močovinu) - zkumavka s šikmo nalitým agarem obsahujícím močovinou, indikátorem změny pH je fenolováčerveň

7 Amoniumcitrát (Simons)

8 SIM agar - pokud je zákal jen kolem vpichu, bakterie je nepohyblivá (nebo byla její pohyblivost nějakým způsobem ovlivněna); pokud je zákal v celém objemu agaru, bakterie je pohyblivá (např. Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, etc.); dále se na tomto agaru testuje produkce sirovodíku - ten zde tvoří černé sraženiny

VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

• Výsledky se hodnotí podle matice a zaznamenají např. do hodnotícího programu v PC

Pokročilá přímá diagnostika

• Program vyhodnotí pravděpodobnost shody s typovými biochemickými profily konkrétních druhů

Pokročilá přímá diagnostika

• Detekce antigenu– Přímý průkaz antigenu v biologickém

materiálu – průkaz infekce konkrétním druhem

• Aglutinací (latexová aglutinace)• Imunofluorescenčně• ELISA

– Průkaz antigenu v čisté kultuře – identifikace konkrétního kmene

• Používají se diagnostická séra sérotypizace(zpětná aglutinace)

Pokročilá přímá diagnostika

Pokročilá přímá diagnostika

VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

• Určení citlivosti k antibiotikům– Velký terapeutický význam– Určení citlivosti / rezistence konkrétního kmene– Disková difúzní metoda – nejčastější, disky

napuštěné ATB – měří se velikost inhibičních zón– E test – proužek s klesající koncentrací ATB, drahé !!!– MIC (Minimální Inhibiční Koncentrace) – bujón s

klesající koncentrací ATB – nejnižší koncentrace při níž bakterie nevyroste = MIC

Pokročilá přímá diagnostika

Pokročilá přímá diagnostika

VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ATB

• Detekce DNA mikroba– Hybridizační metody

• Průkaz navázáním značených genových sond na specifické úseky DNA nebo RNA

– Amplifikační metody• Průkaz pomnožením specifických úseků DNA• Polymerázová řetězová reakce (PCR)

• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

Moderní přímá diagnostika

• Založena na průkazu specifických protilátek hostitele proti mikrobovi

• Klasické metody nepřímé diagnostiky– KFR, Přímá aglutinace, Hemaglutinace

• Moderní metody nepřímé diagnostiky– ELISA, Western blot

• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE SEROLOGIE

Nepřímá diagnostika

• Lokalizovaná infekce (pneumonie)– Odběr lokálního materiálu (sputum)– Mikroskopie (morfologie, Gram, Ziehl-

Neelsen)– Kultivace (krevní agar, McConkeyho agar,

Sabouraudův agar)– Diagnostický test dle výsledků mikroskopie a

kultivace• CAMP, satelitismus, enterotest atd.

– Určení citlivosti k ATB terapeutickédoporučení

Diagnostický postup

• Závažná specifická infekce (meningitida)– Odběr lokálního materiálu (likvor) i krve– Rychlý průkaz antigenů v likvoru (latexová

aglutinace)– Mikroskopie a kultivace likvoru– Hemokultura (kultivace krve)– Při průkazu bakteriálního původce vyšetření

citlivosti k ATB– Jinak průkaz protilátek (spirochety a viry) a

DNA (viry)

Diagnostický postup