Diseño de metodologías luminiscentes para la determinación ...

Universidad de Castilla-La Mancha Facultad de Ciencias Químicas

Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos

Diseño de metodologías luminiscentes para la

determinación de fitohormonas y fungicidas

en alimentos vegetales

Tesis Doctoral

Sonia Becedas Rodríguez

Ciudad Real

2012


Diseño de metodologías fotoluminiscentes para

la determinación de fitohormonas y fungicidas

en alimentos vegetales

por

Sonia Becedas Rodríguez

Visado en Ciudad Real el treinta de mayo de dos mil doce.

Fdo.: José Antonio Murillo Pulgarín

Catedrático del Departamento de

Química Analítica y Tecnología de

Alimentos de la Universidad de

Castilla-La Mancha.

Fdo.: Luisa Fernanda García Bermejo

Profesora Titular de Universidad

del Departamento de Química Analítica

y Tecnología de Alimentos de la

Universidad de Castilla-La Mancha

Trabajo presentado para optar al

Grado de Doctor en Química

Fdo.: Sonia Becedas Rodríguez.

Licenciado en CC. Químicas


Dª. Justa Mª Poveda Colado, profesora Titular de Universidad y Secretaria del

Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de

Castilla-La Mancha.

CERTIFICA:

Que el presente trabajo de investigación titulado “Diseño de metodologías

fotoluminiscentes para la determinación de fitohormonas y fungicidas en alimentos

vegetales” constituye la Tesis Doctoral que presenta Dª. Sonia Becedas Rodríguez para

aspirar al grado de Doctor en Química, y que ha sido realizada en el Departamento de

Química Analítica y Tecnología de Alimentos, cumpliendo todos los requisitos necesarios,

bajo la dirección del Dr. D. José Antonio Murillo Pulgarín y la Dra. Dª. Luisa Fernanda

García Bermejo.

Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a

treinta de mayo de dos mil doce.

VºBº

Fdo. Ana Isabel Briones Pérez Fdo. Justa Mª Poveda Colado

Directora del Departamento Secretaria del Departamento


La realización de esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a los recursos económicos

provenientes del proyecto de investigación:

Desarrollo de nuevos métodos fluorimétricos y fosforimétricos para la

determinación de compuestos de interes farmacologico y medioambiental

(PBI – 05 – 050 y PCI-08-0120), financiados por la Consejería de Educación y

Ciencia de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha y los Fondos FEDER.

A mi familia

“Me lo contaron y lo olvidé, lo vi y lo entendí, lo hice y lo aprendí”

Confucio

Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que de

una u otra forma han estado a mi lado durante todos estos años. Gracias por todos los

momentos que hemos compartido, momentos llenos de buenos sentimientos, risas y

lágrimas, y sobre todo, amistad.

Gracias a mis padres por su comprensión, por su apoyo desinteresado, por sus

palabras de ánimo y cariño siempre que las he necesitado; por haberme enseñado a ser la

persona que soy. Gracias por enseñarme a valorar la vida y a mi familia, y por

demostrarme que si uno lucha, puede conseguir lo que desea.

Gracias a mi hermano por sus sabios consejos y por su cariño incondicional, a pesar

de las adversidades. Gracias por enseñarme a ser mejor persona, a valorarme a mi misma y

que la verdadera riqueza de las personas está en su corazón.

A José Antonio por la confianza depositada en mí, por la oportunidad brindada y

por su cercanía. Quiero agradecer a Luisa su esfuerzo, sus palabras de apoyo y orientación.

A todos mis compañeros del departamento: Fernando, Armando, Beatriz, Nacho,

Nieves, Narjisse, Carolina, Lorena, Reyes, Mar, Sandra, Rosario y José Luís, por vuestro

cariño y vuestra amistad. Gracias.

Índice de contenidos

ÍNDICE DE CONTENIDOS

OBJETIVOS 21

BLOQUE I

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

1. INTRODUCCIÓN GENERAL 27

2. EVOLUCIÓN DEL MERCADO FITOSANITARIO (2000-2010) 29

3. CARACTERÍSTICAS Y CLASIFICACIÓN DE LOS PLAGUICIDAS 30

3. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS 33

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39

CAPÍTULO 2. COMPUESTOS FITOSANITARIOS DETERMINADOS

1. FITOHORMONAS 51

2. AUXINAS 51

2.1. Características principales de las auxinas 53

2.2. Aplicaciones en la agricultura 55

3. EL ÁCIDO 1-NAFTILACÉTICO 55

3.1. Características estructurales 55

3.2. Campo de actividad 56

3.3. Determinaciones 56

4. EL ÁCIDO 2-NAFTOXIACÉTICO 57




5. ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO 58




6. ÁCIDO 3,5,6-TRICLORO-2-PIRIDILOXIACÉTICO 61



6.3. Determinación 62

7. GIBERELINAS 62

7.1. Estructura química 62


8. ÁCIDO GIBERÉLICO 64




9. DERIVADOS BENCIMIDAZÓLICOS 66

10. TIABENDAZOL 67





CAPÍTULO 3. LUMINISCENCIA. TECNICAS LUMINISCENTES

1. LUMINISCENCIA 79

1.1. Introducción 79

1.2. Mecanismo de los procesos fotoluminiscentes 80

2. FLUORESCENCIA 84

2.1. Modalidades de fluorescencia 84

2.1.2. Fluorescencia sincrónica 85

2.1.3. Fluorescencia sincrónica por isopotenciales de la matriz 87

3. FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA 90


3.2. Fundamento teórico 92

3.2.1. Expresión de la intensidad para una disminución de la fluorescencia 93

3.2.2. Expresión de la intensidad de fluorescencia para un aumento de fluorescencia 94

3.3. Instrumentación 95

4. FOSFORESCENCIA 97


4.2. Modalidades de fosforescencia 97

4.2.1. RTP en soporte sólido (SS-RTP) 99

4.2.2. Fosforescencia a temperatura ambiente en disolución en medios organizados 99

4.2.3. La fosforescencia a temperatura ambiente en disolución en presencia de

microemulsiones 101

4.2.4. Fosforescencia a temperatura ambiente en disolución en medios no organizados 102



BLOQUE II

CAPÍTULO 4. MATERIALES Y MÉTODOS

1. INSTRUMENTACIÓN EMPLEADA EN EL DESARROLLO DE ESTA TESIS 119

1.1. Espectrofluorímetro de barrido Photon Technology International TimeMaster 119

1.1.1. Parámetros instrumentales a tener en cuenta 121

1.2. Control de temperatura 122

1.3. Medidor de pH 123

1.4. Centrífuga 123

1.5. Rotavapor 123

1.6. Baño de ultrasonidos 123

1.7. Balanzas 123

1.8. Destilador de agua 123

1.9. Bomba peristáltica 124

1.10. Lámpara UV 124

2. DISOLUCIONES EMPLEADAS 125

3. ESPECTROSCOPÍA DE DERIVADAS 126

4. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS EMPLEADOS 130

4.1. Métodos de regresión lineal 130

4.2. Intervalos de confianza y test de student para la pendiente y la ordenada en el

origen 135

4.3. Comparación de rectas de calibrado. Análisis de varianza 137

4.4. Precisión en las estimaciones obtenidas a partir de la recta de regresión 138

4.5. Estudio de los límites de detección 139


BLOQUE III

CAPÍTULO 5. DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE LOS ÁCIDOS 1-NAFTILACÉTICO Y 2-

NAFTOXIACÉTICO EN MUESTRAS VEGETALES MEDIANTE FOSFORESCENCIA A

TEMPERATURA AMBIENTE

1. OBJETIVO 149

2. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DE LOS ANALITOS 149


3. ESTABILIDAD DE LAS DISOLUCIONES 152

4. OPTIMIZACIÓN SECUENCIAL DE VARIABLES 152

4.1. Variables químicas 152

4.1.1. Optimización del pH y de la concentración de la solución reguladora 153

4.1.2. Optimización de la relación de concentraciones agente micelar/átomo pesado y de la

concentración de sulfito 154

4.1.3. Optimización de la temperatura 156

4.2. Variables instrumentales 157

4.2.1. Optimización de la apertura de las rendijas 158

4.2.2. Optimización del tiempo de espera (delay) 158

4.2.3. Optimización del tiempo de integración (int time) 159

4.2.4. Optimización de la frecuencia de disparo 160

4.2.5 Optimización del número de disparos (shots) 161

4.2.6. Optimización del número de medias 162

5. INFLUENCIA INDIVIDUAL DE LA CONCENTRACIÓN DE NAA Y NOA 163

6. RESOLUCIÓN DE LA MEZCLA DE NAA Y NOA 164

6.1. Proceso de calibración 166

6.2. Estudio de la precisión de las estimaciones 181


7. DETERMINACIÓN DE NAA Y NOA EN FRUTAS, HORTALIZAS Y PRODUCTOS

FITOSANITARIOS 184

7.1. Procedimiento de extracción 185

7.2. Determinación de la concentración problema de NAA y NOA 186

CAPÍTULO 6. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO 2,4- DICLOROFENOXIPROPANOICO EN

MUESTRAS VEGETALES MEDIANTE FLUORESCENCIA INDUCIDA FOTOQUÍMICAMENTE

1. OBJETIVO 191

2. SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE FOTOIRRADIACIÓN 191

2.1. Consideraciones teóricas 191

2.2. Elección del disolvente 192

2.3. Influencia del tiempo de irradiación 194

3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DEL ÁCIDO 2,4-DP 196

4. ESTABILIDAD DE LA DISOLUCIÓN 197


5.1. Optimización de los parámetros químicos 197

5.1.1. Influencia del pH 197

5.1.2. Influencia de la concentración de tampón 199

5.1.3. Influencia de la temperatura 199

5.2. Optimización de las variables instrumentales 201



5.2.2. Optimización del tiempo de integración (“int time”) 202


6. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE 2,4-DP 204

7. DETERMINACIÓN FLUORIMÉTRICA DE ÁCIDO 2,4-DP 205



7.3. Estudio del límite de detección 214

8. DETERMINACIÓN DE 2,4-DP FRUTAS, HORTALIZAS Y PRODUCTOS FITOSANITARIOS


8.2. Determinación de la concentración de 2,4-DP en las muestras 216

CAPÍTULO 7. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO 3,5,6-TRICLORO-2-PIRIDILOXIACÉTICO EN

MUESTRAS VEGETALES MEDIANTE FLUORESCENCIA INDUCIDA FOTOQUÍMICAMENTE

1. OBJETIVO 223




3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES 228

4. ESTABILIDAD DE LA DISOLUCIÓN 229










6. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE TCP 236

7. DETERMINACIÓN DE TCP 237




8. DETERMINACIÓN DE TCP EN FRUTAS, HORTALIZAS Y PRODUCTOS FITOSANITARIOS


8.2. Determinación de la concentración de TCP en las muestras 248


CAPÍTULO 8. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO EN MATRICES VEGETALES

MEDIANTE FLUORESCENCIA INDUCIDA FOTOQUIMÍCAMENTE

1. OBJETIVO 255




3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DEL AGB 258











6. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE AGB 266

7. DETERMINACIÓN DE AGB 267




8. DETERMINACIÓN DE AGB EN FRUTAS, HORTALIZAS Y PRODUCTOS FITOSANITARIOS

277 8.1. Procedimiento de extracción 277

8.2. Determinación de la concentración de AGB en las muestras 278

CAPÍTULO 9. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO NAFTILACÉTICO Y TIABENDAZOL EN

MATRICES VEGETALES MEDIANTE FLUORESCENCIA SINCRÓNICA LINEAL

1. OBJETIVO 283

2. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DE LOS ANALITOS 283



4.1. Optimización de las variables químicas 287

4.1.1. Optimización del porcentaje de etanol 287

4.1.2. Optimización del pH y de la concentración de la solución reguladora 288

4.1.3. Optimización de la temperatura 289




4.2.2. Optimización del tiempo de integración (int time) 292

5. INFLUENCIA INDIVIDUAL DE LA CONCENTRACIÓN DE NAA Y TBZ 293

6. RESOLUCIÓN DE LA MEZCLA DE NAA Y NOA 294

6.1. Selección de la trayectoria sincrónica 295




7. DETERMINACIÓN DE NAA Y TBZ EN CÍTRICOS Y MADROÑO 313


7.2. Determinación de la concentración problema de NAA y TBZ 313

CAPÍTULO 10. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO EN SANDÍA MEDIANTE

FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA POR ISOPOTENCIALES DE LA MATRIZ

1. OBJETIVO 323


3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES 325

4. OPTIMIZACIÓN DE VARIABLES 327

5. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE AGB 328

6. SELECCIÓN DE LA TRAYECTORIA ISOPOTENCIAL 329

7. DETERMINACIÓN DE AGB 331




BLOQUE IV

CONCLUSIONES 347

OBJETIVOS

El presente trabajo tiene como finalidad desarrollar nuevas metodologías para el

análisis de residuos de compuestos fitosanitarios en alimentos vegetales.

Los objetivos se pueden resumir en:

- Aplicar la fosforescencia a temperatura ambiente para la resolución de mezclas de

este tipo de compuestos y demostrar su validez en diferentes tipos de muestras

dentro de los alimentos vegetales.

- Estudiar las posibilidades que la fluorescencia inducida fotoquímicamente ofrece

para abordar el análisis de fitohormonas en matrices fluorescentes y no

fluorescentes, sin necesidad de separaciones previas.

- Demostrar la versatilidad de distintas modalidades de fluorescencia sincrónica para

abordar la determinación de mezclas de productos fitosanitarios y de éstos en

matrices vegetales fluorescentes.

BLOQUE I

INTRODUCCIÓN GENERAL

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

CAPÍTULO 2. COMPUESTOS FITOSANITARIOS DETERMINADOS

CAPÍTULO 3. LUMINISCENCIA. TÉCNICAS LUMINISCENTES

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN

Introducción

27

1. INTRODUCCIÓN GENERAL

La lucha química contra las plagas de los cultivos agrícolas ha prestado, y sigue

haciéndolo, magníficos servicios al agricultor y a la sociedad. Los resultados obtenidos en

el mantenimiento y aumento de las cosechas, fundamentalmente a partir de la década de

los cuarenta, gracias al descubrimiento y aplicación de los plaguicidas orgánicos de

síntesis, han hecho que su empleo en la actualidad sea de gran magnitud.

La continua necesidad de producir más alimentos ha hecho que su demanda siga

aumentando, por lo que la utilización de los plaguicidas agrícolas, entendidos como

agentes químicos para proteger los cultivos, es en el momento actual importante y

necesaria.

El desarrollo de hierbas indeseables junto a los cultivos origina diversos

problemas: disminuye la producción, dificulta el laboreo y recolección y hace necesaria la

mano de obra o el uso de plaguicidas para su eliminación. Por ello, las hierbas indeseables

limitan la producción agrícola, reducen la calidad de las cosechas y repercuten

considerablemente sobre la economía. Todo ello ha hecho que el uso de los herbicidas se

haya impuesto como una de las operaciones más necesarias para conseguir cosechas

estables de alto rendimiento, así como para mantener despejados los linderos de las vías

férreas, las zonas bajo tendidos eléctricos y para mantenimiento de cortafuegos libres de

vegetación.

En la figura 1.1 se muestran los gráficos correspondientes a las cifras de mercado

a nivel europeo y mundial de productos fitosanitarios (2009) (a) y las cifras de ventas de

familias de productos fitosanitarios a nivel europeo y mundial (2010) (b) según la AEPLA

(Asociación empresarial para la protección de plantas). Como se puede ver en los

diagramas, los productos más utilizados son los herbicidas, seguidos de los insecticidas y

fungicidas. Sin embargo, también es cierto que el uso de plaguicidas no está exento de

problemas, ya que estos productos químicos se preparan deliberadamente para ser tóxicos

frente a determinados organismos y, al existir cierta homogeneidad entre muchas formas

de vida, podrían ser tóxicos para los seres humanos si llegasen a incorporarse al organismo

por accidente (ingestión, inhalación, contacto, etc.).

Capítulo 1

28

Figura 1.1. Cifras de mercado a nivel europeo y mundial de productos fitosanitarios (2009) (a),

cifras de ventas de familias de productos fitosanitarios a nivel europeo y mundial (2010) (b),

según AEPLA (Asociación Empresarial para la Protección de las Plantas).

Por otra parte, los residuos de plaguicidas, además, pueden constituir en ciertos

casos una importante fuente de contaminación en las zonas donde se emplean durante

tiempos más o menos largos. Su movilidad a través del aire o del agua, su acumulación o

transformación en el medio donde se aplican y, finalmente, su biomagnificación, dado que

pueden introducirse en la cadena alimentaria, aumentando su concentración al pasar de un

eslabón a otro, constituyen otros riesgos que deben ser comparados con los posibles

beneficios que pueden producir [1.1-1.3].

Durante muchos años se ha prestado una atención preferente a conocer la dinámica

de estos productos en plantas y animales, pero en las últimas décadas y debido a la mayor

preocupación por sus repercusiones en el medio ambiente y en la salud, la investigación se

ha orientado en gran parte a conocer también su comportamiento en otras matrices

ambientales como el suelo, aire, agua, plantas o alimentos. Debido al amplio uso de estos

productos y a que los procesos de aplicación a los cultivos originan depósitos de

plaguicida en el suelo y en las plantas, susceptibles de sufrir numerosos procesos de

transformación y transporte, la aparición de residuos tóxicos en los diferentes

compartimentos ambientales es inevitable y constituye un problema importante.

Los países industrializados y muchos en desarrollo actualmente desarrollan

esquemas de registro para los plaguicidas, y organizaciones internacionales, tales como el

Grupo Internacional de Asociaciones Nacionales de Fabricantes de Agroquímicos, la

Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización para la Agricultura y la

Alimentación (FAO) de las Naciones Unidas, han elaborado guías detalladas de los datos

que se exigen para el registro, incluyendo la toxicología, la posible acumulación en el

suelo y en las cadenas alimenticias y sus tiempos de descomposición.

Herbicidas

44%

Insecticidas

26%

Fungicidas

27%

Otros

3%

Insecticidas,

Acaricidas y

Nematicidas

31%

Fungicidas

26%

Herbicidas

34%

Varios

9%

(a) (b)

Introducción

29

En España, el peligro general de los plaguicidas para las personas se recoge en la

“Reglamentación Técnico Sanitaria para la Fabricación, Comercialización y Utilización de

Plaguicidas”, aprobada por RD 3349/1983 que en su artículo 3º clasifica a los plaguicidas,

atendiendo a los posibles riesgos contra la salud humana, en: muy tóxicos, tóxicos,

nocivos y de baja peligrosidad.

2. EVOLUCIÓN DEL MERCADO FITOSANITARIO (2000-2010)

La evolución de las ventas de productos fitosanitarios muestra un mercado

relativamente estable, en comparación con otros sectores, especialmente el de la industria

química, con una demanda estacional siempre condicionada por la meteorología.

En nuestro país, en los últimos años las cifras del mercado fitosanitario, oscilan

entre los 500 y 650 millones de euros, alcanzándose su récord en el año 2003 debido a una

climatología favorable en el desarrollo de plagas (figura 1. 2).

Las cifras del mercado fitosanitario a nivel europeo se mueven entre los 6000 y los

7000 millones de euros al año (figura 1.3).

Figura 1.2. Evolución en cifras del mercado español de productos fitosanitarios (2000-

2010). (Fuente: AEPLA).

Capítulo 1

30

Figura 1.3. Evolución en cifras del mercado mundial de productos fitosanitarios 2000-2009 (a),

evolución en cifras del mercado europeo (2000-2009) (b).(Fuente AEPLA).

3. CARACTERÍSTICAS Y CLASIFICACIÓN DE LOS PLAGUICIDAS

Con el nombre de plaguicidas o pesticidas se denominan a aquellas sustancias que

combaten los parásitos de los cultivos, del ganado y animales domésticos, así como del

hombre y el medio ambiente que lo rodea.

Habitualmente, el principio activo de un plaguicida se obtiene en la industria

química con un grado de pureza que oscila entre el 75 y el 98%, siendo el resto impurezas

de fabricación. El producto técnicamente puro no suele emplearse de modo directo en

agricultura, sino que se utilizan las denominadas formulaciones que contienen la materia

activa más o menos diluida en un soporte sólido o disolvente líquido, junto con sustancias

coadyuvantes que mejoran su acción.

Según su uso, los plaguicidas pueden clasificarse en:

- Plaguicidas de uso fitosanitario o productos fitosanitarios, destinados a su

utilización en el ámbito de la sanidad vegetal y aquellos otros, de análoga

naturaleza, destinados a combatir malezas u otros organismos indeseables en áreas

no cultivadas.

- Plaguicidas de uso ganadero, destinados a su utilización en el entorno de los

animales o en las actividades estrechamente relacionadas con su explotación.

Introducción

31

- Plaguicidas para uso en la industria alimenticia, utilizados en tratamientos externos

de transformación de vegetales, de productos de origen animal y de sus envases,

así como los destinados al tratamiento de locales, instalaciones o maquinarias

relacionadas con la industria alimenticia.

- Plaguicidas de uso ambiental, empleados en operaciones de desinfección,

desinsectación y desratización en locales públicos o privados, establecimientos

fijos o móviles, medios de transporte e instalaciones.

- Plaguicidas para uso en higiene personal, que son aquellos preparados útiles para la

aplicación directa sobre el hombre.

- Plaguicidas para uso doméstico, cualquiera de los definidos anteriormente,

autorizados expresamente para que puedan ser aplicados por personas no

especialmente cualificadas en viviendas y otros locales habitados.

Los plaguicidas también pueden ser clasificados según su mecanismo de acción como:

- Desviadores del fotosistema 1: bipiridilos.

- Inhibidores del fotosistema 2: triazinas, ureas sustituidas, uracilos y miscelaneos de

acción foliar.

- Inhibidores de la síntesis de clorofila: difenil éteres.

- Inhibidores de la síntesis de carotenoides.

- Inhibidores de la biosíntesis de lípidos: derivados clorados de ácidos alcanoicos,

oximas, ésteres de ácidos ariloxi-fenoxialcanoicos y tiolcarbamatos.

- Inhibidores de la división celular: cloroacetamidas, dinitroanilinas y carbamatos.

- Herbicidas de tipo auxina: ácidos ariloxi-alcanoicos, ácidos aril-carboxílicos y

ácidos quinolino carboxílicos.

- Inhibidores de la síntesis de aminoácidos aromáticos: glifosato.

- Inhibidores de la síntesis de glutamina: glufosinato.

- Inhibidores de la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada: sulfonilureas.

- Inhibidores de aminoácidos de cadena ramificada: imidazolinonas.

Por último, atendiendo al organismo al que está dirigida su acción los plaguicidas se

pueden clasificar como:

Capítulo 1

32

Tipo de plaguicida Organismo-Objeto

Acaricida Ácaros

Alguicida Algas

Avicidas Aves

Bactericidas Bacterias

Desinfectantes Bacterias

Fungicidas Hongos

Herbicidas Plantas

Insecticidas Insectos

Larvicidas Larvas de insectos

Moluscocidas Caracoles, babosas

Nematocidas Nematodos

Pesticidas Peces

Raticidas Roedores

Para que un plaguicida sea aceptable para su uso como tal, debe reunir las

siguientes cualidades:

- Efectividad en la destrucción de la plaga contra la que se aplica.

- Selectividad en su acción sobre su objetivo, en cuyo caso no puede perjudicar la

flora o fauna beneficiosa.

- Economía, proporcionando mayores beneficios que los gastos que ocasiona su uso.

- Seguridad, en el sentido de no suponer un peligro para la salud del hombre ni de

los animales domésticos, ni representar una elevada fitotoxicidad.

- Estabilidad durante el tiempo necesario para el desarrollo de su acción.

- Posibilidad de formulación a los efectos de aplicabilidad, estabilidad y efectividad.

El estudio de los herbicidas requiere la definición previa de varios términos

relativos a su clasificación, que puede hacerse en base a distintos aspectos:

- Atendiendo a la acción que ejercen sobre las plantas, pueden ser: totales, si

destruyen toda la vegetación presente, sin discriminación, incluyéndose aquí los

esterilizantes de suelos, o selectivos, si sólo destruyen malas hierbas de los cultivos

pero dejan indemnes a éstos.

Introducción

33

- En base a su forma de aplicación, hay herbicidas de presiembra que se aplican

antes de sembrar o plantar, de preemergencia, si se emplean después o al mismo

tiempo de la siembra pero antes de que el cultivo emerja del suelo, y de

postemergencia, si se usan sobre el cultivo ya emergido y más o menos

desarrollado.

- Según la forma de actuar sobre la planta pueden ser de contacto (también llamados

de traslocación) y residuales o de superficies. Los primeros destruyen la planta por

contacto y los segundos se aplican al suelo antes de nacer las hierbas o cuando

éstas están germinando y, al ser absorbidos por las raíces de la plántula o la

semilla, destruyen la hierba. Sin embargo, no puede precisarse una delimitación

clara en estas dos maneras de actuar pues hay muchos herbicidas residuales que

también actúan por contacto, generalmente sobre hierbas poco crecidas.

3. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS

El descubrimiento del DDT (Dicloro Difenil Tricloroetano) como insecticida de

contacto, en los primeros años de la década de los cuarenta, marcó el principio de la era de

los plaguicidas orgánicos de síntesis, y pronto emergió una gran variedad de plaguicidas

organoclorados. Sin embargo, debido a su amplio uso, la efectividad de estos compuestos

empezó a disminuir en algunos casos, y a partir de 1950 nuevos plaguicidas de síntesis

(organofosforados y carbamatos) fueron desarrollados para ser usados como complemento

o sustitutos.

Hoy en día se siguen aplicando a los cultivos una amplia variedad de productos

fitosanitarios. La utilización de estos compuestos origina la aparición de sus residuos en

los distintos compartimentos ambientales, pudiendo permanecer en concentraciones

elevadas y durante tiempos prolongados en la matriz donde han sido aplicados o

transportados.

El análisis de los residuos de los plaguicidas consiste en la cuantificación, a nivel

de trazas, de estos compuestos en diferentes matrices y, generalmente, consta de las etapas

de extracción, purificación y determinación. En la extracción de los plaguicidas de las

matrices en las que se encuentran se utilizan diferentes técnicas.

Los sistemas tradicionales de extracción, que se siguen empleando hoy en día en

algunas ocasiones, son la extracción líquido-líquido, la extracción Soxhlet y la extracción

Capítulo 1

34

sólido líquido. Estás técnicas requieren el uso de grandes volúmenes de disolventes

tóxicos, son laboriosas y en algunos casos lentas, como la extracción Soxhlet, que requiere

al menos 24 h.

En las modernas metodologías de extracción se pretende minimizar el uso de

disolventes y conseguir una mayor automatización del proceso, además de una mayor

rapidez. Algunos de estos métodos implican la utilización de fases sólidas, como la

extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction, SPE) [1.4-1.7], técnica que consiste en

la adsorción de los analitos en un adsorbente sólido y en la posterior desorción de los

compuestos mediante la utilización de un pequeño volumen de disolvente orgánico [1.8].

Los adsorbentes utilizados pueden ser no selectivos, como las fases de sílice enlazadas o

derivatizadas con cadenas C8 o C18 y diversos polímeros, o selectivos, como los

inmunoadsorbentes o los polímeros de impronta molecular (Molecularly Imprinted

Polymers, MIP) [1.9,1.10]. Está técnica, aunque permite realizar extracciones selectivas,

no se puede utilizar en la extracción de muestras con un alto grado de viscosidad. Para este

tipo de muestras, se lleva a cabo la dispersión de las mismas en una matriz sólida (Matriz

Solid Phase Dispersión, MSPD). Se utilizan como matrices sólidas diversos componentes,

entre otros, florisil, fases de sílice derivatizada o sin derivatizar y alúmina, para su

posterior empaquetamiento en una columna y elución con el disolvente apropiado

[1.11,1.12].

Por otro lado, la micro extracción en fase sólida (Solid Phase Microextraction,

SPME) constituye otra alternativa interesante, ya que no se utiliza ningún tipo de

disolvente durante el proceso de extracción, sino que los compuestos son adsorbidos de la

matriz por las fibras de extracción y, posteriormente, desorbidos térmicamente en el

instrumento donde se efectúa la determinación. La extracción de los compuestos se puede

realizar sumergiendo la fibra en la matriz, lo que se conoce como extracción directa o

exponiendo la fibra al espacio de cabeza del recipiente que contiene la muestra, técnica

conocida como headspace SPME (HS-SPME) [1.13].

Existen otras técnicas de extracción aplicadas al análisis de residuos de plaguicidas

que implican el uso de equipamiento más complejo, como es el caso de la extracción

mediante fluidos supercríticos (Supercritical Fluid Extraction, SFE) [1.14,1.15], técnica

en la que un fluido supercrítico es utilizado como disolvente extractante [1.16-1.20]. El

dióxido de carbono, con o sin otro disolvente modificador, es el fluido supercrítico más

utilizado [1.21]. Este tipo de extracción presenta la ventaja de que el fluido supercrítico es

un gas en condiciones normales de presión y temperatura. Existe otra técnica similar, la

Introducción

35

extracción acelerada con solventes (Accelerated Solvent Extraction, ASE), en la que en

lugar de un fluido supercrítico se utiliza un líquido, a elevada temperatura y presión, como

agente extractante [1.22,1.23].

Otra técnica empleada es la extracción con solventes en horno de microondas

(Microwaveassisted Solvent Extraction, MAE), la cual utiliza la radiación de microondas

para calentar los disolventes que están en contacto con las muestras sólidas y facilitar la

extracción de los analitos [1.24].

En la purificación de los extractos conseguidos, en caso de que sea necesaria, se

utilizan diferentes técnicas, como la extracción líquido-líquido seguido de la concentración

de los extractos por medio de la evaporación del disolvente con distintos gases (aire o

nitrógeno), y la cromatografía en columna utilizando un adsorbente sólido (florisil,

alúmina), en la que el extracto pasa a través del adsorbente produciéndose un

fraccionamiento por polaridad. Otro tipo de separación es en base al peso molecular o

tamaño de la molécula, utilizando la cromatografía de permeación sobre gel (Gel

Permeation Cromatography, GPC) [1.25]. Mediante algunas de las técnicas de extracción

mencionadas anteriormente, como la SPE o SPME, se puede conseguir la extracción y

purificación de los plaguicidas en el mismo proceso [1.26,1.27].

Desde 1946 hasta 1955 las determinaciones de residuos de plaguicidas habían sido

restringidas a métodos específicos colorimétricos y a algunos procedimientos no

específicos, como determinaciones de cloro y fósforo total, la inhibición de la

colinesterasa y a los bioensayos.

En 1954 se comenzó a aplicar la cromatografía de gases (Gas Chromatography,

GC) [1.28-1.35], presentando una gran sensibilidad y selectividad para el análisis de los

plaguicidas. Durante los años de 1956 a 1962 se sientan las bases de esta técnica y en años

posteriores se va perfeccionando notablemente con el uso de columnas capilares, técnicas

de derivatización y detectores específicos, por lo que se hace posible la detección de

muchos compuestos difíciles de analizar, así como la determinación de sus residuos

[1.36,1.37]. Los detectores de GC más utilizados en el análisis de residuos de plaguicidas

son el detector de captura de electrones (Electron Capture Detector, ECD) [1.38-1.40], el

detector de nitrógeno y fósforo (Nitrógeno Phosphorous Detector, NPD) y el detector

fotométrico en llama (Flame Photometric detection, FPD) [1.41].

Otra técnica utilizada en la determinación de residuos de plaguicidas o herbicidas es

la espectrometría de masas (Mass Spectrometry, MS) [1.42-1.44]. La utilización de esta

técnica tiene una gran importancia debido a la alta sensibilidad que presenta. Para poder

Capítulo 1

36

utilizar este sistema, se necesita un aislamiento previo muy eficiente, por lo que una

aplicación de gran importancia es la identificación de residuos de plaguicidas por medio

del acoplamiento cromatografía de gases-espectrometría de masas (Gas

Chromatogrhaphy/Mass Spectrometry, GC/MS) [1.45-1.51]. El detector de masas, que

usualmente se utiliza en el análisis de residuos de plaguicidas es un cuadrupolo. Aunque

puede funcionar en el modo de barrido completo del espectro, que se utiliza para la

confirmación de los residuos, la mayor sensibilidad se consigue cuando funciona en el

modo de selección de iones (Selected Ion Monitoring, SIM). En esta técnica no se realiza

un barrido completo del espectro, sino que se registran sólo los iones preseleccionados, por

lo que aumenta el tiempo disponible para registrar cada señal, y con ello la sensibilidad.

Además de la cromatografía de gases, le espectrometría de masas puede ser acoplada a

cromatografía líquida (Liquid Chromatogrhaphy/Mass Spectrometry, CL/MS) [1.52,1.53],

a cromatografía iónica con plasma (Ion Chromatogrhaphy-Inductively/Mass Spectrometry,

IC/MS) [1.54], o acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (High Performance

Liquid chromatogrhaphy/Mass Spectrometry, HPLC/MS) [1.55].

La cromatografía de líquidos de alta resolución (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC) [1.56-1.58] es una alternativa interesante para el análisis de

plaguicidas que no pueden ser analizados por cromatografía de gases debido a que son

lábiles a altas temperaturas, a que son poco volátiles o a que poseen gran polaridad y

presentan problemas de elución en la determinación por cromatografía de gases [1.59]. La

mayoría de los análisis realizados por esta técnica se llevan a cabo con columnas de fase

estacionaria C8 o C18, y utilizando detectores de UV trabajando a una longitud de onda fija

o variable y detectores de fluorescencia [1.60-1.65], así como empleando la reacción

quimioluminiscente del luminol como detector [1.66].

La cromatografía en capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC) también se ha

utilizado en la determinación de plaguicidas, aunque en menor medida [1.67], así como

otras técnicas, como la electroforesis capilar (Capillary Electrophoresis, CE) y métodos

inmunoquímicos, dentro de los cuales el análisis de plaguicidas mediante inmuno-ensayos

(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) es el más ampliamente utilizado [1.68-

1.71].

Por otro lado, se ha utilizado la microextracción líquido-líquido acoplada a la

detección por cromatografía de gases-masas con detector de trampa de iones

(DLLME)/(GC-MS) [1.72], acoplada a cromatografía líquida [1.73] y cromatografía

Introducción

37

líquida de alta resolución [1.74] y a cromatografía de gases-fotométrica con detección en

llama (GC-FPD) [1.75].

La determinación fluorimétrica también ha sido utilizada en la determinación de

plaguicidas [1.76-1.80], al igual que la determinación fosforimétrica [1.81-1.85] y, por

último, métodos quimioluminiscentes [1.86,1.87].

La determinación de plaguicidas ha sido aplicada a numerosas muestras de: suelo

[1.88-1.102], agua [1.03-1.128], aire [1.129-1.144], matrices vegetales [1.145-1.162], miel

[1.163,1.164], leche [1.165], zumo de frutas y vino [1.166-1.168], carne [1.169], pescado

[1.170, 1.171], así como tejido adiposo humano [1.172].

Capítulo 1

38

Introducción

39

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1.1]. G. G. Briggs. J. Agric. Food Chem. 29, 1050-1059, (1981).

[1.2]. W. A. Jury, D. D. Focht, W. J. Farmer. J. Environ. Qual. 16 (4), 422-428, (1987).

[1.3]. R. Spear,W. J. Hayes (Jr), E. R. Laws (Jr). Handbook of Pesticide Toxicology. Vol.

1. Academic Press, Inc, (1991).

[1.4]. T. Edward Furlong, R. Mark Burkhardt, M. Paul Gates, L. Stephen Werner, A.

William Battaglin. The Science of The Total Environment. 248, (2-3), 135-146, (2000).

[1.5] I. Carpinteiro, M. Ramil, I. Rodríguez, R. Cela. Journal of Chromatography A. 1217,

7484-7492. (2010).

[1.6] X.F. Luo, Y. Yang, C.J. Sun. Journal of Sichuan University (Medical Science

Edition). 43, 108-112. (2011).

[1.7] M. Asensio Ramos, J. Herníndez Borges, L.M. Ravelo Pérez, M.ª. Rodríguez

Delgado. Electrophoresis. 29, 4412-4421. (2008)

[1.8]. G. Font, J. Mañes, J. C. Moltó, Y. Picó. J. Chromatogr. A. 642, 135-161, (1993).

[1.9]. N. Bertoncini-Delaunay, V. Pichon, M. C. Hennion. LC-GC Europe, March. 162-

172, (2001).

[1.10]. K. Ensing, C. Berggren, R. E. Majors. LC-GC Europe, January, 16-25, (2002).

[1.11]. F. Sicbaldi, A. Sarra, G. L. Copeta. J.Chromatogr. A. 765, 23-30, (1997).

[1.12]. S. A. Baker. LC-GC International. November, 719-724, (1998).

[1.13]. J. Pawliszyn. Solid Phase Microextraction-Theory and Practice, Wiley-VCH, New

York, (1997).

[1.14]. R. Tilio, S. Kapila, K. S. Nam, R. Bossi, S. Facchetti. Journal of Chromatography

A. 662, 191–197, (1994).

[1.15]. J. H. Wang, Q. Xu, K. Jiao. Journal of Chromatography A. 818, 138–143, (1998).

[1.16]. P. Capriel, A. Haisch, S. U. Khan. J. Agric. Food Chem. 34, 70-73, (1986).

[1.17]. A. Valverde-García, A. R. Fernadez-Alba, M. Contreras, A. Agüera. J. Agric. Food

Chem. 44, 1780-1784, (1996).

[1.18]. K. L. Pearce, V. C. Trenerry, S. Were. J. Agric. Food Chem. 45, 153-157, (1997).

[1.19]. K. M. Erstfeld, C. Y. Chen. J. Agric. Food Chem. 46, 499-503, (1998).

[1.20]. J. D. Berset, R. Holzer. J.Chromatogr. A. 852, 545-558, (1999).

[1.21]. S. B. Hawthorne. Anal. Chem. 62, 633-642, (1990).

Capítulo 1

40

[1.22]. B. E. Richter, J. L. Ezzell, D. Felix, K. A. Roberts, D. W. Later. Am. Lab. 27, 24-

28, (1995).

[1.23]. B. E. Richter, B. A. Jones, J. L. Ezzell, N. L. Porter, N. Avdalovic, C. Pohl. Anal.

Chem. 68, 1033-1039, (1996).

[1.24]. R. E. Majors. LC-GC International. October, 638-648, (1996).

[1.25]. A. Gelsomio, B. Petroviová, S. Tiburtini, E. Magnani, M. Felici. J.Chromatogr. A.

782, 105-122, (1997).

[1.26]. F. W. Fifield, P. J. Haines. Environmental Analytical Chemistry. Blackie

Academic & Professional, (1998).

[1.27]. L. Balduini, M. Matoga, E. Cavalli, E. Seilles, D. Riethmuller, M. Thomassin,

Y.C.Guilaume, J. Chromatogr. B 794, 389, (2003).

[1.28]. M. A. Aramendía, V. Borau, F. Lafont, A. Marinas, J. M. Marinas, J. M. Moreno,

F. J. Urbano. Food Chemistry. 105 (2), 855-861, (2007).

[1.29]. E. Crespo-Corral, M.J. Santos-Delgado, L.M. Polo-Díez, A.C. Soria. Journal of

Chromatography A. 1209 (1-2), 22-28, (2008).

[1.30]. Z. Er-cheng, S. Wei-li, Y.L. Shu-ren Jiang, Z. Zhi-qiang. Microchemical Journal.

83 (2), 105-110, (2006).

[1.31]. C. Charrêteur, R. Colin, D. Morin, J.J. Péron. Analusis. 26, 8, (1998).

[1.32]. A. Gelsomino, B. Petrovi, S. Tiburtini, E. Magnani, M. Felic. J. Chromatogr. A

782, 105, (1997).

[1.33]. M.L. Escuderos-Morenas, M.J. Santos-Delgado, S. Rubio-Barroso, L.M. Polo-

Diez. J. Chromatogr. A 1011, 143, (2003).

[1.34]. A.C. Gerecke, C. Tixier, T. Bartels, R.P. Schwarzenbach, S.R. Muller. J.

Chromatogr. A 930, 9, (2001).

[1.35] S. Afful, E. Enimil, B. Blewu, G.A. Mantey, E.A. Ewusie. Research Journal of

Applied Sciences, Engineering and Technology. 2, 592-595. (2010)

[1.36]. A. B. Littlewood. Gas Chromatography. Principles, Techniques, and Applications.

Academic Press, (1970).

[1.37]. A. Anson Moye. Analysis of pesticide residues. John Wiley and Sons, (1981).

[1.38] E. An, H.S. Shin. Food Science and Biotechnology. 20, 1299-1306.(2011).

[1.39] X. Huang, J. Xue, Y. Wang, X. Wu, H. Tong. Analytical Methods. 4, 1132-1141.

(2012).

[1.40] D. Liu, S. Min. Journal of Chromatography A. 1235, 166-173. (2012).

Introducción

41

[1.41] T. Kiljanek, A. Niewiadowska, S. Semeniuk. Bulletin of the Veterinary Institute in

Pulawy. 55, 731-736. (2011).

[1.42]. R. Davis, M. Frearson. Mass Spectrometry. John Wiley and Sons, (1987).

[1.43]. R. M. Silverstein, G. C. Bassler, T. C. Morril. Spectrometric identification of

organic compounds. Jhon Wiley and Sons, Inc, (1991).

[1.44]. A. Laganà, G. Fago, A. Marino, V. M. Penazzi. Analytica Chimica Acta. 415 (1-

2), 30, 41-56, (2000).

[1.45]. C. Rocha, E. A. Pappas, C. H. Huang. Environmental Pollution. 152 (1), 239-244,

(2008).

[1.46]. H. Zhang, Z. Chen, G. Yang, W. Wang, X. Li, R. Li, Y. Wu. Food Chemistry, 108

(1), 322-328, (2008).

[1.47]. B. Albero, C. Sánchez-Brunete, A. Donoso, J. L. Tadeo. Journal of

Chromatography A. 1043, 127–133, (2004).

[1.48]. H. J. Stan. Journal of Chromatography A. 892, 347–377, (2000).

[1.49]. G. Shen, H.K. Lee. Anal. Chem. 74, 648, (2002).

[1.50]. M.C. Bruzzoniti, C. Sarzanini, G. Costantino, M. Fungi. Analytica Chimica Acta.

578 (2), 25, 241-249, (2006).

[1.51] S. Walorczyk. Journal of Chromatography A. 1222, 98-108. (2012).

[1.52] B. Gilbert López, L. Jaén Martos, J.F. García Reyes, M. Villar Pulido, L. Polgar, N.

Ramos Martos, A. Molina Díaz, Food Control. 26, 341-346. (2012)

[1.53] C. Yan, B. Zhang, W. Liu, F. Feng, Y. Zhao, H. Du. Journal of Chromatography B:

Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879, 3484-3489. (2011).

[1.54] Z.X. Guo, Q. Cai, Z. Yang, Journal of Chromatography A. 1100, 160-167. (2005).

[1.55] D. Lu, X. Qiu, C. Feng, Y. Jin, Y. Lin, L. Xiong, Y. Wen, D. Wang, G. Wang,

Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life

Sciences. 895-896, 17-24. (2012).

[1.56]. J. L. Tadeoa, C. Sánchez-Brunete, R. A. Pérez, M. D. Fernández. Journal of

Chromatography A. 882, 175–191, (2000).

[1.57]. A. Asperger, J. Efer, T. Koal,W. Engewald. J. Chromatogr. A 960, 109, (2002).

[1.58] Z. Liu, W. Liu, H. Rao, T. Feng, C. Li, C. Wang, Z. Wang, International Journal of

Environmental Analytical Chemistry. 92, 571-581. (2012)

[1.59] A. Braithwaite, F. J. Smith. Chromatographic Methods. Kluwer Academic

publishers, (1999).

Capítulo 1

42

[1.60]. R. X. Mou, M. X. Chen, J. L. Zhi. Journal of Chromatography B. 875(2) 15, 437-

443, (2008).

[1.61]. D. Puig, D. Barceló. J. Chromatogr. A 673, 55, (1994).

[1.62]. I. Ferrer, D. Barceló, E.M. Thurman. Anal. Chem. 71, 1009, (1999).

[1.63]. H.H. Lin, Y.H. Sung, S.D. Huang. J. Chromatogr. A 1012, 57, (2003).

[1.64]. R. Carabias-Martínez, E. Rodríguez-Gonzalo, E. Herrero-Hernández, J.

Hernández-Méndez. Anal. Chim. Acta. 517, 71, (2004).

[1.65] Z. Liu, W. Liu, Q. Wu, X. Zang, X. Zhou, X. Zeng, Z. Wang. International Journal

of Environmental Analytical Chemistry. 92, 582-591. (2012).

[1.66] J.F. Huertas Pérez, A.M. García Campaña. Analytica Chimica Acta. 630, 194-204.

(2008).

[1.67] J. Sherma. J. AOAC International. 82, 48-53, (1999-a).

[1.68] M. P. Marco, S. J. Gee, H. M. Cheng, Z. Y. Liang, B. D. Hammock. J. Agric. Food

Chem. 41, 423-430, (1993).

[1.69] N. Lee, H. L. Beasley, S. W. L. Kimber, M. Silburn, N. Woods, J. H. Skerritt, I.

R. Kennedy. J. Agric. Food Chem. 45, 4147-4155, (1997).

[1.70] J. Sherma. Pesticide residue analysis: 1997-1998. J. AOAC International 82, 561-

574, (1999-b).

[1.71] Z.L. Xu, Q. Wang, H.T. Lei, S.A. Eremin, Y.D. Shen, H. Wang, R.C. Beier, J.Y.

Yang, K.A. Maksimova, Y.M. Sun. Analytica Chimica Acta. 708, 123-129. (2011).

[1.72]. D. Nagaraju, S. D. Huang. Journal of Chromatography A. 1161(1-2), 89-97,

(2007).

[1.73] L. Fu, X. Liu, J. Hu, X. Zhao, H. Wang, C. Huang, X. Wang. Chromatographia. 70,

1697-1701.(2009).

[1.74] P. Xuejiao, L. Hailu, L. Mingbiao. 3rd International Conference on Bioinformatics

and Biomedical Engineering, iCBBE 2009. Beijing. (2009).

[1.75]. S. Berijani, Y. Assadi, M. Anbia, M.R.M. Hosseini, E. Aghaee. J. Chromatogr. A

1123, 1, (2006).

[1.76]. S. Gao, J. You, X. Zheng, Y. Wang, R. Ren, R. Zhang, Y. Bai, H. Zhang

Talanta.82(4), 1371-1377, (2010).

[1.77]. C. Carrillo-Carrión, B. M. Simonet, M. Valcárcel. Analytica Chimica Acta. 692(1-

2), 103-108, (2011).

[1.78]. R. X. Mou, M. X. Chen, J. L. Zhi. Journal of Chromatography B. 875(2), 437-443,

(2008).

Introducción

43

[1.79]. B.M. Patel, H.A. Moye, R. Weinberger. Talanta. 38, 913, (1991).

[1.80] J.F. García Reyes, P. Ortega Barrales, A. Molina Díaz, Journal of Agricultural and

Food Chemistry. 53, 9874-9878. (2005),

[1.81]. J. A. Murillo Pulgarín, L. F. García Bermejo. Analytica Chimica Acta. 491(1), 37-

45, (2003).

[1.82]. G.N. Piccirilli, G.M. Escandar. Analytica Chimica Acta. 646(1-2), 90-96, (2009).

[1.83]. Y. Wei, W. Jin, R. Zhu, C. Liu, S. Zhang. Talanta. 41(10), 1617-1621, (1994).

[1.84]. S. Abbasi, H. Khani, L. Hosseinzadeh, Z. Safari. Journal of Hazardous Materials.

174(1-3), 257-262, (2010).

[1.85]. A. Murillo, L.F. García. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 50(5), 102-

1008, (2002).

[1.86,1.87]. T. Pérez-Ruiz, C. Martínez Lozano, J. Tomás Martín. Analytica Chimica

Acta. 476(1), 10,141-148. (2003).

[1.88] S. Magdic, A. Boyd-Boland, K. Jinno, J.B. Pawliszyn. J. Chromatogr. A. 736, 219-

228. (1996)

[1.89] K.S.B. Miglioranza, J.E. Aizpún de Moreno, V.J. Moreno, M.L Osterrieth, A.H.

Escalante. Environmental Pollution 105, 91-99. (1999).

[1.90] E. Papadopoulou-Mourkidou, J. Patsias, A. Kotopoulou. J. AOAC International 80,

447-454. (1997).

[1.91] P. Mogadati,, J.B. Louis, J.D. Rosen. J. AOAC International 82, 705-715. (1999).

[1.92] E.J. Aigner, A.D. Leone, R.L. Falconer, R.L. Environ. Sci. Technol. 32, 1162-1168.

(1998).

[1.93] J.L. Snyder, R.L. Grob, M.E. T.S. McNally, T.S. Oostdyk. J.Environ. Sci. Health.

A29, 1801- 1816. (1994).

[1.94] S.U. Khan. J. Agric. Food Chem. 43, 1718-1723. (1995).

[1.95] J.L. Ezzell, B.E. Richter, W.D. Felix, S.R. Black, J.E. Meikle. LC-GC International.

May, 390-397. (1995).

[1.96] V. Lopez-Ávila, R. Young, J. Benedicto, P. Ho, R. Kim. Anal. Chem. 67, 2096-

2102. (1995).

[1.97]V. Lopez-Avila, J. Benedicto. J. AOAC International 81, 1224-1232. (1998).

[1.98] J.L. Snyder, R.L. Grob, M.E. McNally, T.S. Oostdyk. Anal. Chem. 64, 1940-1946.

(1992).

[1.98] F.J. Santos, O. Jáuregui, F.J. Pinto, M.T. Galceran. J. Chromatogr. A. 823, 249-

258. (1998).

Capítulo 1

44

[1.99] R.E. Johnsen, R.I. Starr. J. Agric. Food Chem. 20, 48-51. (1972).

[1.100] S. Babi, M. Petrovi, M.J. Kaštelan-Macan. Chromatogr. A. 823, 3-9. (1998).

[1.101] C. Sánchez-Brunete, R.A. Pérez, E. Miguel, J.L. Tadeo. J.Chromatogr. A. 823, 17-

24. (1998).

[1.102] R. Saito, O. Ikenaga, S. Ishihara, H. Shibata, T. Iwafune, T. Sato, Y. Yamashita.

Journal of Pesticide Science. 35, 479-482.(2010).

[1.103] T.L. Potter, T. Carpenter, R. Putman, K. Reddy, J.M. Clark. J. Agric. Food Chem.

39, 2148. (1991).

[1.104] C. García, P. Tiedra, A. Ruano, J.A. Gómez, R.J. García-Villanova. J.

Chromatogr. A. 605, 251. (1992).

[1.105] W.E. Kenneth, J.E. Elizabeth, E.L. James, V. López-Avila,. J. Assoc. Off. Anal.

Chem. 75, 858. (1992).

[1.106] M.J. Fernández, C. García, R.J. García-Villanova, J.A. Gómez. J. Agric. Food

Chem. 44, 1790 1795. (1996).

[1.107] A. Zapf, R. Heyer, H.J. Stan. J. Chromatogr. A. 694, 453- 461. (1995).

[1.108] C. Colina, A.P. Heras, G.D. Cancela, F.S. Rasero. J. Chromatogr. A. 655, 127-

132. (1993).

[1.109] T.A. Albanis, D.G. .Hela. J. Chromatogr. A. 707, 283-292. (1995).

[1.110] T.A. Albanis, D.G. Hela, T.M. Sakellarides, I.K. Konstantinou. J. Chromatogr. A.

823, 59-71. (1998).

[1.111] R. Eisert, K. Levsen J. Anal. Chem. 351, 555-562. (1995).

[1.112] M.J.A. Magalhaes, J.R. Ferreira, L. Frutuoso, A.A. Tainha. Pestic. Sci. 27, 23-31.

(1989).

[1.113] S. Magdic, J.B. Pawliszyn. J. Chromatogr. A. 723, 111-122. (1996).

[1.114] C. Aguilar, S. Peñalver, E. Pocurull, F. Borull, R.M. Marcé. J. Chromatogr. A.

795,105-115. (1998).

[1.115] D.A. Lambropoulou, T.A. Albanis. J. Chromatogr. A. 922, 243-255. (2001).

[1.116] T.Y. Okumura, Y.J. Nishikawa. Chromatogr. A. 709, 319-331. (1995).

[1.117] G.E. Miliadis. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 61, 255-260. (1998).

[1.118] J.L. Martínez, M.C.P. Espada, A.G. Frenich, F.J. Arrebola. J. Chromatogr. A. 867,

235-245. (2000).

[1.119] P. Parrilla, J.L. Martinez-Vidal, A.R. Fernández-Alba. J. Liquid. Chromatogr. 16,

4019-4029. (1993).

Introducción

45

[1.20] Colina, C., Báez, M.E., Peña, A., Romero, E., Dios, G. y Sánchez-Rasero, F. The

Science of the Total Environment. 153, 1-6. (1994).

[1.121] P. Hinsmann,L. Arce, A. Ríos, M. Valcárcel. J. Chromatogr. A. 866, 137-146.

(2000).

[1.122] R.M. Cavalcante, D.M. Lima, G.M. Fernandes, W.C. Duav, Talanta. 93, 212-218.

(2012).

[1.123] D. Moreno González, J.F. Huertas Pérez, L. Gámiz Gracia, A.M. García Campaña.

International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 91, 1329-1340. (2011).

[1.124] A. Penetra, V. Vale Cardoso, E. Ferreira, M.J. Benoliel. Water Science and

Technology. 62, 667-675. (2010).

[1.125] A.D.S. Pinheiro, G.O. da Rocha, J.B. De Andrade. Microchemical Journal. 99,

303-308. (2011).

[1.126] S. Samadi, H. Sereshti, Y. Assadi. Journal of Chromatography A. 1219, 61-65.

(2012).

[1.127] T. Tuzimski. Journal of AOAC International. 93, 1748-1756. (2010).

[1.128] L. Wu, C. Tai, T. Zhao, T. Zhou. 3rd International Conference on Bioinformatics

and Biomedical Engineering, iCBBE 2009.Beijing. (2009).

[1.129] W.J. Farmer, K. Igue, W.F. Spencer, J.P. Martin. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 36,

443-447. (1972).

[1.130] N.C. Singh, T.P. Dasgupta, E.V. Roberts, A. Mansingh. J. Agric. Food Chem. 39,

575-579. (1991).

[1.131] J.W. Russell. Environ. Sci. Technol. 9, 1175-1178. (1975).

[1.134] T.C. Thomas, J.W. Jackson, Y.A. Nishioka. Am. Ind. Hyg. Assoc. 41, 599-601.

(1980)

[1.135] F.J.E. González, M.L.C. Cano, J.L.M. Vidal, M.M. Galera. J. AOAC Int. 80,

1091-1097. (1997).

[1.136] M. Clément, S. Arzel, B. Le Bot, R. Seux, M. Millet. Chemosphere. 40, 49-56.

(2000).

[1.137] M.T. Tabernero, J. Álvarez-Benedí, J. Atienza, A. Herguedas. Pest. Manag. Sci.

56, 175-180. (2000).

[1.138] A. Gudéhn, B. Kolmodin-Hedman. J. Chromatogr. A. 387, 420 427. (1987).

[1.139] K. Swami, A. Marjit, S. Narang, R.S. Narang. J. AOAC Int. 80, 74-77. (1997).

[1.140]J.L. Martínez Vidal, F.J.E. González, C.R. Glass, M.M. Galera, M.L.C. Cano. J.

Chromatogr. A. 765, 99-108. (1997).

Capítulo 1

46

[1.141] P.P. Singh, R.S. Battu, B. Singh, R.L. Karla. Environment. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 47, 711-716. (1991).

[1.142] M. Gopal, I. Mukherjee. Pestic. Sci. 37, 67-72. (1993).

[1.143] A. Aguilera-del Real, A. Valverde-García, A.R. Fernandez-Alba, F. Camacho-

Ferre. Pestic. Sci. 51, 194-200. (1997).

[1.144] G.F. Antonious, M.E. Byers, J.C. Snyder. Pestic. Sci. 54, 61-67. (1998).

[1.145] W. Liao, T. Joe, W. G. Cusick. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74, 554-565, (1991).

[1.146] C. P. Cai, M. Liang, R. R. Wen. Chromatographia. 40, 417-420, (1995).

[1.147] G. P. Molinari, S. Cavanna, B. Ferroni, B. Food Additives and Contaminants. 15,

510-517, (1998).

[1.148] L. Kadenczki, Z. Arpad, I. Gardi, A. Ambrus, L. Gyorfi, G. Reese, W. Ebing. J.

AOAC Int. 75, 53-61, (1992).

[1.149] S. J. Lehotay, K. I. Eller. J. AOAC Int. 78, 821-830, (1995).

[1.150] Y. C. Ling, I. P. Huang. J. Chromatogr. A. 695, 75-82, (1995).

[1.151] M. Volante, M. Pontello, L. Valoti, M. Cattaneo, M. Bianchi, L. Colzani L. Pest.

Manag. Sci. 56, 618-636, (2000).

[1.152] J. Tekel, S. Hatrík. J. Chromatogr. A. 754, 397-410, (1996).

[1.153] M. W. Morelli-Cardoso, R. T. M. Cardozo, J. L. Mello, S. Abrantes, K. M. P.

Menezes. J. High Resol. Chromatogr. 22, 619-622, (1999).

[1.154] R. C. Hsu, I. Biggs, N. K. Saini, N.K. J. Agric. Food Chem. 39, 1658-1666,

(1991).

[1.155] N. Motohashi, H. Nagashima, C. Párkányi, B. Subrahmanyam, G. W. Zhang. J.

Chromatogr. A. 754, 333-346, (1996).

[1.156] C.K. Bempah, A. Buah Kwofie, E. Enimil, B. Blewu, G. Agyei Martey. Food

Control. 25, 537-542. (2012).

[1.157] I. Ion, A.C. Ion. Materials Science and Engineering C. 32, 1001-1004. (2012).

[1.158] O. López Fernández, R. Rial Otero, C. González Barreiro, J. Simal Gándara. Food

Chemistry. 134, 366-374. (2012)

[1.159] Z.L. Xu, Q. Wang, H.T. Lei, S.A. Eremin, Y.D. Shen, H. Wang, R.C. Beier, J.Y.

Yang, K.A. Maksimova, Y.M. Sun. Analytica Chimica Acta. 708, 123-129. (2011).

[1.160] A. Angioni, L. Porcu, F. Dedola. Pest Management Science. 68, 543-547. (2012).

[1.161] M.I. Shinger, A.A. Elbashir, H.E.O. Ahmed, H.Y. Aboul-Enein. Biomedical

Chromatography. 26, 589-593. (2012).

Introducción

47

[1.162] M. Su, S. Li, F. Li, Z. Gong, J. Wang. Chinese Journal of Chromatography (Se

Pu). 29, 1070-1075. (2011).

[1.163] I. Mukherjee. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 83, 818-

821. (2009)

[1.164] G. Tanner, C. Czerwenka. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59, 12271-

12277. (2011).

[1.165] I.S. Jeong, B.M. Kwak, J.H. Ahn, S.H. Jeong. Food Chemistry. 133, 473-481.

(2012).

[1.166] B. Jin, L. Xie, Y. Guo, G. Pang. Food Research International. 46, 399-409. (2012).

[1.167] N. Megersa, S. Kassahun. Food Additives and Contaminants - Part A Chemistry,

Analysis, Control, Exposure and Risk Assessment. 29, 789-798. (2012).

[1.168] M. Moeder, C. Bauer, P. Popp, M. van Pinxteren, T. Reemtsma. Analytical and

Bioanalytical Chemistry. 1-11. (2012).

[1.169] L.M. Ravelo Pérez, J. Hernández Borges, T.M. Borges Miquel, M.A. Rodríguez

Delgado, Journal of Separation Science. 30, 3240-3246.(2007).

[1.170] G. Arh, S. Fras, T. Polak, B. Alender, M. Veber, M. Pompe, Acta Chimica

Slovenica. 56, 920-926. (2009).

[1.171] A.M. Wilkowska, M. Biziuk. Journal of AOAC International. 93, 1987-1994.

(2010).

[1.172] N. Wang, D. Kong, Z. Shan, L. Shi, D. Cai, Y. Cao, Y. Liu, G. Pang. Journal of

Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. (2012).

CAPÍTULO 2

COMPUESTOS FITOSANITARIOS DETERMINADOS

Compuestos fitosanitarios determinados

51

1. FITOHORMONAS

Las fitohormonas u hormonas vegetales son sustancias químicas producidas por las

células vegetales capaces de regular los fenómenos fisiológicos de las plantas. Las

hormonas vegetales controlan un gran número de procesos, entre ellos el crecimiento de

las plantas, la caída de las hojas, la floración, la formación del fruto y la germinación. Los

efectos fisiológicos producidos no dependen de una sola fitohormona, sino más bien de la

interacción de muchas de éstas sobre el tejido en el cual coinciden.

Las fitohormonas se dividen en cinco grupos conocidos de compuestos que

incluyen al etileno, auxinas, giberelinas, citoquininas y el ácido abscísico (figura 2.1).

Figura 2.1. Estructura de algunas hormonas vegetales. (a) ácido giberélico (giberelinas), (b)

ácido abscísico, (c) ácido indolacético (auxinas), (d) etileno, (e) zeatina (citoquinina).

2. AUXINAS

Las auxinas son un grupo de fitohormonas que funcionan como reguladoras del

crecimiento vegetal, provocando la elongación de las células. Su nombre es de origen

griego y significa crecer. Este grupo de hormonas vegetales, que pueden ser de origen

natural o sintético, regulan muchos aspectos del desarrollo vegetal, siendo el ácido

OH

OC

O

HO

CH3COOH

CH2

COOH

O

OH

NH

OH

O

H2C CH2

N

NNH

N

HN

OH

(a) (b)

(c)

(d)

(e)

(a)

Capítulo 2

52

indolacético (IAA), derivado del aminoácido triptófano, la forma predominante en la

naturaleza.

- Auxinas naturales: pertenecen a este grupo el IAA y conjugados del

mismo con aminoácidos, glicoproteínas y pequeños péptidos.

- Auxinas sintéticas: pertenecen a este grupo los derivados indólicos (ácido

indolbutírico, IBA), derivados del naftaleno (ácido 1-naftilacético, NAA, y

ácido 2-naftoxiacético, NOA), derivados del ácido fenoxiacético y

derivados del ácido benzoico (2,4-diclorofenoxiacético, 2,4-D, y 2,6-

diclorofenoxiacético, 2,6-D). Algunos de ellos se muestran en la figura 2.2.

Figura 2.2. Estructura de algunas hormonas vegetales sintéticas. a) ácido 1-naftilacético (NAA),

b) ácido 2-naftoxiacético (NOA), c) ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D).

La existencia de las auxinas fue demostrada por F. W. Went en 1928 mediante un

sencillo experimento, que consiste a grandes rasgos en: a varias plántulas de avena recién

brotadas se les cortaba el coleóptilo y se comprobaba que la planta interrumpía su

crecimiento, mientras que si a alguna planta decapitada se le volvía a colocar el coleóptilo,

se notaba que reanudaba su crecimiento, indicando que en la punta de las plántulas de

avena existía una sustancia que las hacía crecer.

Esta demostración estimuló a varios investigadores en la búsqueda de la sustancia

que hacía crecer a las plántulas de avena y probablemente a otras plantas.

La primera auxina fue aislada de orina humana en 1934 por Kögl y Haagen-Smit,

siendo la sustancia activa identificada el ácido indolacético. La misma sustancia fue

aislada en 1934 por Haagen-Smit, como producto natural a partir de maíz tierno.

(a) (b)

(c)

O

Cl

COOH

Cl


53

Tras la caracterización del IAA, se descubrió que también eran capaces de

favorecer el crecimiento de las células vegetales el ácido indenoacético, el ácido

2-benzofuranacético, el ácido 3-benzofuranacético, una serie de compuestos derivados del

ácido indólico, como el ácido 3-indolpirúvico, el ácido indolbutírico, derivados del ácido

picolínico o derivados del naftaleno, como son el ácido 1-naftilacético y el ácido 2-

naftoxiacético. Por último, el hecho de que algunos ácidos fenoxiacéticos tuvieran

actividad auxínica llevó al descubrimiento del ácido 2,4-diclorofenoxiacético el cual posee

una gran actividad como fitohormona. A partir de aquí se desarrolló una amplia gama de

moléculas con actividad auxínica, como el ácido 2-metil-4-cloro fenoxiacético (MCPA) y

el ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético (2,4,5-T), ambos compuestos con propiedades

herbicidas cuando se emplean a concentraciones elevadas y utilizados como armas

químicas en la guerra de Vietnam.

2.1. Características principales de las auxinas

Las auxinas se encuentran en la planta en tres formas, una de fácil extracción por

métodos de difusión, otra algo mas difícil de extraer que requiere el empleo de

disolventes orgánicos y, por último, una tercera forma que requiere métodos enérgicos,

como puede ser la hidrólisis con NaOH o el empleo de enzimas proteolíticos.

De aquí surge el concepto de auxina ligada, siendo ésta la forma fisiológicamente

activa, mientras que la auxina que se extrae por difusión es el exceso que se encuentra en

equilibrio con la auxina combinada.

Las auxinas se encuentran en toda la planta, localizándose las más altas

concentraciones en las regiones meristemáticas en crecimiento activo (figura 2.3).

Cuando se encuentra conjugada, la auxina puede hallarse metabolicamente unida a

péptidos de cadena lo suficientemente largos para hacerla insoluble, asociada a

aminoácidos o formando glicósidos. La concentración de auxina libre en plantas varía de 1

a 100 mg/kg. En contraste, la concentración de auxina conjugada es sustancialmente más

elevada.

El elemento central en el almacenaje de auxinas es el indol-3-etanol; este no es

convertible directamente en IAA; el indol-3-etanol procede del indol-3-acetaldehído. A pH

básico, éste es reducido por una alcohol deshidrogenasa que emplea el NADPH2 como

coenzima, reacción que se revierte a pH ácido. Por otro lado, a pH ácido se produce la

Capítulo 2

54

activación de la enzima indol-3-acetaldehído deshidrogenasa, provocando que la

formación de IAA sea inmediata.

Figura 2.3. Distribución de las hormonas vegetales en la planta.

Una característica sorprendente de la auxina es la fuerte polaridad exhibida en su

transporte a través de la planta. La auxina es transportada por medio de un mecanismo

dependiente de energía, alejándose desde el punto apical de la planta hacia su base. Este

flujo de auxina reprime el desarrollo de brotes axiales laterales a lo largo del tallo,

manteniendo de esta forma la dominancia apical.

El transporte de auxinas ha sido medido y estudiado en diferentes tipos de tejidos y

de estos estudios ha podido llegarse a la conclusión de que la velocidad de transporte es:

- Independiente de la longitud del tejido.

- Independiente de la concentración de auxina en el bloque donador, lo que a su vez

indica que no se trata de un proceso de difusión.

- Varía con la edad y tipo de tejidos.

- Se ve influenciada por la temperatura, de manera que un aumento de la

temperatura provoca un aumento de la velocidad.

- Requiere la presencia de una carga negativa en el grupo carboxilo de la cadena

lateral separada por una distancia de 0,5 nm de una carga residual positiva.


55

- El anillo indólico no es esencial para la actividad auxínica, aunque un anillo

aromático está presente en la gran mayoría de los compuestos auxínicos.

Los lugares más importantes de síntesis de auxina son: las hojas jóvenes en

expansión, el tejido cambial, los ovarios inmaduros y semillas en desarrollo. Sin embargo,

otros tejidos, aunque en menor medida, también tienen la capacidad de sintetizar IAA

(hojas maduras, tallos y raíces).

2.2. Aplicaciones en la agricultura

Aunque las auxinas están reconocidas como hormonas muy importantes en el

desarrollo de las plantas, su utilización comercial en la agricultura ha sido muy limitada en

relación a otras como las giberelinas. En general, las plantas tratadas con auxinas no

muestran respuestas significativas en su crecimiento vegetativo (tallo, hoja), y sólo hay

ciertos procesos en donde se observan efectos directos como son: la reproducción asexual

bien sea por estacas, esquejes, etc., el amarre del fruto, la estimulación del crecimiento del

fruto joven o la inhibición de la caída en etapa madura y, por último, la acción como

herbicida.

3. ÁCIDO 1-NAFTILACÉTICO

3.1. Características estructurales

El ácido 1-naftilacético (NAA) es un derivado del naftaleno perteneciente al grupo

de las auxinas.

Figura 2.4. Estructura del ácido 1- naftilacético (NAA).

Según los datos actualizados hasta el 1 de enero de 2012 en el Vademecum de

productos fitosanitarios, existen diferentes formulaciones comerciales disponibles en el

Capítulo 2

56

mercado para el ácido 1-naftilacético, el cual también puede encontrarse formulado con

otros fitorreguladores como el 2,4-D, éster isopropílico o ácido giberélico, siendo algunas

de las casas comerciales en las que podemos encontrarlos disponibles Bayer, Cequisa,

Nufarm, Probelte y Sapec.

Como consecuencia de su uso en la agricultura, se puede esperar la presencia de

pequeñas cantidades del mismo en la fruta, en los suelos o en las aguas subterráneas.

Como medida preventiva, se aconseja que este producto se aplique a los cultivos en

concentraciones bajas, debido a su toxicidad tanto para los mamíferos como para las aves

[2.3-2.5], siendo su actividad biológica suficiente a una concentración de 20-100 mg/L

[2.6]. Así pues, sólo pequeñas cantidades del ácido 1-naftilacético pueden ser detectadas

en el suelo y en la fruta, lo que hace que su control sea problemático, y se requiera del

desarrollo de nuevos métodos de análisis más selectivos y sensibles.

3.2. Campo de actividad

Ampliamente utilizado en la agricultura como regulador del crecimiento vegetal,

entre sus usos se puede encontrar que favorece el enraizamiento, que puede actuar como

biocida y que puede ser usado de forma preventiva para evitar la caída prematura de

frutas, tales como manzana, mango, pera, fresa, tomate, melocotón, nectarina, naranja,

pomelo, ciruelo, uva y olivo [2.1,2.2]. Las funciones principales del ácido 1-naftilacético

son:

- Promueve la latencia en yemas y semillas.

- Inhibe la división celular.

- Causa el cierre de los estomas.

- Favorece el raleo químico.

- Evita la caída prematura del fruto.

3.3. Determinaciones

Han sido descritos diferentes métodos para la determinación de ácido

1-naftilacético en agua [2.7], productos fitosanitarios [2.8], suelos [2.9,2.10], frutas o

vegetales [2.11].

El uso de distintos métodos para la determinación de NAA han sido descritos en la

bibliografía, encontrándose entre ellos la cromatografía líquida [2.12-2.16], cromatografía

de gases (CG) [2.17-2.19] y CG acoplada a espectrometría de masas [2.20]. Además su


57

determinación ha sido llevada a cabo por espectrofluorimetría [2.21-2.25], fosforescencia

a temperatura ambiente inducida por β-ciclodextrinas o usando un agente micelar

[2.11,2.26-2.31], por espectrometría de absorción molecular [2.32,2.33] y por métodos

electroquímicos [2.34].

4. ÁCIDO 2-NAFTOXIACÉTICO


El ácido 2-naftoxiacético (NOA) es un derivado del naftaleno que pertenece

también al grupo de las fitohormonas vegetales denominadas auxinas.

Figura 2.5. Estructura del ácido 2-naftoxiacético (NOA).


Se trata de un regulador del crecimiento vegetal que ha sido ampliamente utilizado

en la agricultura especialmente en las uvas, piñas, manzanas [2.35], fresas [2.36] y tomates

[2.37]. En condiciones en las que la polinización de las flores está desfavorecida, el uso de

NOA estimula las flores para dar fruto y las mantiene en la planta. Parte del NOA, una vez

que entra en contacto con la planta, se transforma en su metabolito β-naftol, el cual

también puede ser determinado [2.38]. Las funciones principales del ácido

2-naftoxiacético son:

- Ha demostrado ser útil como hormona sintética vegetal para prevenir la caída

temprana de la fruta.

- Promueve el crecimiento de las raíces, tallos, flores y frutas.

- Mejora tanto el tamaño como el color de las frutas y hortalizas.

Capítulo 2

58

A pesar de no ser una sustancia muy tóxica, puede ser peligrosa si se consume en

grandes cantidades lo que hace necesario el desarrollo de métodos de análisis que permitan

su determinación.


El uso de distintos métodos para la determinación de NOA ha sido descrito en

bibliografía, encontrándose entre ellos los métodos cromatográficos de líquidos y gases

[2.39-2.44] o la electroforesis capilar [2.45]. Recientemente también se ha desarrollado el

empleo de optosensores para llevar a cabo su determinación [2.62].

Asimismo, han sido utilizados los métodos luminiscentes debido a su gran

selectividad y sensibilidad, como la fluorescencia [2.46,2.47], la fosforescencia a

temperatura ambiente inducida por átomo pesado [2.58-2.50], fosforescencia a

temperatura ambiente estabilizada por micelas [2.51,2.52], fosforescencia en presencia de

ciclodextrinas [2.53-2.55], fosforescencia a baja temperatura [2.56-2.58], fosforescencia a

temperatura ambiente en soporte sólido [2.59,2.60] o fosforescencia a temperatura

ambiente en presencia de microemulsiones, utilizando la derivada del espectro sincrónico

de ángulo variable para la resolución de mezclas [2.61].

5. ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIPROPANOICO


El ácido 2,4-diclorofenoxipropanoico (2,4-DP, diclorprop o dicloroprop) es un

herbicida hormonal que se caracteriza por ser selectivo, sistémico (es absorbido por las

hojas y traslocado hacia las raíces) y por poseer actividad como regulador del crecimiento

según sea la dosis aplicada y el momento de la aplicación.

Figura 2.6. Estructura del ácido 2,4-diclorofenoxipropanoico ( 2,4-DP). (* Carbono asimétrico).


59

Como se muestra en la figura 2.6, el 2,4-DP presenta un carbono asimétrico siendo

el isómero (+) el que proporciona la actividad biológica como herbicida. Se trata de una

auxina que induce la síntesis de etileno, actuando sobre la actividad enzimática,

respiración y división celular, y que al aplicarse antes de la caída fisiológica de los frutos

ejerce un importante efecto raleador provocando la abscisión de un porcentaje elevado de

frutos. En el mercado existen diferentes formulaciones comerciales del 2,4-DP, el cual

puede encontrarse en forma de su sal amina o el éster-2-etilhexil, o bien, formulado con

otros productos fitosanitarios como el MCPA (ácido 2-metil-4-clorofenoxiacético) o el

MCPP (mecoprop), siendo algunas de las casa comerciales en las que pueden encontrarse

Nufarm, I.Q. del Vallés o Kenogard. El 2,4-DP pertenece a la familia de herbicidas

clorofenoxiácidos que incluye:

Figura 2.7. Nombre y estructuras de algunos derivados clorofenoxiácidos.

Por otro lado, el 2,4-DP presenta tiempos de vida media que pueden oscilar entre

los 10 y 1200 días, produciéndose su degradación a través de la ruptura de la cadena

lateral y generándose 2-diclorofenol, por la hidroxilación del anillo y la apertura del

mismo.

Capítulo 2

60


El 2,4-DP presenta actividad como herbicida si se utiliza su éster etilhexil, mientras

que si se utiliza su sal amina aplicada a las dosis adecuadas, actúa como fitorregulador,

retrasando la formación de la zona de abscisión en el pedúnculo del fruto, con lo que

impide su desprendimiento, continuando los procesos de maduración con normalidad, y

persistiendo su acción de 2 a 4 semanas. Está indicado para adelantar y mejorar la

coloración de la fruta; cuando las plantaciones se encuentran establecidas en zonas de

fuerte viento y, en general, siempre que se quiera retrasar el desprendimiento de manzano,

peral, albaricoquero, limonero, mandarino, melocotonero y sus variedades (nectarino,

etc.), naranjo y ciruelo, con el fin de favorecer el engorde del fruto.


Han sido descritos diferentes métodos para la determinación de 2,4-DP mediante

cromatografía líquida o de gases [2.63-2.69], en aguas superficiales y subterraneas por

extracción off-line en fase sólida, cromatografía de gases con captura de electrones,

cromatografía líquida con derivatización post-columna y detección por fluorescencia

[2.70] y determinación por cromatografía electrocinética micelar (MEKC) con detección

fluorimétrica inducida por láser [2.71].

También han sido descritos numerosos trabajos mediante inmunoensayos, con los

cuales parece obtenerse mejores resultados que con la cromatografía de gases o la

cromatografía de líquidos para determinar un residuo específico dentro de una matriz

compleja [2.72-2.81], y de inmunoensayo con detector de carga acoplada en serie [2.82].

En 2006, Papadopoulou-Mourkidou [2.83] diseñó un sistema en línea basado en una

separación previa en fase sólida, acoplado a un sistema de HPLC y seguido de una

derivatización post-columna y detección para la determinación de 2,4-DP. También ha

sido llevada a cabo su determinación con electroforesis capilar con detección fluorimétrica

inducida por láser [2.84]. Además, ha sido estudiado mediante análisis por inyección en

flujo (FIA) con fluorescencia inducida fotoquímicamente [2.85] y, por electroforesis

capilar [2.86,2.87].


61

6. ÁCIDO 3,5,6-TRICLORO-2-PIRIDILOXIACÉTICO


El Ácido 3,5,6-tricloro-2-piridiloxiacético (triclopyr o TCP) es un herbicida

hormonal con actividad reguladora del crecimiento, derivado del ácido picolínico. En el

mercado puede encontrarse formulado con éster butoxietílico o con otros herbicidas como

el fluoroxipir o la clopiralida, siendo algunas de las casas comerciales en las que podemos

encontrarlos Nufarm o Dow Agrosciences Ibérica. Posee actividad herbicida selectiva, es

absorbido rápidamente por las raíces y por las hojas, traslocado por toda la planta y

acumulado en los tejidos meristémicos, pudiendo provocar respuestas de tipo auxínico en

las especies sensibles a él.

Figura 2.8. Estructura del ácido 3,5,6-tricloro-2-piridiloxiacético ( TCP).

El TCP pertenece a la familia de herbicidas derivados del ácido picolínico, la cual

incluye derivados como el clorpiralid y Picloram. Su vía de degradación principal en los

sistemas terrestres es la microbiológica, producida por actinomicetes (Nocardia y

Streptomyces), bacterias (Pseudomonas y Corinebacterium) y hongos (Aspergillus Níger)

dependiendo de la temperatura y del contenido de materia orgánica, textura y humedad del

suelo. Su tiempo de vida media puede variar entre los 8 y los 1300 días por lo que se hace

necesario un control estricto tanto de su uso como en su determinación.


El TCP puede tener actividad herbicida cuando se utiliza el éster butoxietílico. Es

un herbicida sistémico que a la dosis de aplicación normal afecta a especies de hoja ancha.

El concentrado emulsionable del 48%, éster butoxietílico, puede ser utilizado en el

desyerbe de caminos, cortafuegos, recintos industriales, redes de servicios, terrenos

forestales y vías férreas.

http://www.terralia.com/vademecum_de_productos_fitosanitarios_y_nutricionales/index.php?proceso=indice&tipo=cultivo_registros&cultivo=402&base=2011







Capítulo 2

62

Con actividad como fitorregulador se usa el ácido, el cual se emplea en

plantaciones de albaricoquero, nectarino, citricos y de hortalizas como el tomate. Cuando

los frutos alcanzan un determinado diámetro, favorece su crecimiento y desarrollo, a la vez

que induce la formación de azúcares, con lo que se adelanta la madurez unas 2 semanas,

siendo la piel de los frutos tratados con TCP más resistente que la de los no tratados a la

vez que posee un color más vivo.

6.3. Determinación

Los métodos más importantes utilizados para la determinación del TCP son la

cromatografía de gases [2.88], la cromatografía acoplada a la separación con fluidos

supercríticos y detección UV [2.95,2.96], ELISA [2.89], la cromatografía de gases con

columna capilar acoplada con espectrometía de masas [2.90], ELISA como un

complemento del análisis por HPLC [2.91], inmunoensayo [2.93], con inmunosensores

piezoeléctricos [2.94] y, fluoroinmunoensayo de polarización homogénea (PFIAs) [2.92].

7. GIBERELINAS

7.1. Estructura química

Las giberelinas (GAs) son ácidos diterpenos tetracíclicos naturales, cuya estructura

básica está constituida por un anillo de ent-giberelano, algunos de los cuales posee

actividad hormonal [2.97], cuya estructura se forma por ciclación de estas unidades

formando kaureno, a través del camino metabólico del ácido mevalónico. Su síntesis se

produce en todos los tejidos de los diferentes órganos y puede estar afectada, aparte de

por procesos internos de retroalimentación negativa, por factores externos como la luz,

que según su duración lleva a la producción de las giberelinas, las cuales pueden actuar

como reguladores endógenos del crecimiento controlando diversos procesos del desarrollo

de las plantas como la germinación, la elongación del tallo, la expansión de las hojas, el

desarrollo de los tricomas y la inducción de flores y frutos [2.98-2.101].

Hacia 1935, se utilizó por primera vez el término giberelina, cuando unos

fitopatólogos japoneses descubrieron una sustancia producida por el hongo Gibberella

fujikuroi que causa crecimiento excesivo de los tallos y brotes de la planta del arroz,

provocando la enfermedad conocida como “bakanae”. A mediados de los años 50, se

aisló, a partir del filtrado secretado por el hongo, el compuesto inductor del crecimiento



63

del tallo que se denominó ácido giberélico (giberelina GA3 o AGB). Posteriormente, se

aislaron en plantas compuestos de estructuras similares al ácido giberélico, y fue en ese

momento cuando las giberelinas adquieron mayor importancia para los fisiólogos

vegetales [2.97,2.102].

Actualmente se conocen al menos 136 giberelinas presentes en plantas, hongos y

bacterias, a las que se les ha asignado un número (GA1, 2, 3, ... n) según el orden

cronológico de su descubrimiento [2.103].

Las giberelinas se clasifican en dos grupos atendiendo al número de átomos de

carbono presentes en su estructura: las GAs C-20, con 20 átomos de carbono en el

esqueleto de ent-giberelano, y las GAs C-19, con 19 átomos de carbono.

Las GAs C-20 presentan varios estados de oxidación del carbono 20 (C-20) que se

puede encontrar como un grupo metilo (-CH3), hidroximetilo (-CH2OH), aldehído (CHO)

o carboxilo (-COOH). Aquellas que poseen un grupo aldehído en el C-20, pueden perder

ese carbono por descarboxilación oxidativa, formándose una γ-lactona, y dando lugar a las

GAs C-19, entre las que se encuentran la activas biológicamente, y en las que la presencia

o ausencia de grupos hidroxilo y la estequiometría de los mismos en las posiciones C-2,

C-3 y C-13 del ent-giberelano de las GAs C-19 determina la existencia o no de su

actividad biológica. En la figura 2.9 se pueden ver las estructuras químicas de algunas

giberelinas.

Figura 2.9. a) AGB. b) ent-giberelano. c) ent-kaureno.

Las giberelinas provocan la división celular al acortar la interfase del ciclo celular e

inducir las células en fase G1 a sintetizar ADN. Por otro lado, promueven la elongación

(a)

(b) (c)

Capítulo 2

64

celular al incrementar la plasticidad de la pared y aumentar el contenido de glucosa y

fructosa, lo que lleva al ingreso de agua en la célula y produce su expansión. Además,

participan en el transporte de calcio, pudiendo también actuar a nivel génico para provocar

algunos de sus efectos fisiológicos. Entre sus funciones principales destacan:

- Controlan el crecimiento y elongación de los tallos.

- La elongación del escapo floral.

- La inducción de floración en plantas cultivadas en épocas no apropiadas.

- Promueven el crecimiento y desarrollo del fruto.

- Estimulan la germinación de numerosas especies y, en cereales, movilizan reservas

para el crecimiento inicial de la plántula.

- Inducen la formación de flores masculinas en plantas de especies clínicas.

- Reemplazan la necesidad de vernalización para inducir la floración en algunas

especies.

- Interrumpen el periodo de latencia de las semillas, haciéndolas germinar.

- Inducen la brotación de yemas.

- Promueven el desarrollo de los frutos (floración).

- Estimulan la germinación de semillas.

- Favorecen el amarre, crecimiento y maduración de los frutos.

8. ÁCIDO GIBERÉLICO


El ácido giberélico (AGB) es una fitihormona, perteneciente a la familia de las

giberelinas (Figura 2.10).

Figura 2.10. Estructura química del ácido giberélico (AGB).


65

Es un fitorregulador del crecimiento caracterizado por sus efectos fisiológicos y

morfológicos que actúa a concentraciones extremadamente bajas, es traslocado en el

interior de la planta y, generalmente, sólo afecta a las partes aéreas. Su efecto más claro

consiste en acelerar el crecimiento vegetativo de los brotes, produciendo plantas más

grandes. Este efecto se debe principalmente a la elongación de las células pero, en algunos

casos, la multiplicación celular también se ve incrementada. Además actúa:

- Reforzando la dominancia apical.

- Estimulando la floración.

- Rompiendo la dormición de las semillas (acelerando la germinación de algunas

semillas).

- Rompiendo la dormición de los órganos vegetativos (induciendo la brotación de

bulbos y tubérculos).

- Suprimiendo el estrés producido por algunos virus.

- Reduciendo los efectos senescentes producidos por Geotrichum candidum en

cítricos tratados con AGB en postcosecha, antes de almacenarlos.

Existen diferentes formulaciones comerciales disponibles en el mercado para el

ácido ácido giberélico, el cual también puede encontrarse formulado con otros

fitorreguladores como el 2,4-D, naftalenacetamida o el MCPA, siendo algunas de las casas

comerciales en las que podemos encontrarlos disponibles Bayer, Lainco o Nufarm.


Las aplicaciones de las giberelinas son muy numerosas. El AGB, por ejemplo,

puede usarse: en alcachofa, para inducir el crecimiento; en clementino, naranjo y

limonero, para inducir el cuajado y la fijación del fruto; en fresa, para adelantar la

floración y favorecer el engorde del fruto o en peral, para favorecer el cuajado. También se

ha utilizado para aumentar la producción en alfalfa, malta, cebada y algodón, para mejorar

la calidad y tamaño de los frutos de cereza, y para aumentar el rendimiento en ciruelo.

El AGB también ha sido empleado para favorecer el crecimiento de verduras y

hortalizas, tales como espinacas, guisantes, lechuga, judías, berenjenas, calabacines o

tomates, y así mismo se ha utilizado para aumentar el tamaño de los frutos y facilitar el

manejo y transporte de los frutos durante y después de la cosecha en melón y sandía.

Capítulo 2

66

8.3. Determinación

Para la determinación del ácido giberélico han sido empleadas diversas técnicas,

tales como cromatografía líquida, espectrofotometría UV-visible, voltametría y

espectrofluorimetría [2.104-2.107].

9. DERIVADOS BENCIMIDAZÓLICOS

Los bencimidazoles son fungicidas sistémicos cuyo modo de acción es la

inhibición del ensamble de los microtúbulos, impidiendo así el proceso de división celular.

Poseen actividad antimicótica sobre un amplio rango de hongos fitopatógenos en su

mayoría Ascomicetes, hongos imperfectos (Deuteromicetes) o sobre algunos

Basidiomicetes.

Figura 2.11. Nombre y estructuras de algunos derivados bencimidazólicos.

Estos compuestos penetran rápidamente en la planta a través de las raíces y las

hojas, y son absorbidos y transportados por el xilema. Debido a la especificidad del sitio

de acción, estos fungicidas se consideran sitio-específicos, pudiendo llegar directamente a

Benomyl

Fuberidazol

Tiabendazol

Carbendazima


67

flujos de agua naturales o ser degradados a través del terreno, donde pueden permanecer

algunos años tras su aplicación.

10. TIABENDAZOL


El 2-(4-Tiazolil) benzimidazol (Tiabendazol, TBZ), es un derivado

benzimidazólico con propiedades antifúngicas.

Figura 2.12. Estructura química del Tiabendazol.

En el mercado se puede encontrar como medicamento bajo el nombre de Triasox

110ml suspension de laboratorios Berna Biotech España, o formulado con acetato de

guazatina, ceras, ceras + imazalil y fosetil-A de la casa comercial Tecnidex.


El TBZ es utilizado como conservante en la industria alimentaria (E-233), como

fungicida en frutas y en almacenes para evitar su contaminación por hongos inhibiendo su

división celular y en el tratamiento de la helmitiasis. Su asociación con otros fungicidas se

caracteriza por conseguir un campo de actividad más amplio que el de sus componentes

por separado, a la vez que reducen la posibilidad de que aparezcan razas resistentes. Se

absorbe por raíces y hojas e impide la mitosis al unirse a la tubulina por lo que se altera el

crecimiento del hongo.

10.3. Determinación

La determinación de tiabendazol ha sido llevada a cabo por numerosas técnicas

cromatográficas, tales como la determinación por cromatografía líquida con detección UV

[2.108-2.111], acoplada a espectrometría de masas [2.112-2.117] o con detección por

fluorescencia [2.118-2.120], y la determinación por cromatgrafía gas-líquido de captura

electrónica [2.121]. El uso de técnicas electroforéticas también supone un amplio campo

N

N

H

N

S

Capítulo 2

68

de aplicación [2.122]. Por ejemplo, la determinación por electroforesis capilar acoplada a

la detección por espectrometría de masas [2.123] o el uso de HPLC para la determinación

de tiabendazol en muestras de aditivos [2.124], mermeladas [2.125] o suelos [2.126].

Por otro lado, las técnicas fluorimétricas también resultan interesantes para la

determinación de tiabendazol [2.127-2.129], al igual que las fosforimétricas [2.130-2.133].

En cuanto al campo de aplicación, este compuesto ha sido determinado en cítricos

[2.132], plátanos [2.134], tomate, manzana o pera [2.135] vinos [2.136], agua [2.137],

leche [2.138] o suero humano [2.139].


69


[2.1] N.B. Mandava, Editor, Plant Growth Substances, ACS Series III, American

Chemical Society, Washington, (1979).

[2.2] C. de Liñán, Vademecum de Productos Fitosanitarios y Nutricionales, Embajadores,

Madrid, (1994).

[2.3] W. W. Shindy, L. S. Jordan, V. A. Jolliffe, C. W. Coggins, J. Kumamoto. J. Agric.

Food Chem. 21, 629-631, (1973).

[2.4] N. B. Mandava, Ed. Plant Growth Substances. ACS Series III; American Chemical

Society: Washington, DC, (1979).

[2.5] C. De Liñan, Vademécum de Productos Fitosanitarios y Nutricionales; Agrotécnicas

S.L.: Madrid, Spain, (2001).

[2.6] R. Sigrist, A. Temperli, J. Hurter, J. Agr. Food Chem. 22, 568, (1974).

[2.7] M.T. Fernández. Talanta. 66, 696-702, (2005).

[2.8] A. Navalón, R. Blanc, J. L. Vilchez. Mikrochimi. Acta. 126, 33-38, (1997).

[2.9] H. Wensheng, Q. Wanyun, Z. Dazhai, Bull Korean. Chem Soc. 29, 7, 1323-1326,

(2008).

[2.10] J. L. Vilchez, R. Blanc, A. Navalón. Talanta. 45, 105-111, (1997).

[2.11] J. A. Murillo Pulgarín, P. Fernández López, L. F. García Bermejo, F. Martín

Alfonso. J. Agric. Food Chem. 51, 6380-6385, (2003).

[2.12] H. A. Moye, T. A. Wheaton. J. Agric. Food Chem. 27, 291-294, (1979).

[2.13] W. P. Cochrane, M. Lanouette, R. Grant, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 63, 145-148,

(1980).

[2.14] T. E. Archer, J. D. Stokes, J. Agric. Food Chem. 31, 286-288, (1983).

[2.15] B. Maiti, S. R. Desai, T. S. Krishnamoorthy. Analyst. 113, 667-668, (1988).

[2.16] X. J. Wang, J. W. Wei. Sepu. 18, 563-565, (2000).

[2.17] G. Zweig, D.L. Gutnick, R. Gulli, T.e. Archer, H.T. Hartmann. J. Agric. Food

Chem. 12, 59, (1964).

[2.18] T. Nagayama, I. Takano, M. Kobayashi, Y. Tamura, S. Tomizawa, Y. Tateishi, N.

Kimura, K. Kitayama, K. Saito. J. Food Hygienic So. 44, 126, (2003).

[2.19] A. Terashi, A. Kido, R. Shinohara, R. Bunseki-Kagaku. 34, 420-422, (1985).

[2.20] Y. Zhou, W. J. Zhuang. Fenxi-Huaxue. 21, 992, (1993).

[2.21] R. Sigrist, A. Temperli, J. Hurter. J. Agric. Food Chem. 22, 568-570, (1974).

Capítulo 2

70

[2.22] F. García Sánchez, C. Cruces Blanco. Mikrochim. Acta. 2, 49-54, (1989).

[2.23] J. L. Vilchez, R. Blanc, A. Navalón. Anal. Lett. 29, 233-248, (1996).

[2.24] A. Navalón, R. Blanc, J. L. Vilchez. Mikrochim. Acta. 126, 33-38, (1997).

[2.25] J. L. Vilchez, R. Blanc, A. Navalón. Talanta. 45, 105-111, (1997).

[2.26] J. J. Aaron, E. M. Kaleel, J. D. Winefordner. J. Agric. Food Chem. 27, 1233-1237,

(1979).

[2.27] J. J. Aaron, J. D. Winefordner. Analusis. 7, 168-171, (1979).

[2.28] S. Zhang, C. Liu, Y. Bu. Fenxi-Huaxue. 16, 494-497, (1988).

[2.29] A. Muñoz de la Peña, F. Salinas, M.J. Gómez, M.I. Acedo, M.Sánchez Peña. J. Incl.

Phenom. 15, 131, (1993).

[2.30] A. Segura-Carretero, C. Cruces-Blanco, F. Ales-Barrero, A. Fernández-Gutiérrez,

A. J. Agric. Food Chem. 46, 561-565, (1998).

[2.31] J. Kuijt, F. Ariese, U.A.T. Brinkman, C. Gooijer. Anal. Chim. Acta. 488, 135,

(2003).

[2.32] C. Bache, L. Edgerton, D. Lisk. J. Agric. Food Chem. 10, 365, (1962).

[2.33] K. Helrich, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical

Chemists, 15th ed., (1990), VA, USA.

[2.34] Lu, S. F. Anal. Lett. 36, 1523, (2003).

[2.35] A. Segura Carretero, C. Cruces Blanco, A. Fernández Gutiérrez. J. Agric. Food

Chem. 46, 3683-3686, (1998).

[2.36] T. E. Archer, J. D. Stokes. J. Agric. Food Chem. 26, 1465, (1987b).

[2.37] T. E. Archer, J. D. Stokes. J. Agric. Food Chem. 26, 452, (1978a).

[2.38] A. Rosenberg, M. Alexander. J. Agric. Food Chem. 28, 4, (1980).

[2.39] T.E. Archer, J.D. Stokes. J. Agric. Food Chem. 26, 452–455, (1978).

[2.40] T.E. Archer, J.D. Stokes, J. Agric. Food Chem. 36, 1307–1309, (1988).

[2.41] W. Specht, M. Tillkes, Fresenius Z. Anal. Chem. 307, 257–264, (1981).

[2.42] M. Baldi, A. Bovolenta, L. Penazzi, C. Pederzini, S. Buriani, F. Pocaterra.

Industria-Conserve. 60, 304–309, (1985).

[2.43] V. Gökmen, J. Acar. Journal of Chromatography A. 798, 167-171, (1998).

[2.44] V. Gokmen, J. Acar. Journal of Chromatography A. 798, 167–171, (1998).

[2.45] A. Segura Carretero, C. Cruces-Blanco, M.S. Pena, S.C. Ramirez, A.F. Gutierrez. J.

Agric. Food Chem. 52, 1419–1422, (2004).

[2.46] A.S. Carretero. J. Agric. Food Chem. 46, 3683-3686, (1998).

[2.47] A.W. Davidson, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 53, 179, (1970).


71

[2.48] F.G. Sánchez, C.C. Blanco. Anal. Lett. 21, 889–899, (1988).

[2.49] A. S. Carretero, C. C. Blanco, B. C. Daz, A. F. Gutierrez. Analytica Chimica Acta.

361, 217-222, (1998).

[2.50] L. Long-Di, C. Xiao-Kang C, M. Lan, L. Wen-qing, T. Ai-Jun. Analytica Chimica

Acta. 424, 177–183, (2000).

[2.51] A. S. Carretero, C. C. Blanco, A. F. Gutiérrez. Talanta. 43, 1001-1007, (1996).

[2.52] T. Vo-Dinh. Room Temperature Phosphorimetry for Chemical Analysis, John

Wiley. New York. (1984).

[2.53] R.J. Hurtubise. Phosphorimetry. Theory, Instrumentation and Applications, VCH

Publishers. New York, (1990).

[2.54] A. Mutioz de la Petia and I. Duran-Meras. Talanta. 40, 1657, (1993).

[2.55] Li L.; Hai X.; Tong A. Spectrochimica Acta Part A. 56, 1513–1521, (2000).

[2.56] L.B. Sanders and J.D. Winefordner. J. Agric. Food Chem. 20, 166, (1972).

[2.57] N.L. Trautwein and J.C. Guyon. Mikrochim. Acta. Part 1. 413, (1979).

[2.58] J.J. Aaron, E.M. Kaleel and J.D. Winefordner. J. Agric. Food Chem. 27, 1233,

(1979).

[2.59] M. Roth. J. Chromatogr. 30, 276, (1967).

[2.60] J.J. Aaron and J.D. Winefordner. 7, 168, (1979).

[2.61] A. S. Carretero, C. C. Blanco, A. F. Gutiérrez, Analyst. 122, 925–929, (1997).

[2.62] B. Blessingting, N. Crabb, S. Karkee, A. Northage. J. Chromatogr. 469, 183-190,

(1989).

[2.63] E.R. Bogus, T.L. Watschke, R.O. Mumma. J. Agr. Food Chem. 38, 142-144,

(1990).

[2.64] W. Schuessler. Chromatographia, 29, 24-30, (1990).

[2.65] H. Steinwandter, Z. Fresenius. Anal. Chem. 334, 133-135, (1989).

[2.66] W.C. Vaughan. Anal. Chim. Acta, 131, 307-310, (1981).

[2.67] J. Hodgeson, J. Collins, W. Bashe, J. Chromatogr., 659, 395, (1994).

[2.68] V. Coquart, M. C. Hennion, The Science of the Total Environment, 132, 349,

(1993).

[2.69] S. Toshinari, W. Satoru. Journal of AOAC International. 75(4), 720-4, (1992).

[2.70] I. Vassilakis, D. Tsipi, M. Scoullos. Journal of Chromatography. 823, 49-58,

(1998).

[2.71] J. Martin, W. C. Brumley. From Journal of Chromatography. A, 717, 299-308,

(1995).

Capítulo 2

72

[2.72] B. D. Hammock, R. O. Mumma. Pesticide Analytical Methodology (Harvey, J.,

Zweig, G., Jr., Eds.), ACS Symposium Series No. 136, Vol. 18, pp. 321-352, American

Chemical Society, Washintong.

[2.73] E. M. Thurman, M. Meyer, M. Pomes, C. A. Perry, A. P. Schwab. Anal. Chem, 62,

2043-2048, (1990).

[2.74] J. M. Van Emon, J. N. Seiber, B. D. Hammock. Bioregulators for Pest Control

(Hedin, P. A., Ed.), ACS Symposium Series No. 136, Vol. 22, pp. 307-316, American

Chemical Society, Washington.

[2.75] M. Franck, V. Kolar, M. Granatova, Z. Nevorankova. J. Agric. Food. Chem. 42,

1369, (1994).

[2.76] J. Fleeker, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 70, 874, (1987).

[2.77] J. C. Hall, R. J. A. Deschamps, K. K. Krieg, J. Agric. Food Chem, 37, 981, (1989).

[2.78] S. A. Eremin, E,erging Technoloies in Inmmonoanalysis of Agrochemicals (J. O.

Nelson, A. E. Karu y R. B. Wong, Eds.) ACS Symposium Series 586, Washington D. C.,

Chap., 16, 223, (1995).

[2.79]F. García Sánchez, A. Navas Díaz, J. Lovillo. Analytical

Biochemistry (1996), 239(1), 2-7. ).

[2.80] F. Sánchez García, A. Navas, J. Lovillo. Analytical Biochemistry. 214(2), 359-65,

(1993).

[2.81] F. García Sánchez, A. Navas, F. Alonso, J. Lovillo. Journal of Agricultural and

Food Chemistry. 41(11), 2215-19, (1993).

[2.82] F. García Sánchez A. Navas, J. Lovillo. Analytical biochemistry. 239(1), 2-7,

(1996).

[2.83] E. Papadopoulou-Mourkidou, J. Patsias, A. Koukourikou. Methods

Biotechnology ,19, 435-451, (2006).

[2.84] Y. Mechref, Z. El Rassi. Electrophoresis. 18(2), 220-226, (1997).

[2.85] L. F. García, S. Eremin, J. J. Aaron. Analytical Letters. 29(8), 1447-1461, (1996).

[2.86] Y. Mechref, Z. El Rassi. Electrophoresis. 18(2), 220-226, (1997).

[2.87] Y. Mechref, Z. Rassi. Analytical Chemistry. 68(10), 1771-7, (1996).

[2.88] K.C. Ting, C.S. Lee, J. Chromatogr. 690, 119, (1995).

[2.89] B.D. Johnson, J.C. Hall, J. Agric. Food Chem. 44, 488, (1996).

[2.90] P. Begley, B.E. Foulger, J. Chromatogr. 438,45, (1988).

[2.91] J.B. Fischer, J.L. Michael, Bull. Environ. Contam. Toxicol. 59, 611–618, (1997).

[2.92] F. García Sánchez, A. Navas Díaz, A.F. González Díaz, J. Lovillo


73

Analytica Chimica Acta. 439, 131–138, (2001).

[2.93] A. Velasco-Arjona, J. J. Manclús, A. Montoya, M. D. Luque de Castro. Talanta.

45(2), 371-377, (1997).

[2.94] C. March, J.J. Manclús, Y. Jiménez, A. Arnau, A. Montoya. Talanta.78(3), 827-

833, (2009).

[2.95] J. L. Luque-García, M. D. Luque de Castro. Journal of Chromatography A. 959(1-

2), 25-35, (2002).

[2.96] M. M. Jiménez-Carmona, J. J. Manclús, A. Montoya, M. D. Luque de Castro.

Journal of Chromatography A. 785(1-2), Issues 1-2, 329-336, (1997).

[2.97] J. Azcón-Bieto y M. Talón (eds).Giberelinas. En: Fundamentos de Fisiología

Vegetal. Interamericana Mc Graw Hill, España, pp. 325-341.

[2.98] R. P. Pharis, R. W. King. Annu. Rev. Plant Physiol. 36, 517-568, (1985).

[2.99] A. K. Huttly, A. L. Phillips. Physiol. Plant. 95, 310-317, (1995).

[2.100] V. M. Sponsel, P. J. Davies (ed). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The

Netherlands.. 66-97, (1995).

[2.101] P. Hedden, Y. Kamiya. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 431-460,

(1997).

[2.102] P. Hedden, W. M. Proebsting. Plant Physiol. 119, 365-370, (1999).

[2.103] J. MacMillan, N. Takahashi. Nature 217, 170-171, (1968).

[2.104] Z. Zhang. Pesticide. 31, 26, (1992).

[2.105] J. Gordon, J. Agr. Food Chem., 15, 520, (1968).

[2.106] Agricultural Academy of China, Pesticide Analysis, Chemical Industrial Press,

Beijing, 529, (1988).

[2.107] J. Zhiliang, L. Xuhong, L. Aihui. Analytica Chimica Acta. 346, 249-252, (1997).

[2.108] A. Di Muccio, I. Camoni, M. Ventriglia, D. Attard Barbini, M. Mauro, P. Pelosi,

T. Generali, A. Ausili, S. Girolimetti. Journal of Chromatography A. 697(1-2), 145-152,

(1995).

[2.109] Y. Ito, Y. Ikai, H. Oka, J. Hayakawa, T. Kagami. Journal of Chromatography A.

810(1-2), 81-87, (1998).

[2.110] N. Tharsis, J.L. Portillo, F. Broto-Puig, L. Comellas. Journal of Chromatography

A. 778(1-2), 95-101, (1997).

[2.111] A. Di Muccio, S. Girolimetti, D. A. Barbini, P. Pelosi, T. Generali, L. Vergori, G.

De Merulis, A. Leonelli, P. Stefanelli. Journal of Chromatography A. 833(1), 61-65,

(1999).

Capítulo 2

74

[2.112] N. Yoshioka, Y. Akiyama, T. Matsuoka, T. Mitsuhashi. Food Control. 21(2), 212-

216, (2010).

[2.113] N. Yoshioka, Y. Akiyama, K. Teranishi. Journal of Chromatography A. 1022(1-

2), 145-150, (2004).

[2.114] A. Cannavan, S. A. Haggan, D. G. Kennedy. Journal of Chromatography:

Biomedical Applications. 718(1), 103-113, (1998).

[2.115] X. Xia, Y. Dong, P. Luo, X. Wang, X. Li, S. Ding, J. Shen. Journal of

Chromatography B. 878(30), 3174-3180, (2010).

[2.116] D. Chen, Y. Tao, H. Zhang, Y. Pan, Z. Liu, L. Huang, Y. Wang, D. Peng, X.

Wang, M. Dai, Z. Yuan. Journal of Chromatography B. 879(19), 1659-1667, (2011).

[2.117] G. Balizs. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications.

727, (1-2), 167-177, (1999).

[2.118] Q. Wu, Y. Li, C. Wang, Z. Liu, X. Zang, X. Zhou, Z. Wang. Analytica Chimica

Acta. 638(2), 139-145, (2009).

[2.119] M. Maeda, A. Tsuji. Journal of Chromatography A. 120(2), 449-455, (1976).

[2.120] A.López, D. Vega, M. E. Torres, Z. Sosa, J. J. Santana. Anal Bioanal Chem. 387,

1957-1963. (2007).

[2.121] N. Nose, S. Kobayashi, A. Tanaka, A. Hirose, A. Watanabe. Journal of

Chromatography A. 130(11), 410-413, (1977).

[2.122] C. Cacho, L. Schweitz, E. Turiel, C. Pérez-Conde. Journal of Chromatography A.

1179(2), 216-223, (2008).

[2.123] S. Takeda, K. Fukushi, K. Chayama, Y. Nakayama, Y. Tanaka, S. Wakida. Journal

of Chromatography A. 1051(1-2), 297-301, (2004).

[2.124] Y. Ikai, H. Oka, N. Kawamura, M. Yamada. Journal of Chromatography A. 457,

333-343, (1988).

[2.125] A. Collinge, A. Noirfalise. Journal of Chromatography A. 257, 416-418, (1983).

[2.126] M. Asensio-Ramos, J. Hernández-Borges, T. M. Borges-Miquel, M. A.

Rodríguez-Delgado. Journal of Chromatography A. 1218(30), 4808-4816, (2011).

[2.127] G. de Armas, E. Becerra, A. Cladera, J. M. Estela, V. Cerdà. Analytica Chimica

Acta. 427(1), 83-92, (2001).

[2.128] G. de Armas, M. Miró, J. M. Estela, V. Cerdà. Analytica Chimica Acta. 471(2),

173-186, (2002).

[2.129] G.N. Piccirilli, G.M. Escandar. Analytica Chimica Acta. 601(2), 196-203, (2007).

[2.130] R.A. Correa, G.M. Escandar. Analytica Chimica Acta. 571(1)58-65, (2006).


75

[2.131] A. Segura-Carretero, C. Cruces-Blanco, B. Cañabate-D az, J.F. Fernández-

Sánchez, A. Fernández-Gutiérrez. Analytica Chimica Acta. 417(1), 19-30, (2000).

[2.132] G.N. Piccirilli, G.M. Escandar. Analytica Chimica Acta. 646(1-2), 90-96, (2009).

[2.133]LWT - Food Science and Technology. 43( 9), 1301-1306, (2010).

[2.134] A. Veneziano, G. Vacca, S. Arana, F. De Simone, L. Rastrelli. Food Chemistry.

87(3), 383-386, (2004).

[2.135] A. Moral, M.D. Sicilia, S. Rubio. Analytica Chimica Acta. 650, 207-213. (2009).

[2.136] Mª.J. Nozal, J.L. Bernal, J.J. Jiménez, Mª.T. Martín, J. Bernal. Journal of

Chromatography A. 1076(1-2), 90-96, (2005).

[2.137] C. Cacho, E. Turiel, C. Pérez-Conde. Talanta. 78(3), 1029-1035, (2009).

[2.138] P. Jedziniak, T. Szprengier-Juszkiewicz, M. Olejnik. Journal of Chromatography

A. 1216(46), 8165-8172, (2009).

[2.139] M. T. Watts, V. A. Raisys, L. A. Bauer. Journal of Chromatography B:

Biomedical Sciences and Applications. 230(1), 79-86, (1982).

CAPÍTULO 3

LUMINISCENCIA. TECNICAS LUMINISCENTES

Luminiscencia. Técnicas luminiscentes

79

1. LUMINISCENCIA

1.1. Introducción

En 1565, Nicolás Monardes escribió acerca del extraordinario color azul intenso de

un extracto acuoso de la madera llamada “lignum nephrilicum”. Esa misma solución fue

estudiada casi 100 años más tarde en Alemania, Italia e Inglaterra, pero nadie identificó

entonces esa luz azul intensa como emisión luminiscente. En 1852 el físico inglés George

Stokes, usando filtros y prismas, demostró que la luz incidente de una región espectral era

absorbida y transformada por la solución en una luz emitida en una región espectral

diferente, de mayor longitud de onda. Demostró, con ayuda de este efecto, que el cuarzo es

atravesado por las radiaciones ultravioletas, mientras que el vidrio ordinario no lo es.

El término luminiscencia fue introducido en 1888 por el químico alemán Eilhard

Wiedemann para abarcar los dos fenómenos, la fluorescencia y la fosforescencia. Y

definió a la luminiscencia como “todos los fenómenos luminosos no causados solamente

por el aumento de la temperatura”.

Hoy en día, la luminiscencia se entiende como un fenómeno molecular en el cual

tiene lugar una absorción de energía por la materia y un proceso posterior de emisión de la

radiación electromagnética en la que intervienen los estados electrónicos de la molécula.

La luminiscencia de un compuesto surge de la emisión de fotones desde estados

energéticos moleculares electrónicamente excitados y, en función de la naturaleza de

dichos estados, se obtienen dos de las técnicas luminiscentes de mayor aplicación

analítica: la fluorimetría y la fosforimetría.

Dependiendo de la clase de excitación que produce la luminiscencia existen diferentes

procesos luminiscentes:

- Quimioluminiscencia: la excitación electrónica de las moléculas es causada por

reacciones químicas. Si la reacción química ocurre en un organismo viviente, como

la luciérnaga, el proceso se conoce como bioluminiscencia.

- Triboluminiscencia: es la luminiscencia que resulta de la rotura, fricción o

despedazamiento de ciertos materiales a consecuencia de descargas eléctricas que

tienen lugar entre partes diferentes del sólido, cuando éstas se separan por acciones

mecánicas externas.

Capítulo 3

80

- Electroluminiscencia: la excitación que origina la luminiscencia es producida

mediante energía eléctrica. Tiene lugar cuando ocurren descargas eléctricas en

presencia de gases enrarecidos o con vapores de ciertas sustancias.

- Catodoluminiscencia: es la luminiscencia producida mediante el bombardeo de

electrones acelerados.

- Radioluminiscencia: es la luminiscencia producida por la acción de los materiales

radiactivos.

- Fotoluminiscencia: es la luminiscencia procedente de la excitación de moléculas

por absorción de un fotón. Hay dos tipos en función del nivel electrónico desde el

que se produce la emisión: fluorescencia y fosforescencia.

- Sonoluminiscencia: es la luminiscencia debida a excitaciones producidas por ondas

sonoras de altas frecuencias o, por ultrasonidos, y puede observarse en algunos

líquidos orgánicos.

1.2. Mecanismo de los procesos fotoluminiscentes

Para entender como tiene lugar el proceso de luminiscencia en una molécula, conviene

recordar algunos conceptos fundamentales, tales como los descritos a continuación:

- Los electrones orbitan alrededor del núcleo atómico en niveles electrónicos

cuantizados, pudiendo saltar de un nivel a otro sin pasar por estados intermedios, lo

cual conlleva la absorción o emisión de una determinada cantidad de energía, que

se corresponde con la diferencia de energía entre los dos niveles implicados en la

transición.

- En cuanto al espín del electrón, el principio de exclusión de Pauli establece que en

un átomo no puede haber dos electrones con los cuatro números cuánticos (n, l, m,

s) iguales, de manera que no puede haber más de dos electrones en un mismo

orbital, los cuales, deben tener espines opuestos.

- La nomenclatura del estado singlete, doblete y triplete deriva de consideraciones

de multiplicidad espectroscópica, siendo ésta igual a 2S+1 en un estado de energía

molecular, en el que S es el sumatorio de los números de espín en valor absoluto.

Así, un estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los electrones

están apareados se denomina estado singlete. El estado fundamental para un radical

libre, es un estado doblete. Por otro lado, cuando uno de los electrones de una

molécula es excitado a un nivel de energía superior, se forma un estado singlete


81

excitado o un estado triplete (figura 3.1), siendo necesario destacar que el estado

triplete excitado es menos energético que el correspondiente estado singlete

excitado.

Figura 3.1. Representación de los estados singlete, doblete y triplete.

Una forma de ilustrar la posición de los niveles electrónicos y las posibles

transiciones es emplear el diagrama de Jablonski, que se muestra en la figura 3.2. En el

diagrama de Jablonski se representan los niveles electrónicos fundamental (S0) y excitados

(S1, S2, T1…), así como sus respectivos niveles vibracionales.

En primer lugar tiene lugar la absorción de radiación desde el nivel fundamental S0

hacia los niveles excitados S1 o S2; dicha absorción se produce en unos 10-5

s. Las

transiciones S0S1 y S0S2 son útiles ya que permiten el análisis mediante

espectroscopía de absorción/excitación UV/Vis, proporcionando información estructural

de las moléculas.

Junto con el proceso de absorción se produce la Dispersión Rayleigh, que es la

dispersión de parte de la radiación por las moléculas que se encuentran presentes en el

medio. Dicho proceso es particularmente molesto en las metodologías fluorescentes en

aquellos casos en los que la emisión se produce a longitudes de onda cercanas a las de

excitación, debido a que frecuentemente se enmascara completamente a la señal

fluorescente.

M=2S+1=2(1/2-1/2)+1=1

Estado singlete fundamental (S0)

M=2S+1=2(1/2-1/2)+1=1

Estado singlete excitado (S1)

M=2S+1=2(1/2)+1=2

Estado doblete fundamental (D0)

M=2S+1=2(1/2+1/2)+1=3

Estado triplete excitado (T1)

Capítulo 3

82

Figura 3.2. Diagrama de Jablonski. En él se muestran la excitación de una molécula y las

diferentes transiciones radiantes y no radiantes que pueden tener lugar en su posterior

desactivación.

Una vez que se ha producido la absorción de radiación y el electrón se encuentra en

niveles excitados, existen diferentes vías posibles de relajación o desactivación, para que

la molécula vuelva a su estado fundamental (diagrama de Jablonski en la Figura 3.3). La

más favorable dependerá del tipo de molécula y de la naturaleza de los estados excitados

implicados, de manera que el camino más propicio hacia el estado fundamental es aquel

que minimiza el tiempo de vida del estado excitado. Estos caminos de relajación

acostumbran a ser procesos muy rápidos y se pueden clasificar en tres categorías bien

diferenciadas:

1. Procesos radiantes, que implican la emisión de radiación electromagnética desde el

nivel vibracional más bajo del primer estado electrónicamente excitado hasta el

estado electrónico fundamental.

2. Procesos no radiantes, en los que la población electrónica del estado inicialmente

excitado se transfiere a otro estado sin que le acompañe ninguna emisión. Dentro


83

de estos procesos se encuentra la relajación vibracional, en la que el electrón

decae hasta el nivel vibracional mas bajo del estado excitado en que se encuentra,

siendo su tiempo de vida medio 10-12

. Además, se producen dos tipos de procesos

no radiantes diferentes según las multiplicidades de espín de los estados

implicados. Uno de ellos es la conversión interna, que supone la transferencia de

población entre estados electrónicos de igual multiplicidad de espín; en la figura

3.2 serían los pasos S2S1 y S1S0. Dichos procesos de decaimiento ocurren

entre los 10-14

y 10-12

s. Parecen ser particularmente eficaces cuando dos niveles de

energía electrónicos están lo suficientemente próximos como para que haya un

solapamiento de los niveles de energía vibracional. El otro proceso no radiante es

el cruce entre sistemas, el cual supone que la transferencia de población tiene lugar

entre estados electrónicos de diferente multiplicidad de espín y, por tanto, es una

transición prohibida por las reglas de la termodinámica. La probabilidad de esta

transición aumenta si los niveles vibracionales de los dos estados se solapan, por

ejemplo, la transición S1T1 que se muestra en la figura 3.2 es un ejemplo en el

que el estado vibracional singlete más bajo se solapa con uno de los niveles

vibracionales triplete más elevado, siendo de esta manera más probable un cambio

de espín. El cruce entre sistemas es más probable en moléculas que contienen

átomos pesados.

3. Procesos de atenuación (quenching), que son procesos de relajación bi- o

trimoleculares que implican la transferencia de energía de la molécula inicialmente

excitada a otras partículas mediante choques inelásticos.

Dentro de las transiciones radiantes se pueden distinguir dos tipos: la fluorescencia y la

fosforescencia.

1. El fenómeno de la fluorescencia implica la emisión de radiación desde un estado

excitado de igual multiplicidad que el estado inferior de la transición. En las

moléculas orgánicas, generalmente, esta transición se produce desde el estado

excitado singlete de menor energía, S1, hasta el estado fundamental S0, por lo que

se habla de una transición S1S0. Debido a que no se produce un cambio en la

multiplicidad del estado, esta transición está permitida por lo que habitualmente se

produce de manera rápida, en el rango de los 10-11

a 10-7

s.

Capítulo 3

84

2. Por el contrario, si la multiplicidad de espín del estado que emite es diferente a la

del estado inferior se produce la fosforescencia. De este modo, si el estado triplete

de menor energía se halla poblado, a menudo por haberse producido un cruce entre

sistemas desde el estado S1, se puede observar la posterior transición T1S0, dando

lugar a la fosforescencia. La transición desde el estado triplete al estado

fundamental es una transición prohibida que implica el cruce entre sistemas, y se

caracteriza por su larga duración, que oscilan entre los 10-4

y los 10 s.

2. FLUORESCENCIA

2.1. Modalidades de fluorescencia

Una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su

elevada sensibilidad y selectividad. Sin embargo, a la hora de llevar a cabo análisis de

mezclas de compuestos o en matrices complejas, es una técnica muy limitada, ya que,

aunque cada analito se encuentra caracterizado por unas longitudes de onda de excitación

y emisión, los espectros de fluorescencia se caracterizan por poseer bandas bastante

anchas y poco definidas, hecho que provoca que existan grandes solapamientos de los

espectros a la hora de determinar muestras complejas, ocasionando un gran número de

interferencias dentro del análisis.

Para solucionar estos problemas, en los últimos años se han desarrollado un gran

número de metodologías que permiten modernizar la instrumentación de medida. Así se

pasó de la obtención de espectros bidimensionales de excitación y emisión, a espectros

tridimensionales de fluorescencia. De este modo, la información analítica proporcionada

por estos conjuntos de espectros es muy superior a la proporcionada por los espectros de

excitación o emisión clásicos.

Otra metodología útil para la resolución de mezclas complejas es el análisis

multivariante, el cual permite resolver mezclas introduciendo un gran número de variables

en la regresión (como las que posee un espectro o un conjunto de espectros).

Aun así, normalmente no es suficiente obtener el espectro de fluorescencia total

para la resolución de mezclas complejas, sino que también es necesario poder manipular

dicho espectro. Han sido muchos los autores preocupados por realizar operaciones

matemáticas con la matriz de datos del espectro de fluorescencia total, desarrollándose


85

para ello programas como el software denominado FTOTAL [3.1], que permite realizar la

representación del espectro tridimensional en sus diversas versiones: proyecciones

isométricas y mapas de contorno.

Dicho programa permite representar el espectro en forma de proyección isométrica,

tanto de emisión como de excitación, pudiéndose invertir la dirección de los ejes, de

manera que posibilita ver lo que hay detrás del espectro o eliminar la banda debida a la

dispersión Rayleigh.

Por otro lado, el software también realiza la representación del espectro en forma

de curvas de nivel o mapas de contorno, uniendo líneas de igual intensidad de

fluorescencia a lo largo del espectro. Con este método de representación es mucho más

sencillo observar de una forma directa los espectros de fluorescencia o fosforescencia de

los analitos.

El programa permite también extraer espectros bidimensionales realizando cortes

en los espectros de fluorescencia total. Así, al hacer una sección horizontal, a una longitud

de onda de emisión conocida y constante, se obtiene un espectro de excitación

convencional. Del mismo modo, si se hace un corte en vertical a una longitud de onda de

excitación conocida constante, se obtiene un espectro de emisión convencional.

Pero quizá el aspecto más importante de este tipo de software es que permite tratar

los espectros tridimensionales de diferentes formas de cara a realizar un análisis más

selectivo. Estas nuevas formas dan lugar a la siguiente serie de metodologías:

fluorescencia sincrónica, fluorescencia sincrónica de ángulo variable (VASF),

fluorescencia sincrónica de ángulo variables no lineal (VNLAF) y fluorescencia sincrónica

por isopotenciales de la matriz (MISF).

2.1.2. Fluorescencia sincrónica

Un espectro sincrónico es un espectro bidimensional en el que siempre se mantiene

una diferencia de longitud de onda constante entre la excitación y la emisión, manteniendo

una inclinación de 45º.

Así pues, la técnica consiste en mantener un intervalo constante entre las

longitudes de onda de excitación y emisión [3.2]. Por ello, el corte que proporciona la

máxima intensidad de fluorescencia es aquél cuya Δλ coincide con la diferencia de

longitudes de onda de los máximos de excitación y emisión.

La intensidad de fluorescencia sincrónica depende por lo tanto de:

Capítulo 3

86

- El carácter de los espectros de excitación y emisión convencionales.

- De la diferencia de longitud de onda (Δλ), entre las longitudes de onda de

emisión y de excitación.

La intensidad puede expresarse como:

Is = k c b Ex (λex) Em (λex + Δλ) (Ecuación 3.1)

o bien como:

Is = k c b Ex (λem - Δλ) Em (λ em ) (Ecuación 3.2)

donde:

Ex: función de excitación a una longitud de onda de excitación dada.

Em: función de emisión a una longitud de onda de emisión dada.

c: concentración del analito.

b: anchura del paso de luz.

k: constante que incluye el "factor de geometría instrumental" y parámetros

relacionados.

La fluorescencia sincrónica presenta numerosas ventajas, como por ejemplo:

- El aumento de selectividad con respecto a la fluorescencia clásica sin

pérdida de sensibilidad, debido al estrechamiento de las bandas espectrales.

- La disminución de interferencias debido a la luz dispersada.

- La rapidez.

- La siimplicidad instrumental.

- El bajo coste.

En 2010 Andrade Eiroa y col [3.3,3.4] llevaron a cabo una recopilación de los

principios y aplicaciones fundamentales de la fluorescencia sincrónica como herramienta

analítica. Estos trabajos se centran en las innovaciones desarrolladas, teniendo en cuenta

las consideraciones prácticas. En ellos se evalúan las posibilidades y limitaciones de cada

modalidad sincrónica, finalizando con una comparación con otras metodologías analíticas.

Las aplicaciones de la fluorescencia sincrónica son muy numerosas [3.5-3.27]

siendo principalmente utilizada, a lo largo de los años, para la determinación de fármacos.


87

2.1.3. Fluorescencia sincrónica por isopotenciales de la matriz

La principal utilidad de la fluorescencia sincrónica por isopotenciales de la matriz

es poder determinar compuestos fluorescentes en matrices que también lo son. Una de las

desventajas de los métodos fluorescentes es la dificultad para eliminar la fluorescencia de

la matriz. Si la matriz en la cual se desea realizar la determinación fluorimétrica tiene una

composición casi invariable, aunque su intensidad de fluorescencia varíe, es posible

mantener una señal de fondo constante si se realiza un corte en el espectro de

luminiscencia total de la matriz siguiendo una de las trayectorias que unen los puntos de

igual intensidad de fluorescencia, denominada “Trayectoria Isopotencial”. Dicha

trayectoria debe reunir las siguientes características:

- Debe unir puntos de igual intensidad en el espectro de la matriz interferente.

- Debe pasar por los máximos de intensidad de los analitos con el objetivo de no

perder sensibilidad (este punto no siempre es posible de cumplir).

- A ser posible, debe atravesar completamente el espectro del analito de manera que

en los extremos no se tenga señal del mismo, lo cual tampoco es siempre posible.

La figura 3.3 muestra un espectro de fluorescencia total de una matriz teórica, una

trayectoria isopotencial “A” y un analito fluorescente. Si este analito se encuentra en

presencia de la matriz anterior, la mezcla presentará un espectro que será la suma de

ambos, tal y como se muestra en la figura 3.4.

Como se puede observar en la figura 3.5, el espectro de la matriz una vez aplicada

la trayectoria es una línea horizontal de intensidad constante K, y cuando se aplica la

trayectoria anterior (A) al espectro del analito en presencia de la matriz fluorescente, se

obtiene un espectro sincrónico equivalente al del analito aislado, incrementado el valor de

la constante K en todas las longitudes de onda.

Capítulo 3

88

Figura 3.3. Espectro de fluorescencia total de la matriz, del analito y la trayectoria isopotencial a

la matriz que pasa por las longitudes de onda de máxima intensidad de fluorescencia del analito.

Figura 3.4. Espectro de fluorescencia total del analito en la matriz y la trayectoria isopotencial a

la matriz.


89

Figura 3.5. Espectros MISF obtenidos al pasar la trayectoria por el espectro de la matriz (rosa),

del analito (azul) y de la mezcla de ambos (verde).

De los espectros de la figura podemos comprobar que la intensidad de

fluorescencia de la mezcla es la suma de la intensidad del analito más la intensidad de la

matriz cuyo valor es una constante (K):

KII emexaemexm ),(),(

Ecuación 3.3. Cálculo de la intensidad de fluorescencia de la mezcla.

De la figura también podemos deducir que a la intensidad fluorescente de la mezcla

en los extremos de la trayectoria únicamente contribuye la intensidad de la matriz (valor

constante). Por lo tanto, para eliminar la contribución de la matriz en el espectro de la

mezcla, únicamente se debe restar el valor constante K a todo el espectro de la mezcla. Sin

embargo, no siempre es posible obtener una trayectoria que corte al espectro del analito en

los extremos. En este caso no se puede obtener directamente el valor de intensidad

constante de la matriz, y para resolver los espectros MISF se recurre al empleo de la

primera derivada de esos espectros:

exex

emexa

ex

emexm

d

dK

d

dI

d

dI

),(),(

Ecuación 3.4. Primera derivada del espectro MISF de la mezcla.

Capítulo 3

90

0exd

dK

ex

emexa

ex

emexm

d

dI

d

dI

),(),( (Ecuación 3.5)

De esta forma, los espectros derivados del analito en ausencia y en presencia de la

matriz serán así coincidentes y, por tanto, se habrá eliminado la interferencia de la matriz

en la determinación de dicho analito [3.28-3.47].

3. FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA

3.1. Introducción

El mayor interés de las técnicas fluorimétricas reside en su elevada selectividad y

en la gran sensibilidad que generalmente presentan, en comparación con otros métodos de

espectroscopía molecular.

Dado que el número de sustancias fluorescentes es mucho menor que el de

compuestos absorbentes, en términos generales, las determinaciones fluorimétricas son

más selectivas que las basadas en la absorción de luz, puesto que la mayor parte de las

moléculas excitadas por absorción se desactivan, a través de diferentes procesos no

radiantes. En consecuencia, el número de sustancias que se desactivan con una emisión

fluorescente es relativamente escaso.

A veces, la radiación UV produce la fotólisis del analito, originándose cambios en

su fluorescencia. Este fenómeno ha dado lugar a que se haya propuesto una modificación

que, mediante el uso de reacciones fotoquímicas, aumente la sensibilidad, selectividad y

reproducibilidad de la detección fluorimétrica [3.48-3.50]. Este método se denomina

fluorescencia fotoinducida, (Photo-Induced Fluorescence, PIF) [3.51-3.53].

Asimismo, la PIF se ha utilizado en combinación con la cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC) [3.54], la cromatografía en capa fina [3.55-3.57] y el análisis por

inyección en flujo (FIA) [3.58]. En el caso de HPLC, la PIF se ha empleado también como

sistema de detección [3.59, 3.60] en sistemas con derivatización postcolumna y

microextracción en fase sólida [3.61-3.63].

Las reacciones fotoquímicas pueden dar lugar a varios procesos. Se pueden formar

fotoproductos, menos fluorescentes que los originales [3.64,3.65], o bien puede tener lugar


91

la desaparición de la fluorescencia de los analitos originales. No obstante, en la mayoría de

los compuestos la reacción fotoquímica conlleva un aumento del coeficiente de absorción y

del rendimiento cuántico de fluorescencia con relación a los del analito [3.66,3.67]. Es

decir, aunque los analitos no sean inicialmente fluorescentes y, el aumento de la señal de

fluorescencia del fotoproducto origina un aumento de la sensibilidad de la detección

fluorimétrica, lo que permite la detección de compuestos débilmente fluorescentes [3.68-

3.70] o no fluorescentes [3.71].

La fluorescencia inducida fotoquímicamente es una técnica muy versátil, por lo que

sus aplicaciones son múltiples, fundamentalmente en el análisis de residuos de pesticidas

[3.72-3.101] y en el análisis farmacológico-clínico [3.102-3.124].

El número de reacciones inducidas fotoquímicamente en las que pueden producirse

variaciones de fluorescencia es amplio. No obstante, para que una de estas reacciones sea

interesante desde el punto de vista analítico, debe reunir una serie de requisitos que

raramente se cumplen simultáneamente. Estos requisitos han de ser:

- El analito debe presentar una fuerte absorción en el UV visible, para que tenga

lugar la reacción fotoquímica.

- Numerosas reacciones secundarias se evitarán si la radiación absorbida por el

analito es de una longitud de onda (λ) que no sea significativamente absorbida por

el fotoproducto.

- El fotoproducto habrá de ser estable química y térmicamente, al menos el tiempo

suficiente para realizar las medidas.

- El proceso de fotoconversión deberá tener un alto rendimiento fotoquímico.

- La fluorescencia del fotoproducto será tanto mayor que la del analito, cuanto

mayor sea el aumento de rigidez estructural de aquel.

- Por otra parte, los componentes de la matriz pueden originar interferencias que se

evitarán en la medida en la que se encuentren condiciones operatorias en las que

estos componentes no originen productos fluorescentes o bajo la irradiación

pierdan la posible fluorescencia nativa.

Entre las reacciones que pueden producirse por irradiación UV, las que más aplicación

encuentran en los métodos de análisis basados en fluorescencia inducida son: reacciones

de fotociclación [3.125-3.132], fotoisomerización [3.133,3.134], fotólisis [3.135-3.140],

fotooxidación [3.141-3.144] y fotorreducción [3.145-3.148].

Capítulo 3

92

3.2. Fundamento teórico

Los aspectos teóricos de la PIF han sido estudiados fundamentalmente en

disoluciones diluidas [3.149-3.152].

En una disolución diluida, cuya absorbancia sea inferior a 10-2

, la velocidad de

fotorreacción de un analito viene dada por la expresión:

p

ppp AoBA CbaI

dt

dC

dt

dCv

,

(Ecuación 3.6)

En esta ecuación, el sumatorio afecta únicamente a aquellas longitudes de onda

incidente que producen fotorreacción, siendo el resto de las variables que se incluyen:

- Φλp: rendimiento cuántico de la fotorreacción a cada λ.

- I0,λp: intensidad incidente a cada λ.

- a λp: 2.303 x εA. Dónde εA es la absortividad molar a cada λ.

- b: camino óptico.

- CA: concentración del analito.

- CB: concentración del fotoproducto.

Admitiendo que I0,λp es constante y mucho mayor que CA, la expresión anterior se

puede transformar en la siguiente ecuación de primer orden:

tba

oAtA

p

p

p

CC

10)()( (Ecuación 3.7)

donde (CA)t es la concentración del analito a un tiempo t y (CA)o su concentración inicial.

Llegado este punto han de considerarse dos alternativas:

1. Que el analito sea fluorescente y el fotoproducto no. Por tanto, tiene lugar una

disminución en la fluorescencia.


93

2. Que el analito sea débilmente fluorescente o no fluorescente y el fotoproducto sea

fuertemente fluorescente observándose, en consecuencia, un aumento en la

fluorescencia.

3.2.1. Expresión de la intensidad para una disminución de la fluorescencia

La intensidad de fluorescencia, IFA, del analito viene dada por la expresión:

AFAFA CbaIgfIFAFAFA

,0´)()(

(Ecuación 3.8)

siendo f(θ) el factor geométrico y g(λ´)λFA la respuesta del detector a la longitud de onda

analítica. En esta expresión, λFA se refiere a la longitud de onda de excitación del analito,

teniendo el resto de las variables el mismo significado que en la ecuación 3.6.

Las expresiones (3.6) y (3.8) son similares, dado que ambas se refieren a procesos

competitivos de disipación de energía desde un mismo estado singlete excitado que se ha

alcanzado tras un proceso de absorción simple.

Admitiendo que la intensidad de la radiación incidente es constante, la velocidad

de la disminución de la intensidad de fluorescencia del analito, dada en la expresión (3.8),

sólo depende de la concentración de CA y, por tanto, la segunda expresión indica que la

fotorreacción es de primer orden en (CA)t.

Para medir la concentración inicial del analito, (CA)0, se han propuesto tres

procedimientos:

- Método de la velocidad inicial. Dado que la velocidad inicial de la fotorreacción es

una medida de (CA)0, el método se basa en extrapolar la curva intensidad de

fluorescencia frente al tiempo a t = 0.

- Medida directa de la fluorescencia. Consiste en medir, a un tiempo constante, la

intensidad que es proporcional a (CA)0, para un tiempo dado.

- Integración digital de la señal de fluorescencia en un intervalo de tiempo dado. La

señal integrada es proporcional a la concentración inicial de analito, como se

deduce a continuación.

Teniendo en cuenta las expresiones (3.7) y (3.8), se definen los parámetros K y χ:

Capítulo 3

94

baIKpp

p

p o

,

(Ecuación 3.9)

FA

FAFAbaIgf oFA

,´)()(

(Ecuación 3.10)

Por tanto, la señal de florescencia del analito a cualquier tiempo viene dada por la

expresión:

)10)()( ( kt

oAtAtFA CCI (Ecuación 3.11)

Integrando a un intervalo de tiempo t, se obtiene la señal de fluorescencia

integrada:

dtCdtII kt

AtFAFA

0

)(

0

0

int 10)()()(

(Ecuación 3.12)

y, por tanto:

1)(

0int 10)()( kt

AFA Ck

I

(Ecuación 3.13)

3.2.2. Expresión de la intensidad de fluorescencia para un aumento de

fluorescencia

Considérese ahora una reacción fotoquímica simple, como es la transformación de

un analito A en un fotoproducto B. La concentración de este último a un tiempo t es:

tAoAtB CCC )()()( (Ecuación 3.14)

y, teniendo en cuenta la expresión (3.7), se obtiene:

btaI

oAtB

ppo

p

p

CC

,

101)()(

(Ecuación 3.15)

De modo que la intensidad de fluorescencia del fotoproducto (IFB) viene dada por:


95

BoFBFB CbaIgfIFBFB

FB

,´)()(

(Ecuación 3.16)

En esta última expresión, los diferentes parámetros tienen el significado indicado

previamente, pero ahora están referidos al fotoproducto B.

Por tanto, si la intensidad de la radiación incidente es constante, la variación en la

intensidad de fluorescencia del fotoproducto sólo depende de CB, ya que dicha variación

corresponde únicamente a la de la concentración del fotoproducto CB.

Análogamente al apartado anterior, K y χ se definen como:

baIKp

ppp o

,

(Ecuación 3.17)

p

FBFBbaIgf oFB

,´)()(

(Ecuación 3.18)

y a partir de ellas puede obtenerse la expresión que indica la señal de fluorescencia del

fotoproducto a tiempo t:

kt

oAtBtFB CCI 101)()()( (Ecuación 3.19)

Si se emplea el mismo tiempo para todas las medidas, al representar la señal de

fluorescencia del fotoproducto (IFB)t frente a la concentración de analito inicial (CA)0 se

obtiene una calibración. No obstante, puede no encontrarse linealidad si se produce más de

un fotoproducto.

Por tanto, en estas condiciones, si la fotorreacción de un analito no fluorescente o

débilmente fluorescente conduce a un fotoproducto fluorescente, la fluorescencia

fotoinducida permite la determinación de este tipo de compuestos.

3.3. Instrumentación

En un equipo para medida de fluorescencia fotoinducida, el componente

diferenciador de un espectrofluorímetro clásico es el fotorreactor, siendo éste la parte

fundamental del sistema.

Capítulo 3

96

Los primeros fotorreactores estaban constituidos por lámparas de mercurio de

media o alta presión refrigeradas por agua, o bien por lámparas de xenón o xenón-

mercurio refrigeradas por aire.

En todos los casos, el analito circulaba por el interior de un capilar de cuarzo

enrollado sobre la lámpara que permitía, dada su buena transparencia a la radiación UV, la

irradiación del analito. La fragilidad y dificultad de manejo del cuarzo llevó a Scholten, en

1980, a proponer el teflón (politetrafluoroetileno, PTFE) como material para los capilares.

Su transparencia a la radiación UV es debida a múltiples procesos de reflexión que hacen

que la radiación pase a través de los poros del polímero. Se encuentra comercializado en

diferentes diámetros, su coste es bajo y las señales de fluorescencia proporcionadas son

similares.

Por todas estas razones, finalmente, el cuarzo fue sustituido por el teflón, y en

1983, Lang diseñó el primer fotorreactor con capilares de este material en el que los

capilares de teflón se encuentran enrollados sobre un cilindro de cuarzo, en cuyo interior

se encuentra la lámpara, manteniéndola refrigerada con agua a 25 ºC. Sin embargo, el uso

del teflón, presenta el inconveniente de la liberación de cantidades significativas de F- y

H+ cuando la temperatura se acerca a los 50 ºC. La liberación de F

- es función del tiempo

de residencia del analito en el capilar y puede dar lugar a un aumento de la señal de fondo

y una variación de la fluorescencia del compuesto en estudio.

Para minimizar el efecto de la temperatura y simplificar su construcción en 1982,

se propuso el uso de las lámparas de baja presión, en el que los capilares están tejidos

sobre unas barras que se soportan en un cilindro de cuarzo, dentro del cual se encuentra la

lámpara. A veces, los fotorreactores se introducen dentro de una camisa que mediante el

paso de N2 evita la difusión de oxígeno a través de los poros del teflón.

Por último, Arakawa [3.153], en 1983, propuso el uso de un fotorreactor en el que

se emplea una lámpara de mercurio de baja presión y concéntrico a ella un cilindro de

cuarzo sobre el cual va enrollado el capilar de teflón por el que circula la solución en

estudio, tal y como se esquematiza en la figura 3.6.


97

Figura 3.6. Esquema del diseño de un fotorreactor con lámpara de Hg a baja presión.

4. FOSFORESCENCIA

4.1. Introducción

Como ya se indicó con anterioridad, la fosforescencia se trata de un proceso de

desactivación radiante, que implican la emisión de radiación electromagnética en el que la

multiplicidad de espín del estado que emite es diferente a la del estado inferior. De este

modo, si el estado triplete de menor energía se halla poblado, a menudo por haberse

producido un cruce entre sistemas desde el estado S1, se puede observar la posterior

transición T1S0, dando lugar a la fosforescencia. La transición desde el estado triplete al

estado fundamental es una transición prohibida que implica el cruce entre sistemas y se

caracteriza por su larga duración, que gira entorno a los 10-4

y 10 s.

4.2. Modalidades de fosforescencia

Los primeros antecedentes bibliográficos sobre esta técnica datan de finales del

siglo XIX. En 1888, Wiedeman describió emisión de fosforescencia en disoluciones

sólidas de algunos colorantes orgánicos [3.154]. Cuarenta y siete años más tarde, en 1935,

Jablonskii [3.155] propuso su conocido esquema de niveles de energía para explicar el

fenómeno fosforescente, y Sklar [3.156] identificó una débil absorción singlete-singlete en

el benceno. La identificación de la fosforescencia como una transición radiante entre el

estado triplete más bajo y el estado singlete fundamental y la demostración de la existencia

de electrones desapareados en el estado fosforescente fue hecha por Lewis y col. [3.157]

en 1945. La existencia de un proceso de acoplamiento espín-orbital se demostró usando

átomos pesados como sustituyentes [3.158]; asimismo, se demostró la naturaleza

paramagnética de la fosforescencia [3.159].

Capítulo 3

98

A partir de estos trabajos pioneros, se han realizado numerosos estudios con objeto

de comprender el fenómeno fosforescente, y se han desarrollado múltiples aplicaciones del

mismo, habiéndose convertido esta técnica en una herramienta analítica de gran utilidad.

En la década de los 60, la mayor parte de las aplicaciones fosforimétricas usaban

disolventes rígidos a baja temperatura, 77 K. La necesidad de utilizar condiciones

criogénicas ha sido una de las principales limitaciones de la fosforimetría a baja

temperatura (Low Temperature Phosphorescence, LTP).

Un avance significativo en la generación de fosforescencia fue la introducción por

Roth [3.160], en 1967, de la fosforescencia a temperatura ambiente, Room Temperature

Phosphorescence (RTP). Esta técnica se ha convertido en un método práctico de detección

de numerosos compuestos orgánicos. Papel de filtro, gel de sílice, acetato sódico y

diversos compuestos inorgánicos han sido utilizados en RTP en soporte sólido

[3.161,3.162].

Figura 3.7. Modalidades de fosforescencia

En el esquema anterior se resumen los distintos métodos de obtención de

fosforescencia que han ido surgiendo durante su desarrollo.


99

4.2.1. RTP en soporte sólido (SS-RTP)

Hasta comienzo de los años 70, con los trabajos de Schulman y Walling

[3.163,3.164], no se reconoció el verdadero potencial de la fosforescencia a temperatura

ambiente sobre soporte sólido. Desde entonces, han aparecido numerosos estudios y el

fenómeno de la RTP en soporte sólido ha sido estudiado en profundidad [3.161,3.62]. El

papel de filtro es la superficie sólida más usada para obtener RTP combinándolos con

medios organizados, como las β-ciclodextrinas, con objeto de incrementar las señales de

fosforescencia obtenidas de sustancias fosforescentes adsorbidas en soportes sólidos

[3.165-3.175].

Si bien, la RTP en soporte sólido, no puede usarse en sistemas dinámicos tales

como análisis por inyección en flujo o cromatografía líquida de alta resolución.

4.2.2. Fosforescencia a temperatura ambiente en disolución en medios

organizados

Los medios organizados son aquéllos que, de alguna forma, son capaces de

proteger la molécula físicamente de las interacciones con el medio, lo que disminuye de

manera importante las desactivaciones no radiantes por colisiones entre moléculas.

Este tipo de metodologías fueron usadas por primera vez en 1977 por

Kalyanasundaran y col., los cuales observaron fosforescencia de diferentes compuestos en

medio micelar y comprobaron los efectos de diferentes átomos pesados en la emisión

fosforescente [3.176]. Siendo, por otra parte, el grupo del investigador Cline Love en 1980

el primero en proponer la fosforescencia a temperatura ambiente en medio micelar (MS-

RTP) para la determinación de mezclas de compuestos orgánicos [3.177,3.178].

Los agentes surfactantes son moléculas que poseen una estructura de tipo R-X,

siendo R una cadena de hidrocarburos que forma la cola hidrofóbica, y X un grupo polar o

iónico que forma la cabeza. Dada la alta capacidad de autoasociación de los agentes

micelares al introducirlos en una disolución acuosa, estos forman agregados con las

cabezas en contacto con la fase acuosa y con las colas dirigidas hacia el interior formando

un núcleo hidrofóbico, siempre y cuando la concentración del surfactante se encuentre por

encima de una concentración determinada (conocida normalmente como concentración

micelar crítica (c.m.c.)).

Capítulo 3

100

Figura 3.8. Representación de una micela aniónica cortada transversalmente.

Algunas propiedades interesantes de las micelas son, por ejemplo, el poder

solubilizante sobre hidrocarburos poco solubles en agua, o la capacidad para concentrar o

separar reactivos, ya que, la solubilización selectiva de los reactivos en la micela los

acerca respecto a su situación en la disolución acuosa, favoreciéndose reacciones que en

fase acuosa eran lentas.

Existen multitud de ejemplos del empleo de esta metodología descritos en

bibliografía [3.179-3.183].

En nuestro grupo de investigación son varias las referencias empleando esta

técnica. Así, se llevaron a cabo las determinaciones de ácido 6-metoxi-2-naftilacético en

orina empleando una optimización simplex [3.184], de nabumetona en preparados

farmacéuticos empleando también optimización simplex [3.185], de propranolol en orina y

en preparados farmacéuticos con SDS como agente micelar [3.186], del pesticida

napropamida en suelos, pimiento y tomate [3.187], y en productos fitosanitarios y

muestras vegetales [3.188], de dipiridamol en preparados farmacéuticos [3.189], de

nafronil [3.190], y de dipiridamol [3.191] en preparados farmacéuticos empleando la

técnica de de flujo detenido, de nafcilina en preparados farmacéuticos [3.192] y de

nafronil en preparados farmacéuticos [3.193].

El principal problema de este tipo de metodologías es la presencia de oxígeno

disuelto. Como se comentó anteriormente, el oxígeno ejerce un efecto atenuador sobre los

procesos fotoluminiscentes y, por tanto, es necesario eliminarlo del medio. Existen

diferentes formas para eliminar el oxígeno del medio, siendo la más empleada la purga con

nitrógeno. Este método, sin embargo, presentaba ciertas complicaciones y, por ello, en

1986 Díaz García y col. [3.194] propusieron la desoxigenación química empleando sulfito


101

sódico. Nugura y col. estudiaron una mezcla de tres hidrocarburos utilizando SDS y SOS

como agentes micelares y sulfito de sodio como agente desoxigenante [3.195].

Paralelamente al empleo de micelas para estudios fosforescentes se realizaron

pruebas empleando ciclodextrinas. Así, Tubuschi y col. proponen un método empleando

una β-dextrina [3.196]. Pero fue de nuevo Cline Love en 1984, quien propuso una nueva

metodología de análisis a la que denominó fosforescencia a temperatura ambiente en

disolución en presencia de ciclodextrinas (CD-RTP), demostrando que se podía emplear

la técnica en moléculas que no contenían átomos pesados externos. Para ello, empleó 1,2-

dibromoetano como átomo pesado externo [3.197].

La influencia de la presencia de las ciclodextrinas en la señal fosforescente se debe

a que las moléculas del analito se introducen en la cavidad interna de dichas

ciclodextrinas, aislándose del medio. La inclusión en dicha cavidad causa restricción en la

movilidad molecular y protección de los estados excitados frente a las desactivaciones no

radiantes.

Figura 3.9. Representación de una β-ciclodextrina.

4.2.3. La fosforescencia a temperatura ambiente en disolución en presencia de

microemulsiones

Una metodología más reciente en este campo es la fosforescencia a temperatura

ambiente en disolución en presencia de microemulsiones. Las microemulsiones son

estructuras muy similares a las micelas, pero con un interior mucho más apolar, de manera

que permiten ampliar el campo de análisis.

Capítulo 3

102

Las microemulsiones se forman mezclando agua y un disolvente orgánico en

presencia de un surfactante y un co-surfactante. Dicho co-surfactante suele ser un alcohol

de talla mediana con un grupo alquil de C-4 a C-8. En bibliografía se encuentran algunas

aplicaciones de esta técnica [3.198-3.200].

4.2.4. Fosforescencia a temperatura ambiente en disolución en medios no

organizados

Un tipo de fosforescencia indirecta fue propuesto en 1982 por Donkerbroek y col.,

quienes la denominaron “fosforescencia sensibilizada”. Dicha fosforescencia se basa en la

presencia en el medio de una molécula con un rendimiento cuántico de fosforescencia

elevado y un estado triplete excitado de baja energía (generalmente suele ser biacetilo o

1,4-dibromonaftaleno), de manera que el analito pueda transferir la energía desde su

estado triplete excitado hacía el del aceptor, siendo éste último el responsable de la

emisión fosforescente. [3.201,3.202].

Un gran avance en la investigación en nuevas metodologías fosforescentes se

produjo en 1998, cuando Segura Carretero y col. comprobaron que era posible determinar

varios derivados del naftaleno sin utilizar ningún tipo de medio organizado en la

disolución. Únicamente era necesario tener en el medio un átomo pesado que favoreciera

el cruzamiento entre sistemas y un agente desoxigenante como el sulfito sódico. A esta

nueva metodología la denominaron fosforescencia a temperatura ambiente inducida por

átomo pesado (HAI-RTP) [3.203].

Quizá el hecho más importante que permite que el rendimiento cuántico de la

fosforescencia en esta técnica sea elevado, sea la proximidad de los átomos pesados al

analito, ya que, en medios micelares, esta distancia venía definida por la longitud de las

cadenas hidrocarbonadas. La cercanía de los átomos pesados permite un aumento en el

rendimiento cuántico de fosforescencia, compensando así el efecto de las desactivaciones

no radiantes en dicho rendimiento.

Posteriormente, se realizaron estudios del empleo de diferentes átomos pesados,

llegando a la conclusión de que la naturaleza del átomo pesado influye tanto en la

intensidad como en la longitud de onda máxima de emisión [3.204].


103

Aunque inicialmente se empleó el Tl+ como átomo pesado [3.205-3.207], se

demostró que era posible emplear otros elementos como átomos pesados (yodo, plata, etc.)

[3.208-3.216].

En nuestro grupo de investigación está técnica también ha sido empleada para la

determinación de diferentes analitos tales como, naftopidil empleando Tl+

como átomo

pesado [3.217], ácido 1-naftoxiláctico en fluidos biológicos [3.218] naftopidil también en

fluidos biológicos mediante optimización simplex [3.219] o 4-metilpropranolol en fluido

cerebroespinal, suero y orina mediante optimización simplex [3.220].

Capítulo 3

104


105


[3.1] J. A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina. Computer Chem. 17, 34, (1993).

[3.2] T. Vo Dinh. Anal. Chem. 50, 1583, (1978).

[3.3] A. Andrade Eiroa, E. Graciela de Armas, J. M, Cerda. V. Trends in Analytical

Chemistry. 29 (8), 902- 927 (2010).

[3.4] A. Andrade Eiroa, E. Graciela de Armas, J. M, Cerda. V. Trends in Analytical

Chemistry. 29 (8), 885 – 901, (2010).

[3.5] M. Furusawa, M. Tachibana, M. Fujishima. Bull. Chem. Soc. Jpn. 56(11) 3509,

(1983).

[3.6] M. Tachibana, M. Furusawa. Bull. Chem. Soc. Jpn. 56(8), 2254, (1983).

[3.7] M. Valcarcel, A. Gomez Hens, S. Rubio. Clin. Chem. 31(11), 1790, (1985).

[3.8] A. Petidier, S. Rubio, A. Gomez Hens, M. Valcarcel. Anal. Biochem. 157(2), 212,

(1986).

[3.9] M.C. Gutierrez, S. Rubio, A. Gomez Hens, M. Valcarcel. Talanta. 34(3), 325,

(1987).

[3.10] M.C. Gutierrez, S. Rubio, A. Gomez Hens, M. Valcarcel. Anal. Chim. Acta. 193,

349, (1987).

[3.11] M. Valcarcel, A. Gomez Hens, S. Rubio, A. Petidier. Clin. Chem. 33(10), 1826,

(1987).

[3.12] A. Muñoz de la Peña. F. Salinas, I. Duran Meras. Anal. Chem. 60(22), 2493,

(1988).

[3.13] F. Salinas, A. Muñoz de la Peña, I. Duran Meras, M. Soledad Duran. Analyst.

115(7), 1007, (1990).

[3.14] D.G. Konstantianos, P.C. Ioannou. Analyst. 117(5), 877, (1992).

[3.15] D.G. Konstantianos, P.C. Ioannou, E. Stratikos. Anal. Chim. Acta. 290(1), 34,

(1994).

[3.16] D.G. Konstantianos, P.C Ioannou. Analyst. 121(7), 909, (1996).

[3.17] P. Damiani, G. Ibañez, A.C Olivieri. J. Pharm. Biomed. Anal. 12(10), 1333, (1994).

[3.18] P. Damiani, M.E. Ribone, G. Ibañez, A.C. Olivieri. Analyst. 120(2), 443, (1995).

[3.19] E.S. Lianidou, P.C. Ioannou, C.K. Polydorou, C.E. Efstathiou. Anal. Chim. Acta.

320(1), 107, (1996).

[3.20] S.Y. Jiang, S.W. Jin. Yaowu. Fenxi. Zazhi. 17(3), 182, (1997).

Capítulo 3

106

[3.21] T. Perez Ruiz, C. Martínez Lozano, V. Tomas, J. Carpena. Talanta. 47(3), 537,

(1998).

[3.22] Y.F. Wei, X.H. Li, D.M. Ma. Guangpuxue Yu. Guangpu. Fenxi. 25(4), 588, (2005).

[3.23] K.Abbas, R. Karoui. European Food Research and Technology. 234(3), 457-465.

(2012).

[3.24] X. Liu, J. Jing. Chemosphere 86(2), 198-201. (2012).

[3.25] M.I. Walash, F. F. Belal. Chemistry Central Journal. 70. (2011).

[3.26] Y. Wang, P. H. Zhu. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59(23), 12629-

12634. (2011).

[3.27] Y. N. Yi, G. R. Li. Analytica Chimica Acta. 707(1-2). 128-134. (2011).

[3.28] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina. Anal.Chim. Acta, 296(1): 87, (1994).

[3.29] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina. Anal.Chim. Acta, 317(1-3): 359, (1995).

[3.30] J.J. Berzas Nevado, J. Rodríguez, M.L. Morena. Fresenius J. Anal.Chem, 349, 756,

(1994).

[3.31] J.J. Berzas Nevado, J.A. Murillo Pulgarín, M.A. Gómez Laguna. Analyst, 120(1):

171, (1995).

[3.32] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Talanta, 43(3): 431,

(1996).

[3.33] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Analitica Chimica

Acta, 10, 326(1-3): 117, (1996).

[3.34] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Analyst, 122(3):

247, (1997).

[3.35] Li. Y. Q, Sui. W, Wu. C, Yu. L. J. Anal. Sci, 17(1): 167, (2001).

[3.36] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Anal.Biochem, 245:

8, (1997).

[3.37] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina. Microchem. J, 52(3): 341, (1995).

[3.38] J.J. Berzas Nevado, J.A. Murillo Pulgarín, M.A. Gómez Laguna. J. Pharm.

Biomed. Anal, 14(11): 1487, (1996).

[3.39] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina. Talanta, 56(3): 557, (2002).

[3.40] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina. Analyst, 119(8): 1915, (1994).

[3.41] Sui. W, Wu. C, Li. Y. Q, Wen. W. H. Fenxi Huaxue, 29(3): 320, (2001).

[3.42] Lin. D. L, He. L. F, Li. Y. Q. Clin.Chem, 50(10): 1797, (2004).

[3.43] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Anal Biochem,

292(1): 59, (2001).


107

[3.44] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, L. Munoz Fernández. Journal Agric.

Food Chem, 56(19): 8838, (2008).

[3.45] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López, I. Sánchez-Ferrer

Robles. Analytica Chimica Acta, 625 (1): 47-54, (2008).

[3.46] J.A. Murillo Pulgarin, A. Alañón Molina, P. Fernández López, I. Sánchez-Ferrer

Robles. Analytica Chimica Acta, 583 (1): 55-62, (2007).

[3.47] Zhou. P. C, Huang. W, Zhang. R. B, Zou. Z. X, Luo. H. D, Falih. A. A, Li. Y. Q.

Applied Spectroscopy, 62 (11), 1268- 1273, (2008).

[3.48] S. Udenfriend, Fluorescence Assay in Biology and Medicine, Vol. 3. Academic

Press, New York, (1969).

[3.49] W. Fink y W. R. Koeffier. Anal. Chem. 42, 990, (1970).

[3.50] J. M. Fitzgerald, Ed., Analytical Photochemistry and Photochemical Analysis,

Marcel Dekker, New Cork, p. 145, (1971).

[3.51] J. J. Aaron , Molecular Luminiscence Spectroscopy. Methods and Applications.

Part 3., Ed. by S.G. Schulman, 85, (1993).

[3.52] A. Espinosa-Mansilla, A. Muñoz De La Peña, D. González Gómez, F. Salinas.

Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life

Sciences 822(1-2), 185-193.(2005).

[3.53]J. López Flores, A. Molina Díaz, M. L. Fernández de Córdova. Talanta 72(3), 991-

997.(2007).

[3.54] J. W. Birks, y R. W. Frei.Anal. Chem. 1, 361, (1982).

[3.55] J. Fidanza y J. J. Aaron. Analusis. 9, 118, (1981).

[3.56] J. J. Aaron y J. Fidanza. Talanta. 29, 383, (1982).

[3.57] J. J. Aaron, S. A. Ndiaye, J. Fidanza. Analusis. 10, 433, (1982).

[3.58] M. Tsuchiya, E. Torres, J. J. Aaron, J. D. Winerfordner. Anal. Lett. 17 ,1831,

(1984).

[3.59] A.H.M.T. Scholten, U.A Th. Brinkman, R.W. Frei. Anal. Chim. Acta. 114, 137,

(1980).

[3.60] A.H.M.T. Scholten, P.L.M. Welling, U.A Th. Brinkman, R.W. Frei. J. Chromatogr.

199, 239, (1980).

[3.61] H. Bagheri, H. Ghanbarnejad, F. Khalilian. Journal of Separation Science 32(17),

2912-2918.(2009).

[3.62] A.R Mughari, P. P. Vázquez, M. M. Galera. Analytica Chimica Acta 593(2), 157-

163.(2007).

Capítulo 3

108

[3.63]Vázquez, P. P., A. R. Mughari, M. M. Galera. Analytica Chimica Acta 607(1), 74-

82.(2008).

[3.64] R. J. Lukasiewicz, J. M. Fitzgerald. Anal. Chem. 45, 511, (1973).

[3.65] R. J. Lukasiewicz, J. M. Fitzgerald. Appl. Spectrosc. , 28, 151, (1974).

[3.66] J. J. Aaron, J. E. Villafranca, V. R. White, J. M. Fitzgerald. Appl Spectrosc. 30, 59,

(1976).

[3.67] J. J. Aaron. Methods Enzymol., 67F, 140, (1982).

[3.68] M. S. Gandelman, J. W. Birks. Anal. Chem.54, 2131, (1982).

[3.69] M. S. Gandelman, J. W. Birks, U. A. Brinkman, R. W. Frei. J. Chromatogr. 282,

193, (1983).

[3.70] M. S. Gandelman, J. W. Birks. Anal. Chim. Acta. 155, 159, (1983).

[3.71] S. Traore, J. J. Aaron. Anal. Lett. 20, 1995, (1987).

[3.72] C.E. Werkhoven-Goewie, W.M. Boon, A.J.J. Praat, R.W. Frei, U.A. Th. Brinkman,

C.L. Little. Chromatographia. 16, 53, (1982).

[3.73] D. Chen, A. Ríos, M.D. Luque de Castro, M. Valcarcel. Analyst. 116, 171, (1991).

[3.74] L.F. García, S. Eremin, J.J. Aaron. Anal. Lett. 29,1447, (1996).

[3.75] A. Coly, J.J. Aaron. Analusis. 24, 107, (1996).

[3.76]. R.G. Luchtefeld. J. Chromatogr. Sci. 23, 516, (1985).

[3.77] C.J. Miles, H.A. Moye. Chromatographia. 24, 628, (19879.

[3.78] B.M. Patel, H.A. Moye, R. Weinberger. J. Agric. Food Chem. 38, 126, (1990).

[3.79] B.M. Patel, H.A. Moye, R. Weinberger. Talanta. 38, 913, (1991).

[3.80] C.J. Miles. J. Chromatogr.592, 283, (1992).

[3.81] J.A. Stab, M.J.M. Rozing, B. Van Hattum, W.P. Cofino, U.A.Th. Brinkman. Ibid.

609, 195, (1992).

[3.82] A. Muñoz de la Peña, M.C. Mahedero, A. Bautista-Sánchez. J. Chromatogr. A.

950, 287, (2002).

[3.83] A. Coly, J.J. Aaron. Analyst. 119, 1205, (1994).

[3.84] S. Eremin, B. Laasis, J.J. Aaron. Talanta. 43, 295, (1996).

[3.85] C.J. Miles, H.A. Moye. Anal. Chem. 60, 220, (1988).

[3.86] A. Coly, J.J. Aaron. Talanta. 49, 107, (1999).

[3.87] A. Coly, J.J. Aaron. Luminescence. 15, 63, (2000).

[3.88] M. Maafi, K. Taha-Bouamri, A. Bautista, J.J. Aaron, M.C. Mahedero, A. Muñoz de

la Peña, F. Salinas, Biomed. Chromatogr. 13, 189, (1999).

[3.89] W. Schuessler. Chromatographia. 29, 24, (1990).


109

[3.90] A. Coly, J.J. Aaron. Anal. Chim. Acta. 360, 129, (1998).

[3.91] M.C. Mahedero, A. Muñoz de la Peña, A. Bautista-Sánchez, J.J. Aaron.

Luminescence. 15, 103, (2000).

[3.92] M.C. Mahedero, A. Muñoz de la Peña, A. Bautista-Sánchez, J.J. Aaron, J. Incl.

Phenon. Mol. Recog. (2001).

[3.93] A. Coly, J.J. Aaron. Anal. Chim. Acta. 392, 255, (1999).

[3.94] A.M. García-Campaña, J.J. Aaron, J.M. Bosque-Sendra. Talanta. 55, 531, (2001).

[3.95] E. M. Almansa López, A. M. García-Campaña, J. J. Aaron, L. Cuadros Rodríguez.

Talanta, 60(2-3,) 355-367 (2003).

[3.96] A. M. García Campaña, J. J. Aaron, J. M. Bosque-Sendra. Talanta, 55(3), 531-539.

(2001).

[3.97] A. M. García Campaña, J. J. Aaron. Luminiscence. 15,110. (2000).

[3.98] J. J. Aaron, A. Coly. Analyst. 121, 1545. (1996).

[3.99] A. Coly, J. J. Aaron. Talanta. 49, 107. (1999).

[3.100] M.C. Mahedero, N. Mora Díaz, A. Muñoz de la Peña, A. Espinosa Mansilla, D.

Gónzalez Gómez, D. Bohoyo Gil. Talanta. 65, 806-813, (2004).

[3.101] M.C. Mahedero García, N. Mora Diez, D. Bohoyo Gil, F. Salinas López. Journal

of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 38, 349-354, (2005).

[3.102] J.J. Aaron, J.E. Villafranca, V.R. White, J.M. Fitzgerald. Appl. Spectrosc. 30,

159, (1976).

[3.103] R.J. Lukasiewicz, J.M. Fitzgerald. Appl. Spectrosc. 28, 151, (1974).

[3.104] W.P. Cai, Y.G. Ouyang, J.M. Chen, G.Q. Tang. Fenxi Huaxue. 25, 519, (1997).

[3.105] R. Fricoteaux, M. Quaglia, J.J. Aaron. J. Pharm. Biomed. Anal. 7, 1585, (1989).

[3.106] Y. Wu, T.L. Zhang, H.C. Zhao, L.P. Jin. Anal. Lett. 33, 3303, (2000).

[3.107] T.L. Zhang, H.C. Zhao, L.P. Jin. Talanta. 49, 77, (1999).

[3.108] F.T. You, T.L. Zhang, L.P. Jin, H.C. Zao, S.B. Wang. Spectrochim. Acta. 55 A,

1119, (1999).

[3.109] M.C. Mahedero, J.J. Aaron. Analusis. 20, 53, (1992).

[3.110] M. Sánchez-Peña, F. Salinas, M.C. Mahedero, J.J. Aaron. J. Pharm. Biomed. Anal.

10, 805, (1992).

[3.111] M. Sánchez-Peña, F. Salinas, M.C. Mahedero, J.J. Aaron. Talanta. 41, 233, (1994).

[3.112] M. Sánchez-Peña, A. Muñoz de la Peña, F. Salinas, M.C. Mahedero, J.J. Aaron.

Analyst. 119, 1177, (1994).

Capítulo 3

110

[3.113] M.C. Mahedero, F. Salinas, M. Jiménez Arrabal, J.J. Aaron. Anal. Lett. 27, 1543,

(1994).

[3.114] J.J. Aaron, M.I. Acedo Valenzuela, M. Sánchez-Peña, F. Salinas, M.C. Mahedero.

Anal. Chim. Acta. 314, 45, (1995).

[3.115] M.C. Mahedero, J.J. Aaron. Ibid. 269, 193, (1992).

[3.116] B. Laassis, J.J. Aaron, M.C. Mahedero. Ibid. 290, 27, (1994).

[3.117] B. Laassis, M. Maafi, J.J. Aaron, M.C. Mahedero. Anal. Lett. 30, 1541, (1997).

[3.118] J.J. Aaron, B. Laassis, M.C. Mahedero, A. Muñoz de la Peña, F. Salinas. J. Incl.

Mol. Recog. Chem. 18, 69, (1994).

[3.119] M. Maafi, B. Laassis, J.J. Aaron, M.C. Mahedero, A. Muñoz de la Peña, F.

Salinas. J. Fluorescence. 7, 25, (1997).

[3.120] M. Maafi, J.J. Aaron, M.C. Mahedero, F. Salinas. J.Fluorescence. 7, 11, (1997).

[3.121] M. Maafi, M.C. Mahedero, J.J. Aaron. Talanta. 44, 2193, (1997).

[3.122] M. Maafi, J.J. Aaron, M.C. Mahedero, F. Salinas. Appl. Spectrosc. 52, 91, (1998).

[3.123] B. Laassis, J.J. Aaron, M.C. Mahedero. Talanta. 41, 1985, (1994).

[3.124] D. Westerlund, A. Theodorsen, Y. Jaksch. J. Liq. Chromatogr. 2, 969, (1979).

[3.125] J.M. Birks, W. Frei. Trends Anal. Chem. 1, 361, (1982)

[3.126] R.R. Brown, R. Brain, V. Craig Jordan. J. Chromatogr. Biomed. Appl. 272, 351,

(1983).

[3.127] C. Kikuta, R. Schmid. J. Pharmacol. Biomed. Anal. 7, 329, (1989).

[3.128] C. Kikuta, R. Schmid. J. Phannacol. Biomed. Anal. 7. 329, (1988).

[3.129] P. J. Harman, G. L. Blackman, G. Philipou. J. Chromatogr. 225, 131, (1981).

[3.130] M. Thsuchiya, J. J. Aaron, E. Torres, J. D. Winefordner. Anal. Lett. 18, 1647,

(1985).

[3.131] R. O. Kan, Organic Photochemistry, McGraw-Hill, New York. 219, (1996).

[3.132] R. R. Brown, R. Bam, V. Craig Jordán. J. Chromatogr. Biomed. Appl. 272, 351,

(1983).

[3.133] J.J. Aaron, A. Diop. Analusis. 13, 40, (1985).

[3.134] J.R. Procopio, P.H. Hernández, L.H. Hernández. Analyst. 112, 79, (1987).

[3.135] Y. Arakawa, K. Imai, Z. Tamura. Anal. Chim. Acta. 147, 325, (1983).

[3.136] C. de Ruiter, J. F. Bohle, G.J. Dejong, U.A.Th. Brinkman, R.W. Frei. Anal. Chem.

60, 666, (1988).

[3.137] C.J. Miles, M.A. Moye. Ibid. 60, 220, (1988).

[3.138] Y.T. Shih, P.W. Carr. Anal. Chim. Acta. 159,211, (1984).


111

[3.139] M.D. Gil-García, M. Martínez-Galera, T. López- López, J.L. Martínez-Vidal,

M.C. Mahedero, F. Salinas. Talanta. 53, 915, (2001).

[3.140] A. Bautista, J.J. Aaron, M. C. Mahedero, A. Muñoz de la Peña. Analys. 27, 857,

(1999).

[3.141] V.R. White, C.S. Frings, J.E. Villafranca, J.M. Fitzgerald. Anal. Chem. 48, 1314,

(1976).

[3.142] M. Maafi, B. Laasis, J.J. Aaron, M.C. Mahedero, A. Muñoz de la Peña, F. Salinas.

J. Inclus. Phenom. Mol. Recog. Chem. 22, 235, (1995).

[3.143] B. Laasis, J. J. Aaron, M. C. Mahedero. Anal. Chim. Acta. 290, 27, (1994).

[3.144] M. S. Gandelman, J. W. Birks. J. Chromatogr. 242, 21, (1982).

[3.145] M.S. Gandelman, J.W. Birks. Anal. Chem. 54, 2131, (1982).

[3.146] S. Traore, J.J. Aaron. Anal. Lett. 20, 1995, (1987).

[3.147] J. J. Aaron, J. E. Villafranca, V. R. White, J. M. Fitzgerald. Appl Spectrosc. 30,59,

(1976).

[3.148] M. F. Lefevre, R. W. Freí, A. H. M. T. Scholten, U. A. Brinkman.

Chromatographia. 15, 459, (1982).

[3.149] J. J. Aaron. En: Molecular Luminescence Spectroscopy. Capítulo 3:

“Photochemical Fluorometry”, S.G. Schulman (Editor), Chemical Analysis Series, Vol 77,

(1993).

[3.150] J.M. Fitzgerald, en J.M. Fitzgerald Ed., “Analytical Photochemistry and

Photochemical Analysis”, New York, (1971).

[3.151] R.J. Lukasiewicz, J.M. Fitzgerald, Anal. Chem. 45, 511, (1973).

[3.152] J.J. Aaron, J.E. Villafranca, V.R. White, J.M. Fitzgerald. Appl. Spectrosc. 30, 159,

(1976).

[3.153] Y. Arakawa, K. Imai, Z. Tamura. Anal. Chim. Acta. 147, 325, (1983).

[3.154] E. Wiedemann. Ann. Physik. 34, 446, (1888).

[3.155] A. Jablonskii, Z. Phisik. 94, 38, (1935).

[3.156] J. Sklar, J. Chem. Phys. 5, 699, (1937).

[3.157] G. Lewis, M. Calvin. J. Am. Chem .Soc. 67, 994, (1945).

[3.158] D. McClure. Ibid. 17, 905, (1949).

[3.159] D. F. Evans. Nature. 176, 777, (1955).

[3.160] M. Roth. J. Chromatogr. 30, 276, (1967).

[3.161] T. Vo-Dinh, “Room Temperature Phosphorimetry for Chemical Analysis”;

Willey: New York (1984)

Capítulo 3

112

[3.162] R. J. Hurtubise, “Solid Surface Luminiscence Anaysis:Theory, Instrumentation

and Applications” ; M. Dekker : New York (1981)

[3.163] E.M. Schulman, C.J. Walling. Science. 53, 178, (1972).

[3.164] E.M. Schulman, C.J. Walling. J. Phys. Chem. 77, 902, (1973).

[3.165] T. Vo-Dinh, A.M. Alak. Appl. Spectrosc. 41, 963, (1987).

[3.166] A.M. Alak, T. Vo-Dinh. Anal. Chem. 60, 596, (1988).

[3.167] S.M. Ramasamy, R. J. Hurtubise. Microchem. J. 40, 317, (1989).

[3.168] J.M. Bello, R.J. Hurtubise. Appl. Spectrosc. 40, 790, (1986).

[3.169] J.M. Bello, R.J. Hurtubise. Anal. Lett. 19, 775, (1986).

[3.170] J.M. Bello, R.J. Hurtubise. Anal. Chem. 59, 2395, (1987).

[3.171] J.M. Bello, R.J. Hurtubise. Ibid. 60, 1285, (1988).

[3.172] J.M. Bello, R.J. Hurtubise. Anal. Chem. 60, 1291, (1988).

[3.173] J.M. Bello, R.J. Hurtubise. Appl. Spectrosc. 42, 619, (1988).

[3.174] M.D. Richmond, R.J. Hurtubise. Appl. Spectrosc. 43, 810, (1989).

[3.175] M.D. Richmond, R.J. Hurtubise. Anal. Chem. 61, 2643, (1989).

[3.176] K. Kalyanasundaran, F. Grieser, J.K. Thomas. Chem. Phys. Lett. 51, 501, (1977).

[3.177] L.J. Cline Love, M. Skrilec, J.G. Habarta. Anal. Chem. 52, 754, (1980).

[3.178] L.J. Cline Love, M. Skrllec, Anal. Chem., 53, 1872-1875, (1981).

[3.179] S. Igarashi, K. Endo. Anal. Chim. Acta. 320(1), 133, (1996).

[3.180] Y. Wei, W. Jin, Ch. Liu, H. Zhou. H. Tong, N. Zhang. Spectrochim. Acta. T A.

53(9),1405, (1997).

[3.181] Rob Nay Woods, Spectrochimica Acta 40ª,7, 643-650, (1984).

[3.182] J. Weijun, Ch. Liu. Microchem. Journal. 48(1), 94, (1998).

[3.183] J.A. Arancibia, G.M. Escandar. Analyst. 126, 917, (2001).

[3.184] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, M.T. Alañón Pardo. Anal. Biochem.

339(1), 157, (2005).

[3.185] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, M.T. Alañón Pardo. Anal. Chim. Acta.

528(1), 77, (2005).

[3.186] J. A. Murillo Pulgarin, A. Alañón Molina, P. Fernández López, M. T. Alañon

Pardo. Anal. Biochem. 312(2), 167, (2003).

[3.187] J.A. Murillo Pulgarín, L.F. García Bermejo. J. Agric. Food Chem. 50(5), 1002,

(2002).

[3.188] J.A. Murillo Pulgarín, L.F. García Bermejo. Anal. Chim. Acta. 491(1), 37, (2003).


113

[3.189] J. A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Analyst, 122, 253,

(1997).

[3.190] A. Muñoz de la Peña, A. Espinosa Mansilla, J. A. Murillo Pulgarin, A. Alañon

Molina, P. Fernández López. Analyst, 123, 2285, (1998).

[3.191] J. A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Talanta. 48(5),

1061, (1999).

[3.192] J.A. Murillo Pulgarin, A. Alañon Molina, M.T. Alañon Pardo. Anal. Chim. Acta.

423(1), 85, (2000).

[3.193] J. A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, P. Fernández López. Anal. Chim. Acta.

382(1-2), 77, (1999).

[3.194] M.E. Díaz García, A. Sanz Medel, Anal. Chem. 58, 1436, (1986).

[3.195] N. E. Nugara, Allen D. King Jr, Anal. Chem., 61, 1431-1435, (1989).

[3.196] S. Tubuschi, K. Fujita, L.C. Yuan. Tetrahedron Lett. 29, 2503, (1977).

[3.197] S. Scypinski, L.J. Cline Love. Anal. Chem. 56, 322, (1984).

[3.198] J. Weijun, D. Yansheng, L. Changsong, Z. Sushe. Anal. Chem. 54, 1552, (1994).

[3.199] A. Segura Carretero, C. Cruces Blanco, A. Fernandez Gutierrez. Anal. Chim.

Acta. 165, 329, (1996).

[3.200] A. Segura Carretero, C. Cruces Blanco, A. Fernandez Gutierrez, M. Sanchez Polo,

J.C. Avila Roson. Anal. Chim. Acta. 474(1), 91, (2002).

[3.201] J.J. Donkerbroek, C. Gooijer, N.H. velthorst, R. W. Frei. Anal. Chem. 54, 891

(1982).

[3.202] J.J. Donkerbroek, N.J.R. Van Eikema Hommes, C. Gooijer, N.H. velthorst, R. W.

Frei. J. Chromatogr. 255, 581 (1983).

[3.203] A. Segura Carretero, C. Cruces Blanco, B. Cañabate Díaz, A. Fernández Gutiérrez.

Anal. Chim. Acta. 361, 217 (1998).

[3.204] X.K. Chen, L. Mou, L.D. Li. Chem. J. Chinese U. 20(7), 1052 (1999).

[3.205] W.Q. Long, L.D. Li, A.J. Tong. Fenxi Huaxue. 30(10), 1201 (2002).

[3.206] L.D. Li, Y.D. Chen, A.J. Tong. Huaxue Tongbao. 6, 46 (1996).

[3.207] L. Mou, X.K. Chen, L.D. Li. Chem. J. Chinese U. 20(2), 214 (1999).

[3.208] L. Mou, X.K. Chen, L.D. Li. Chinese J. Anal. Chem. 27(5), 509 (1999).

[3.209] L.D. Li, Y. Zhao, Y.G. Wu, A.J. Tong. Talanta, 46(5), 1147 (1998).

[3.210] C.C. Blanco, A. Segura Carretero, B. Cañabate Diaz, A. Fernández Gutierrez.

Inter. J. Environ. Anal. Chem. 75(4), 377 (1999).

[3.211] A. Segura Carretero, C. C. Blanco, A.F. Gutierrez. J. Agri. Food Chem. 46

Capítulo 3

114

3683 (1998).

[3.212] A. Fernández Gutierrez, A. Segura Carretero, B. Cañabate Diaz, C. Cruces

Blanco. Appl. Spectrosc. 53(6), 741 (1999).

[3.213] X.K. Chen, L.D. Li. Fenxi Huaxue. 30(8), 897 (2002).

[3.214] X.K. Chen, L. Mou, L.D. Li. Chem. J. Chinese U. 20(7), 1052 (1999).

[3.215] W.Q. Long, L.D. Li, A.J. Tong. Fenxi Huaxue. 30(10), 1201 (2002).

[3.216] A. Castillo, L. Ongaro Gambino, G. Polizzi, Luminescence, 22, 527–533 (2007).

[3.217] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, M.T. Alañón Pardo. Analyst. 126, 234

(2001).

[3.218] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina. Fres. J. Anal. Chem. 368(5), 505 (2000).

[3.219] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, M.T. Alañón Pardo. Talanta. 57 (4),

795 (2002).

[3.220] J.A. Murillo Pulgarín, A. Alañón Molina, M. T. Alañón Pardo. Anal. Biochem.

306(2), 270 (2002).

[3.221) J.A. Murillo Pulgarín, L.F. García Bermejo, I. Sánchez-Ferrer Robles, S. Becedas

Rodríguez. Phytochemical Analysis. 23, 214-221. (2012).

BLOQUE II

MATERIALES Y MÉTODOS

CAPÍTULO 4. MATERIALES Y MÉTODOS

CAPÍTULO 4

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y métodos

119

1. INSTRUMENTACIÓN EMPLEADA EN EL DESARROLLO DE

ESTA TESIS

1.1. Espectrofluorímetro de barrido Photon Technology

International TimeMaster

Este espectrofluorímetro es un sistema modular que cuenta con la posibilidad de

realizar medidas de fluorescencia o fosforescencia en estado estacionario y curvas de

decaimiento para estudios de medidas resueltas en el tiempo. El sistema presenta una

configuración en X, de manera que en el compartimiento de muestra existen dos entradas

para la excitación y dos salidas para la emisión. Como fuentes de excitación el sistema

cuenta con una lámpara continua de arco de xenón de 75 W para las medidas de

fluorescencia en estado estacionario, con una lámpara pulsada (flash) de xenón para las

medidas de fosforescencia, y, por último, con un láser pulsado de nitrógeno para las

medidas de tiempos de vida de fluorescencia, con un ancho de pulso de 800 ps. Estas

fuentes están situadas de manera que ante la primera entrada de excitación se encuentra la

lámpara continua y la pulsada, seleccionables mediante un espejo situado a la entrada del

monocromador de excitación, y por la segunda entrada se encuentra conectada una fibra

óptica procedente del láser pulsado de nitrógeno.

En cuanto a las salidas, en la primera se encuentran los detectores de fluorescencia

y fosforescencia en estado estacionario, seleccionables a través de un espejo situado en la

salida del monocromador, y en la segunda salida se sitúa un detector estroboscópico para

las medidas de tiempos de vida de fluorescencia, acoplado a un tercer monocromador. El

esquema del equipo se puede ver en la figura 4.1.

La sensibilidad del sistema para el Raman del agua es de 10000:1 para la lámpara

continua (apertura de las rendijas = 5 nm), 3000:1 para la lámpara pulsada (apertura de las

rendijas = 10 nm), y es capaz de medir el decaimiento de una disolución 7 pM de

fluoresceína con el láser de nitrógeno.

El sistema cuenta con tres sistemas detectores distintos: un fotomultiplicador para

trabajar en fluorescencia que cubre el rango entre 200 y 700 nm, con posibilidad de trabajo

tanto en modo analógico como digital, un segundo fotomultiplicador para trabajar en

fosforescencia sincronizado con la frecuencia de pulso de la lámpara pulsada, y un tercer

fotomultiplicador específico para trabajar en modo estroboscópico para fluorescencia

resuelta en el tiempo.

Capítulo 4

120

Figura 4.1. Esquema del espectrofluorímetro TimeMaster de PTI. (a) Configuración de

fosforescencia. (b) Configuración de fluorescencia.

(a)

(b)


121

Para la selección de longitudes de onda, tanto de excitación como de emisión, el

sistema cuenta con tres monocromadores Czerny-Turner con una distancia focal de 200

nm. Las redes de difracción son holográficas cóncavas de 1200 líneas/mm. El

monocromador es capaz de seleccionar longitudes de onda con una separación de 0,25 nm.

La resolución del monocromador es de 0,5 nm y la precisión es de 0,25 nm. Las rendijas

son ajustables vía software entre 0 y 25 nm.

El control del equipo se realiza a través del software Felix32 y la interfase con el

ordenador se realiza vía ethernet. El software, entre muchas de sus capacidades, permite la

representación de espectros bidimensionales, tridimensionales (excitación/emisión,

resueltos en el tiempo, etc.), calcular tiempos de vida con deconvolución de la señal de la

fuente de excitación, cálculos de FRET, etc...

1.1.1. Parámetros instrumentales a tener en cuenta

En el caso del espectrofluorímetro PTI Time Master, el voltaje tiene un valor fijo

de 1000 V cuando se trabaja en modo digital. Por tanto, este parámetro no será necesario

optimizarlo.

Otro parámetro que sí hay que tener en cuenta y, por lo tanto, debe ser optimizado,

es la apertura de las rendijas: al aumentar la apertura aumenta la intensidad, a costa de la

resolución y de un aumento considerable del ruido.

Cuando se trabaja en fluorescencia también es necesario optimizar el tiempo de

integración (Int Time), que es el tiempo durante el cual se está integrando la señal de

fluorescencia.

Además, deben ser considerados otros parámetros relacionados con la lámpara

pulsada, que es la fuente de excitación que se utiliza al trabajar en fosforescencia, y que se

encuentran representados en la figura 4.2. El primero de ellos es el tiempo de espera

(Delay), el cual se puede definir como el tiempo que transcurre desde el inicio del pulso de

la lámpara hasta el comienzo de la integración de la señal fosforescente. Este parámetro

permite eliminar la intensidad de la señal procedente de la lámpara. El siguiente

parámetro a fijar es el tiempo de integración (Int Time) que es el tiempo durante el que se

está integrando la señal de fosforescencia. Comienza cuando termina el tiempo de espera y

lo que se fija es el tiempo final. Como puede observarse en la figura 4.2, este valor no es

conveniente extenderlo demasiado puesto que solaparía con el siguiente pulso.

Capítulo 4

122

Figura 4.2. Parámetros instrumentales de la lámpara pulsada.

Otro parámetro a fijar es la frecuencia de disparos. Una mayor frecuencia reducirá

el tiempo de análisis pero aumentará el ruido instrumental. Por otro lado, otro parámetro a

tener en cuenta es el número de disparos (Shots) que va a dar el instrumento para registrar

un punto. El equipo va a dar el número de disparos que se seleccione y representará la

media de esos disparos como un único punto. Un aumento del número de disparos

aumentará la relación señal/ruido a costa de un mayor tiempo de análisis. También es

importante, y está relacionado con en número de disparos, el número de replicados

(Número de medias) que se va a hacer de una misma medida. Como al aumentar el

número de disparos, un aumento en el número de replicados disminuirá considerablemente

el ruido instrumental, presentando como desventaja un mayor tiempo de análisis. Además,

hay que tener en cuenta que en moléculas que presenten “fotoatenuación” se va a ir

perdiendo señal a medida que se irradia la muestra. Generalmente y por razones

estadísticas, es preferible realizar un mayor número de medias que aumentar el número de

disparos.

1.2. Control de temperatura

Para el control de la temperatura se empleó un Sistema Peltier Quantum modelo

TC 125 capaz de regular la temperatura entre 0 y 99 ºC con una precisión de 0,1 ºC.


123

1.3. Medidor de pH

Las medidas de pH se realizaron empleando un medidor Crison modelo GMP 21+

con una sensibilidad de 0,01 unidades de pH. El sistema cuenta con un electrodo

combinado de vidrio y calomelanos.

1.4. Centrífuga

Para la centrifugación de las muestras se empleó una centrifuga Selecta modelo

Medifriger termostatizable con una velocidad máxima de 5000 r.p.m.

1.5. Rotavapor

Se utilizó un rotavapor Büchi modelo RE 111 acoplado a un baño termostatizado

Büchi modelo 461 para la eliminación del disolvente orgánico tras el proceso de

extracción en muestras reales.

1.6. Baño de ultrasonidos

Para la extracción de los principios activos de la matriz de la muestra vegetal fue

necesario el empleo de un baño de ultrasonidos Selecta modelo Ultrasons.

1.7. Balanzas

Para la pesada de los reactivos se emplearon dos balanzas; una balanza analítica

Sartorius modelo RC 210 D con sensibilidad de 0,01 mg, y un granatario Sartorius modelo

L420 P de sensibilidad 0,1 g.

1.8. Destilador de agua

Para la preparación de disoluciones se empleo agua destilada obtenida mediante un

sistema de purificación de agua Milli-Q 185 plus con un nivel de materia orgánica inferior

a 10 ppb.

Capítulo 4

124

1.9. Bomba peristáltica

Para impulsar las disoluciones de los analitos a través de la lámpara UV se emplea

una bomba fabricada por GILSON modelo Minipuls 3 (figura 4.3), que consta de un

cabezal rotatorio de cuatro vías que puede girar en ambos sentidos. En cada una de estas

vías o canales se pueden introducir tubos de silicona, los cuales se unen a su vez a tubos de

teflón para el transporte de las disoluciones de los analitos desde los recipientes que los

contienen hasta la salida de la lámpara UV en la que se produce la reacción fotoquímica.

El margen de velocidades, en escala de revoluciones por minuto (rpm), que permite

obtener esta bomba está comprendido en el intervalo de 0.10 y 48 rpm.

1.10. Lámpara UV

La obtención de fotoproductos fluorescentes de determinados analitos fue llevada a

cabo utilizando una lámpara UV modelo PSA 10.570 UV Cracker (figura 4.12). La

radiación UV procede de una lámpara interna de mercurio a baja presión, la cual está

protegida por una carcasa metálica de color blanco como se puede observar en la figura

4.12. A lo largo de esta lámpara se encuentra enrollado un tubo flexible de teflón de 1,56

mm de diámetro y 4,78 m de longitud, por donde se hace fluir la disolución de los analitos,

impulsada por una bomba peristáltica, para ser sometida a la radiación UV. Dicho tubo

podría modificarse en función del tiempo de irradiación que las diferentes muestras

necesiten para ser analizadas en condiciones óptimas. Las características técnicas de dicha

lámpara se detallan a continuación:

- Dimensiones: largo 70 cm; alto 51 cm ; ancho 51 cm.

- Voltaje: 240/220 V.

- Dimensiones internas de la lámpara: largo 43 cm; diámetro 25 cm.

- Potencia: 4.5 W.


125

2. DISOLUCIONES EMPLEADAS

Los principios activos estudiados son los presentados en la tabla 4.1.

Tabla 4.1. Principios activos

Principio activo Casa

comercial

Medio

(mol L-1

)

Concentración

(mg L-1

)

Ácido 1-Naftilacético (NAA) Riedel-de Haën

SDS (0,2) 100

Etanol 100% 200

Ácido 2-Naftoxiacético (NOA) Fluka SDS (0,2) 100

(2,4-DP) Ácido

2,4-dicloropropanoico Fluka Etanol 100% 200

(TCP) Ácido

3,5,6-tricloro-2-

piridiloxiacético

Fluka Etanol 100% 200

Ácido Giberélico (AGB) Fluka Etanol 100% 200

Tiabenzdazol (TBZ) Sigma-Aldrich Etanol 100% 200

Como indica la tabla 4.1, para llevar a cabo su análisis, se prepararon disoluciones

madre de 100,0 mg L-1

o 200,0 mg L-1

, y a partir de ellas las sucesivas disoluciones de

trabajo. Así mismo, los reactivos empleados en el desarrollo de esta tesis se detallan en la

tabla 4.2.

Figura 4.3. Lámpara

UV PSA 10.570.

Capítulo 4

126

Tabla 4.2. Reactivos utilizados

Reactivo Casa comercial Uso

Hidrogenocarbonato de sodio

(NaHCO3) Panreac Extracción en ultrasonidos

Ácido sulfúrico (H2SO4) Panreac Medio ácido en el proceso

de extracción orgánica

Diclorometano (CH2Cl2) Rathburn Extracción orgánica

Dihidrogenofosfato de sodio

(NaH2PO4·2H2O) Panreac Tampón

Ácido Clorhídrico (HCl) Panreac Médio ácido

Hidróxido sódico (NaOH) Panreac Médio básico

Dodecilsulfato de sodio

(SDS) Sigma-Aldrich Agente micelar

Nitrato de talio (TlNO3) Sigma-Aldrich Átomo pesado

Etanol (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich Disolvente

Citrato de sodio Sigma-Aldrich Tampón

Acetato de sodio Sigma-Aldrich Tampón

Sulfito de sodio (Na2SO3) Panreac Agente desoxigenante

Metanol (CH3OH) Sigma-Aldrich Disolvente

3. ESPECTROSCOPÍA DE DERIVADAS

Las técnicas de derivadas han sido ampliamente aplicadas a la espectrofotometría

de absorción UV-Vis. Como es bien sabido, la espectrofotometría de derivadas es una

técnica que consiste en la obtención y tratamiento del cociente diferencial dnA/dλ

n de un

espectro convencional en un determinado intervalo de longitudes de onda, siendo n el

orden de la derivada.

La espectrofotometría de derivadas fue introducida al comienzo de la década de los

cincuenta [4.1-4.3], aunque no se implantó hasta algunos años más tarde, debido

posiblemente a la falta de instrumentación de bajo coste y a la limitación inicial de poder


127

obtener solamente la derivada de primer orden. La introducción de la diferenciación

electrónica, posteriormente, con el desarrollo de los ordenadores, la diferenciación digital

y la facilidad de derivación con los espectrofotómetros de diodos [4.4] hicieron posible la

obtención de derivadas de orden superior, abriendo un amplio campo de aplicaciones a un

precio razonable.

La espectrofotometría de derivadas es especialmente útil para determinar la

longitud de onda exacta de los máximos de absorción, sobre todo cuando los espectros

están constituidos por bandas anchas, ya que en la primera derivada del espectro la

posición del máximo viene definida exactamente por el paso de la curva por el valor cero

(“zero-crossing”). Otra ventaja es la mejor resolución con que aparece la estructura fina,

que, a veces, puede ser difícil de apreciar en el espectro normal, ya sea con fines de

identificación, como criterio de pureza o para el control de calidad. Una importante

aplicación es la determinación cuantitativa de compuestos en muestras turbias, ya que las

disoluciones turbias presentan, en general, un aumento continuo de la absorbancia hasta

longitudes de onda más cortas y no ocasionan ninguna variación importante en los

espectros derivados [4.5].

Sin duda alguna, el mayor campo de aplicación de la espectrofotometría de

derivadas se centra en la determinación simultánea, sin separación previa, de dos o más

componentes de una mezcla cuyos espectros se encuentren solapados.

Existen descritos en la bibliografía varios métodos para evaluar las bandas

solapadas de los componentes, describiendo las condiciones límite para la detección de

dichas bandas [4.6-4.8]. Chen y col. [4.9] estudiaron detalladamente la resolución por

segunda y cuarta derivada de dos bandas solapadas considerando numerosas posibilidades,

y O´Haver y Green [4.10] concluyeron que, mediante esta técnica, el error total de las

determinaciones se reduce, como norma general, al menos tres veces.

Uno de los métodos de medida más utilizado en el análisis de mezclas es el

llamado “zero-crossing” [4.10,4.11], que consiste en medir la señal derivada de un

componente a la longitud de onda en la que el espectro derivado del compuesto

interferente corta al eje de abscisas, es decir, se anula [4.12], tal como se muestra en la

Figura 4.13.

Otros estudios teóricos también pueden encontrarse en la bibliografía que tratan

sobre aspectos cuantitativos de esta técnica [4.13-4.15].

Una desventaja de la espectrofotometría de derivadas es que disminuye la relación

señal/ruido y, por ello, es necesario realizar algún tipo de filtrado de los espectros [4.16].

Capítulo 4

128

O´Haver estudió este efecto [4.17], concluyendo que la relación señal/ruido depende de la

anchura de la banda y decrece cuando aumenta el orden de la derivada.

Figura 4.13. Representación del zero-crossing

Debido a la importancia y amplitud que ha adquirido la espectrofotometría de

derivadas, existen numerosas revisiones bibliográficas sobre las propiedades de los

espectros derivados [4.18-4.26] y de sus aplicaciones prácticas [4.27-4.35].

En 1989 Sánchez Rojas y col. [4.36] publicaron una completa revisión en la que

tratan aspectos teóricos, instrumentales y aplicaciones en diferentes campos (análisis

farmacéutico, toxicología forense, análisis de aminoácidos y proteínas, química clínica,

análisis del medio ambiente, análisis inorgánico, etc.).

Debido a los numerosos trabajos de investigación que aparecen publicados

empleando esta técnica, la conocida revista “Analytical Chemistry” dedica bienalmente

desde 1984 un apartado dedicado a la espectrofotometría en la que se incluye la técnica de

derivadas para llevar a cabo la determinación de metales, no metales y compuestos

orgánicos [4.37-4.44].

Los análisis fluorimétrico y fosforimétrico, que conllevan la reemisión de radiación

previamente absorbida, muestran muchas características similares a las de los métodos

fotométricos, aunque poseen como propiedad particular su elevada sensibilidad, que los

hace útiles en el análisis de trazas. Con frecuencia, las técnicas fluorimétricas, y en mayor

medida las fosforimétricas, ofrecen mayor grado de selectividad que las absorciométricas,

200 250 300 350 400 450

Longitud de onda (nm)

-8.0E-3

-4.0E-3

0.0E+0

4.0E-3

8.0E-3

1.2E-2

Pri

me

ra d

eri

va

da


129

puesto que hay un mayor número de moléculas que absorben radiación que moléculas que

reemiten, siendo de estas últimas menor el número de moléculas que reemiten emisión

fosforescente desde un estado triplete excitado, además de eso, la mayor selectividad se

debe a que para llevar a cabo la determinación de un compuesto por fluorescencia o

fosforescencia es necesario seleccionar dos longitudes de onda.

En 1974, Green y O´Haver propusieron la aplicación de las derivadas a la

espectrometría luminiscente [4.45]. En la bibliografía han sido descritos numerosos

trabajos considerando su utilidad en la determinación simultánea de mezclas de

compuestos. Así, fue aplicada la técnica de “zero-crossing” para llevar a cabo la

determinación de paracetamol y salicilamida mediante la primera derivada de sus

espectros fluorescentes [4.46].

La espectroscopia de derivadas es una técnica muy útil cuando se combina con las

metodologías de fluorescencia sincrónica, concediéndole una gran potencialidad a la hora

de resolver muestras complejas.

La derivación de los espectros sincrónicos mejora considerablemente la resolución

de las posibles bandas solapadas, debido a que produce una distinción entre las bandas

estrechas y las anchas, que aumenta proporcionalmente con el orden de derivación. Esto es

debido a que, para bandas Gaussianas o Lorentzianas, la amplitud Dn de la derivada de

orden n es inversamente proporcional a la anchura de la banda original w elevada al

grado n:

Dn α

n

w

1

Ecuación 4.1 Amplitud de la banda derivada.

Así, para dos bandas coincidentes, de igual intensidad, la amplitud de la derivada

de la banda más estrecha, es mayor que la correspondiente a la derivada de la banda más

ancha. Las ventajas que proporcionan las técnicas de derivación se basan en que permiten

discriminar de una forma mucho más satisfactoria.

Por otro lado la principal desventaja de las técnicas de derivación es que disminuye

considerablemente la relación señal/ruido [4.47] al aumentar el grado de la derivada.

Debido a ello, es necesario acompañar la derivación con un proceso de filtrado. Los

procesos de filtrado se basan simplemente en crear nuevos puntos de datos mediante

Capítulo 4

130

combinación lineal de los puntos adyacentes originales. El programa FTOTAL permite

tanto derivar como filtrar los espectros bidimensionales con diferentes grados de filtrado.

John y Soltar fueron los primeros en combinar la fluorescencia sincrónica y

derivada [4.48], consiguiendo un menor solapamiento de las bandas por el estrechamiento

de éstas en los espectros sincrónicos, y desde entonces han sido numerosos los trabajos

que hacen uso de la combinación de ambas técnicas.

Han sido propuestas derivadas de distinto orden en espectros de fluorescencia

sincrónicos [4.49-4.54], sincrónicos de energía constante [4.55], sincrónicos de ángulo

variable [4.56] y sincrónicos por isopotenciales de la matriz [4.57,4.58] para llevar a cabo

la determinación de diferentes clases de analitos.

Por otro lado, también han sido aplicadas las derivadas en espectros de

fosforescencia sincrónicos a temperatura ambiente y en medios no protegidos [4.59-4.61],

sincrónicos de ángulo variable [4.62,4.63] o fosforescencia a temperatura ambiente sobre

soporte sólido [4.64].

4. MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS EMPLEADOS

4.1. Métodos de regresión lineal

Generalmente, en química analítica una variable no se mide directamente sino que

se determina a partir de otra variable que esté relacionada con ella; normalmente, la

variable desconocida es la concentración y la variable relacionada es una propiedad

analítica de la muestra determinada experimentalmente.

De esta forma existen dos variables: una variable independiente (concentración)

que se conoce como x, y una dependiente (propiedad analítica) conocida como y. La forma

más simple de predecir una a partir de la otra es construir una recta de regresión

preparando un conjunto de muestras patrón con valores conocidos de ambas variables.

Dicha recta tendrá la siguiente forma:

xy

Ecuación 4.2. Ecuación de la recta de regresión.

Donde α y β son los parámetros poblacionales del modelo, a priori, desconocidos.

Normalmente se les denomina ordenada en el origen o intersecto poblacional y pendiente


131

poblacional, respectivamente. Por su parte, ε es el error observado entre el modelo teórico

y el medido experimentalmente. Estos parámetros se estiman a través de las muestras

patrón como se comentó con anterioridad, construyendo la regresión:

bxay ˆ

Ecuación 4.3. Método de regresión.

Donde y es la predicción de y, mientras que, por otro lado, a y b son los

coeficientes de la regresión estimadores de los valores α y β. Para cada valor de x se tiene

un valor real observado y un valor predicho. Por tanto, se puede definir el valor residual

para un valor de x = i (ri) como la diferencia entre ambos valores:

ri = yi - iy

Ecuación 4.4. Cálculo de los residuales.

El método usado con mayor frecuencia para estimar los coeficientes de regresión

es el de los mínimos cuadrados. Este método consiste, básicamente, en minimizar la suma

del cuadrado de los residuales:

n

i

ii

n

i

n

i

iii bxayyyr1

2

1

2

1

2 )()ˆ(

Ecuación 4.5. Modelo de mínimos cuadrados.

Para resolver la ecuación anterior, se realizan las derivadas de la ecuación respecto

a a y respecto a b, y se igualan ambas derivadas a cero:

ii xbany

2

iiii xbxayx

Si se despeja b, se obtiene la siguiente ecuación:

2)(

))((

xx

yyxxb

i

ii

Ecuación 4.6. Cálculo del coeficiente b.

Capítulo 4

132

Dado que la recta de regresión pasa por el centroide ( yx, ) se puede obtener la

ordenada en el origen a través de la ecuación siguiente:

a = xby

Ecuación 4.7. Cálculo del coeficiente a.

Una forma de evaluar el ajuste es calcular el coeficiente de la determinación (r2).

Dicho coeficiente relaciona la varianza explicada por el modelo y la varianza total, la cual

es la suma de la varianza explicada más la varianza de los residuales. Por tanto, si la

varianza total es igual a la varianza explicada (ajuste perfecto), r2 tomará el valor unidad.

Por el contrario, si no existe correlación lineal entre las variables, r2 tomará el valor 0.

2

2

2

)(

)ˆ(

var

var

yy

yyr

i

i

total

exo

Ecuación 4.8. Cálculo del coeficiente de determinación.

Para que un modelo de regresión por mínimos cuadrados sea válido debe cumplir

unos requisitos determinados:

- En primer lugar, el modelo considera que los errores aleatorios en la variable

independiente son despreciables. Por tanto, esto debe cumplirse para que el modelo

sea válido.

- Además, debe cumplirse que la relación entre ambas variables sea lineal en el

intervalo de valores estudiado.

- Los residuales deben ser aleatorios, es decir, deben ser independientes del valor de

x, y la media de dichos residuales debe tomar el valor cero. En ese caso se dice que

los residuales son homocedásticos.

- Por último, no deben existir puntos anómalos ni puntos leva en el modelo; un

punto anómalo es aquel que mantiene el valor medio de los puntos xi y varía el de

los puntos yi. Un punto leva es el contrario de un punto anómalo, es decir, el que

varía el valor medio de los puntos yi y mantiene el de los puntos xi.

Como se ha visto el modelo de mínimos cuadrados se ve fuertemente influenciado

por la presencia de errores en alguno de sus puntos. Por ello, es usual emplear métodos de

regresión que se encuentren menos influenciados por estos errores. A estos métodos se les


133

conoce como métodos de regresión robustos. Uno de los métodos robustos más empleado

es la regresión por mínima mediana de cuadrados. Dicho método es considerado como un

método robusto debido a que la mediana es un parámetro estadístico poco sensible a las

grandes desviaciones respecto al grueso de los datos.

Este modelo se basa en minimizar las desviaciones con respecto a la mediana de

los residuales:

Mínima med (yi – (a + bxi))2

Ecuación 4.9. Modelo de regresión por mínima mediana de cuadrados.

Una vez ajustados los valores de x e y al modelo, se procede a identificar los puntos

anómalos como aquellos que distan bastante del ajuste robusto, es decir, aquellos que

producen grandes residuales positivos o negativos. Para decidir si un residual tiene un

valor significativo hemos de compararlo con un estimador del error estándar de los

residuales ( ) (error estándar estimado de los residuales o error estándar estimado de la

recta). Por supuesto, este estimador debe ser robusto por sí mismo y no verse afectado por

datos anómalos. La expresión de este estimador es:

2

1ˆ

ii

rmedC

Ecuación 4.10. Cálculo del estimador del error estándar de los residuales.

En la ecuación anterior, ri es el residual del caso i con respecto a la recta ajustada y

C1 es una constante que hace de factor de corrección para que el cálculo sea coherente con

la distribución Gaussiana de errores. El modelo de la regresión por mínima mediana de

cuadrados propone un coeficiente de la determinación (r2) que representa en qué medida el

modelo ajustado explica la variabilidad observada en y. Este coeficiente r2 viene dado por

la expresión:

2

2 1

jj

ii

i

ymedymed

rmedr

Ecuación 4.11. Cálculo del coeficiente de la determinación para el modelo de mínima mediana de

cuadrados.

Capítulo 4

134

La presencia de puntos anómalos y puntos leva en el modelo puede estudiarse con

ayuda del residual estandarizado (RS) y con la resistencia al diagnóstico (RD),

respectivamente.

Para calcular el residual estandarizado es necesario calcular un error estándar

estimado preliminar (s0), basado en el valor de la función objetivo multiplicado por un

factor de corrección que tiene en cuenta el tamaño de la muestra:

20

2

514826,1 i

irmed

ns

Ecuación 4.12. Cálculo del error estándar estimado.

Los residuales estandarizados se calculan dividiendo el valor del residual entre el

error estándar estimado:

0s

rRS i

i

Ecuación 4.13. Cálculo de los residuales estandarizados.

En función del valor del residual estandarizado, a los puntos se les asigna un peso

wi en la regresión. Si el valor del residual estandarizado es superior a 2,5, el peso será 0 y

si el valor es igual o inferior a 2,5, el peso será 1 [4.65].

El error estándar de los residuales viene dado por la expresión de la siguiente

ecuación:

n

i

i

n

i

ii

w

rw

1

1

2

2

*

Ecuación 4.14. Cálculo del error estándar de los residuales.

Finalmente, se hace una corrección de los residuales estandarizados teniendo en

cuenta el error estándar de los residuales, σ*.

Para el cálculo de la resistencia al diagnóstico lo que se hace es estandarizar la

lejanía de la observación i (ui):

Jinj

Ji

Ji

rmed

ru

,,...,1

,max

Ecuación 4.15. Cálculo de la lejanía de la observación.


135

La ecuación anterior se resuelve calculando, para cada observación (x, y), los

residuales, r, de todas las rectas posibles que pasen por cada dos de las observaciones,

tomándose éstos en valor absoluto. Para cada recta posible, J, se calcula la mediana de los

residuales, med ri,J. Para cada observación i-ésima, (xi, yi), se calculan entonces los

residuales a todas las posibles rectas, rj,J y se estandarizan con respecto a la mediana de los

residuales de la recta J considerada. De todos estos residuales, el mayor de todos define la

lejanía de la observación i-ésima con respecto al resto de las observaciones y representa la

mayor distancia estandarizada a todas las rectas posibles. Calculadas todas las lejanías (ui),

se calcula su mediana para estandarizar dichas lejanías y la lejanía estandarizada

constituye la resistencia al diagnóstico, que viene dada por:

jnj

ii

umed

uRD

,...,1

Ecuación 4.16. Cálculo de la resistencia al diagnóstico.

Un punto se considerará leva cuando su RD sea superior a 2,5. Conviene apuntar

que un punto leva no tiene porque tener una gran influencia sobre el ajuste. Un punto con

un RS alto suele tener un valor de RD alto, pero no al contrario de manera que no influirá

excesivamente en la regresión.

4.2. Intervalos de confianza y test de student para la pendiente y la

ordenada en el origen

El intervalo de confianza de la pendiente para un nivel de confianza del 95% viene

dado por la siguiente ecuación:

bn stb 2,05.0

Ecuación 4.17. Intervalo de confianza para la pendiente con un nivel de confianza del 95%.

Generalmente, en las pruebas de significación, se calcula el valor experimental de t

para un valor hipotético de la pendiente (β0):

bs

bt 0

Ecuación 4.18. Cálculo del valor experimental de t.

Capítulo 4

136

Si el valor experimental de t es superior al tabulado existirán diferencias

significativas entre b y β0; y, por tanto, el valor hipotético de la pendiente no entra dentro

del intervalo de confianza de dicha pendiente.

La desviación estándar de la pendiente, sb, viene dada por la ecuación siguiente:

ns

ss

x

yx

b

Ecuación 4.19. Desviación estándar de la pendiente.

Para la ordenada en el origen el estudio es similar, de manera que el intervalo de la

ordenada en el origen a un nivel de confianza del 95% viene dado por la expresión.

2,05.0 nta

Ecuación 4.20. Intervalo de confianza para la ordenada en el origen con un nivel de confianza del

95%.

Así, se puede calcular el valor experimental del estadístico t para un valor

hipotético de la ordenada en el origen, α0, a partir de la ecuación:

as

at 0

Ecuación 4.21. Cálculo del valor experimental de t para la ordenada en el origen.

De manera similar a lo que ocurría para la pendiente, si el valor de t es superior al

tabulado se podrá decir que existen diferencias significativas entre los valores de a y α0.

Entonces, el valor hipotético de la ordenada en el origen, α 0, no entra en el intervalo de

confianza de la ordenada en el origen de la recta de regresión, existiendo, por tanto,

diferencias significativas entre ambos valores.

La desviación estándar de la ordenada en el origen, sa, se puede obtener de la

siguiente ecuación:

2

21

x

yxans

x

nss

Ecuación 4.22. Cálculo de la desviación estándar de la ordenada en el origen.

Estos ensayos tienen dos funciones básicas; por un lado, descartar la hipótesis de la

pendiente nula, β0 = 0, que anularía el método de regresión, ya que no sería adecuado para


137

explicar la relación entre ambas variables. Y, por otro lado, la significación de la ordenada

en el origen va a indicar si se debe tener en cuenta la señal analítica debida al blanco

[4.66].

4.3. Comparación de rectas de calibrado. Análisis de varianza

Al trabajar con mezclas de analitos o con analitos en presencia de matrices que

presentan señal interferente, es conveniente realizar calibrados a diferentes

concentraciones o con diferentes matrices para evaluar si realmente existe interferencia en

las determinaciones. Una buena herramienta para esta tarea es el empleo del análisis de

varianza para comparar rectas de calibrado.

En esta tesis se emplean dos parámetros estadísticos, F1 y F2, para comparar las

rectas de calibrado individuales con la recta de calibración global y para establecer

posibles diferencias entre las pendientes de las rectas, respectivamente.

Para realizar el análisis de varianza se debe definir una serie de varianzas que se

encuentran recogidas en la tabla 4.3.

Tabla 4.3. Definición de las varianzas empleadas en los análisis.

FFuueennttee ddee

vvaarriiaacciióónn SSuummaa ddee ccuuaaddrraaddooss

GGrraaddooss

ddee

lliibbeerrttaadd VVaarriiaannzzaa

Desviaciones

dentro de los

calibrados

nk-2k 2

1s

Diferencias

entre las

pendientes bj

k-1 2

2s

Desviaciones

entre los

calibrados

individuales

213 ssss T 2k-2 2

3s

Desviación

lineal sobre el

calibrado

global

nk-2 2

Ts

Por lo tanto, para comparar las rectas individuales con la recta global se emplea el

estadístico F1; F(0,05.2k-2.nk-2k) = s32/s1

2. Si el valor experimental resulta ser menor que el

teórico para ese nivel de confianza, se podrá decir que no existen diferencias significativas

entre los calibrados y se podrá emplear la regresión global.

k

j j b b s

1

2 2 ) (

k

j

n

i j i j i y y s

1 1

2 , , 1 ) ˆ (

k

j

n

i

k

j

n

i j i j i j i T y y x x b y y s

1 1 1 1 , ,

0 2 , ) )( ( ) (

Capítulo 4

138

Para comparar las pendientes se emplea el estadístico F2; F(0,05.k-1,nk-2k)= s22 /s1

2.

Nuevamente, si el valor experimental de F es menor que el tabulado se puede decir que no

existen diferencias significativas entre las pendientes de las rectas de regresión.

4.4. Precisión en las estimaciones obtenidas a partir de la recta de regresión

Para estudiar la precisión en la estimación de la recta de regresión es conveniente

definir el error estándar de un punto determinado. Esto resulta más sencillo si se hace a

partir de la ecuación de la recta expresada en función del punto medio ( yx, ) [4.65]:

)(ˆ xxbyy ii

2

222

2222

ˆ

x

yxyx

byyns

Xs

n

sXsss

i

2

22

ˆ

1

x

yx

yxyns

Xs

nss

i

Ecuación 4.23. Cálculo del error estándar sobre la variable y.

A partir de esta definición, es posible deducir que, para un valor dado de x, el

intervalo de valores que tomará un punto en la recta para un nivel de confianza del 95%

será el dado por: iyni sty ˆ)2.05,0(

ˆ . Estos intervalos forman una hipérbola que constituye

las bandas de dispersión de la recta de calibración a ese nivel de confianza.

Normalmente, se estima a partir de la recta de regresión el valor de x, no el de y.

Por ello, conviene estudiar también la precisión en la estimación de x. La precisión de la

estimación de x depende de la fiabilidad de la recta de regresión y también de la precisión

en el valor medio obtenido de y:

22

2

ˆ

)(11

Xb

yy

nmb

ss iyx

xi

ixni stx ˆ)2.05,0(ˆ

Ecuación 4.24. Cálculo del error estándar sobre la variable x.


139

A su vez, los límites de confianza, L, de xi se calculan mediante la siguiente

expresión, donde t se obtiene de las tablas para el nivel de significación α deseado y para

(m + n – 3) grados de libertad.

m

tsxL i

i

Ecuación 4.25. Cálculo de los límites de confianza.

Figura 4.14. Bandas de dispersión y límites de confianza de la recta de regresión.

El diseño analítico de la calibración debe ser tal que haga el error estándar de la

estimación de x lo más pequeño posible. Matemáticamente, se deben hacer varios

replicados por punto y un número aceptable de puntos experimentales que deben, además,

situarse lo más lejos posible de x (extremos de la recta).

4.5. Estudio de los límites de detección

Como es bien sabido, el límite de detección se conoce como el nivel de

concentración más bajo de analito que proporciona en el instrumento una señal

estadísticamente diferente a la señal de un blanco analítico. El debate en cuanto al límite

de detección se refiere está en qué se considera por “estadísticamente diferente”. Así, han

surgido diferentes definiciones para los límites de detección (IUPAC, Long y

Winefordner, Clayton, etc.).

Capítulo 4

140

Según el criterio de la IUPAC, el límite de detección se define como la

concentración de analito que proporciona una señal igual a la del blanco, más tres veces su

desviación estándar [4.67,4.68].

Ecuación 4.26. Límite de detección según la IUPAC, donde SB es la desviación estándar del

blanco, y b es la pendiente de la recta de regresión.

Con este factor de seguridad de 3 propuesto por la IUPAC se ha demostrado que

existe una probabilidad del 0,13% de cometer un error tipo α o falso positivo, es decir, de

que se asuma que hay analito cuando en realidad no lo hay, y que la probabilidad de

cometer un error tipo β o falso negativo es del 50%, esto es, de que se asuma que no hay

analito cuando en realidad sí lo hay.

Para corregir esto, Kaiser [4.69] propuso aumentar el factor de seguridad hasta un

valor de 6, de manera que la probabilidad de cometer un error tipo β se iguale a la de

cometer un error tipo α (0,13%). Posteriormente, la ACS propuso un nuevo límite de

cuantificación que presentaba un factor de seguridad de 10, de manera que se encuentre lo

suficientemente alejado para poder cuantificar el analito sin cometer un falso negativo.

Long y Winefordner consideraron que se deben tener en cuenta los errores

asociados a la pendiente y a la ordenada en el origen, además de la desviación estándar de

las medidas del blanco [4.70].

2

2

22

baBLOD sb

ass

b

kc

Ecuación 4.27. Límite de detección según Long y Winefordner, donde k es el factor de seguridad.

Por último, según el criterio de Clayton, además de ofrecer protección frente a

errores tipo α, como hacían los anteriores, también ofrece protección frente a errores tipo

β. Para ello, Clayton establece como nivel de seguridad un estadístico (Δ), no centrado con

n-2 grados de libertad, sin tener en cuenta la desviación estándar del blanco [4.71].

Ecuación 4.28. Límite de detección según el criterio de Clayton.

b

s c B

LOD 3

2 2

2

) 2 ; 05 , 0 ( 1 1

x b n m b

s c

yx n LOD

y


141


[4.1] V. J. Hammond, W. C. Price. J. Opt. Soc. Amer. 43, 924. (1953).

[4.2] J. D. Morrison. J. Chem. Phys. 21, 1767. (1953).

[4.3] A. T. Giese, C. S. French. Appl. Spectrosc. 9, 78. (1955).

[4.4] B. Grego, E. C. Nice y R. J. Simpson; J. Chromatog. 352, 359. (1986).

[4.5] A. Schmitt. “introducción a la espectroscopía de derivadas”. Publicaciones de

Perkin-Elmer. Madrid. (1978).

[4.6] J. R. Morrey. Anal. Chem. 40, 905. (1968).

[4.7] B. F. Barker, M. F. Foz. Chem. Soc. Rev. 9, 143. (1980).

[4.8] W. F. Maddams. Appl. Spectrosc. 34, 245. (1980).

[4.9] P. Chen, L. Qingyao, Y. Zeng, G. Yu Guangpu. Fenxi. 5, 5. (1985).

[4.10] T. C. O´Haver, G. L. Green. Anal. Chem. 48, 312. (1976)

[4.11] T. C. O´Haver. Clin. Chem. 25, 1548. (1979).

[4.12] G. Talsky, Derivative Spectrophotometry. ISBN 3-527-28294-7.

[4.13] T. R. Griffiths, K. King, V. J. Hubbard, M. J. Schwing-Weill, J. Meullemeestre.

Anal. Chim. Acta. 143, 163. (1982).

[4.14] Y. K. Kvaratskheli, Y. V. Demin, Zh. Analit. Khim. 38, 1427. (1983).

[4.15] V. I. Sidelmikov. Vestn. Mosk. Univ. Fiz. Astron. 26, 61. (1985).

[4.16] T. C. O´Haver, T. Begley. Anal. Chem. 53, 1876. (1981).

[4.17] T. C. O´Haver. Anal. Proc. 19, 22. (1982).

[4.18] D. Botter. Instrum. News. 25, 14. (1975).

[4.19] A. Schmitt. Tech. Lab. 5, 1207. (1978).

[4.20] T. Motokawa. Nihacho Bunto Kodoho to Sono Oyo. 176. (1979).

[4.21] T.C. O´Haver. Anal. Chem. 51, 91 A. (1979).

[4.22] M. Furukawa, S. Shibata. Bunseki. 608. (1980).

[4.23] B. P. Chadburn. Anal. Proc. 19, 42. (1982).

[4.24] C. T. Cotrell, Anal. Proc. 19, 43. (1982).

[4.25] G. Talsky, GIT Fachz. Lab. 26, 929. (1982).

[4.26] J. N. Miller, T. A. Ahmad, A. F. Fell. Anal. Proc. 19, 37. (1982).

[4.27] R. N. Hager; Anal. Chem. 45, 1131 A. (1973).

[4.28] F. S. Rojas, C.B. Ojeda. Analytical Chimica Acta. 635, 22-44. (2009).

[4.29] L.H. Reyes, K. Wrobel. Journal of the American Leather Chemists Association. 97,

5764. (2002).

Capítulo 4

142

[4.30] J. Dahlen, S. Karlsson, M. Backstrom, J. Hagberg, H. Pettersson. Chemosphere. 40,

71-77. (2000).

[4.31] J. L. Vidal, M. García, M. Galera, A. Frenich. Analytical Letters. 30, 2409-2432.

(1997).

[4.32] A. Fernández, V. Martínez, P. Aguilera, F. Frenich, A. Guerra. Analytical Letters.

25, 1581-1593. (1992).

[4.33] V. Rodenas, M. S. García, C. Sánchez-Pedreño, M. I. Albero. Talanta. 52 (3), 517-

523. (2000).

[4.34] N. Erk, Y. Özkan, E. Banaglu, S. A. Özkan. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis. 24, 469-475. (2001).

[4.35] K. Sözgen, E. Tülem. Talanta. 62 (5), 971-976. (2004).

[4.36] F. Sánchez Rojas, C. Bosch Ojeda, J.M. Cano Pavón. Talanta. 35, 753. (1988).

[4.37] L. G. Hargais, J. A. Howell. Anal. Chem. 56, 225 R. (1984).

[4.38] J. A. Howell, L. G. Hargis. Anal. Chem. 58, 108 R. (1986).



[4.41] L. G. Hargis, J. A. Howell. Anal. Chem. 64, 66 R. (1992).

[4.42] J. A. Howell, R. E. Sutton. nalytical Chemistry. 70 (12), 107R-118R. (1998).

[4.43] L. G. Hargis, J. A. Howell, R. E. Sutton. Analytical Chemistry. 68 (12), 169R-

183R. (1996).

[4.44] J. A. Howell, L. G. Hargis. Analytical Chemistry. 66 (12), 445R-461R. (1994).

[4.45] G. L. Green, T. C. O´Haver, Analytical Chemistry. 46 Nº 14, 2191. (1974).

[4.46] J. A. Murillo, L. F. García, Analytical Letters. 29 (3), 423-438. (1996).

[4.47] Cahill. J. E. Am. Lab. 11, 79. (1979).

[4.48] John. P, Soltar. I. Proc. Anal. Div. Chem. Soc. 13, 209. (1976).

[4.49] T. Pérez, C. Martínez, V. Tomas, J. Carpena. Talanta. 47 (3) , 537-545. (1998).

[4.50] D. G. Konstantianos, P. C. Loannou. The analyst. 121 (7), 909-912. (1996).

[4.51] J. J. Santana, Z. Sosa, J. Hernández. The Analyst. 119 (10), 2241-2246. (1994).

[4.52] M. E. Urena, A. García de Torres, J. M. Cano. Analytical Chemistry. 59 (8), 1129-

1133. (1987).

[4.53] M. C. Gutierrez, S. Rubio, A. Gómez-Hens, M. Valcarcel. Talanta. 34 (3) 325-329.

(1987).

[4.54] El-Wasseef D. R. Journal of Fluorescence. 19, 817-828 (2009)


143

[4.55] A. Andrade, E. Vazquez, P. Lçopez, S. Muniategui, D. Prado, E. Fernández,

Talanta. 51 (4), 677-684 (2000).

[4.56] J.J. Berzas Nevado, J. A. Murillo Pulgarín, O.I. Reillo. Applied spectroscopy. 54

(11), 1678-1683. (2000).

[4.57] J.A. Murillo, A. Alañón, P. Fernández, I. Sánchez-Ferrer. Analyticla Chemica Acta.

583 (1), 55-62. (2007).

[4.58] D.L. Lin, L. F. He, Y. Q. Li. Clinical Chemistry. 50 (10), 1797-1803. (2004).

[4.59] R. G. Machicote, L. Bruzzone. Analytical Sciences. 25 (2), 623-626. (2009).

[4.60] K. Endo, S. Igarashi, T. Yotsuyanagi. Chemistry Letters. (10), 1711-1714. (1986).

[4.61] T. Vo-Dinh, R. B. Gammage. Analytica Chimica Acta. 107, 261-271. (1979).

[4.62] B. Canabate, A. Segura, C. Cruces, A. Fernández. Applied Spectroscopy. 57 (12),

1585-1591. (2003).

[4.63] A. Segura, C. Cruces, A. Fernández. The Analyst. 122 (9), 925-929. (1997).

[4.64] C. Dong, S. M. Shuang, W. J. Jin, C. K. Feng, C. S. Liu. Analytical Letters. 32 (5),

985-994. (1999).

[4.65] P.J. Rousseeuw, A.M. LeRoy. Wiley. “Robust regresión and outlier detection”.

Nueva York. (1987).

[4.66] P.D. Lark, B.R. Craven, R.C.L. Bosworth. “The relationship between two variables-

simple linear relationships, The handling of chemical data”. Pergamon Press (1968).

[4.67] IUPAC. “Nomenclature, symbols, units and their usage in spectrochemical

analisis”, II. Spectrochim. Acta B, 33B, 242, (1978).

[4.68] D. MacDougall, W.B. Crummett. Anal. Chem. 52, 2242. (1980).

[4.69] H.H. Kaiser. Anal. Chem. 42, 26. (1970).

[4.70] G.L. Long, J.D. Winefordner. Anal. Chem. 55, 712. (1983).

[4.71] C.A. Clayton, J.W. Hines, P.D. Elkins. Anal. Chem. 59, 2506. (1987).

Capítulo 4

144

BLOQUE III

DESARROLLO DE METODOLOGÍAS EXPERIMENTALES

CAPÍTULO 5. DETERMINACIÓN DE NAA Y NOA MEDIANTE MS-RTP

CAPÍTULO 6. DETERMINACIÓN DE 2,4-DP MEDIANTE PIF

CAPÍTULO 7. DETERMINACIÓN DE TCP MEDIANTE PIF

CAPÍTULO 8. DETERMINACIÓN DE AGB MEDIANTE PIF

CAPÍTULO 9. DETERMINACIÓN DE NAA Y TBZ MEDIANTE LSF

CAPÍTULO 10. DETERMINACIÓN DE AGB MEDIANTE MISF

CAPÍTULO 5

DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE LOS ÁCIDOS

1-NAFTILACÉTICO Y 2-NAFTOXIACÉTICO EN MUESTRAS

VEGETALES MEDIANTE FOSFORESCENCIA A TEMPERATURA

AMBIENTE

Trabajo publicado:

“Simultaneous Determination of Plant Growth Regulators 1-Naphthylacetic Acid and 2-

Naphthoxyacetic Acid in Fruit and Vegetable Samples by Room Temperature Phosphorescence”

José A. Murillo Pulgarín, Luisa F. García Bermejo, Ignacio Sánchez-Ferrer Robles y Sonia

Becedas Rodríguez. Phytochemical Analysis. 23, 214-221 (2012). DOI 10.1002/pca.1345 (2011).

Determinación de NAA y NOA mediante MS-RTP

149

1. OBJETIVO

El objetivo del presente trabajo es desarrollar un método analítico para llevar a

cabo la determinación simultánea de ácido 1-naftilacético (NAA) y ácido 2-naftoxiacético

(NOA), cuyas estructuras se muestran en la figura 5.1, en muestras vegetales, como

tomate y diferente tipos de frutas, mediante fosforescencia a temperatura ambiente en

medio micelar.

(a) (b)

Figura 7.1. Estructuras de los ácidos (a) 1-naftilacético (NAA) y (b) 2-naftoxiacético (NOA).

Para ello, se realizó un estudio exhaustivo de las variables, tanto químicas como

instrumentales, que afectan a la señal de fosforescencia de ambos analitos con el fin de

obtener la máxima sensibilidad en la determinación. El proceso de optimización de estas

variables se realizó de forma secuencial, es decir, una variable era modificada dentro de un

intervalo determinado mientras que el resto de variables se mantenían constantes. Un

primer estudio permitió conocer las características espectrales de cada uno de los analitos

a determinar.

2. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DE LOS ANALITOS

El espectro tridimensional permite una mejor caracterización de la fosforescencia

de ambos analitos. En la figura 5.2 se representa el espectro de fosforescencia total del

NAA (0,3 mg L-1

) en proyección isométrica, el cual fue obtenido en presencia de

0,12 mol L-1

de SDS, 5·10-3

mol L-1

de Na2SO3, 4·10-2

mol L-1

de TlNO3, una

concentración de tampón H2PO4-/HPO4

2- de 4·10

-2 mol L

-1 de pH 7,2 y termostatizando a

Capítulo 5

150

una temperatura de 25 ºC. Como se puede comprobar en dicha figura, el NAA presenta un

máximo de excitación situado a una longitud de onda de 281 nm y dos máximos de

emisión fosforescente localizados a las longitudes de onda de emisión de 490 y 522 nm.

Como puede apreciarse, la intensidad en ambos máximos es similar, aunque el segundo de

ellos es ligeramente más intenso.

Figura 5.2.Representación isométrica del espectro de fosforescencia total del NAA.

Por otro lado, en la figura 5.3 se representa el espectro de fosforescencia total del

NOA (0,6 mg L-1

) en proyección isométrica, el cual fue obtenido en las mismas

condiciones químicas que el espectro tridimensional del NAA. Como puede observarse,

también presenta un máximo de excitación situado a una longitud de onda de 274 nm y

dos máximos de emisión fosforescente, localizados a las longitudes de onda de emisión de

501 y 534 nm. Al igual que el NAA, el máximo de emisión situado a la longitud de onda

más larga es ligeramente más intenso.

En la figura 5.4 se muestran las curvas de nivel superpuestas de los espectros

tridimensionales de fosforescencia de los dos analitos estudiados, pudiéndose comprobar

que el solapamiento entre ambos es muy intenso y, por ello, la determinación simultánea

de ambos en una mezcla de manera directa resulta inviable.


151

Figura 5.3. Representación isométrica del espectro de fosforescencia total del NOA.

Figura 5.4. Curvas de nivel superpuestas de los espectros de fosforescencia del NAA (azul) y

NOA (rojo).

Capítulo 5

152

3. ESTABILIDAD DE LAS DISOLUCIONES

Este estudio se realizó preparando disoluciones madre de ambos analitos con una

concentración de 100,0 mg L-1

. Para favorecer la solubilidad de los analitos en agua, se

empleó dodecilsulfato de sodio (SDS) a una concentración de 0,2 mol/L como disolvente.

Dichas disoluciones fueron conservadas protegidas de la luz en matraces de color topacio

y almacenadas a 4ºC.

Para comprobar la estabilidad de las disoluciones madre se prepararon diariamente

soluciones individuales de 1,0 mg L-1

de cada analito, que contenían 0,04 mol L-1

de

TlNO3, 0,005 mol L-1

de Na2SO3, 0,04 mol L-1

de solución reguladora de pH

7,2 (H2PO4-/HPO4

2-) y 0,12 mol L

-1 de SDS. La medida diaria de estas disoluciones en las

respectivas longitudes de onda de sus máximos puso de manifiesto que la intensidad de

fosforescencia de cada una de ellas era constante, y que, por tanto, las disoluciones eran

estables durante, al menos, cuatro semanas.

Por otra parte, se comprobó la estabilidad de las disoluciones de trabajo de cada

una de las sustancias a determinar, a una concentración de 0,2 mg L-1

y midiendo cada 15

minutos la intensidad de fosforescencia en sus máximos respectivos. Este estudio permitió

concluir que las disoluciones de trabajo de ambos compuestos eran estables durante, al

menos, dos horas.

4. OPTIMIZACIÓN SECUENCIAL DE VARIABLES

4.1. Variables químicas

Para el estudio de la influencia de las variables químicas sobre la intensidad de

fosforescencia de los analitos, se midieron las intensidades de sus espectros de emisión y

la cinética fosforescente de ambos analitos en los pares de longitud de onda de máxima

intensidad (ex = 281 y em = 522 nm para el NAA; ex = 274 y em = 534 nm para el

NOA) con el fin de obtener la máxima sensibilidad y un tiempo de desarrollo de la señal lo

más pequeño posible. El proceso de optimización se realizó de forma secuencial, de

manera que una variable era modificada dentro de un intervalo determinado, manteniendo

el resto de ellas constantes.

Las concentraciones de NAA y NOA utilizadas para llevar a cabo el proceso de

optimización de variables fueron 0,3 y 0,6 mg L-1

, respectivamente, debido a que la

intensidad de fosforescencia del NAA es mayor que la del NOA. Las condiciones


153

químicas empleadas inicialmente en este estudio fueron: 0,025 mol L-1

de TlNO3, 0,02

mol L-1

de Na2SO3 y 0,04 mol L-1

de SDS. Por otro lado, las condiciones instrumentales

de partida fueron: 10 Hz de frecuencia, 200 μs de tiempo de integración, 5 disparos por

punto, 200 μs tiempo de espera, 7 nm de rendija y 20 ºC de temperatura.

4.1.1. Optimización del pH y de la concentración de la solución regulad4+ora

Para el estudio de la influencia del pH en la señal de fosforescencia, se prepararon

disoluciones en las condiciones iniciales indicadas anteriormente y se les varió el pH

añadiendo cantidades variables de H2SO4 y NaOH. En primer lugar, se registraba la

cinética correspondiente de cada disolución midiendo a las longitudes de onda de sus

máximos de fosforescencia, con el fin de conseguir la mayor intensidad posible en el

menor tiempo de desarrollo de la señal fosforescente.

Figura 5.5. Influencia del pH y de la concentración del tampón en la intensidad de fosforescencia.

Una vez alcanzada la máxima intensidad de fosforescencia, se registraba su

correspondiente espectro y se medía la emisión fosforescente en las longitudes de onda de

sus respectivos máximos para cada una de las disoluciones a los diferentes valores de pH.

Puesto que el agente desoxigenante pierde su poder a valores de pH ácidos, el intervalo de

pH que se estudió comprendía los valores entre 6 y 11. Los resultados experimentales

obtenidos se muestran en la figura 5.4. A la vista de los mismos se concluye que 7,2 es el

valor de pH óptimo para llevar a cabo la determinación simultánea de ambos analitos,

Capítulo 5

154

dado que a ese valor se alcanzaba la intensidad fosforescente máxima y constante para los

dos analitos en un menor tiempo.

La solución reguladora escogida para proporcionar el pH de 7,2 fue dihidrógeno

fosfato/hidrógeno fosfato (pKa = 7,2), cuya concentración fue entonces optimizada. Para

ello, se varió su concentración en el intervalo comprendido entre 5·10-3

y 6·10-2

mol L-1

,

procediéndose de manera semejante al estudio del pH. En base a los resultados obtenidos

(figura 5.5), la concentración óptima escogida para la solución reguladora fue la de 0,04

mol L-1

, con la que se consigue un menor tiempo en el desarrollo de la cinética hasta

alcanzar el máximo de intensidad para ambos analitos.

4.1.2. Optimización de la relación de concentraciones agente micelar/átomo

pesado y de la concentración de sulfito

Un problema asociado al empleo conjunto de agente micelar y talio (I) es la

precipitación de la sal del átomo pesado en presencia de altas concentraciones de agente

micelar. Por este motivo fue necesario hacer un estudio de la relación de ambas

concentraciones para comprobar cuál era la relación óptima. Para ello se estudiaron

diferentes relaciones, llegándose a la conclusión de que la relación [SDS]/[TlNO3] debía

mantenerse en un valor igual o inferior a 3, puesto que a valores superiores se producía

una precipitación que fue atribuida al dodecil sulfato de talio (I) formado. Se seleccionó

una relación [SDS]/[TlNO3] de 3:1, ya que para relaciones menores la intensidad de

fosforescencia que se obtenía era menor.

A continuación se procedió a la optimización de las concentraciones de ambos

reactivos en la disolución de trabajo, manteniendo una relación entre ambas de 3:1. El

intervalo de concentración estudiado varió desde 0,005 hasta 0,05 mol L-1

para el Tl+ y

desde 0,015 hasta 0,15 mol L-1

para el SDS. Para cada una de las disoluciones se

registraron tanto las cinéticas como los espectros de emisión una vez alcanzada la señal de

fosforescencia máxima y estable. La figura 5.6 presenta los resultados obtenidos en este

estudio, realizando las medidas a las longitudes de onda del máximo de emisión de los

espectros obtenidos en cada una de las condiciones.

El valor escogido como óptimo para la relación [SDS]/[TlNO3] fue el de 0,12/0,04

mol L-1

, ya que, aunque no resultó ser la relación a la cual se obtenía una mayor

intensidad, a concentraciones superiores existía el riesgo de que ocurriera la precipitación


155

de la sal de talio y, además, con dichas concentraciones se conseguía un menor tiempo en

el desarrollo de la señal fosforescente, esto es, una cinética más rápida.

Para llevar a cabo la determinación propuesta se utilizó sulfito sódico como agente

desoxigenante en las disoluciones de trabajo. La concentración de sulfito sódico afecta al

tiempo en el que se alcanza la desoxigenación y a la máxima intensidad de fosforescencia.

Por un lado, al aumentar la concentración de sulfito, el oxígeno del exterior de la micela se

consume más rápidamente, por lo que el desarrollo de la fosforescencia se produce en un

periodo de tiempo más corto. De manera simultánea, el exceso de sodio en la disolución

produce un desplazamiento del talio que se encuentra en la superficie externa de la micela,

haciéndose menor el efecto de átomo pesado y disminuyendo la intensidad de

fosforescencia.

Figura 5.6. Influencia de las concentraciones de SDS y Na2SO3 en la intensidad de fosforescencia,

manteniendo constante la relación [SDS]/[TlNO3] = 3.

Para determinar su concentración óptima se prepararon disoluciones con

concentraciones crecientes de sulfito en el intervalo comprendido entre 2,5·10-3

y 0,04

mol L-1

, fijándose las condiciones previamente seleccionadas. Para cada una de las

disoluciones se registraron tanto las cinéticas como los espectros de emisión una vez

alcanzada la intensidad máxima de fosforescencia. En la figura 5.6 se pueden observar los

resultados experimentales obtenidos para ambos analitos, medidos a las longitudes de

onda de sus respectivos máximos de emisión. Como puede comprobarse, la concentración

de sulfito para la cual se obtenía la máxima intensidad de fosforescencia fue 5·10-3

mol L-1

Capítulo 5

156

para ambos analitos, por lo que este valor fue el escogido como óptimo para llevar a cabo

nuestro estudio.

4.1.3. Optimización de la temperatura

Los procesos de desactivación no radiantes se ven favorecidos a altas temperaturas

dado que se produce un aumento del movimiento molecular y, por tanto, aumenta la

probabilidad de que existan colisiones intermoleculares. Por ello, es necesario estudiar el

efecto de la temperatura en la intensidad de fosforescencia de ambos analitos.

Para ello, se prepararon disoluciones individuales de 0,3 mg L-1

de NAA y de 0,6

mg L-1

NOA en las condiciones químicas previamente establecidas. Las disoluciones

fueron preparadas para cada punto experimental, aunque las condiciones químicas de

todas ellas eran las mismas, y los matraces que las contenían fueron introducidos en un

baño termostático durante 10 min para que se estableciera el equilibrio térmico. Una vez

alcanzada la temperatura, se registraron las cinéticas de desarrollo de la fosforescencia

usando un portacubetas termostatado a la misma temperatura y, una vez alcanzada la

intensidad máxima y estable, se registraron los espectros de emisión fosforescentes a las

longitudes de onda de excitación inicialmente establecidas para cada uno de los analitos.

Figura 5.7. Influencia de la temperatura en la intensidad de fosforescencia.


157

La optimización de la temperatura se llevó a cabo en un intervalo comprendido

entre 15 y 40 ºC para el NOA y entre 22 y 40 ºC para el NAA. En la figura 5.7 se

encuentran reflejados los resultados obtenidos. Debido a que a temperaturas inferiores

existían problemas de precipitación, se eligió 25 ºC como valor óptimo para llevar a cabo

nuestro estudio.

4.2. Variables instrumentales

La optimización de las variables instrumentales que afectan al desarrollo de la

señal fosforescente se realizó también siguiendo un procedimiento secuencial, variando

una de ellas y manteniendo el resto constantes. Este estudio fue realizado en disoluciones

individuales de cada uno de los analitos, 0,3 y 0,6 mg L-1

de NAA y NOA,

respectivamente. Dichas disoluciones contenían las concentraciones de cada uno de los

reactivos que habían sido ya optimizadas y que se encuentran recogidas en la Tabla 5.1.

Tabla 5.1. Variables químicas optimizadas

Parámetro Valor óptimo

pH 7,2

[Tampón] 0,04 mol L-1

(H2PO4-/HPO4

2-)

Relación [SDS]/[TlNO3] 0,12/0,04 mol L-1

[Na2SO3] 0,005 mol L-1

Temperatura 25 ºC

Este proceso de optimización se realizó valorando tanto la intensidad de

fosforescencia obtenida como la relación señal-ruido, de manera que lo que se perseguía

era obtener señales de fosforescencia con poco ruido y con valores altos en la intensidad.

Para calcular el ruido instrumental, a la señal espectral de emisión obtenida

experimentalmente para cada analito le restamos la misma señal suavizada con un factor

de 21 puntos de suavizado y calculamos la desviación estándar de dicha resta en un

intervalo de longitudes de onda constante de línea base (460-480 nm).

Capítulo 5

158

4.2.1. Optimización de la apertura de las rendijas

Las rendijas controlan la cantidad de radiación que entra o sale de los

monocromadores; obviamente, una apertura grande de las rendijas va a proporcionar una

mayor señal pero también va a aumentar el ruido y se perderá resolución. Por tanto, será

necesario establecer un valor de compromiso con el que obtener, por un lado, un buen

valor de intensidad y, por otro, una resolución y un ruido aceptables. En la figura 5.8 se

puede observar como varía la intensidad fosforescente, así como el ruido y la relación

señal/ruido con la apertura de las rendijas para el NAA y el NOA.

A la vista de los resultados se seleccionó 9 nm como valor óptimo para ambas

rendijas dado que la relación señal/ruido era superior que las obtenidas para otras aperturas

en el caso de ambos analitos en estudio.

Figura 5.8. Influencia de la apertura de la rendija en la intensidad, ruido y la relación entre

ambos de la señal fosforescente para el NAA y el NOA.

4.2.2. Optimización del tiempo de espera (delay)

El tiempo de espera (delay), definido como el tiempo que transcurre desde el inicio

del pulso de la lámpara hasta el comienzo de la integración de la señal fosforescente, evita

la interferencia de la señal procedente de la lámpara. Para determinar su efecto en el

desarrollo de la señal fosforescente, así como en el ruido instrumental, se prepararon

disoluciones de ambos analitos en las condiciones químicas seleccionadas, usando un


159

tiempo de integración de 200 μs. A continuación se registraron los espectros de emisión

fijando distintos valores de tiempo de espera en un rango de 60 a 500 μs.

En la figura 5.9 se encuentran los resultados obtenidos. Como era de esperar, en el

caso de los dos analitos, al aumentar el tiempo de espera se produce una disminución

importante de la intensidad de emisión y una disminución del ruido, de manera que la

relación señal/ruido experimenta una disminución, si bien, no muy acusada. En base a

estos resultados, se seleccionó un valor de tiempo de espera de 160 μs como valor óptimo

para la determinación.

Figura 5.9. Influencia del tiempo de espera en la intensidad, ruido y la relación entre ambos de la

señal fosforescente para el NAA y el NOA.

4.2.3. Optimización del tiempo de integración (int time)

Podemos definir el tiempo de integración de la señal fosforescente como el tiempo

en el que el fotomultiplicador permanece abierto recogiendo la señal que le llega de la

muestra una vez finalizado el tiempo de espera.

La optimización del tiempo de integración se llevó a cabo entre 50 y 1000 µs para

cada uno de los analitos, usando 160 s como tiempo de espera seleccionado. Los

resultados experimentales obtenidos se muestran en la figura 5.10. Como puede

observarse, para ambos analitos la intensidad de fosforescencia aumenta al aumentar el

tiempo de integración, al principio de manera considerable y, posteriormente, este

Capítulo 5

160

aumento se suaviza. En cuanto al ruido, aunque aumenta con el tiempo de integración, sin

embargo, dicho aumento es menos acusado y tiende a estabilizarse con el tiempo.

El valor de tiempo de integración escogido como óptimo fue 500 µs porque, a

pesar de no ser el óptimo en cuanto a la relación señal/ruido para el NOA, si se encuentra

próximo a él y, además, con este tiempo de integración se obtenían tiempos de registro

menores.

Figura 5.10. Influencia del tiempo de integración en la intensidad, ruido y la relación entre ambos

de la señal fosforescente para el NAA y el NOA.

4.2.4. Optimización de la frecuencia de disparo

Este parámetro controla la cantidad de disparos por segundo que va a efectuar el

equipo. Lógicamente, al aumentar la frecuencia disminuye el tiempo de análisis pero

aumenta el ruido instrumental, por lo que la frecuencia de disparo debe ser optimizada.

Para ello, se prepararon disoluciones de ambos analitos en las condiciones

químicas e instrumentales hasta ahora seleccionadas. A continuación, se obtuvo el

desarrollo de la señal fosforescente y el registro de los espectros de emisión variando la

frecuencia de disparos en el intervalo entre 5 y 20 Hz.

Los resultados experimentales obtenidos para el NAA y el NOA se muestran en la

figura 5.11. Considerando el valor de frecuencia de disparo que proporcionó una mayor

relación señal/ruido, 10 Hz fue el valor seleccionado como óptimo en el caso de los dos

analitos.


161

Figura 5.11. Influencia de la frecuencia en la intensidad, ruido y la relación entre ambos de la

señal fosforescente para el NAA y el NOA.

4.2.5 Optimización del número de disparos (shots)

Este parámetro instrumental determina el número de “disparos” que realiza el

equipo para cada punto experimental registrado en el espectro. Un aumento del número de

disparos disminuirá el ruido a costa de un mayor tiempo de análisis. Generalmente, y por

razones estadísticas, es preferible realizar más medias de un espectro que aumentar el

número de disparos.

Figura 5.12. Influencia del número de disparos en la intensidad, ruido y la relación entre ambos

de la señal fosforescente para el NAA y el NOA.

Capítulo 5

162

Se estudió el efecto de este parámetro en la intensidad de la señal de fosforescencia

de cada analito, así como en el ruido de dichas señales, en el intervalo entre 1 y 100

disparos. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 5.12. Aunque el valor que nos

proporcionaba una mejor relación señal/ruido era el de 100 disparos por punto, sin

embargo, el tiempo de análisis se extiende considerablemente a medida que se aumenta

dicho parámetro. Por este motivo, y con el fin de reducir el tiempo de análisis, el valor

tomado como óptimo fue el de 5 disparos por punto.

4.2.6. Optimización del número de medias

Este parámetro nos va a permitir reducir en gran medida el nivel de ruido de las

señales obtenidas. Al aumentar el número de medias, el equipo repite el espectro y, a

medida que va adquiriendo puntos, va realizando la media de dichos puntos.

Para determinar el valor óptimo de esta variable, se prepararon disoluciones de

ambos analitos en las condiciones químicas e instrumentales seleccionadas hasta ahora. Se

registraron los espectros de emisión fosforescente de NAA y NOA utilizando un número

de medias comprendido entre 1 y 10. En la figura 5.13 se muestran los resultados

experimentales obtenidos. Si bien se produce un aumento considerable en la relación

señal/ruido con el número de medias realizadas en cada medida espectral para los dos

analitos estudiados, el valor elegido como óptimo fue 5 medias para conseguir un tiempo

de registro del espectro menor.

Figura 5.13. Influencia del número de medias en la intensidad, ruido y la relación entre ambos de

la señal fosforescente para el NAA y el NOA.


163

5. INFLUENCIA INDIVIDUAL DE LA CONCENTRACIÓN DE NAA

Y NOA

Establecidas las condiciones óptimas, tanto químicas como instrumentales, para la

determinación de NAA y NOA, se procedió a estudiar la relación entre la concentración de

cada uno de los analitos con la intensidad de fosforescencia medida en sus respectivos

máximos de emisión.

En primer lugar, se abordó el estudio para el NAA. La relación entre la

concentración de NAA y la emisión fosforescente se estudió preparando diferentes

disoluciones en las que se varió la concentración de analito entre 10 y 1500 ng mL-1

. Para

cada nivel de concentración se registró el espectro de emisión fosforescente a ex = 281

nm y se midió la intensidad fosforescente a em = 522 nm, que es donde se encuentra el

máximo de emisión mayor. En la figura 5.14 se encuentran recogidos los resultados

experimentales obtenidos al representar la intensidad de fosforescencia frente a la

concentración de NAA. Como puede observarse en dicha figura, el comportamiento es

lineal entre 10 y 800 ng mL-1

, puesto que a partir de esa concentración se producía la

saturación de la señal.

Figura 5.14. Relación de la concentración de NAA y NOA con la intensidad de emisión

fosforescente.

De la misma manera que en el caso anterior, se estudió la relación entre la

concentración de NOA y la emisión fosforescente para distintas concentraciones de este

Capítulo 5

164

analito. Para ello, se prepararon diferentes disoluciones en las que se varió la

concentración de NOA entre 25 y 2500 ng mL-1

. Para cada nivel de concentración se

registró el espectro de emisión fosforescente a ex = 274 nm y se midió la intensidad

fosforescente a em = 534 nm, que es la longitud de onda de su máximo de mayor

intensidad de emisión. En la figura 5.14 se encuentran recogidos los resultados

experimentales obtenidos en este estudio. Como puede observarse en dicha figura, el

comportamiento es lineal entre 25 y 2000 ng mL-1

de NOA, produciéndose la saturación

de la señal a partir de la última concentración

6. RESOLUCIÓN DE LA MEZCLA DE NAA Y NOA

Como pudo comprobarse en las curvas de nivel de los espectros de fosforescencia

total de NAA y NOA presentados en la figura 5.4, no existen ni espectros de excitación ni

de emisión donde las bandas de ambos analitos estén separadas para resolver esta mezcla

mediante fosforescencia convencional debido al gran solapamiento que presentan.

Por esta razón, se aplicó la técnica de “zero-crossing” a la primera o segunda

derivada de sus espectros de fosforescencia. Esta técnica, como se indicó en la

introducción, implica la medida del valor absoluto del espectro derivado de uno de los

analitos a un valor de longitud de onda en el que el espectro derivado del otro compuesto

se anula. Dichas medidas serían debidas, por tanto, a la presencia de uno de los

componentes, aquel cuya derivada no se hace cero y nos permitiría llevar a cabo su

cuantificación.

Abordar la determinación de ambos compuestos utilizando la técnica de “zero-

crossing” en el espectro derivado conlleva un estudio preliminar que nos permita

establecer en primer lugar si la derivada de primer orden nos es válida, para, si no es así,

obtener y hacer el estudio en la segunda derivada. A continuación, en el orden de derivada

seleccionado, deben establecerse las longitudes de onda en las que se van a llevar a cabo

las medidas que nos permitan cuantificar cada analito sin la interferencia del otro, puesto

que su señal derivada se anula.

Para ello, se prepararon tres muestras independientes en las condiciones químicas

establecidas que contenían 200 ng mL-1

de NOA, 80 ng mL-1

de NAA y una mezcla de

ambos en estas mismas concentraciones. En las condiciones de trabajo que previamente

habían sido seleccionadas como óptimas, se registraron los espectros de emisión

fosforescentes de cada una de las muestras. Seguidamente, se obtuvo la derivada de primer


165

orden de cada uno de los espectros registrados. El análisis de esta primera derivada nos

permitió concluir que el NAA no podía ser determinado puesto que no existía una longitud

de onda a la cual se anulase la primera derivada del NOA y tuviésemos una señal derivada

significativa del NAA. Sin embargo, tal como puede verse en la figura 5.15, podríamos

llevar a cabo la determinación del NOA midiendo a em = 488.5 nm, donde la señal

derivada de primer orden del NAA se anula y la señal del NOA coincide con la de la

mezcla. Por ello, se seleccionó dicha longitud de onda de la derivada de primer orden para

llevar a cabo la determinación del NOA.

Figura 5.15. Primera derivada de los espectros de emisión de 200 ng mL-1

de NOA, 80 ng mL-1

NAA y una mezcla de ambos.

Para abordar la determinación del NAA, se prepararon otras tres muestras que

contenían 100 ng mL-1

de NAA, 125 ng mL-1

de NOA y una mezcla de ambos a dichas

concentraciones, y se procedió de manera similar al caso anterior, es decir, se registraron

sus espectros de emisión fosforescente, pero en este caso, se obtuvo la segunda derivada

de cada uno de ellos. En la figura 5.16, se comprueba como la determinación del NAA

puede realizarse midiendo a em = 469.5 nm, donde la señal derivada de segundo orden del

NAA coincide con la de la mezcla, anulándose la señal derivada correspondiente al NOA.

Por ello, se seleccionó dicha longitud de onda de la derivada de segundo orden para llevar

a cabo la determinación del NAA.

Capítulo 5

166

Este estudio permite concluir que, en las condiciones químicas e instrumentales

seleccionas, midiendo la señal de la segunda derivada a em = 469,5 nm se puede

determinar el NAA en presencia del NOA; análogamente, se puede determinar el NOA

midiendo la señal de la primera derivada a em = 488,5 nm, donde la señal de NAA no

interfiere ya que se hace cero.

Figura 5.16. Segunda derivada de los espectros de emisión de 100 ng mL-1

de NAA, 125 ng mL-1

NOA y una mezcla de ambos.

6.1. Proceso de calibración

En el siguiente estudio se pretende evaluar la linealidad entre las concentraciones

de los analitos en estudio y sus correspondientes señales de primera derivada para el caso

del NOA y de segunda derivada para el caso del NAA medidas a las longitudes de onda

anteriormente seleccionadas. Además, se pretende demostrar la independencia de dichas

señales derivadas de cada componente de la presencia del otro, y, consecuentemente,

evaluar que la aplicación de la técnica de “zero-crossing” a la primera y a la segunda

derivada es adecuada para resolver la mezcla de NOA y NAA, respectivamente.

El intervalo de concentración establecido para cada uno de los analitos fue entre 20

y 100 ng mL-1

para el NAA y entre 50 y 250 ng mL-1

para el NOA. Los valores de


167

concentraciones seleccionados se encuentran dentro de los intervalos de concentración a

los cuales cada analito presenta un comportamiento lineal midiendo la intensidad de

fosforescencia en el máximo de cada uno de ellos, anteriormente descritos.

Para llevar a cabo este estudio, se prepararon 3 calibrados para el NAA y otros 3

para el NOA, cuyos contenidos se encuentran resumidos en la tabla 5.2. Los patrones de

calibrado se prepararon en matraces volumétricos de 10 mL de capacidad y en las

condiciones químicas seleccionadas, esto es, conteniendo 5·10-3

mol L-1

de agente

desoxigenante, 4·10-2

mol L-1

de solución reguladora, 0,12 mol L-1

de SDS y 4·10-2

mol L-

1 de TlNO3.

Tabla 5.2. Calibrados realizados de NAA y NOA

Calibrados de NAA (20 – 100 ng mL-1

)

NAA (a) NAA (b) NAA (c)

Ausencia de NOA 100 ng mL-1

NOA 200 ng mL-1

NOA

Calibrados de NOA (50 – 250 ng mL-1

)

NOA (a) NOA (b) NOA (c)

Ausencia de NAA 30 ng mL-1

NAA 80 ng mL-1

NAA

Tras agitar cada uno de las muestras hasta homogeneidad, se procedió al registro

de los espectros de emisión fosforescente en las condiciones instrumentales previamente

optimizadas. Posteriormente, se obtuvieron los espectros derivados de segundo orden para

los calibrados del NAA, midiendo su señal a em = 469,5 nm y los espectros derivados de

primer orden para los calibrados del NOA, midiendo su señal a em = 488,5 nm. Los

espectros derivados correspondientes a los tres calibrados propuestos para la

determinación de NAA se muestran en la figura 5.17 y los del NOA en la figura 5.18.

Los valores de la segunda derivada medidas a em = 469,5 nm para cada una de las

muestras de los calibrados del NAA y los parámetros de regresión de estos calibrados se

recogen en las tablas 5.3 y 5.4, respectivamente. Igualmente, los valores de la primera

derivada medidos a em = 488,5 nm en cada uno de los calibrados del NOA y los

parámetros de regresión de estos calibrados se recogen en las tablas 5.5 y 5.6,

respectivamente.

Capítulo 5

168

Figura 5.17. Segunda derivada de los espectros de fosforescencia del NAA a diferentes

concentraciones (20-100 ng mL-1

). a) En ausencia de NOA. b) En presencia de 100 ng mL-1

de

NOA. c) En presencia de 200 ng mL-1

de NOA.


169

Figura 5.18. Primera derivada de los espectros de fosforescencia del NOA a diferentes

concentraciones (50-250 ng mL-1

). a) En ausencia de NAA. b) En presencia de 30 ng mL-1

de NAA.

c) En presencia de 80 ng mL-1

de NAA.

Capítulo 5

170

Tabla 5.3. Rectas de calibrado de NAA: señales de segunda derivada a λ= 469.5 nm

[NAA] (ng mL-1

) Ausencia de NOA 100 ng mL-1

NOA 200 ng mL-1

NOA

20 1,39 1,15 1,10

30 2,15 2,19 1,92

40 2,71 2,25 2,66

60 3,92 3,82 4,02

80 4,81 5,01 4,97

100 6,23 5.99 6,07

Tabla 5.4. Parámetros estadísticos de la regresión lineal: y = a + bx

Parámetro Ausencia de NOA 100 ng mL-1

NOA 200 ng mL-1

NOA

Mínima mediana de cuadrados

a 3,99·10-1

5,65·10-1

5,65·10-1

b 5,83·10-2

5,43·10-2

7,02·10-2

Escala estimada 2,40·10-2

6,90·10-2

6,90·10-2

r2

0,999 0,999 0,998

Parámetro Mínimos cuadrados

a 3,26·10-1

9,95·10-2

8,59·10-2

b 5,83·10-2

6,01·10-2

6,13·10-2

sxy 1,3·10-1

2,3·10-1

1,9·10-1

sa 1,1·10-1

2,1·10-1

1,7·10-1

sb 1,8·10-3

3,3·10-3

2,8·10-3

r2

0,995 0,985 0,989

ta = 0a /sa 2,86 0,48 0,50

tb = 0b /sb 31,6 18,0 22,1

tteórico (α=0,05; n-2=16) = 2,12


171

Tabla 5.5. Rectas de calibrado de NOA: señales de primera derivada a λ = 488.5 nm

[NOA] (ng mL-1

) Ausencia de NAA 30 ng mL

-1 NAA 80 ng mL

-1 NAA

50 11,77 10,34 11,27

75 17,38 18,75 15,69

125 29,49 29,32 28,67

175 41,73 37,83 38,22

200 44,90 42,25 41,29

250 56,86 56,01 56,26


Parámetro Ausencia de NAA 30 ng mL-1

NAA 80 ng mL-1

NAA


a -3,38·10-1

47,7·10-1

-5,66·10-1

b 2,39·10-1

1,91·10-1

2,25·10-1


27,0·10-1

18,0·10-1

r2

0,999 0,997 0,998


a 8,19·10-1

10,5·10-1

-1,02·10-1

b 2,25·10-1

2,15·10-1

2,19·10-1

sxy 9,6·10-1

17·10-1

16·10-1

sa 9,1·10-1

16·10-1

16·10-1

sb 5,6·10-3

1,0·10-2

9,6·10-3

r2

0.997 0,989 0,990

ta = 0a /sa 0,90 0,64 0,07

tb = 0b /sb 40,0 21,3 22,8

tteórico (α=0,05; n-2=16) = 2,12

Capítulo 5

172

Como se puede observar, tanto en los calibrados de NAA como de NOA, los

coeficientes de la determinación fueron próximos a la unidad. En cuanto a las ordenadas

en el origen de estas rectas, resultaron no significativamente distintas de cero, excepto

para el calibrado de NAA en ausencia de NOA, ya que en este caso el valor de ta

experimental fue superior al valor de tteórico. Además, las pendientes resultantes de la

regresión mediante mínima mediana de cuadrados y mínimos cuadrados, fueron bastante

similares entre ellas para ambos analitos.

Con objeto de estudiar la independencia de las señales analíticas del NAA y del

NOA, es decir, que la señal analítica del NAA es nula a la longitud de onda de medida

seleccionada para la determinación de NOA y viceversa, se realizaron sendos análisis de

varianza de los calibrados propuestos (tablas 5.7 y 5.8).

Tabla 5.7. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de NAA

Fuente de variación Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática

Desviaciones dentro de los

calibrados individuales 4,22·10

-1 12 3,52·10

-2

Deferencias entre las pendientes de

los calibrados individuales 2,09·10

-2 2 1,05·10

-2

Desviaciones entre los calibrados

individuales 7,29·10

-2 4 1,82·10

-2

Desviación total sobre el calibrado

global 4,96·10

-1 16 3,09·10

-2

Estadístico F Experimental Teórico (α = 0,05)

F1 0,52 3,26

F2 0,29 3,89


173

Tabla 5.8. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de NOA


cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática


calibrados individuales 26,5 12 2,21

Diferencias entre las pendientes de

los calibrados individuales 1,57 2 78,3


individuales 11,8 4 2,94


global 38,3

16 2,39


F1 1,33 3,26

F2 3,54·10-1

3,89

En ambos casos resultaron valores experimentales de F1 y F2 menores que los

tabulados, por lo que se aceptó una regresión mediante mínimos cuadrados globales como

calibrados de NAA y NOA.

Por un lado, los parámetros estadísticos más importantes obtenidos mediante

regresión por mínima mediana de cuadrados y mínimos cuadrados de la calibración global,

y, por otro lado, el análisis de varianza en el que se contrasta la hipótesis de linealidad de

estas rectas figuran en las tablas 5.9 y 5.10 para el NAA y en las tablas 5.11 y 5.12 para el

NOA.

La significación de la pendiente obtenida por mínimos cuadrados se evaluó

mediante el test de la t de Student, con el fin de determinar el grado de sensibilidad. Se

obtuvo un valor de 40,62 y 42,13 para NAA y NOA, respectivamente, los cuales resultan

ser superiores al valor de tteórico, lo que indica que la sensibilidad del método propuesto es

satisfactoria.

Capítulo 5

174

Tabla 5.9. Recta de calibrado global del NAA

Parámetro Mínima mediana de cuadrados

a 4,86·10-1

b 5,59·10-2


r2

0,997


a 1,71·10-1

b 5,99·10-2

syx 1,8·10-1

sa 9,1·10-2

sb 1,5·10-3

r2

0,9898

ta = 0a /sa 1,87

tb = 0b /sb 40,6

tteórico (α=0.05, n-2=16) = 2,12

Tabla 5.10. Análisis de varianza: linealidad del calibrado del NAA

Fuente de varianza Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Varianza

Varianza explicada 51,12 1 51,12

Falta de ajuste 0,20 4 5,10·10-2

Error puro 0,29 12 2,43·10-2

Varianza no explicada 0,49 16 3,09·10-2

Varianza total 51,62 17 3,036


F(Falta de ajuste/error puro) 2,09 3,26


175

Tabla 5.11. Recta de calibrado global del NOA


a 7,23·10-1

b 2,24·10-1

Escala estimada 1,50

r2

0,997


a 5,89·10-1

b 2,20·10-1

syx 15·10-1

sa 8,4·10-1

sb 5,2·10-3

r2

0,991

ta = 0a /sa 0,70

tb = 0b /sb 42,1

tteórico (α=0.05, n-2=16) = 2,12

Tabla 5.12. Análisis de varianza: linealidad del calibrado de NOA

Fuente de varianza Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Varianza

Varianza explicada 4249 1 4249

Falta de ajuste 15,57 4 3,89

Error puro 22,74 12 1,89

Varianza no explicada 38,30 16 2,39

Varianza total 4288 17 252,2

Estadístico F Experimental Teórico (α =0,05)

F(Falta de ajuste/error puro) 2,05 3,26

Capítulo 5

176

Las pendientes de las rectas de regresión mediante mínima mediana de cuadrados y

mínimos cuadrados resultaron muy similares, lo que indica que, si existen puntos

anómalos en el calibrado, éstos ejercen un efecto poco significativo, pues no provoca un

giro en la recta de regresión de mínimos cuadrados. Como puede observarse en las tablas

anteriores, las ordenadas en el origen, a un nivel de confianza del 95 %, no son

significativamente distintas de cero, puesto que texperimental es inferior a tteórico. Respecto al

análisis de varianza de la linealidad, la falta de ajuste resultó no significativa frente al error

puro ya que el valor de Fexperimental es menor que el valor de Fteórico y, por tanto, en ambas

rectas se cumplió la hipótesis de linealidad. En las figuras 5.19 y 5.20 se ilustran las rectas

de regresión por mínimos cuadrados y mínima mediana de cuadrados para el NAA y

NOA, respectivamente, pudiéndose apreciar que, en ambos casos, las rectas prácticamente

solapan entre sí. Con objeto de estudiar con más profundidad las rectas de mínimos

cuadrados globales, se calcularon los residuales estandarizados, mostrados en las figuras

5.21 para el NAA y 5.22 para el NOA, y la resistencia al diagnóstico mediante mínima

mediana de cuadrados, mostrados en la figura 5.23 para los calibrados de NAA y NOA.

Figura 5.19. Datos experimentales ajustados mediante mínimos cuadrados globales (azul) y

mínima mediana de cuadrados globales (rojo) para el NAA.


177

Figura 5.20. Datos experimentales ajustados mediante mínimos cuadrados globales (azul) y

mínima mediana de cuadrados globales (rojo) para el NOA.

Figura 5.21. Los residuales estandarizados a la recta de regresión de NAA por mínimos

cuadrados y por mínima mediana de cuadrados.

Capítulo 5

178

Figura 5.22. Los residuales estandarizados a la recta de regresión de NOA por mínimos


Figura 5.23. Las resistencias al diagnóstico mediante mínima mediana de cuadrados para los

calibrados de NAA y de NOA.

Como se puede observar, en ambos casos, la distribución de los residuales a la

recta de regresión mediante mínimos cuadrados globales es uniforme, por lo que se puede

aceptar que dichas rectas presentas homocedasticidad, lo que implica que la precisión es

estadísticamente semejante para todas las concentraciones.


179

En cuanto al análisis de residuales cabe destacar que, en el caso del NAA, se

presentan dos residuales estandarizados cuyos valores son superiores a -2.5 y, por tanto,

constituyen datos anómalos de la recta de regresión. No obstante, estos datos no

provocaron un giro significativo en la recta (figura 5.19). Estos datos, en principio,

producirían un aumento de la ordenada en el origen pero su efecto fue despreciable. En

cuanto al NOA, se obtuvo un residual que superó el límite de -2,5, pero que al igual que en

lo ocurrido para el NAA, no provocó un giro significativo en la recta (figura 5.20).

Las rectas de calibrado global y las bandas de dispersión de dichas rectas a un nivel

de confianza del 95% se ilustran en las figuras 5.24 y 5.25 para el NAA y el NOA,

respectivamente. Además, en la figura 5.26 se muestran las correspondientes regiones

conjuntas de las verdaderas pendiente y ordenada en el origen de dichas rectas.

Figura 5.24. Bandas de dispersión y recta global de calibrado del NAA.

Capítulo 5

180

Figura 5.25. Bandas de dispersión y recta global de calibrado del NOA.

Figura 5.26. Región conjunta de la pendiente y la ordenada en el origen, a un nivel de confianza

del 95% para el NAA y el NOA.


181

Como puede observarse, se obtiene una precisión muy elevada en la recta de

calibrado, incluso en los extremos inferior y superior del intervalo de calibración escogido.

Asimismo, puede constatarse que la zona de mayor precisión (aquélla donde las bandas de

dispersión se hacen más estrechas y, por tanto, en la cual debería utilizarse el calibrado),

se corresponde con un nivel de concentración entorno a 60 y 150 ng L-1

de NAA y NOA,

respectivamente. Valores numéricos que coinciden, lógicamente, con el centro de

gravedad de cada calibrado (valor medio de la x).

La recta de calibrado global puede tomar cualquier valor dentro de sus bandas de

dispersión. Este hecho origina la existencia de una región conjunta, en forma de elipse, de

los posibles valores de la pendiente y de la ordenada en el origen.

Puede apreciarse como, en ambos casos, la región para la ordenada en el origen

nula se sitúa dentro de la elipse y, por tanto, ésta no se consideró significativamente

distinta de cero.

6.2. Estudio de la precisión de las estimaciones

Con objeto de conocer el error que se comete en la estimación de las

concentraciones de los dos analitos en estudio, se evaluó el intervalo de confianza en una

serie de 10 disoluciones que contenían NAA y NOA, siendo sus concentraciones 60 y 125

ng mL-1

, respectivamente. Esta serie se preparó en las mismas condiciones experimentales

que los patrones de calibrado y, una vez obtenidos los espectros de fosforescencia a λex =

274 nm, se registró el espectro derivado de primer orden, donde se midió la señal derivada

a em = 488,5 nm para llevar a cabo la determinación de la concentración de NOA.

Posteriormente, se registró el espectro derivado de segundo orden para todas las muestras

de la serie y se obtuvo la señal derivada a em = 469,5 nm, donde se cuantificó el NAA.

Los valores de la primera y segunda derivada medidos a las longitudes de onda antes

indicadas, así como la concentración estimada para cada una de las disoluciones, usando

las rectas de los calibrados globales, se muestran en la tabla 5.13. Por otro lado, en la tabla

5.14 se muestran los intervalos de confianza de la estimación y, el error estándar de la

banda de dispersión de las de las estimaciones de la recta de calibrado con 10 replicados.

Capítulo 5

182

Tabla 5.13. Estudio de la precisión del método

Replicado

NAA (60 ng L-1

) NOA (125 ng L-1

)

Segunda derivada

(λ = 469.5 nm)

[NAA]

(ng L-1

)

Primera derivada

(λ = 488.5 nm)

[NOA]

(ng L-1

)

1 3,85 60,10 30,19 131,3

2 3,60 55,70 30,69 133,5

3 3,53 54,50 29,22 127,0

4 3,14 47,50 31,26 136,1

5 3,61 55,80 29,28 127,3

6 3,81 59,50 29,27 127,2

7 3,68 57,10 29,22 127,0

8 3,65 56,60 30,23 131,5

9 3,81 59,40 29,76 129,4

10 3,74 58,10 29,60 128,7

Tabla 5.14. Intervalos de confianza del NAA y el NOA

Fuente de

Error

Grados de

libertad

t teórico

(α = 0,05)

D.E.b y

E.E.c

(ng mL-1

)

Intervalo

(ng mL-1

)

D.E.R.b

y

E.E.R.c

(%)

NAA 60 ng mL-1

. Valor medio encontrado: 56,43 ng mL-1

Error puro n -1 = 9 2,26 3,6b

48,23-63,65 6,42d

B.D.E.R.C.a

n - 2 = 16 2,12 1,2c

53,97-58,89 2,05e

NOA 125 ng mL-1


Error puro n -1 = 9 2,26 5,1b

118,5-141,3 3,89d

B.D.E.R.C.a n - 2 = 16 2,12 2,8

c 123,9-135,8 2,16

e

a: Banda de dispersión de las estimaciones de la recta de calibrado

b: Desviación estándar (relativa)

c: Error estándar (relativo)


183

En ambos casos se obtuvo una precisión aceptable, siendo menor el error de la

estimación en el caso del NOA aunque, la desviación estándar relativa es muy similar para

el NOA y el NAA, tomando un valor próximo a 2,1%. En el caso del NOA, la precisión de

la estimación a este nivel de concentración, que es prácticamente el centro de gravedad de

la recta de calibrado, está definida por el error puro de los replicados al igual que para el

NAA.


Se preparó una serie de 10 replicados de un blanco analítico en las mismas

condiciones experimentales que los patrones de calibrado, pero en ausencia de NAA y

NOA. Entonces, se registraron los espectros de fosforescencia a λex = 274 nm, y a partir de

éstos, los correspondientes espectros derivados de primer y segundo orden. Para la señal

del blanco fue medida su segunda derivada a la longitud de onda em = 469,5 nm, que es

donde se determina el NAA, y, por otro lado, fue medida a em = 488,5 nm, en el espectro

derivado de primer orden, que es donde se determina el NOA.

Los valores de la primera y segunda derivada de cada uno de los replicados se

muestran en la tabla 5.15 y, los límites de detección encontrados para el NAA y el NOA

se muestran en la tabla 5.16.

Se observan valores lógicos para los límites de detección considerando las distintas

teorías que los definen, así, el límite de detección propuesto por la IUPAC considera

únicamente la desviación estándar del blanco, por lo que su valor es inferior al límite de

detección propuesto por Long y Winefordner que considera, además de la desviación

estándar del blanco, la dispersión de la recta de calibrado. Por otro lado, el límite de

detección obtenido según el criterio de Clayton es el mayor de todos para el NOA puesto

que considera la dispersión de la recta de calibrado y el error de tipo β, sin embargo, para

el NAA es para el que se obtiene un límite de detección inferior.

Capítulo 5

184

Tabla 5.15. Blanco analítico de NAA y NOA

Replicado Segunda derivada

(λ = 469.5 nm)

Primera derivada

(λ = 488.5 nm)

1 0,47 -0,03

2 0,09 0,39

3 -0,13 1,25

4 0,19 2,13

5 -0,18 -0,03

6 0,18 2,00

7 -0,16 0,99

8 0,28 0,18

9 -0,04 1,06

10 0,04 0,98

Tabla 5.16. Límites de detección del NAA y del NOA

Definición Estadístico CLOD (ng mL

-1)

NAA NOA

IUPAC K 3,00 10,5 10,5

G. L. Long y J. D.

Winefordner K 3,00 11,5 15,6

Clayton Δ(α = β = 0.05, n – 2 = 16) 3,44 7,84 19,2

7. DETERMINACIÓN DE NAA Y NOA EN FRUTAS, HORTALIZAS

Y PRODUCTOS FITOSANITARIOS

El método propuesto fue aplicado para la resolución de una mezcla de NAA y

NOA en frutas, hortalizas y el producto fitosanitario Etifix. Para ello, fue necesario

establecer un proceso de extracción previo a fin de eliminar las posibles interferencias de

las matrices.


185

7.1. Procedimiento de extracción

Para llevar a cabo el método propuesto, en primer lugar, ha de realizarse una

extracción de ambos compuestos en cada una de las matrices bajo estudio. Para ello, se

siguió un procedimiento basado en otro propuesto por nuestro equipo de investigación

para la determinación de NAA en muestras de manzana, en el que se usa la medida de la

fosforescencia aplicando la técnica de “Stopped-Flow”. Sin embargo, ha sido necesario

adaptarlo a las condiciones particulares del análisis simultáneo de NAA y NOA en fresa,

naranja, ciruela y tomate, que es el propósito del estudio desarrollado en este trabajo.

En primer lugar, se tomaron 10 g de cada una de las matrices, los cuales fueron

triturados y, considerando los estudios preliminares en los que se descartó la presencia

tanto de NAA como de NOA en las matrices analizadas, al triturado obtenido se le

adicionó una cantidad de NAA y de NOA de manera que sus concentraciones en la

disolución final de extracción fuesen de 200 ng mL-1

de NAA y de 500 ng mL-1

de NOA.

A continuación, se añadieron 30 mL de NaHCO3 al 4%, se homogeneizó la mezcla y se

agitó durante 10 minutos en ultrasonidos con el fin de acondicionar cada una de las

muestras, conteniendo los principios activos que se pretenden analizar en este trabajo.

Seguidamente se filtra con un filtro para análisis cuantitativo sin cenizas DP (145 125) y el

filtrado obtenido es acidificado con 14 mL de H2SO4 al 10%.

Adecuada la muestra para la extracción de ambos analitos, se lleva a cabo una

extracción líquido-líquido mediante la adición de 10 mL de CH2Cl2. Se recoge la fase

orgánica, de la cual, después de centrifugar, se toman 5 mL para asegurarnos de que

solamente tomamos disolución (sin ningún resto sólido) y, se evapora a sequedad usando

un rotavapor para eliminar el disolvente.

A continuación, el residuo seco se redisuelve en 6 mL de SDS 0,5 mol L-1

y se

lleva a un volumen final de 25 mL con agua desionizada, de forma que la concentración

final de SDS en la muestra extraída es de 0,12 mol L-1

, siendo las concentraciones de

NAA y NOA las anteriormente indicadas, es decir, 200 y 500 ng mL-1

, respectivamente.

7.2. Determinación de la concentración problema de NAA y NOA

El método diseñado fue aplicado para la determinación de NAA y NOA en

productos agrícolas españoles de origen ecológico tales como el tomate y frutas,

concretamente, fresa, naranja y ciruela, así como al producto fitosanitario Etifix. Todas las

Capítulo 5

186

muestras analizadas estaban libres de contaminación de NAA y NOA, puesto que al ser de

procedencia ecológica no habían sido expuestos a tratamientos químicos.

A las muestras de tomate y frutas se les añadieron las soluciones estándar de los

dos reguladores del crecimiento vegetal y tras aplicar el tratamiento de extracción, descrito

anteriormente, se llevó a cabo sus respectivas determinaciones en las condiciones

químicas previamente establecidas. El estudio en cada una de las muestras fue realizado

por triplicado (tabla 5.17). A continuación se llevó a cabo el estudio del porcentaje de

recuperación siguiendo el mismo procedimiento mencionado anteriormente, pero en este

caso el NAA fue añadido directamente del producto fitosanitario, de manera que en la

muestra a analizar la concentración del mismo fuese de 3 μg g-1

(tabla 5.18).

Tabla 5.17. Estudio del porcentaje de recuperación de NAA y NOA en frutas y

tomate mediante el método MS-RTP propuesto

Muestra Cantidad añadida

(μg g-1

)

Cantidad encontrada

(μg g-1

)

Porcentaje de

recuperación

,%)( DEx

NAA NOA NAA NOA NAA NOA

Etifix 3,0 6,3 2,6 6,2 85,7 ± 0,3 99,7 ± 1,1

Fresa 3,0 6,3 2,9 6,4 95,0 ± 0,3 102,0 ±0,1

Naranja 3,0 6,3 3,1 6,1 103,0 ±0,1 97,2 ± 4,6

Ciruela 3,0 6,3 2,9 6,8 96,0 ± 1,3 107,3 ±0,6

Tomate 3,0 6,3 2,7 6,3 90,4 ± 0,3 101,5 ±1,6


187

Tabla 5.18. Estudio del porcentaje de recuperación de NAA (a partir de Etifix) y

NOA en frutas y tomate mediante el método MS-RTP propuesto

Muestra Cantidad añadida

(μg g-1

)

Cantidad encontrada

(μg g-1

)

Porcentaje de

recuperación

,%)( DEx

Etifix

(NAA)

NOA Etifix

(NAA)

NOA Etifix

(NAA)

NOA

Fresa 3,0 6,3 2,7 6,6 93 ± 0,2 107,0 ±0,9

Naranja 3,0 6,3 2,8 6,1 94,8 ± 0,1 104,0 ±3,0

Ciruela 3,0 6,3 2,1 6,2 70 ± 0,6 99,0 ± 1,3

Tomate 3,0 6,3 2,9 6,4 99 ± 0,8 104 ± 2,2

Los resultados obtenidos, mostrados en estas últimas tablas, permiten concluir que

el método propuesto permiten la resolución de mezclas formadas por los analitos NAA y

NOA, con porcentajes de recuperación en todos los casos que concuerdan con la cantidad

añadida en cada una de las muestras.

Capítulo 5

188

CAPÍTULO 6

DETERMINACIÓN

DE ÁCIDO 2,4- DICLOROFENOXIPROPANOICO EN MUESTRAS

VEGETALES MEDIANTE FLUORESCENCIA INDUCIDA

FOTOQUÍMICAMENTE

Determinación de 2,4-DP mediante PIF

191

1. OBJETIVO

El objetivo del presente trabajo es la determinación del ácido 2,4-

diclorofenoxipropanoico (2,4-DP) en muestras reales, tales como productos fitosanitarios

y matrices vegetales procedentes de diferentes frutas y tomate mediante fluorescencia

inducida fotoquímicamente (PIF).

El 2,4-DP (figura 6.1), es un herbicida hormonal con actividad reguladora del

crecimiento, perteneciente a la familia de los clorofenoxiácidos.

Figura 6.1. Estructura química del ácido 2,4-diclorofenoxipropanoico.

El ácido 2,4-DP es un compuesto que presenta una débil fluorescencia. Mediante

radiación ultravioleta (UV) dicho analito es transformado en un producto fluorescente, el

cual puede ser determinado de una forma simple, rápida y sensible aplicando técnicas

espectrofluorimétricas.

Para llevar a cabo la determinación de este analito se comenzó haciendo un estudio

experimental de las características espectrales del 2,4-DP tras la aplicación de radiación

UV, seguido de la optimización secuencial de las variables químicas e instrumentales que

afectan a la señal de fluorescencia con el fin de obtener la máxima sensibilidad en la

determinación en cada una de las matrices de estudio.

2. SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE FOTOIRRADIACIÓN

2.1. Consideraciones teóricas

El bajo rendimiento cuántico de fluorescencia de los compuestos aromáticos

clorados, tales como los clorofenoxiácidos, es debido al efecto que ejerce el átomo de

Capítulo 6

192

cloro intramolecular. En efecto, el cloro y otros halógenos aumentan la constante de

velocidad del cruce intersistemas del estado singlete excitado al estado triplete excitado,

produciendo así una disminución del rendimiento cuántico de la fluorescencia. Por tanto,

el uso de reacciones de fotodeshalogenación puede ser considerado como un método

analítico para mejorar la detección de fluorescencia indirecta de compuestos aromáticos

que contengan átomos de halógeno en su molécula.

Sistemas de reacción-detección fotoquímica basados en la fotolisis de los

compuestos orgánicos halogenados han sido propuestos por diversos autores [4.85]. Por

ejemplo, un fenol clorado (Ar-Cl) genera principalmente ácido clorhídrico y fenol a través

de la siguiente secuencia de reacciones:

Ar-Cl + h Ar· + Cl·

Cl· + H-R HCl + R·

Ar· + H-R Ar-H + R· + otros productos

Los otros productos incluyen hidroxifenoles, dihidroxibifenoles, polímeros y

productos de fotodegradación. Eluyentes como el metanol pueden servir como átomos

donadores de hidrógeno en muchas reacciones de radicales libres. La existencia de un

mecanismo de decloración fotolítica análogo puede explicar la eficacia de fluorescencia

relativamente alta observada en los fotoproductos de herbicidas clorofenoxiácidos como el

ácido 2,4-DP.

Las condiciones de fotoirradiación consideradas para optimizar la fluorescencia

obtenida incluyen las siguientes variables:

- Disolvente adecuado para la reacción fotoquímica.

- Influencia y selección del tiempo de irradiación.

Estas variables influyen en la señal analítica obtenida, de manera que van a afectar

a la sensibilidad del método. Se procedió, por tanto, a su estudio con el fin de obtener para

el ácido 2,4-DP señales fluorescentes de alta intensidad y estables, que permitan

cuantificar su concentración.

2.2. Elección del disolvente

A fin de elegir el disolvente más adecuado para llevar a cabo la determinación

propuesta, se estudió la influencia del medio sobre la señal de fluorescencia obtenida


193

fotoquímicamente. Los disolventes ensayados fueron: etanol, metanol y acetona. Dado que

el 2,4-DP era disuelto en etanol para preparar la disolución madre, se prepararon

disoluciones de 0,5 μg mL-1

del 2,4-DP en cada uno de los disolventes, manteniendo un

porcentaje fijo de un 5% de etanol en el caso del metanol y acetona. Una alícuota de estas

disoluciones fue irradiada durante varios minutos con el fin de originar la formación del

fotoproducto fluorescente.

Tras registrar los espectros de excitación y emisión a las longitudes de onda de

máxima intensidad del analito en los diferentes disolventes, se decidió elegir como

disolvente una mezcla de etanol/metanol, por ser la que mayor señal de fluorescencia

proporcionaba.

A continuación se procedió a determinar la influencia del porcentaje de metanol

sobre la señal fluorescente obtenida para el 2,4-DP bajo irradiación. Para ello, se

prepararon disoluciones conteniendo 0,5 μg mL-1

de 2,4-DP, 5% de etanol, una

concentración de tampón acético/acetato de 0,04 mol L-1

de pH 5 y se fue variando el

porcentaje de metanol desde 0 hasta 50%. Las disoluciones eran preparadas en el

momento de realizar cada una de las medidas y fueron irradiadas con una velocidad de la

bomba peristáltica de 10 rpm, lo que proporcionaba un tiempo de irradiación de 3,30 min.

Figura 6.2. Influencia del porcentaje de metanol en la señal de fluorescencia del 2,4-DP.

Seguidamente se registraron los espectros de excitación y emisión de cada una de

las muestras irradiadas utilizando 6 nm para las rendijas, tanto de excitación como de

Capítulo 6

194

emisión, y un tiempo de integración de 0,1 s. Los resultados obtenidos permiten concluir,

que el aumento en el porcentaje de metanol en el medio produce un aumento significativo

de la intensidad de fluorescencia fotoinducida, tendencia que puede observarse en la figura

6.2. Éste hecho nos llevó a seleccionar el 50 % de metanol como el porcentaje óptimo en

la muestra.

2.3. Influencia del tiempo de irradiación

Una vez seleccionado el medio disolvente en el que llevar a cabo la irradiación, se

procedió a estudiar cómo afectaba el tiempo de irradiación sobre la señal de fluorescencia

obtenida para el 2,4-DP. El montaje experimental utilizado para llevar a cabo la

irradiación de la muestra estaba formado una bomba peristáltica GILSON Minipuls 3 y

una lámpara modelo PSA 10.570 UV Cracker, las cuales fueron descritas en el capítulo 3

de esta tesis. Dadas las características de este montaje, la velocidad de la bomba

peristáltica va a determinar el tiempo de irradiación de la muestra.

Figura 6.3. Influencia del tiempo de irradiación en la señal de fluorescencia del 2,4-DP.

Así, para determinar la influencia que el tiempo de irradiación ejercía sobre la

intensidad fluorescente del analito, en este caso el 2,4-DP, se prepararon disoluciones que

contenían una concentración de 0,5 μg mL-1

de 2,4-DP, 5% de etanol, 50 % de metanol y

0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato de pH = 5. Dichas muestras fueron propulsadas a


195

través de la lámpara UV a velocidades de la bomba peristáltica comprendidas entre 1 y 40

rpm, lo que corresponde a tiempos de irradiación de 60 a 1 min. Una vez que las muestras

habían sido irradiadas, éstas fueron recogidas y fue medida su fluorescencia en su

correspondiente máximo manteniendo los parámetros instrumentales de 6 nm para la

apertura de las rendijas y 0,1 s para el tiempo de integración.

Los resultados obtenidos, representados en la figura 6.3, ponen de manifiesto que

la señal de fluorescencia presenta sus valores más altos para velocidades de la bomba

comprendidas entre 5 y 10 rpm, aproximadamente, disminuyendo bruscamente para

velocidades más bajas y no de manera tan acusada para velocidades mayores de la bomba.

Se seleccionó, por tanto, una velocidad de la bomba peristáltica de 5 rpm, con la que se

obtenía un tiempo de irradiación de 6 min como óptimo para nuestro estudio.

En la figura 6.4 se han representado los espectros de excitación y emisión en

muestras sin irradiar e irradiadas durante 6 min. En ella se puede observar que la

disolución de 2,4-DP que no ha sido sometida a radiación UV no presenta fluorescencia,

siendo la señal obtenida la correspondiente al blanco analítico, mientras que aquella otra

disolución de 2,4-DP que había sido sometida a irradiación UV en las condiciones

establecidas hasta el momento presentan una considerable señal fluorescente, apareciendo

los máximos de excitación y emisión a λex= 276 nm y λem= 303 nm, respectivamente.

Figura 6.4. Espectros bidimensionales de excitación y emisión del 2,4-DP sin irradiar e irradiado.

Capítulo 6

196

3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DEL ÁCIDO 2,4-DP

Figura 6.5. Representación isométrica del espectro de fluorescencia total del ácido 2,4-DP.

Figura 6.6. Espectro de fluorescencia total del 2,4-DP representado mediante curvas de nivel.

En la figura 6.5 se representa el espectro de fluorescencia total del ácido 2,4-DP en

proyección isométrica, el cual fue obtenido irradiando durante 6 min una disolución de

analito de 0,5 μg L-1

en presencia de 5% de etanol, 50% de metanol, una concentración de


197

tampón ácido acético/acetato 0,04 mol L-1

de pH 5.0, y, termostatizado a una temperatura

de 20 ºC.

En la figura 6.6 se encuentran representadas las curvas de nivel del espectro de

fluorescencia total del ácido 2,4-DP, las cuales unen puntos de igual intensidad dentro del

espectro. Como puede comprobarse en dicha figura, el ácido 2,4-DP presenta tres

máximos de excitación, localizados a las longitudes de onda de 276, 302 y 379 nm, y tres

máximos de emisión a las longitudes de onda de 303, 407 y 430 nm.

Las longitudes de onda de mayor intensidad y que serán, por tanto, con las que se

realizará la determinación propuesta son λex = 276 nm y λem = 303 nm.

4. ESTABILIDAD DE LA DISOLUCIÓN

Los estudios descritos en bibliografía ponen de manifiesto la sensibilidad del 2,4-

DP a la luz [4.85], hecho que hace necesario el estudio de la estabilidad de sus

disoluciones. Para ello, se preparó una disolución madre del 2,4-DP de 200 μg mL-1

en

medio etanólico, la cual fue conservada protegida de la luz en matraces de color topacio y

almacenada a 4 ºC.

La estabilidad de dicha disolución fue estudiada midiendo la señal de fluorescencia

de disoluciones diluidas de 0,5 μg mL-1

del analito, conteniendo 5% de etanol, 50% de

metanol y 0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato de pH 5, las cuales eran preparadas

diariamente y sometidas a 6 min de irradiación UV. Las medidas fueron realizadas a la

longitud de onda de máxima intensidad, indicada anteriormente, y pusieron de manifiesto

que la intensidad de fluorescencia era constante y que, por tanto, las disoluciones eran

estables durante, al menos, dos semanas.

Por otra parte, se estudió la estabilidad de las disoluciones de trabajo midiendo la

intensidad de fluorescencia en su máximo de emisión cada 15 min. Este estudio permitió

concluir que las disoluciones de trabajo eran estables durante, al menos, una hora.


5.1. Optimización de los parámetros químicos

5.1.1. Influencia del pH

Para estudiar la influencia del pH sobre la señal de fluorescencia, se prepararon

diferentes muestras en matraces de 10 mL conteniendo una concentración de 0,5 μg mL-1

Capítulo 6

198

de 2,4-DP, 5% de etanol y 50 % de metanol. A estas disoluciones se les fueron añadiendo

concentraciones variables de NaOH y HCl con el fin de ir variando el valor de pH del

medio.

Cada una de esas muestras fue sometida a radiación UV durante el tiempo

previamente establecido (6 min), así como también lo fueron los blancos correspondientes

a cada una de las disoluciones. Posteriormente, se registraron sus espectros de excitación y

emisión utilizando 6 nm para las rendijas de excitación y emisión y 0,1 s como tiempo de

integración. Los resultados obtenidos mostraron que para los diferentes valores de pH

estudiados los espectros no presentaban desplazamientos en las longitudes de onda de los

máximos de excitación y emisión, siendo éstas λex= 276 nm y λem= 303 nm.

En la figura 6.7 se representa la intensidad de fluorescencia en el máximo de

emisión frente al pH. En ella puede observarse que en medios muy básicos o muy ácidos

la intensidad obtenida en la formación del fotoproducto es mucho menor que la obtenida

para valores de pH comprendidos entre 4,5 y 5,5. En consecuencia, fue seleccionado como

óptimo un valor de pH = 5, que se corresponde con el anteriormente descrito en la

bibliografía, motivo por el cual fue inicialmente incluido en nuestros estudios iniciales.

Figura 6.7. Influencia del pH en la señal de fluorescencia del 2,4-DP.


199

5.1.2. Influencia de la concentración de tampón

Una vez seleccionado el pH de la disolución de trabajo se procedió a estudiar la

influencia de la concentración de solución reguladora en la señal de fluorescencia

fotoinducida del 2,4-DP. Para ello, se prepararon muestras conteniendo 0,5 μg mL-1

del

analito, 5% de etanol, 50 % de metanol y concentraciones variables de la disolución

tampón acético/acetato de pH = 5 comprendidas entre 0,01 y 0,08 mol L-1

.

Una vez irradiadas las diferentes muestras en las condiciones establecidas, se

registraron sus espectros de emisión y excitación, así como los correspondientes a los

diferentes blancos (exentos del 2,4-DP y, en consecuencia, del producto fluorescente que

éste produce cuando es sometido a la radiación UV) a las longitud de onda λex= 276 nm y

λem= 303 nm, respectivamente.

Los resultados obtenidos, mostrados en la figura 6.8, ponen de manifiesto que la

concentración de solución reguladora no afecta significativamente a la intensidad de

fluorescencia, siendo 0,03 mol L-1

el valor seleccionado como óptimo para llevar a cabo la

determinación propuesta.

Figura 6.8. Influencia de la concentración de solución reguladora en la señal de fluorescencia del

2,4-DP.

5.1.3. Influencia de la temperatura

La fluorescencia es un proceso de desactivación radiante, sin embargo, los

procesos de desactivación no radiantes se ven favorecidos a altas temperaturas dado que se

Capítulo 6

200

produce un aumento del movimiento molecular y, por tanto, aumenta la probabilidad de

que existan colisiones intermoleculares. Este hecho, hace necesario estudiar el efecto de la

temperatura en la intensidad de fluorescencia del analito bajo estudio con la metodología

propuesta.

Por ello, la experiencia que se expone a continuación tiene por objeto establecer

cómo afecta la temperatura sobre la fluorescencia del 2,4-DP tras ser sometido a la

radiación UV. Para llevar a cabo este estudio se prepararon disoluciones individuales del

analito a una concentración de 0,5 μg mL-1

y en las condiciones químicas previamente

establecidas. Las disoluciones eran preparadas para cada punto experimental, aunque las

condiciones químicas de todas ellas eran las mismas. Una vez irradiadas cada una de las

muestras, los matraces que las contenían eran introducidos en un baño termostático, junto

con los blancos, durante 10 min para que se estableciera el equilibrio térmico. Una vez

alcanzada la temperatura, se registraron los espectros de excitación y emisión a las

longitudes de onda del máximo, antes establecidas, y usando un portacubetas termostatado

a la misma temperatura.

Figura 6.9. Influencia de la temperatura en la señal de fluorescencia del 2,4-DP.


entre 15 y 45 ºC. En la figura 6.9 queda reflejado cómo un aumento de la temperatura

provoca una disminución de la intensidad de fluorescencia fotoinducida obtenida para el

2,4-DP. Teniendo en cuenta el alto grado de influencia de la temperatura en la señal de

fluorescencia, su control se hace indispensable. Se consideró que una temperatura próxima


201

a la ambiente era la más adecuada, optándose por la de 20 ºC para termostatar las muestras

en el método considerado.

5.2. Optimización de las variables instrumentales

La optimización de las variables instrumentales se realizó, al igual que en la

optimización de las variables químicas, siguiendo un proceso secuencial, es decir,

modificando el valor de la variable a optimizar mientras que el resto de variables se

mantienen constantes.

Para realizar este estudio de optimización, se prepararon disoluciones del analito en

las condiciones químicas antes seleccionadas, las cuales se encuentran detalladas a

continuación:

- 0,5 μg mL-1

de 2,4-DP

- 5% de Etanol

- 50% de Metanol

- 0,03 mol L-1

de tampón acético/acetato

- 20 ºC de temperatura

- 6 min de tiempo de irradiación

En la optimización de las variables instrumentales no sólo se debe buscar la

máxima intensidad, sino que, debe tenerse en cuenta el ruido instrumental y buscar la

máxima relación entre intensidad y ruido.

Para calcular el ruido instrumental lo que se hizo fue restar a la señal obtenida la

señal suavizada con un valor de 21 puntos de suavizado, y, posteriormente, medir la

desviación estándar de dicha resta en un intervalo de 30 nm de longitud de onda constante

de línea base.



monocromadores; obviamente, una apertura grande de las rendijas va a proporcionar una

mayor señal pero también va a aumentar el ruido y se perderá resolución, de tal manera

que será necesario establecer un valor de compromiso con el que obtener, por un lado, un

buen valor de intensidad y, por otro, una resolución y un ruido aceptables, sin llegar a la

saturación del detector. En la figura 6.10 se puede observar como varía la intensidad de

Capítulo 6

202

fluorescencia, así como el ruido y la relación señal/ruido con la apertura de las rendijas

para el 2,4-DP.


ambos de la señal fluorescente para el 2,4-DP.

Teniendo en cuenta los resultados, se seleccionó 6 nm como valor óptimo para

ambas rendijas, dado que con ellas se obtiene una buena relación señal/ruido; además,

tomando 6 nm como apertura de las rendijas, se elimina el riesgo de la posibilidad de

saturación del equipo al aumentar la concentración del analito.

5.2.2. Optimización del tiempo de integración (“int time”)

Se puede definir el tiempo de integración de la señal fluorescente como el tiempo

en el que el fotomultiplicador permanece abierto recogiendo la señal de emisión que le

llega de la muestra. Su optimización se llevó a cabo variando éste parámetro entre 0,01 y

0,25 s. Los resultados experimentales obtenidos se muestran en la figura 6.11.

Donde observarse, que la intensidad de fluorescencia permanece prácticamente

constante al aumentar el tiempo de integración. Sin embargo, en cuanto al ruido, éste

disminuye de manera considerable entre valores del tiempo de integración de 0,01 y 0,1 s,

permaneciendo estable a partir de éste último valor.


203


de la señal fluorescente para el 2,4-DP.

El valor de tiempo de integración escogido como óptimo fue 0,1 s ya que ofrece el

valor óptimo en cuanto a la relación señal/ruido y, además, con este tiempo de integración

se obtienen tiempos de registro menores.


Este parámetro nos va a permitir reducir en gran medida el nivel de ruido de las

señales obtenidas. Al aumentar el número de medias, el equipo repite el espectro y, a

medida que va adquiriendo puntos, va realizando la media de dichos puntos.

Para determinar el valor óptimo de esta variable, se prepararon disoluciones de 2,4-

DP en las condiciones químicas seleccionadas, usando las condiciones instrumentales

hasta ahora optimizadas (apertura de las rendijas de 6 nm y tiempo de integración de 0,1

s). Se registraron los espectros de emisión utilizando un número de medias comprendido

entre 1 y 10, mostrándose los resultados experimentales en la figura 6.12. Como puede

apreciarse en dicha figura, la intensidad de emisión fluorescente permanece prácticamente

constante.

Capítulo 6

204


la señal fluorescente para el 2,4-DP.

Sin embargo, con valores más altos en el número de medias se obtiene una relación

señal/ruido mayor. El valor elegido como óptimo fue de 3 medias con el fin conseguir un

tiempo de registro del espectro menor.

6. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE 2,4-DP

Para estudiar de que forma influye la concentración de 2,4-DP sobre la señal de

fluorescencia obtenida al someter al analito a radiación UV, a fin de determinar el

intervalo de dependencia lineal entre ambas magnitudes, se prepararon muestras de

concentración crecientes del analito en matraces aforados de 10 mL, en las que se

mantuvieron las condiciones químicas seleccionadas, esto es, un 5% de etanol, un 50 % de

metanol y 0,04 mol L-1

de disolución reguladora de pH 5.

Las muestras y el blanco correspondiente se irradiaron durante 6 min, tras los

cuales, se registraron sus correspondientes espectros de excitación y emisión en las

condiciones instrumentales seleccionadas y se midieron las intensidades de fluorescencia a

λem= 303 nm, empleando como longitud de onda de excitación λex= 276 nm. Los

resultados obtenidos se muestran en la figura 6.13.


205

Figura 6.13. Influencia de la concentración de 2,4-DP sobre la intensidad de emisión

fluorescente.

En dicha figura puede observarse como la señal de fluorescencia aumenta de forma

lineal a medida que aumenta la concentración de 2,4-DP, hasta que ésta alcanza un valor

de 500 ng mL-1

, a partir de la cual se pierde la linealidad.

7. DETERMINACIÓN FLUORIMÉTRICA DE ÁCIDO 2,4-DP


Con el propósito de definir un método de determinación del ácido 2,4-DP, se

realizó el siguiente estudio con el que se pretende evaluar la linealidad entre las

concentraciones del analito a determinar y sus correspondientes señales de fluorescencia

fotoinducida medidas a las longitudes de onda anteriormente seleccionadas.

El intervalo de concentración del 2,4-DP estudiado estaba comprendido entre 40,0

y 200,0 ng mL-1

. Los valores de concentraciones seleccionados se encuentran, como se vio

anteriormente, dentro del intervalo de concentraciones al cual el analito presenta un

comportamiento lineal, midiendo la intensidad de fluorescencia en el máximo de emisión,

anteriormente descrito.

Capítulo 6

206

Para llevar a cabo este estudio, se prepararon tres calibrados del ácido 2,4-DP, en

las condiciones químicas previamente establecidas. Los patrones de calibrado se

prepararon en matraces volumétricos de 10 mL de capacidad de la siguiente manera: se

tomaron alícuotas de 2,4-DP de tal manera que su concentración en dichos patrones

estuviera comprendida entre 40,0 y 200,0 ng mL-1

; posteriormente, cada muestra fue

adecuada a las condiciones químicas seleccionadas, esto es, 5% de etanol, 50% de metanol

y 0,04 mol L-1

de solución reguladora, fue añadida agua suficiente hasta enrasar a un

volumen final de 10 mL y, finalmente, fueron irradiadas durante 6 min.


de los espectros de emisión fluorescente en las condiciones instrumentales previamente

optimizadas, esto es, apertura de rendija de 6 nm, 3 medias y 0,1 s de tiempo de

integración, excitando a 276 nm. En las mismas condiciones se registró el espectro del

blanco correspondiente (exento del clorofenoxiácido en estudio), el cual fue restado a los

espectros de las muestras. Posteriormente, se obtuvieron las intensidades de fluorescencia

midiendo en la longitud de onda del máximo de emisión a 303 nm. Las intensidades

correspondientes a los tres calibrados propuestos para la determinación de 2,4-DP se

muestran en la figura 6.14.

Figura 6.14. Datos experimentales ajustados mediante mínimos cuadrados para el calibrado 1

(azul), calibrado 2 (rojo) y calibrado 3 (verde).

Los valores de la intensidad medidos a λem= 303 nm para cada una de las muestras

de los calibrados del 2,4-DP y los parámetros de regresión de estos calibrados se recogen

en las tablas 6.1 y 6.2, respectivamente.


207

Tabla 6.1. Rectas de calibrado de 2,4-DP: intensidad de fluorescencia a

λem= 303 nm

[2,4-DP] (ng mL-1

) Calibrado 1 Calibrado 2 Calibrado 3

40 99165 89973 94563

60 142000 164573 168553

80 184154 218013 223543

150 381994 375913 396783

200 499894 529543 539913


Parámetro Calibrado 1 Calibrado 2 Calibrado 3


a -4,146 · 103

8,808 · 103 -1,502 · 10

3

b 2,531 · 103

2,607 · 103 2,769 · 10

3

Escala estimada 8,5 · 103

1,8 · 104

1,2 · 104

r2

0,999 0,998 0,999


a -10,26·102 -32,40·10

2 -16,45·10

2

b 25,63·102 26,31·10

2 27,01·10

2

sxy 8,8 · 103 1,5 · 10

4 1,1 · 10

4

sa 7,9

1,3

9,6

sb 6,5·102

1,1·102

7,9·102

r2

0,998 0,995 0,997

ta = 0a /sa 1,29 0,24 0,17

tb = 0b /sb 39,2 24,1 34,1

tteórico (α=0,05; n-2=16) = 2,17

Como se puede observar en los calibrados del 2,4-DP, los coeficientes de la

determinación fueron próximos a la unidad. En cuanto a las ordenadas en el origen de

Capítulo 6

208

estas rectas, resultaron no significativamente distintas de cero, ya que los valores de ta

experimentales obtenidos fueron inferiores al valor de tteórico.

Con objeto de estudiar la independencia de las señales analíticas de los calibrados

propuestos de 2,4-DP, se les aplicó el análisis de varianza (tabla 6.3). Observando la tabla

podemos comprobar que tanto el estadístico experimental F1 como el F2 resultan ser

menores que el teórico, por lo tanto, las pendientes de las rectas individuales no difieren

significativamente entre sí; este hecho permite que la pendiente global pueda tomarse

como pendiente representativa.

Por otro lado, los valores de intensidad y los parámetros estadísticos más

importantes obtenidos mediante regresión por mínimos cuadrados de la calibración global

figuran en las tablas 6.4 y 6.5, respectivamente. La significación de la pendiente obtenida

por mínimos cuadrados se evaluó mediante el test de la t de Student, con el fin de

determinar el grado de sensibilidad. Se obtuvo un valor de de tb de 41,95, el cual resulta

ser superior al valor de tteórico, lo que indica que la sensibilidad del método propuesto es

satisfactoria. Como puede observarse en la tabla 6.5, la ordenada en el origen, a un nivel

de confianza del 95 %, no es significativamente distinta de cero, puesto que texperimental es

inferior a tteórico.

Tabla 6.3. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de 2,4-DP


cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática


calibrados individuales 1,256 · 10

9 12 1,047 · 10

8

Deferencias entre las pendientes

de los calibrados individuales 1,701 · 10

8 2 8,504 · 10

7

Desviaciones entre los


9 4 4,755 · 10

8

Desviación total sobre el

calibrado global 3,158 · 10

9 16 1,974 · 10

8


F1 2,54 3,26

F2 8,12 · 10-1

3,89


209

Tabla 6.4. Rectas de calibrado global de 2,4-DP:

intensidad de fluorescencia a λem= 303 nm

[2,4-DP] (ng mL-1

) Calibrado global

40,0 94567

60,0 158375

80,0 208570

150,0 384896

200,0 523116

Tabla 6.5. Recta de calibrado global del 2,4-DP


a -1,994 · 104

b 2,754 · 103


r2

0,995


a - 5048,3

b 2631,6

syx 1,4·104

sa 76,3·10-1

sb 6,3·10-2

r2

0,992

ta = 0a /sa 0,66

tb = 0b /sb 41,9

tteórico (α=0.05, n-2=16) 1,77

Capítulo 6

210

En la figura 6.15 se ilustra la recta global de regresión por mínimos cuadrados para

el 2,4-DP, pudiéndose apreciar su linealidad, puesta de manifiesto por el coeficiente de la

determinación, r2. Por otro lado, con objeto de estudiar con más profundidad las rectas

mediante mínima mediana de cuadrados y de mínimos cuadrados globales, se calcularon

los residuales estandarizados y la resistencia al diagnóstico para el calibrado global del

2,4-DP. Estos residuales se muestran en la figura 6.16.

Figura 6.15. Recta de regresión global del 2,4-DP ajustado mediante mínimos cuadrados.

Como se puede observar, la distribución de los residuales a la recta de regresión

mediante mínima mediana de cuadrados y mínimos cuadrados globales es uniforme, por lo

que se puede aceptar que dicha recta presenta homocedasticidad, lo que implica que la

precisión es estadísticamente semejante para todas las concentraciones. Por otro lado, cabe

destacar que no se presentan valores de residuales estandarizados cuyos valores sean

superiores a 2.5 y, por tanto, no existen puntos que constituyan datos anómalos de la recta

de regresión. La recta de calibrado global y las bandas de dispersión de dicha recta a un

nivel de confianza del 95% se ilustran en la figura 6.17.

Como puede apreciarse, se obtiene una precisión muy elevada en la recta de

calibrado, incluso en los extremos inferior y superior del intervalo de calibración elegido.



se corresponde con un nivel de concentración entorno a 120 ng L-1

.


211

Figura 6.16. Los residuales estandarizados a la recta de regresión por mínimos cuadrado y

mínima mediana de cuadrados; resistencias al diagnóstico mediante mínima mediana de

cuadrados.

Capítulo 6

212

Figura. 6.17. Bandas de dispersión y recta global de calibrado del 2,4-DP.


Con objeto de conocer el error que se comete en la estimación de las

concentraciones de 2,4-DP se estudió el intervalo de confianza en una serie de 10

disoluciones de 50,0 ng mL-1

de concentración. Esta serie se preparó en las mismas

condiciones experimentales que los patrones de calibrado y, una vez obtenidos los

espectros de excitación y de emisión fluorescente se midió la fluorescencia a λem= 303 nm.

Los valores de intensidad obtenidos, la concentración estimada para cada una de

las disoluciones, así como, el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de

variación de cada uno de los 10 replicados, se muestran en la tabla 6.6. Los intervalos de

confianza del método propuesto se encuentran reflejados en la tabla 6.7.

Se obtuvo una precisión aceptable para el método propuesto, con unas desviaciones

estándar entre el 4 y 6 %.


213


Replicado

2,4-DP 50 ng L-1

Intensidad de

fluorescencia

Concentración

(ng L-1

)

1 1,47 · 105

57,8

2 1,05 · 105 41,8

3 1,09 · 105 43,3

4 1,41 · 105 55,5

5 1,14 · 105 45,2

6 1,24 · 105 49,0

7 1,40 · 105 55,1

8 9,92 · 104 39,6

9 1,20 · 105 47,5

10 1,36 · 105

53,6

Promedio desviación estándar 48,9 6,4

Coeficiente de variación 13,1 %

Tabla 6.7. Intervalos de confianza del 2,4-DP

Fuente de

Error

Grados de

libertad

t teórico

(α = 0,05)

Intervalo

(ng mL-1

)

D.E.R.b

y

E.E.R.c

(%)

2,4-DP 50 ng mL-1


Error puro n - 2 = 16 2,12 39,32 - 58,48 4,5b

B.D.E.R.C.a

n -1 = 9 2,26 34,46 - 63,33 6,4c

a: Banda de dispersión de las estimaciones de la recta de calibrado.

b: Desviación estándar relativa.

c: Error estándar relativo.

Capítulo 6

214

7.3. Estudio del límite de detección

Para la determinación del límite de detección se aplicó en primer lugar el criterio

de la IUPAC y, seguidamente, los propuestos por Long y Winefordner y Clayton. Para

ello, se preparó una serie de 10 replicados de un blanco analítico en las mismas

condiciones experimentales que los patrones de calibrado, pero en ausencia de 2,4-DP. A

continuación, se registraron los espectros de fluorescencia y se midió su intensidad a la

longitud de onda correspondiente al máximo del analito. Los valores de intensidad

medidos λem= 303 nm de cada uno de los replicados se muestran en la tabla 6.8 y, los

límites de detección en la tabla 6.9.

Tabla 6.8. Blanco analítico de 2,4-DP

Replicado Intensidad de fluorescencia a λem= 303 nm

1 20096,1

2 18432,6

3 18315,3

4 17709,0

5 19264,3

6 19264,3

7 19205,7

8 18902,5

9 18374,0

10 18012,2

Como se puede comprobar, los valores de los límites de detección son superiores

cuando se emplea el criterio de Clayton, lo cual es debido a que el factor de seguridad es

superior ya que tiene en cuenta tanto los errores de tipo como los errores de tipo . El

criterio de Long y Winefordner sólo tiene en cuenta los errores de tipo , por tanto, el

factor de seguridad es superior al del criterio de la IUPAC e inferior al de Clayton.


215

Tabla 6.9. Límites de detección del 2,4-DP


-1)

2,4-DP

IUPAC K 3,00 8,2 · 10-1

(ng mL-1

)

G. L. Long y J. D.

Winefordner K 3,00 8,3 (ng mL

-1)

Clayton Δ(α = β = 0.05, n – 2 = 16) 3,44 14,2 (ng mL-1

)

8. DETERMINACIÓN DE 2,4-DP FRUTAS, HORTALIZAS Y

PRODUCTOS FITOSANITARIOS

El método propuesto fue aplicado para la determinación de 2,4-DP en muestras de

ciruela, mandarina, madroño, tomate y el producto fitosanitario Fixofrut. Para llevar a

cabo la determinación del 2,4-DP en este último únicamente fue necesario realizar una

dilución del mismo, mientras que para la determinación de este clorofenoxiácido en las

frutas y tomate fue necesario aplicar un proceso de extracción previo en cada una de las

matrices en estudio.


La determinación del ácido 2,4-DP en diferentes frutas y tomate mediante el

método propuesto, basado en la obtención de fluorescencia fotoinducida mediante

aplicación de radiación UV, requiere un previo tratamiento de extracción del analito de

dichas muestras , el cual fue realizado utilizando etanol como disolvente.

Para ello, en primer lugar, se tomaron 10 g de la fruta o tomate a analizar, los

cuales fueron triturados y, considerando estudios preliminares en los que se descartó la

presencia de 2,4-DP en las muestras en estudio, al triturado obtenido se le adicionó una

cantidad de 2,4-DP de manera que su concentración en la disolución final de extracción

fuese de 120 ng mL-1

. De la misma forma se obtuvo un triturado de las diferentes matrices

a las que no fue añadido el clorofenoxiácido en estudio. A continuación, se añadieron 25

mL de etanol, se homogeneizó la mezcla y se agitó durante 10 minutos en ultrasonidos con

el fin de extraer cuantitativamente el analito que se pretende analizar en este trabajo.

Capítulo 6

216

Seguidamente, se filtró con un filtro para análisis cuantitativo sin cenizas ALBET DP

(125) y se procedió al análisis del filtrado según el procedimiento propuesto.

8.2. Determinación de la concentración de 2,4-DP en las muestras

Para llevar a cabo la determinación del 2,4-DP en el tomate y las frutas indicadas

mediante el método propuesto se prepararon muestras a partir de los filtrados etanólicos

obtenidos tras el proceso de extracción, tanto de aquellas matrices a las que no se había

añadido el 2,4-DP como de aquellas otras a las que si había sido añadido. Se prepararon

las muestras en matraces aforados de 10 mL, a las que se añadió 0.1 mL de la solución de

etanol obtenida en el proceso de extracción, cantidad necesaria para que en la disolución

del extracto la concentración de 2,4-DP sea de 120 ng mL-1

, y el volumen de etanol

necesario para mantener un porcentaje constante del 5%, un 50 % de metanol y 0,04 mol

L-1

de disolución reguladora de pH 5, llevándose finalmente a enrase con agua

desionizada. Se prepararon de forma similar muestras a partir de los extractos de las

matrices que no contenían el analito. Las muestras se irradiaron durante 6 min, tras los

cuales se midieron las intensidades de fluorescencia a λem= 303 nm, empleando como

longitud de onda de excitación λex= 276 nm y en las condiciones instrumentales

anteriormente seleccionadas.

Figura 6.18. Espectro de fluorescencia total del extracto de ciruela representado mediante curvas

de nivel.


217

Figura 6.19. Espectro de fluorescencia total del extracto de tomate representado mediante curvas

de nivel.

Es conveniente destacar que tanto la ciruela como el tomate, se trata de matrices

biológicas que presentan una elevada fluorescencia en las condiciones de medida cuando

éstas no han sido sometidas a irradiación previa, tal y como puede observase en las figuras

6.18 y 6.19, respectivamente. Por otro lado, las matrices procedentes tanto de la mandarina

como del madroño, presentan una fluorescencia natural muy débil en las condiciones de

medida seleccionadas en la determinación propuesta.

Cuando las matrices fluorescentes de ciruela y tomate son sometidas al proceso de

irradiación en las condiciones seleccionadas para la determinación de 2,4-DP, su señal de

fluorescencia desaparece, pudiéndose observar la señal correspondiente al blanco

analítico, o bien la señal del 2,4-DP procedente de la disolución patrón. En las figuras 6.20

y 6.21 puede comprobarse que cuando la muestra que es irradiada es la que procede del

extracto en la que se encuentra tanto la matriz como el analito, la señal obtenida se debe

exclusivamente a la señal procedente del analito y no a la matriz. Mientras que, por otro

lado, las matrices que de forma natural presentaban una ligera fluorescencia, como son la

mandarina y el madroño, tampoco la presentan después de ser irradiadas y, de igual modo

que en tomate y ciruela, al ser irradiadas junto al analito, la fluorescencia obtenida es

debida exclusivamente a éste (figuras 6.22 y 6.23).

Capítulo 6

218

Además, el 2,4-DP también fue determinado en el producto fitosanitario Fixofrut

16%. Para ello, se preparó una disolución de 160 ppm de Fixofrut al 100% en etanol. De

esta disolución se tomó una alícuota y se prepararon las muestras en las condiciones

fotoquímicas optimizadas y, se realizaron las medidas de fluorescencia manteniendo las

condiciones instrumentales optimizadas.

Figura 6.20. Espectros de excitación de los extractos de la ciruela sin irradiar, de la

mezcla (ciruela y 2,4-DP) irradiada y del 2,4-DP irradiado.

Figura 6.21. Espectros de excitación de los extractos del tomate sin irradiar, de la mezcla (tomate

y 2,4-DP) irradiada y del 2,4-DP irradiado.


219

Figura 6.22. Espectros de excitación del extracto de la mandarina sin irradiar, de la mezcla

(mandarina y 2,4-DP) irradiada y del 2,4-DP irradiado.

Figura 6.23. Espectros de excitación del extracto del madroño sin irradiar, de la mezcla

(tmadroño y 2,4-DP) irradiada y del 2,4-DP irradiado.

Se realizaron tres replicados para cada una de las muestras. Para todas ellas se

registró el espectro de fluorescencia excitando a λex = 276 nm, y, a continuación se

obtuvieron los valores de intensidad midiendo a em = 303 nm. Los valores de

Capítulo 6

220

recuperación obtenidos para cada una de las muestras estudiadas se detallan en la tabla

6.10.

Tabla 6.10. Estudio del porcentaje de recuperación de 2,4-DP en frutas, tomate y

productos fitosanitarios mediante PIF.

Muestra Cantidad

añadida (μg g-1

)

Cantidad encontrada

(μg g-1

)

Porcentaje de

recuperación

,%)( DEx

Ciruela 6,0 6,4 106,7 ± 0,1

Tomate 6,0 6,1 101,2 ± 2,6

Mandarina 6,0 5,8 98,9 ± 3,1

Madroño 6,0 5,9 99,2 ± 1,4

Fixofrut 6,0 5,9 99,1± 0,8

Como puede observarse en esta última tabla, los resultados obtenidos para la

determinación del ácido 2,4-DP en muestras reales permiten concluir la validez del

método propuesto, puesto que los porcentajes de recuperación concuerdan con las

concentraciones añadidas a las mismas.

221

CAPÍTULO 7

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO 3,5,6-TRICLORO-2-

PIRIDILOXIACÉTICO EN MUESTRAS VEGETALES MEDIANTE

FLUORESCENCIA INDUCIDA FOTOQUÍMICAMENTE

Determinación de TCP mediante PIF

223

1. OBJETIVO

El objetivo del presente trabajo es la determinación del ácido 3,5,6-tricloro-2-

piridiloxiacético (triclopyr o TCP) en muestras reales procedentes de matrices vegetales de

diferentes frutas y tomate, así como en el producto fitosanitario Trident mediante

fluorescencia inducida fotoquímicamente. El TCP (figura 7.1) es un herbicida hormonal

con actividad reguladora del crecimiento, derivado del ácido picolínico.

Figura 7.1. Estructura del 3,5,6-tricloro-2-piridiloxiacético (TCP).

El TCP, de manera semejante al 2,4-DP, presenta en su molécula varios átomos de

cloro unidos al anillo aromático, los cuales hacen que este analito no presente una

fluorescencia natural. La aplicación de radiación UV sobre dicho compuesto producirá una

reacción de fotolisis de los átomos de halógeno, que conducirá a la formación de un

producto fluorescente, permitiendo la determinación fluorimétrica cuantitativa de este

compuesto.

Para el estudio propuesto, se seleccionaron las condiciones óptimas de irradiación

UV, tras lo cual se determinaron las características fluorimétricas espectrales del producto

obtenido del TCP irradiado. Seguidamente, se procedió a la optimización secuencial de las

variables, tanto químicas como instrumentales, que afectan a la señal de fluorescencia

fotoinducida, con el fin de obtener la máxima sensibilidad en la determinación del TCP

contenido en cada una de las matrices bajo estudio.

Capítulo 7

224


El estudio que se describe a continuación se realizó teniendo en cuenta las

consideraciones teóricas expuestas en el apartado 2.1 del capítulo 6 referentes al uso de

radiación UV sobre compuestos aromáticos clorados, cuya finalidad es la obtención de

productos que presenten fluorescencia fotoquímicamente inducida.

Dado que el TCP presenta en su estructura química tres átomos de cloro unidos al

anillo aromático, se llevó a cabo una ruptura fotolítica de los mismos a fin de producir

compuestos que presentasen un rendimiento cuántico de fluorescencia alto y, además, que

fuesen estables química y térmicamente, al menos durante el tiempo suficiente para llevar a

cabo la determinación cuantitativa del herbicida en estudio.

Para ello, se optimizaron las condiciones de fotoirradiación del TCP para conseguir

la señal de fluorescencia más adecuada mediante el estudio de las siguientes variables:

- disolvente para la reacción fotoquímica.

- influencia del tiempo de irradiación.

La señal analítica obtenida tras este estudio va a condicionar la sensibilidad final

del método propuesto, y, por tanto, la capacidad de poder cuantificar el TCP mediante

medidas fluorimétricas en diferentes matrices.


A la hora de seleccionar el disolvente más adecuado para llevar a cabo la

determinación propuesta, se estudió la influencia de etanol, metanol y acetona en el medio

para seleccionar aquel que proporcionara una mayor intensidad de señal de fluorescencia

tras la irradiación del TCP. Dado que este compuesto es insoluble en medio acuoso, la

disolución madre fue preparada en etanol. A partir de ella, se prepararon disoluciones que

contenían 0,5 μg mL-1

del TCP en cada uno de los disolventes, manteniendo un porcentaje

fijo de un 5% de etanol en el caso del metanol y acetona. Cada una de estas disoluciones

fue irradiada durante varios minutos con el fin de originar un fotoproducto con

propiedades fluorescentes.

Analizando el comportamiento del TCP irradiado en los diferentes disolventes,

mediante el estudio de los espectros de excitación y de emisión fluorescentes, se decidió


225

trabajar con una mezcla de etanol/metanol, por ser la que mayor señal de fluorescencia

proporcionaba.

Con el fin de comprobar de qué forma afectaba a la señal de fluorescencia

fotoinducida del TCP el porcentaje de metanol presente en el medio, se prepararon

diferentes disoluciones conteniendo 0,5 μg mL-1

de TCP, un 5% de etanol, una

concentración de tampón acético/acetato de 0,04 mol L-1

de pH 5 y se fue variando el

porcentaje de metanol desde un 0 a un 50%. Las disoluciones eran preparadas en el

momento de llevar a cabo la medida y fueron irradiadas durante 3,30 minutos.

A continuación se registraron los espectros de excitación y emisión de cada una de

las muestras irradiadas estableciendo unos valores iniciales de tiempo integración de 0,1 s

y rendija de 7 nm. Las intensidades de emisión máximas obtenidas en este estudio se


0 20 40 60Metanol (% )

0

5

10

15

20

25

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-5

Figura 7.2. Influencia del porcentaje de metanol en la señal de fluorescencia del TCP.

Los resultados obtenidos permiten concluir, que la intensidad de fluorescencia

fotoinducida sufre un aumento considerable al aumentar el porcentaje de metanol en el

medio. Éste hecho nos llevó a seleccionar el 50 % de metanol como el porcentaje óptimo

en la muestra para nuestro estudio.

Capítulo 7

226


Seleccionado el medio disolvente en el que llevar a cabo la irradiación, se procedió

a estudiar como afectaba el tiempo de irradiación sobre la señal de fluorescencia obtenida

para el TCP. Tal como se comentó en el apartado 2.3 del capítulo 6, debido a las

características del montaje utilizado para llevar a cabo la irradiación, la velocidad de la

bomba peristáltica va a ser la que determine el tiempo de irradiación de la muestra.

Para determinar el efecto que el tiempo de irradiación ejercía sobre la intensidad de

fluorescencia inducida fotoquímicamente del TCP, se prepararon disoluciones conteniendo

una concentración de 0,5 μg mL-1

de TCP, 5% de etanol, 50 % de metanol y 0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato de pH = 5. Dichas muestras fueron propulsadas a través de la

lámpara UV a velocidades de la bomba peristáltica entre 1 y 40 rpm, lo que equivale a

tiempos de irradiación de 60 a 1 min. A continuación, se medía la señal fluorescente de

cada una de las muestras irradiadas, manteniendo constantes los parámetros instrumentales

de 7 nm como apertura de las rendijas y 0,1 s de tiempo de integración.

Los resultados obtenidos y representados en la figura 7.3 ponen de manifiesto que

la señal de fluorescencia aumenta a medida que lo hace el tiempo de irradiación hasta un

tiempo de 3,30 min, en el que la intensidad es máxima. Para tiempos de irradiación

mayores la intensidad fluorescente disminuye. En consecuencia, se seleccionó para

nuestro estudio un tiempo de irradiación de 3,30 min, el cual era proporcionado por una

velocidad de la bomba peristáltica de 10 rpm. En la figura 7.4, se han representado los

espectros de excitación y emisión en muestras sin irradiar e irradiadas durante 3,30 min.

En ella se puede observar que el TCP no presenta fluorescencia antes de ser sometido a

radiación UV, y como su señal fluorescente es considerable al ser irradiado en las

condiciones establecidas, presentando sus máximos de excitación y emisión a 380 y 435

nm, respectivamente.


227

0 10 20 30 40Velocidad de la bomba (rpm)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

0

5

10

15

20

25

Figura 7.3. Influencia de la velocidad de la bomba y del tiempo de irradiación en la señal de

fluorescencia del TCP.

200 250 300 350 400 450

(nm)

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

Espectro de excitación sin irradiar

Espectro de excitación irradiado

Espectro de emisión sin irradiar

Espectro de emisión irradiado

ex= 380 nm

em= 435 nm

1.2

0.8

0.4

10

0.6

Inte

nsid

ad

de

flu

ore

sce

ncia

x1

0-6

Figura 7.4. Espectros bidimensionales de excitación y emisión del TCP sin irradiar e irradiado.

Capítulo 7

228

3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES

En la figura 7.5 se representa el espectro de fluorescencia total de una disolución

de TCP de 0,5 μg L-1

en proyección isométrica, tras ser sometida a un proceso de

fotoirradiación durante 3,30 min. Dicho espectro fue obtenido en presencia de 5% de

etanol, 50% de metanol, una concentración 0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato de pH

5 y termostatizando a una temperatura de 20 ºC.

En la figura 7.6 se muestran representadas las curvas de nivel del espectro de

fluorescencia del TCP. El TCP presenta 2 máximos de excitación, localizados a las

longitudes de onda de 279 y 380 nm, y 2 máximos de emisión a las longitudes de onda de

305 y 435 nm. Siendo el máximo correspondiente a la λex = 380 nm y λem = 435 nm el de

mayor intensidad y que será, por lo tanto, en el que se realizarán las medidas para llevar a

cabo la determinación propuesta.

Figura 7.5. Espectro tridimensional de fluorescencia total del TCP.


229

Figura 7.6. Espectro tridimensional de fluorescencia total del TCP representado mediante curvas

de nivel.

4. ESTABILIDAD DE LA DISOLUCIÓN

El estudio de la estabilidad en el tiempo de la disolución de TCP se realizó

preparando una disolución madre de 200 μg mL-1

del analito en etanol, disolvente en el

que éste es totalmente soluble. Dicha disolución fue conservada protegida de la luz en un

matraz de color topacio y almacenada a 4ºC.

A partir de la disolución madre se prepararon diariamente las disoluciones de

medida con una concentración de 0,5 μg mL-1

del analito, 5% de etanol, 50% de metanol y

0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato, las cuales eran sometidas a 3,30 min de

irradiación. La medida de la intensidad de fluorescencia de estas disoluciones en la

longitud de onda de su máximo puso de manifiesto que, puesto que la intensidad era

constante, las disoluciones eran estables durante, al menos, dos semanas.

Por otra parte, se comprobó la estabilidad de las disoluciones de trabajo midiendo

cada 15 minutos la intensidad en su máximo de emisión. Los resultados obtenidos en este

estudio llevaron a la conclusión de que las disoluciones de trabajo eran estables durante, al

menos, una hora.

Capítulo 7

230




Para llevar a cabo el estudio de la influencia del pH sobre la señal de fluorescencia,

se prepararon muestras en matraces de 10 mL conteniendo una concentración de

0,5 μg mL-1

de TCP, 5% de etanol y 50 % de metanol. A estas disoluciones se les fue

variando el valor de pH añadiendo concentraciones variables de HCl y NaOH y,

finalmente, se enrasaron con agua.

Las muestras con los diferentes valores de pH, y sus correspondientes blancos,

fueron irradiadas durante 3,30 min, tiempo previamente seleccionado y fueron registrados

los correspondientes espectros de excitación y emisión usando rendijas de 6 nm y 0.1 s

como tiempo de integración. Tras llevar a cabo dicho estudio pudodo comprobarse que las

longitudes de onda de excitación y emisión del máximo no variaban al hacerlo el pH de la

disolución, permaneciendo constante en los valores λex= 380 nm y λem= 435 nm.

0 4 8 12pH

0

1

2

3

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

Figura 7.7. Influencia del pH en la señal de fluorescencia del TCP.

Como se puede observar en la figura 7.7, en donde se representa la intensidad de

fluorescencia en el máximo de emisión frente al pH de la disolución, en medios muy


231

básicos o muy ácidos la formación del producto con propiedades fluorescentes es

considerablemente menor que la obtenida a valores de pH comprendidos entre 4,5 y 5,7.

El pH seleccionado como valor óptimo para llevar a cabo la determinación fluorimétrica

del TCP según el método considerado fue 5, el cual era proporcionado por una disolución

tampón ácido acético/acetato .


Una vez fijado el pH de trabajo se procedió a la optimización de la influencia de la

concentración de solución reguladora en la señal de fluorescencia fotoinducida del TCP.

Para ello, se prepararon muestras conteniendo una concentración de 0,5 μg mL-1

de TCP,

5% de etanol, 50 % de metanol y una concentración de disolución tampón acético/acetato

que variaba entre 0,01 y 0,08 mol L-1

, manteniendo un pH fijo de 5, y todas ellas enrasadas

hasta un volumen final de 10 mL con agua.

Cada una de las muestras fue irradiada durante 3,30 min y se registraron sus

espectros de excitación y emisión, así como los correspondientes a los diferentes blancos

(exentos de TCP y, por lo tanto, del producto fluorescente que éste produce cuando es

sometido a la irradiación UV) a λem= 435 nm y λex= 380 nm, respectivamente.

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

[Tampón] (mol L-1)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Inte

nsi

dad d

e flu

ore

scenci

a x

10

-6

Figura 7.8. Influencia de la concentración de la solución reguladora en la señal de fluorescencia

del TCP.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7.8 y ponen de manifiesto que la


Capítulo 7

232

fluorescencia. Se optó por seguir utilizando en el estudio propuesto una concentración de

tampón de 0,04 mol L-1

, que es la concentración que supone un valor de intensidad

ligeramente superior.


Para estudiar la influencia de la temperatura en la fluorescencia del analito tras ser

sometido al tiempo de irradiación UV establecido, se prepararon disoluciones individuales

de 0,5 μg mL-1

de TCP en las condiciones químicas previamente seleccionadas. Las

disoluciones fueron preparadas para cada punto experimental, aunque las condiciones

químicas de todas ellas eran las mismas. Los matraces que contenían cada una de las

muestras fueron introducidos en un baño termostático y durante 10 min fueron mantenidos

a cada una de las temperaturas en estudio con el fin de que se estableciera el equilibrio

térmico. Una vez alcanzada cada una de las temperaturas, se registraron los espectros de

emisión fluorescente a la longitud de de onda de excitación inicialmente establecida,

usando un portacubetas termostatado a la misma temperatura. De la misma forma se

realizó un estudio paralelo con la disolución del blanco analítico. La optimización de la

temperatura se llevó a cabo en un intervalo comprendido entre 15 y 45 ºC.

10 20 30 40 50Temperatura (ºC)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Inte

nsi

dad d

e flu

ore

scenci

a x

10

-6

Figura 7.9. Influencia de la temperatura en la señal de fluorescencia del TCP.

En la figura 7.9 queda reflejada la disminución de la intensidad de fluorescencia

que se produce para el TCP al aumentar la temperatura. Estudiado dicho comportamiento


233

se eligió como valor óptimo el de 20 ºC para realizar las medidas analíticas en la



Para la optimización de las variables instrumentales se realizó, al igual que en el

caso anterior, un proceso secuencial, optimizando cada vez una variable y manteniendo las

demás constantes. Este proceso fue realizado con disoluciones de TCP preparadas en las

condiciones químicas ya optimizadas, recogidas a continuación:

- 0,5 μg mL-1

de TCP.

- 5% de etanol.

- 50% de metanol.

- 0,04 mol L-1

de tampón ácido acético/acetato de pH = 5.

- 20 ºC de temperatura.

- 3,30 min de tiempo de irradiación.

En la optimización de las variables instrumentales no sólo se debe buscar aquel

valor que nos proporcione la máxima intensidad, sino que, también se hace necesario tener

en cuenta el ruido instrumental y buscar la máxima relación entre la intensidad y el ruido.

Para calcular el ruido instrumental, a la señal obtenida se le restó la señal suavizada

con un valor de filtrado de 21 puntos, y, posteriormente, se midió la desviación estándar

de dicha resta en un intervalo de línea base de 30 nm de longitud.


La apertura de las rendijas será un parámetro a seleccionar puesto que si un mayor

valor de éstas proporciona una mayor señal también aumentará el ruido y se perderá

resolución. El criterio en su elección fue el de establecer un valor de compromiso con el

que obtener, por un lado, una intensidad alta y, por otro, una resolución y un ruido

aceptables. En la figura 7.10 se presentan los resultados obtenidos es este estudio, tanto

para la variación en la intensidad de fluorescencia del TCP irradiado, como para el ruido y

la relación señal/ruido.

Capítulo 7

234

2 4 6 8 10Rendijas (nm)

0

1

2

3

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

0

1000

2000

3000

Ruid

o y

Señal/R

uid

o

—— Señal

—— Ruido

—— Señal/Ruido

Figura 7.10. Influencia de la apertura de la rendija en la intensidad, ruido y la relación

entre ambos de la señal fluorescente para el TCP.

En nuestro estudio se seleccionó 7 nm como valor óptimo para ambas rendijas

dado que con dicho valor se obtiene una buena relación señal/ruido y, además, se elimina

el riesgo de la posibilidad de saturación de la señal al aumentar la concentración del

analito.


El tiempo que permanece abierto el fotomultiplicador recogiendo la emisión

fluorescente que le llega de la muestra es otro de los parámetros que fue optimizado. Para

ello, se varió su valor entre 0,01 y 0,25 s, siendo los resultados experimentales obtenidos

los mostrados en la figura 7.11. Como puede observarse, la intensidad de fluorescencia

permanece prácticamente constante al aumentar el tiempo de integración. Sin embargo, en

cuanto al ruido, éste disminuye de manera considerable al ir aumentando los valores del

tiempo de integración.

A pesar de que el valor de tiempo de integración que nos ofrece una mayor relación

señal/ruido es 0,25, no tomamos este valor puesto que al aumentar el tiempo de

integración aumenta de forma considerable el tiempo de registro. El valor de tiempo de


235

integración escogido como óptimo fue 0,1 s, el cual, proporciona señales altas de la

intensidad de la señal y, además, se obtienen tiempos de registro menores.

0 0.1 0.2 0.3Tiempo de integración (s)

0

1

2

3

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

0

1000

2000

3000

4000R

uid

o y

Señal/R

uid

o

—— Señal

——Ruido

—— Señal/Ruido

Figura 7.11. Influencia del tiempo de integración en la intensidad, ruido y la relación entre

ambos de la señal fluorescente para el TCP.


Para determinar el valor óptimo de esta variable, se prepararon disoluciones de

TCP en las condiciones químicas seleccionadas, usando las condiciones instrumentales

hasta ahora optimizadas (apertura de las rendijas de 7 nm y tiempo de integración de

0,1 s). Se registraron los espectros de emisión a λex= 380 nm utilizando un número de

medias comprendido entre 1 y 10.

Los resultados experimentales obtenidos en este estudio se muestran en la figura

7.12. En ella puede comprobarse que la intensidad de emisión fluorescente medida en el

máximo a λem= 435 nm permanece prácticamente constante. Sin embargo, utilizando

valores más altos en el número de medias se obtiene una relación señal/ruido mayor. El

valor elegido como óptimo fue de 3 medias para conseguir un tiempo de registro del

espectro menor.

Capítulo 7

236

0 4 8 12Número de medias

0

1

2

3

Inte

nsid

ad

de flu

ore

sce

ncia

x 1

0-6

0

2000

4000

6000

8000

Ruid

o y

Señ

al/R

uid

o—— Señal

——Ruido

—— Señal/Ruido


la señal fluorescente para el TCP.

6. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE TCP

Para estudiar cómo influye la concentración de TCP sobre la señal de fluorescencia

obtenida al someter el analito a radiación UV en las condiciones químicas establecidas, se

prepararon muestras de concentración creciente del analito en matraces aforados de

10 mL, a las que se añadió el volumen de etanol necesario para mantener un porcentaje del

5%, un 50 % de metanol y 0,04 mol L-1

de disolución reguladora acético/acetato de pH 5.

Las muestras conteniendo las diferentes concentraciones de TCP y el blanco

analítico de las mismas se irradiaron durante 3,30 min. Posteriormente, en las condiciones

instrumentales seleccionadas, se registraron sus correspondientes espectros de emisión,

empleando λex= 435 nm y se midieron las intensidades de fluorescencia a λem= 380 nm.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 7.13, en la que se puede observar que la

señal de fluorescencia aumenta de forma lineal a medida que lo hace la concentración de

TCP hasta que ésta alcanza un valor de 600 ng mL-1

, concentración a partir de la cual las

señales de fluorescencia se apartan de la linealidad.


237

0 400 800 1200

[TCP] (ng mL-1)

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

Figura 7.13. Influencia de la concentración de TCP sobre la intensidad de emisión fluorescente.

7. DETERMINACIÓN DE TCP


Teniendo en cuenta el intervalo de concentraciones en el que el analito presenta un

comportamiento lineal midiendo la intensidad de fluorescencia en el máximo,

anteriormente descrito, se llevó a cabo un proceso de calibración dentro del intervalo de

concentraciones de TCP comprendido entre 20 y 100 ng mL-1

. Para llevar a cabo este

estudio, se prepararon tres calibrados del TCP en las condiciones químicas previamente

establecidas.

Los patrones de calibrado se prepararon en matraces volumétricos de 10 mL de

capacidad de la siguiente manera: se tomaron alícuotas de TCP de tal manera que su

concentración en dichos patrones estuviera comprendida entre 20 y 100 ng mL-1

;

posteriormente, cada muestra fue adecuada de manera que contuviera 5% de etanol, 50%

de metanol y 0,04 mol L-1

de solución reguladora de pH = 5, añadiéndose agua suficiente

hasta enrasar a un volumen final de 10 mL. Finalmente, se irradió cada una de las

muestras durante 3,30 min.

Capítulo 7

238

Tras agitar cada una de las muestras hasta homogeneidad, se procedió al registro de

los espectros de emisión fluorescente en las condiciones instrumentales previamente

optimizadas, siendo éstas 7 nm de apertura de rendija, 3 medias y 0,1 s de tiempo de

integración, utilizando ex = 380 nm. En las mismas condiciones se registró el espectro del

blanco correspondiente (muestra exenta de TCP), el cual fue restado a los espectros de de

cada una de las muestras de los calibrados. Posteriormente, se obtuvieron las intensidades

de los espectros de emisión midiendo a em = 435 nm.

Las intensidades correspondientes a los tres calibrados propuestos para la

determinación de TCP se muestran en la figura 7.14.

0 40 80 120[TCP] (ng mL-1)

0

1

2

3

4

Inte

nsid

ad

de flu

ore

scencia

x 1

0-5

Figura 7.14. Datos experimentales ajustados mediante mínimos cuadrados para el calibrado 1

(azul), calibrado 2 (rojo) y calibrado 3 (verde).

Por otro lado, los valores de la intensidad medidos a λem= 435 nm para cada una de

las muestras de los calibrados del TCP y los parámetros de regresión de estos calibrados se

recogen en las tablas 7.1 y 7.2, respectivamente. Como se puede observar en los

calibrados del TCP, los coeficientes de la determinación fueron próximos a la unidad. En

cuanto a las ordenadas en el origen de estas rectas, resultaron no significativamente

distintas de cero, ya que los valores de ta experimental obtenidos fueron inferiores al valor

de tteórico. Además, las pendientes resultantes de la regresión mediante mínima mediana de

cuadrados y mínimos cuadrados, fueron bastante similares entre ellas.


239

Tabla 7.1. Rectas de calibrado de TCP: señales de intensidad de fluorescencia a

λem= 435 nm

[TCP] (ng mL-1


30 99884 99884 100790

40 129090 138650 132480

50 157600 145130 146680

75 242980 231820 234100

100 328360 328360 323350




a 1,067 · 104 5,861 · 10

4 1,267 · 10

4

b 2,948 · 103 3,240 · 10

3 2,965 · 10

3

Escala estimada 8,0 · 102 1,4 · 10

4 1,4 · 10

3

r2

0,999 0,996 0,999


a 81,70·101 24,45·10

2 40,29·10

2

b 32,45·102 31,69·10

2 31,25·10

2

sxy 3,8 · 103 1,1 · 10

4 8,5 · 10

3

sa 3,4 · 103

9,9 · 103

7,6 · 103

sb 5,7 ·101

1,7 · 102

1,3 · 102

r2

0,998 0,986 0,991

ta = 0a /sa 0,24 0,25 0,53

tb = 0b /sb 57,2 18,9 24,5

tteórico (α=0,05; n-2=16) = 2,12

Capítulo 7

240


de TCP, se realizó el análisis de varianza de los calibrados propuestos cuyos resultados se

muestran en la tabla 7.3. Tanto el valor experimental de F1 como el de F2 resultó ser

menor del valor tabulado, por lo que se aceptó una regresión mediante mínimos cuadrados

globales como calibrado del TCP.


importantes obtenidos mediante regresión por mínima mediana de cuadrados y mínimos

cuadrados de la calibración global se encuentran recogidos en las tablas 7.4 y 7.5,

respectivamente. La significación de la pendiente obtenida por mínimos cuadrados se

evaluó mediante el test de la t de Student, con el fin de determinar el grado de sensibilidad.

En este estudio se obtuvo un valor de tb de 48,7, el cual es superior al valor de tteórico, lo

que indica que la sensibilidad del método propuesto es satisfactoria.

Tabla 7.3. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de TCP


cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática



8 12 7,121 · 10

7



7 2 1,652 · 10

7



7 4 1,605 · 10

7



8 16 5,742 · 10

7


F1 0.23 3,26

F2 0.23

3,89


241

Tabla 7.4. Rectas de calibrado global de TCP:

señales de intensidad de fluorescencia a λem= 435 nm

[TCP] (ng mL-1

) Calibrado global

30 69949

40 133406

50 149803

70 236300

100 326690

Tabla 7.5. Recta de calibrado global del TCP


a 1,206 · 104

b 2,935 · 103


r2

0,999


a 2,43 · 103

b 3,18 · 103

syx 7,6 · 103

sa 3,9 · 103

sb 6,5 · 101

r2

0,992

ta = 0a /sa 0,63

tb = 0b /sb 48,7

tteórico (α=0.05, n-2=16) 2,17

Capítulo 7

242

Como puede observarse en la tabla anterior, la ordenada en el origen, a un nivel de

confianza del 95 %, no es significativamente distinta de cero, puesto que texperimental es


En la figura 7.15 se ilustra la recta global de regresión por mínimos cuadrados,

para el TCP, pudiéndose apreciar su linealidad, como bien indica el coeficiente de la

determinación, r2.

0 40 80 120

[TCP] (ng mL-1)

0

1

2

3

4

Inte

nsi

dad

de flu

ore

scenci

a x

10

-5

Figura 7.15. Recta de regresión global del TCP ajustado mediante mínimos cuadrados.

Con objeto de estudiar con más profundidad las rectas por mínima mediana de

cuadrados y de mínimos cuadrados globales, se calcularon los residuales estandarizados y

la resistencia al diagnóstico para el calibrado global del TCP, mostrándose los resultados

de dicho estudio en la figura 7.16.


mediante mínimos cuadrados globales es uniforme, por lo que se puede aceptar que dicha

recta presenta homocedasticidad, lo que implica que la precisión es estadísticamente

semejante para todas las concentraciones. Esto se debe a que a pesar de presentarse ciertos

valores de residuales estandarizados cuyos valores son superiores a 2.5, éstos, no

constituyen datos anómalos de la recta de regresión.


243

-4

-2

0

2

4

Re

sid

uale

s e

sta

nd

arizado

s

-4

-2

0

2

4

Re

sid

uale

s e

sta

ndarizad

os

0 40 80 120[TCP] (ng mL-1)

0

1

2

3

4

Resis

tencia

al dia

gn

óstico

MÍNIMOS CUADRADOS

MÍNIMA MEDIANA DE CUADRADOS


Figura 7.16. Los residuales estandarizados a la recta de regresión por mínimos

cuadrados y mínima mediana de cuadrados; resistencia al diagnóstico mediante mínima

mediana de cuadrados.

Capítulo 7

244

La recta de calibrado global y las bandas de dispersión de dicha recta a un nivel de

confianza del 95% se ilustra en la figura 7.17. Como puede observarse, se obtiene una

precisión muy elevada en la recta de calibrado, incluso en los extremos inferior y superior

del intervalo de calibración escogido. Asimismo, puede constatarse que la zona de mayor

precisión (aquélla donde las bandas de dispersión se hacen más estrechas y, por tanto, en

la cual debería utilizarse el calibrado), se corresponde con un nivel de concentración

entorno a 60 ng L-1

.

40 60 80 100

[TCP] (ng mL-1)

0

100000

200000

300000

4000004

3

2

1

Inte

nsi

dad d

e flu

ore

scenci

a x

10

-5

Figura. 7.17. Bandas de dispersión y recta global de calibrado del TCP.


El error que se comete en la estimación de las concentraciones de TCP fue

evaluado mediante el estudió del intervalo de confianza en una serie de 10 disoluciones de

47 ng mL-1

de concentración. Esta serie se preparó en las mismas condiciones

experimentales que los patrones de calibrado y, una vez obtenidos los espectros de

excitación y de emisión fluorescente, se midió su intensidad a λex=380 nm y λem= 435 nm.

Los valores de intensidad obtenidos y la concentración estimada para cada una de las

disoluciones, así como el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación

de cada uno de los 10 replicados, se muestran en la tabla 7.6. El intervalo de confianza del

método propuesto se encuentra recogido en la tabla 7.7.


245

Observando los datos obtenidos puede concluirse que el método presenta una

precisión aceptable ya que el coeficiente de variación es inferior al 1 %. Y el error puro de

los replicados está en torno al 4%.


Replicado

TCP 47 ng mL-1

Intensidad de

fluorescencia

Concentración

(ng L-1

)

1 68363,7 46,9

2 68547,2 47,1

3 68740,3 47,3

4 68084,6 46,8

5 68166,8 46,8

6 67749,2 46,5

7 68485,1 47,1

8 66717,5 45,7

9 68007,8 46,7

10 68757,8 47,3



Tabla 7.7. Intervalos de confianza del TCP

Fuente de

Error

Grados de

libertad

t teórico

(α = 0,05)

Intervalo

(ng mL-1

)

D.E.R.b

y

E.E.R.c

(%)

TCP 47 ng mL-1


Error puro n - 2 = 16 2,26 43,57-50,05 4,8b

B.D.E.R.C.a

n -1 = 9 2,09 45,86-47,75 18c


b: Desviación estándar relativa

c: Error estándar relativa

Capítulo 7

246


Para la determinación del límite de detección se preparó una serie de 10 replicados

de un blanco analítico en las mismas condiciones experimentales que los patrones de

calibrado, pero en ausencia de TCP. A continuación, se registraron los espectros de

fluorescencia y se midió su intensidad a la longitud de onda correspondiente al máximo de

emisión del analito irradiado. Los valores de intensidad de cada uno de los replicados

medidos a λem= 435 nm se muestran en la tabla 7.8 y, los límites de detección en la tabla

7.9.

Tabla 7.8. Blanco analítico de TCP

Replicado Intensidad de fluorescencia a

λem= 435 nm

1 18932,5

2 18402,6

3 18344,0

4 17759,3

5 18042,2

6 19205,3

7 19234,7

8 20006,1

9 18385,3

10 19264,0

Tal y como era de esperar, el valor del límite de detección es superiores cuando se

emplea el criterio de Clayton, lo cual se debe a que el factor de seguridad es superior ya

que tiene en cuenta tanto los errores de tipo α como los de tipo β. Además, puesto que el

criterio de Long Winefordner sólo tiene en cuenta los errores de tipo β, el valor obtenido

para el límite de detección siguiendo este criterio es inferior al de Clayton pero superior al

proporcionado por el criterio de la IUPAC.


247

Tabla 7.9. Límites de detección del TCP


-1)

TCP

IUPAC K 3,00 0.68

G. L. Long y J. D.

Winefordner K 3,00 3,72

Clayton Δ(α = β = 0.05, n – 2 = 16) 3,44 6,31

8. DETERMINACIÓN DE TCP EN FRUTAS, HORTALIZAS Y

PRODUCTOS FITOSANITARIOS

El método propuesto en este capítulo fue aplicado para la determinación del TCP

en muestras de ciruela, tomate, mandarina, madroño y el producto fitosanitario Trident.

El producto fitosanitario fue analizado por dilución directa del mismo, mientras

que para poder analizar el TCP en las frutas y hortalizas fue necesario establecer

previamente un proceso de extracción.


El método propuesto para la determinación del ácido TCP en diferentes frutas y

tomate, basado en la obtención de fluorescencia fotoinducida mediante aplicación de

radiación UV, requiere de un proceso de extracción previo que nos permita extraer el

analito de dichas matrices, el cual fue realizado utilizando etanol como disolvente.

Para ello, en primer lugar, se tomaron 10 g de la fruta u hortaliza a analizar y, tras

ser triturados, se realizó un estudio preliminar, para descartar la presencia del TCP en las

muestras analizadas, a triturados semejantes de las diferentes matrices se le adicionó una

cantidad de TCP de manera que su concentración en la disolución final de extracción fuese

de 75 ng mL-1

. De la misma forma se obtuvo un triturado de las diferentes muestras

vegetales a las que no fue añadido TCP. A continuación, se añadieron 25 mL de etanol se

homogeneizó la mezcla y se agitó durante 10 minutos en ultrasonidos, con el fin de extraer

cuantitativamente el analito que se pretende analizar en este trabajo. Seguidamente se

Capítulo 7

248

filtró con un filtro para análisis cuantitativo sin cenizas ALBET DP (125) y el filtrado

obtenido fue analizado siguiendo el procedimiento propuesto anteriormente optimizado.

8.2. Determinación de la concentración de TCP en las muestras

En primer lugar, fue necesario determinar si la matriz en la cual vamos a

cuantificar el analito presenta fluorescencia en las condiciones optimizadas para el

análisis, tanto químicas como de irradiación. Para ello, se prepararon extractos de cada una

de las matrices que se iban a analizar siguiendo el método de extracción detallado

anteriormente pero sin adicionarle el analito. De esta manera el extracto obtenido procedía

exclusivamente de las matrices. Una vez obtenidos dichos extractos, se tomó 0,1 mL de

cada extracto y se llevó a cabo el registro de sus espectros de fluorescencia total en las

condiciones tanto químicas como instrumentales optimizadas en el método propuesto.

200 250 300 350 400 450

(nm)

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

TCP

Blanco

Ciruela sin irradiar

Ciruela irradiada

10

15

20

5

25

Inte

nsid

ad

de

flu

ore

sce

ncia

x1

0-6

Figura 7.18. Espectros de fluorescencia de excitación de la ciruela sin irradiar e irradiada, del

TCP irradiado y del blanco analítico irradiado.


249

200 250 300 350 400 450

(nm)

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

TCP

Blanco

Tomate sin irradiar

Tomate irradiado

10

15

20

5

25

Inte

nsid

ad

de

flu

ore

sce

ncia

x1

0-6

Figura 7.19. Espectros de fluorescencia de excitación del tomate sin e irradiada, del TCP

irradiado y del blanco analítico irradiado.

200 250 300 350 400 450

(nm)

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

TCP

Mandarina sin irradiar

Mandarina irradiado

10

15

20

5

25

Inte

nsid

ad

de

flu

ore

sce

ncia

x1

0-6

Figura 7.20. Espectros de fluorescencia de excitación de la mandarina sin irradiar e irradiada y

del TCP irradiado.

Capítulo 7

250

200 250 300 350 400 450

(nm)

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

TCP

Madroño sin irradiar

Madroño irradiado

10

15

20

5

25

Inte

nsid

ad

de

flu

ore

sce

ncia

x1

0-6

Figura 7.21. Espectros de fluorescencia de excitación del madroño sin irradiar e irradiado y del

TCP irradiado.

Se pudo comprobar, como ya se había visto en estudios anteriores presentados en

el capítulo anterior, que tanto el tomate como la ciruela presentaban una fluorescencia

bastante intensa sin ser sometidos a ningún proceso de irradiación; sin embargo, el

madroño y la mandarina no presentaban una fluorescencia significativa en las condiciones

de medida establecidas para llevar a cabo la determinación de TCP. Cuando estas matrices

fueron sometidas al proceso de irradiación (3,30 min) en las condiciones en las cuales el

analito presenta la máxima intensidad de fluorescencia, aquellas que eran fuertemente

fluorescentes dejaban de serlo, mientras que las que apenas lo eran tampoco presentaban

fluorescencia después de ser irrradiadas, como puede observarse en las figuras 7.18, 7.19,

7.20 y 7.21.

Por otro lado, una vez obtenidos los extractos de las correspondientes matrices en

presencia del TCP, se prepararon las muestras de medida en matraces aforados de 10 mL,

a las que se añadió el volumen de etanol necesario para mantener un porcentaje constante

del 5%, un 50 % de metanol, 0,04 mol L-1

de disolución reguladora de pH 5 y la cantidad

de extracto etanólico necesario para que en la disolución la concentración de TCP fuera de

75 ng mL-1

. Las muestras se irradiaron durante 3,30 min, tras los cuales se registraron los


251

correspondientes espectros de emisión, empleando λex= 380 nm y las condiciones

instrumentales anteriormente optimizadas.

A continuación se midieron las intensidades de fluorescencia a λem= 435 nm y

pudo comprobarse que cuando la muestra que es irradiada es la que procede del extracto

en la que se encuentra tanto la matriz como el analito, la señal obtenida se debe

exclusivamente a la señal procedente del analito y no a la matriz, lo que permitía llevar a

cabo la determinación directa del TCP en cada una de las matrices según el método de

irradiación propuesto.

El TCP también fue determinado en el producto fitosanitario Trident 48%. Para

ello, se preparó una disolución de Trident al 100% en etanol conteniendo 480 ppm de

TCP. De esta disolución se tomó una alícuota y se prepararon las muestras en las

condiciones fotoquímicas optimizadas y se realizaron las medidas de la emisión

fluorescente manteniendo las condiciones instrumentales optimizadas.

Se realizaron tres replicados para cada una de las muestras. Para todas ellos se

registró el espectro de fluorescencia excitando a λex = 380 nm, y, a continuación los

valores de intensidad fueron medidos a em = 435 nm. Los datos obtenidos se detallan en

la tabla 7.10.

Los resultados obtenidos en la determinación del TCP en muestras reales

confirman la validez del método propuesto, ya que los porcentajes de recuperación

muestran la concordancia entre las concentraciones añadidas a cada una de las matrices

vegetales y las obtenidas siguiendo dicho método.

Tabla 7.10. Estudio del porcentaje de recuperación de TCP en ciruela, tomate,

mandarina, madroño y el producto fitosanitario “Trident” mediante PIF.

Muestra Cantidad

añadida (μg g-1

)

Cantidad encontrada

(μg g-1

)

Porcentaje de

recuperación

,%)( DEx

Ciruela 3,75 3,71 98,9 ± 0,4

Tomate 3,75 3,76 100,3 ± 1,6

Mandarina 3,75 3,70 98,7 ± 2,1

Madroño 3,75 3,77 100,5 ± 2,4

Trident 75 (ppb) 76,3 (ppb) 101,7± 1,3

Capítulo 7

252

CAPÍTULO 8

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO EN MATRICES

VEGETALES MEDIANTE FLUORESCENCIA INDUCIDA

FOTOQUIMÍCAMENTE

Determinación de AGB mediante PIF

255

1. OBJETIVO

El objetivo del presente trabajo es la determinación del ácido giberélico (AGB) en

diferentes matrices hortícolas y frutales, así como en productos fitosanitarios,

concretamente, Clemencuaje, mediante la medida de su fluorescencia fotoinducida.

El AGB, herbicida hormonal con actividad reguladora del crecimiento

perteneciente al grupo de las giberelinas, es un ácido diterpeno tetracíclico cuya estructura

básica está constituida por un anillo de ent-giberelano (figura 8.1). El AGB es un

compuesto que no presenta fluorescencia de forma natural, sin embargo, es transformado

en un producto fluorescente cuando se somete a radiación UV, lo cual puede llevar a cabo

su determinación mediante la aplicación de técnicas espectrofluorimétricas.

Figura 8.1. Estructura del ácido giberélico.

La parte experimental se inició llevando a cabo un estudio de las características

fluorescentes espectrales del AGB tras la aplicación de radiación UV. A continuación se

procedió a la optimización secuencial de las variables que afectan a la señal de

fluorescencia fotoinducida, cuya finalidad era obtener la máxima sensibilidad en la

determinación de este analito en cada una de las matrices analizadas en el presente trabajo.


El estudio que se describe a continuación se realizó con la finalidad de obtener un

producto fluorescente al someter al AGB a radiación UV, de tal manera que se pudiese

llevar a cabo su determinación mediante la medida de su fluorescencia fotoinducida.

Capítulo 8

256

Para ello, se optimizaron las condiciones de fotoirradiación del AGB a fin de

conseguir compuestos que presentasen un rendimiento cuántico de fluorescencia alto y,

además, que fuesen estables química y térmicamente, al menos durante el tiempo

suficiente para llevar a cabo la determinación cuantitativa de dicho herbicida.

La señal analítica obtenida tras este proceso de optimización va a condicionar la

sensibilidad final del método propuesto, y, por tanto, la capacidad de poder cuantificar el

AGB mediante medidas fluorimétricas en diferentes matrices. Las variables optimizadas en

dicho proceso fueron:

- disolvente para la reacción fotoquímica.

- influencia del tiempo de irradiación.


Se procedió al estudio de la elección del disolvente más adecuado para la

determinación del AGB mediante PIF con el fin de obtener un medio en el que la señal de

fluorescencia obtenida para el analito fuera la más apropiada para su determinación

cuantitativa. Los disolventes probados fueron: etanol, metanol y acetona.

Se preparó una disolución de 0,5 μg mL-1

del AGB en cada uno de los disolventes,

manteniendo constante un 5% de etanol en las muestras con metanol y acetona, puesto que

la disolución madre de AGB fue preparada en este medio etanólico al ser este compuesto

insoluble en agua. Una alícuota de cada una de estas disoluciones fue irradiada durante

varios minutos con el fin de originar la formación del producto fluorescente y, a

continuación, se registró el espectro de fluorescencia total de cada una de ellas. Dado el

comportamiento del AGB en los diferentes disolventes, se decidió elegir como disolvente

una mezcla de etanol/metanol, por ser la que mayor señal de fluorescencia proporcionaba.

Para comprobar de qué forma afectaba a la señal fluorescente obtenida la presencia

de metanol en el medio, se prepararon disoluciones conteniendo 0,5 μg mL-1

de AGB, un

5% de etanol, una concentración de tampón acético/acetato de 0,04 mol L-1

de pH 5 y se

fue variando el porcentaje de metanol desde un 0 a un 50%. Cada una de estas

disoluciones fue sometida a un tiempo de irradiación de 3,30 min.

A continuación se registraron los espectros de excitación y emisión de cada una de

las muestras preparadas, estableciendo unos valores iniciales de tiempo de integración de

0,1 s y rendijas de 6 nm. Como puede verse en la figura 8.2, un aumento en el porcentaje


257

de metanol en el medio produce un aumento significativo de la intensidad de fluorescencia

fotoinducida. Por ello, se seleccionó un 50 % de metanol como el porcentaje óptimo en la

muestra.

0 20 40 60Metanol (%)

0

5

10

15

20

25

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-5

Figura 8.2. Influencia del porcentaje de metanol en la señal de fluorescencia del AGB.


En el medio disolvente seleccionado, se estudió la influencia del tiempo de

irradiación sobre la intensidad de fluorescencia obtenida para el AGB. Dadas las

características del montaje utilizado para aplicar la radiación UV sobre la muestra, tal

como se comentó en el apartado 2.3 del capítulo 6, la velocidad de la bomba peristáltica va

a ser la que determine el tiempo de irradiación de la muestra en la lámpara de mercurio de

baja presión descrita en el capítulo 3.

Para determinar esta influencia se prepararon disoluciones conteniendo una

concentración de 0,5 μg mL-1

de AGB, 5% de etanol, 50 % de metanol y 0,04 mol L-1

de

tampón acético/acetato de pH 5. Dichas disoluciones eran impulsadas por medio de la

bomba peristáltica a través de la lámpara UV a velocidades de la bomba comprendidas

entre 1 y 40 rpm, lo que proporcionaba tiempos de irradiación comprendidos entre 60 y 1

min. Una vez que las muestras eran irradiadas, su fluorescencia era medida en su

correspondiente máximo de excitación y emisión, manteniendo constantes los parámetros

Capítulo 8

258

instrumentales de 6 nm para la apertura de las rendijas y 0,1 s para el tiempo de

integración.

Los resultados obtenidos y representados en la figura 8.3 ponen de manifiesto que

la señal de fluorescencia aumenta a medida que lo hace el tiempo de irradiación, siendo

máxima aproximadamente a los 6 min. Cuando la velocidad de la bomba peristáltica varía

de 10 a 40 rpm, se produce un aumento poco significativo en la intensidad de la señal

fluorescente. De 5 a 10 rpm, la intensidad de la señal fluorescente aumenta de forma

notable y a partir de ese momento, cuando la velocidad de la bomba va disminuyendo y,

por lo tanto, aumentando el tiempo de irradiación, la intensidad de la señal sufre un

descenso fuertemente acusado.

Del análisis de los resultados se determinó que el tiempo de irradiación óptimo

para llevar a cabo la determinación fluorescente del AGB era de 6 min, lo que se

conseguía con una velocidad de la bomba peristáltica de 5 rpm.

0 10 20 30 40 50

Velocidad de la bomba (rpm)

0

4

8

12

16

Inte

nsid

ad

de flu

ore

scencia

x 1

0-5

0

10

20

30

40

Tie

mpo d

e irra

dia

ció

n (m

in)

—— Señal

—— Tiempo


fluorescencia del AGB.

3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DEL AGB

En la figura 8.4 se representa el espectro de fluorescencia total en proyección

isométrica de una disolución de AGB (0,5 μg mL-1

), tras ser sometida a un proceso de


259

fotoirradiación durante 6 min, la cual contenía un 5% de etanol, 50% de metanol, una

concentración 0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato de pH 5 y estaba termostatizada a

una temperatura de 20 ºC.

Figura 8.4. Espectro tridimensional de fluorescencia total del AGB.

Figura 8.5. Espectro tridimensional de fluorescencia total del AGB representado mediante curvas

de nivel.

En la figura 8.5 se muestran representadas las curvas de nivel del espectro de

fluorescencia del AGB, el cual presenta dos máximos de excitación localizados a las

Capítulo 8

260

longitudes de onda de 280 y 315 nm y dos máximos de emisión a las longitudes de onda

de 303 y 420 nm. El máximo correspondiente a λex = 280 nm y λem = 303 nm es el que

presenta mayor intensidad y, por tanto, será el que utilizaremos para llevar a cabo la

determinación de AGB.


El estudio de la estabilidad se llevó a cabo preparando una disolución madre de

AGB de 200 μg mL-1

en medio etanólico, en el que el analito es totalmente soluble. Dicha

disolución se mantuvo protegida de la luz en un matraz de color topacio y almacenada a

4ºC.

A partir de la disolución madre se prepararon diariamente las disoluciones de

medida con una concentración de 0,5 μg mL-1

del analito, 5% de etanol, 50% de metanol y

0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato. La medida diaria de estas disoluciones, tras ser

sometidas a irradiación UV durante 6 min, en la longitud de onda de su máximo de

emisión puso de manifiesto que la intensidad de fluorescencia era constante, y que, por

tanto, las disoluciones eran estables durante, al menos, dos semanas.

Además, se comprobó la estabilidad de las disoluciones de trabajo midiendo cada

15 minutos la intensidad en su máximo de emisión. Este estudio permitió concluir que las

disoluciones de trabajo eran estables durante, al menos, una hora.




Para estudiar la influencia del pH sobre la señal de fluorescencia, se prepararon

muestras conteniendo una concentración de 0,5 μg mL-1

de AGB, 5% de etanol y 50 % de

metanol. A estas disoluciones se les fue variando el valor de pH añadiendo cantidades

variables de NaOH y HCl. Cada una de estas muestras fue sometida a radiación UV

durante 6 min, así como también lo fueron los blancos correspondientes a cada una de las

disoluciones. A continuación, se registraron los espectros de emisión y excitación para

cada una de las disoluciones, utilizando 6 nm como apertura de las rendijas y 0,1 s como


261

tiempo de integración, y en ellos fue medida la intensidad en su correspondiente máximo,

el cual se mantuvo constante a λex = 280 nm y λem = 303 nm.

0 4 8 12pH

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

Figura 8.6. Influencia del pH en la señal de fluorescencia del AGB.

Como se puede observar en la figura 8.6, en medios muy básicos o muy ácidos la

intensidad de fluorescencia del fotoproducto obtenido al irradiar el AGB es mucho menor

que la obtenida a valores de pH comprendidos entre 3,8 y 7. En base a estos resultados, se

seleccionó un pH de 5 como valor óptimo para llevar a cabo la determinación

fluorimétrica del AGB según el método propuesto, el cual fue proporcionado por una

disolución tampón ácido acético/acetato, cuya concentración fue a continuación

optimizada .


Una vez fijado el valor de pH 5 y la disolución tampón acético/acetato para

proporcionarlo, se procedió a estudiar la influencia de la concentración de esta disolución

reguladora en la señal de fluorescencia del AGB sometido a radiación UV. Para ello, se

prepararon muestras semejantes a las utilizadas en el estudio de pH pero con

concentraciones de disolución tampón que variaban entre 0,01 y 0,08 mol L-1

. Se

Capítulo 8

262

irradiaron las muestras, así como los blancos correspondientes a cada una de ellas, durante

un tiempo de 6 min y se registraron los espectros de excitación y emisión a λem= 303 nm y

λex= 280 nm, respectivamente.

Los resultados obtenidos, como muestra la figura 8.7, ponen de manifiesto que la


fluorescencia. Se consideró por seguir utilizando una concentración de tampón de 0,04

mol L-1

para llevar a cabo la determinación propuesta.

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1[Tampón] (ng mL-1)

0

2

4

6

8

10

Inte

nsid

ad

de flu

ore

scencia

x 1

0-5

Figura 8.7. Influencia de la concentración de solución reguladora en la señal de fluorescencia del

AGB.


Para estudiar la influencia de la temperatura en la fluorescencia del analito se

prepararon disoluciones de 0,5 μg mL-1

de AGB en las condiciones químicas previamente

establecidas, las cuales fueron sometidas a radiación UV durante 6 min. Los matraces que

contenían las disoluciones de la muestra irradiada eran introducidos en un baño

termostático durante 10 min para que se estableciera el equilibrio térmico. Una vez

alcanzada la temperatura, se registraron los espectros de emisión fluorescente a λex= 280

nm, usando un portacubetas termostatado a la misma temperatura. Paralelamente se realizó

un estudio este estudio con la disolución del blanco analítico.


entre 15 y 45 ºC. En la figura 8.8 queda reflejada la disminución de la intensidad de

fluorescencia que se produce para el AGB al aumentar la temperatura debido a la


263

aparición de procesos de desactivación no radiantes, los cuales se ven favorecidos a

elevadas temperaturas. Por ello, se seleccionó 20 ºC como valor óptimo de temperatura a

la que realizar las medidas fluorimétricas en la determinación de AGB.

10 20 30 40 50Temperatura (ºC)

0

0.5

1

1.5

2

2.5In

tensid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

Figura 8.8. Influencia de la temperatura en la señal de fluorescencia del AGB.


La optimización de las variables instrumentales se realizó siguiendo un proceso

secuencial en el que una variable era optimizada manteniendo las demás constantes. Para

ello, se prepararon disoluciones en las condiciones químicas ya optimizadas:

- 0,5 μg mL-1

de AGB

- 5% de etanol

- 50% de metanol

- 0,04 mol L-1

de tampón ácido acético/acetato de pH = 5

- 20 ºC de temperatura

- 6 min de tiempo de irradiación

En la optimización de las variables instrumentales se buscó la máxima relación

entre intensidad y ruido, puesto que ha de considerarse el ruido instrumental, además de la

máxima intensidad de emisión. Para calcular dicho ruido instrumental se restó a la señal

obtenida la señal suavizada, con un valor de 21 puntos de suavizado, y se midió la

Capítulo 8

264

desviación estándar de dicha resta en un intervalo de 30 nm de longitud de onda de línea

base.


La apertura de las rendijas será determinante puesto que condicionará la señal

analítica obtenida tanto en intensidad como en ruido y poder de resolución. Su elección va

a venir dada por un compromiso con el que obtener, por un lado, una intensidad alta y, por

otro, una resolución y un ruido aceptables. En la figura 8.9 se puede observar como varía

la intensidad de fluorescencia, así como el ruido y la relación señal/ruido con la apertura

de las rendijas para el AGB.

2 4 6 8 10Rendija (nm)

0

1

2

3

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

—— Señal

—— Ruido

—— Señal/Ruido

Ruid

o y

Señal/R

uid

o


ambos de la señal fluorescente para el AGB.

En base a los resultados obtenidos, se seleccionó 6 nm como valor óptimo para

ambas rendijas dado que con dicho valor se obtiene una buena relación señal/ruido y,

además, tomando 6 nm como apertura de las rendijas se elimina el riesgo de la posibilidad

de la saturación del equipo al aumentar la concentración del analito.


265


El siguiente parámetro instrumental que fue optimizado es el tiempo de apertura

del fotomultiplicador recogiendo la emisión fluorescente que le llega de la muestra. Para

ello, se varió su valor entre 0,01 y 0,25 s, mostrándose los resultados experimentales

obtenidos en la figura 8.10. Como puede observarse, las variaciones de este parámetro

apenas modifica la intensidad de fluorescencia del analito. Sin embargo, en cuanto al

ruido, éste disminuye de manera considerable al ir aumentando los valores del tiempo de

integración.

0 0.1 0.2 0.3Tiempo de Integración (s)

0

0.4

0.8

1.2

Inte

nsid

ad d

e f

luore

sce

ncia

x 1

0-6

0

4000

8000

12000

16000

Ruid

o y

Señal/R

uid

o

—— Señal

——Ruido

—— Señal/Ruido

Figura 8.10. Influencia del tiempo de integración en la intensidad, ruido y la relación entre

ambos de la señal fluorescente para el AGB.

El valor de tiempo de integración escogido como óptimo fue 0,1 s ya que para

valores mayores la relación señal/ruido prácticamente no aumenta y, además, con este

tiempo de integración se obtienen tiempos de registro menores.


Por último, se determinó el valor óptimo en el número de medias, para lo cual se

prepararon disoluciones de AGB en las condiciones químicas seleccionadas. Se registraron

los espectros de emisión a λex= 280 nm, usando las condiciones instrumentales hasta ahora

optimizadas (apertura de las rendijas de 6 nm y tiempo de integración de 0,1 s) y variando

Capítulo 8

266

el número de medias entre 1 y 10. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 8.11.

Como puede apreciarse en la figura, la intensidad de emisión fluorescente permanece

prácticamente constante al variar el número de medias espectrales. El valor elegido como

óptimo fue de 4 medias con el fin de conseguir un tiempo de registro del espectro menor.

0 4 8 12Número de medias

0

0.4

0.8

1.2

Inte

nsid

ad d

e flu

ore

scencia

x 1

0-6

0

1000

2000

3000

4000

Seña

l y S

eñal/R

uid

o

—— Señal

——Ruido

—— Señal/Ruido


la señal fluorescente para el AGB.

6. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE AGB

A continuación se procedió a estudiar de qué forma influye la concentración de

AGB sobre la señal de fluorescencia que se produce al someter a irradiación dicho analito

en las condiciones químicas seleccionadas. Para ello, se prepararon muestras de

concentración crecientes del analito en matraces aforados de 10 mL, conteniendo todas

ellas un 5% de etanol, un 50 % de metanol y 0,04 mol L-1

de disolución reguladora

acético/acetato de pH 5.

Las muestras y el blanco analítico de las mismas se irradiaron durante 6 min, tras

los cuales se registraron sus correspondientes espectros de emisión, empleando λex= 280

nm y en las condiciones instrumentales seleccionadas. A continuación se midieron las

intensidades de fluorescencia a λem= 303 nm. Los resultados obtenidos se muestran en la


267

figura 8.12, en la que se puede observar que la intensidad de fluorescencia aumenta a

medida que lo hace la concentración de AGB, hasta que ésta alcanza un valor de 500 ng

mL-1

, a partir del cual puede apreciarse como las intensidades experimentan una ligera

disminución al ir aumentando la concentración de AGB.

0 200 400 600 800 1000[AGB] (ng mL-1)

0

2

4

6

8

10In

ten

sid

ad d

e flu

ore

scen

cia

x 1

0-5

Figura 8.12. Influencia de la concentración de AGB sobre la intensidad de emisión fluorescente.

7. DETERMINACIÓN DE AGB


En el siguiente estudio se pretende evaluar el intervalo de linealidad entre las

concentraciones del analito en estudio y sus correspondientes señales de fluorescencia

medidas en el máximo de emisión.

El intervalo de concentración establecido para llevar a cabo el estudio de

calibración de AGB fue de 50 a 150 ng mL-1

. Los valores de concentraciones

seleccionados se encuentran dentro del intervalo de concentración en el cual el analito

presenta un comportamiento lineal, anteriormente descrito. Para llevar a cabo este estudio,

se prepararon tres calibrados del AGB en las condiciones químicas previamente

establecidas.

Capítulo 8

268


capacidad de la siguiente manera: se tomaron alícuotas de la disolución madre de AGB de

tal manera que su concentración en dichos patrones estuviera comprendida entre 50 y 150

ng mL-1

; posteriormente, cada muestra fue adecuada a las condiciones químicas

seleccionadas, esto es, 5% de etanol, 0,04 mol L-1

de solución reguladora y 50% de

metanol. Finalmente, se irradió cada una de las muestras durante 6 min.


de los espectros de emisión fluorescente en las condiciones instrumentales previamente

optimizadas (apertura de rendija de 6 nm, 4 medias y 0,1 s de tiempo de integración),

utilizando ex = 280 nm. En las mismas condiciones se registró el espectro del blanco

correspondiente (muestra exenta de AGB), el cual fue restado a los espectros de de cada

una de las muestras de los calibrados. Posteriormente, se obtuvieron las intensidades de los

espectros de emisión midiendo en el máximo a em = 303 nm. Las intensidades

correspondientes a los tres calibrados propuestos para la determinación de AGB se


40 60 80 100 120 140 160[AGB] (ng mL-1)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Inte

nsid

ad

de flu

ore

scencia

x 1

0-5

Figura 8.13. Datos experimentales ajustados mediante mínimos cuadrados globales para el

calibrado 1 (azul), calibrado 2 (rojo) y calibrado 3 (verde).

Los valores de la intensidad medidos a λem= 303 nm para cada una de las muestras

de los calibrados del AGB y los parámetros de regresión de estos calibrados se recogen en

las tablas 8.1 y 8.2, respectivamente.


269

Tabla 8.1. Rectas de calibrado de AGB: señales de intensidad de fluorescencia a

λem= 303 nm

[AGB] (ng mL-1


50 68477 67238 68602

75 97035 94800 96253

100 130593 129000 127000

125 167000 168563 176000

150 206533 204000 204000




a 1,79 · 104 -1,504 · 10

4 1,049 · 10

4

b 1,071 · 103 1,456 · 10

3 1,168 · 10

3

Escala estimada 4,1 · 103 5,6 · 10

3 3,3 · 10

3

r2

0.999 0,999 0,999


a 9,716 · 103 9,226 · 10

3 7,448 · 10

3

b 1,261 · 103 1,255 · 10

3 1,287 ·10

3

sxy 6,3 · 103 6,8 · 10

3 7,3 · 10

3

sa 4,5 · 103 4,8 · 10

3 5,2 · 10

3

sb 5,0 · 103 5,3 · 10

1 5,7 · 10

1

r2

0,991 0,989 0,988

ta = 0a /sa 2,16 1,92 1,44

tb = 0b /sb 25,24 23,56 22,42

tteórico (α=0,05; n-2=19) = 2,52

Capítulo 8

270

Como se puede observar en los calibrados del AGB, los coeficientes de la

determinación fueron próximos a la unidad. En cuanto a las ordenadas en el origen de

estas rectas, resultaron no significativamente distintas de cero, ya que los valores de ta

experimental obtenidos fueron inferiores al valor de tteórico.


de AGB, se realizó el análisis de varianza de los calibrados propuestos (tabla 8.3). Los

valores experimentales de F1 y F2 fueron menores que los tabulados, por lo que se aceptó

una regresión mediante mínimos cuadrados globales como calibrado del AGB.

Tabla 8.3. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de AGB


cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática



8 15 4,626 · 10

7



6 2 4,655 · 10

6



7 4 3,109 · 10

6



8 19 3,717 · 10

7


F1 6,72 · 10-2

3,06

F2 1,01 · 10-1

3,68


importantes obtenidos mediante regresión por mínima mediana de cuadrados y mínimos

cuadrados de la calibración global se encuentran recogidos en las tablas 8.4 y 8.5,

respectivamente.


271

Tabla 8.4. Rectas de calibrado global de AGB:

señales de intensidad de fluorescencia a λem= 303 nm

[AGB] (ng mL-1

) Calibrado global

50 68106

75 96029

100 128864

125 170521

150 204844

Tabla 8.5. Recta de calibrado global del AGB


a 1,652 · 104

b 1,062 · 103


r2

0,998


a 8,797 · 103

b 1,268 · 103

syx 6,1 · 103

sa 2,5 · 103

sb 2,8 · 101

r2

0,991

ta = 0a /sa 2,51

tb = 0b /sb 45,67

tteórico (α=0.05, n-2=19) = 2,52

Capítulo 8

272


mediante el test de la t de Student, con el fin de determinar el grado de sensibilidad. En

este estudio se obtuvo un valor de tb de 45,67, el cual es superior al valor de tteórico, lo que

indica que la sensibilidad del método propuesto es satisfactoria.

Como puede observarse en la tabla 8.5, la ordenada en el origen, a un nivel de




para el AGB, pudiéndose apreciar su linealidad, como bien indica el coeficiente de la

determinación, r2.

40 80 120 160[AGB] (ng mL-1)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Inte

nsid

ad

de flu

ore

scencia

x 1

0-5

Figura 8.14. Recta de regresión global del AGB ajustada mediante mínimos cuadrados.

Con la finalidad de estudiar con más profundidad las rectas por mínima mediana de

cuadrados y de mínimos cuadrados globales, se calcularon los residuales estandarizados y

la resistencia al diagnóstico para el calibrado global del AGB. Estos residuales se



mediante mínimos cuadrados globales es uniforme, por lo que se puede aceptar que dicha

recta presenta homocedasticidad, lo que implica que la precisión es estadísticamente

semejante para todas las concentraciones. Esto se debe a que no se presentan valores de

residuales estandarizados cuyos valores sean superiores a 2,5 y, por tanto, no existen

puntos que constituyan datos anómalos de la recta de regresión.


273

-4

-2

0

2

4

Re

sid

uale

s e

sta

nd

arizad

os

MÍNIMOS CUADRADOS

-4

-2

0

2

4

Re

sid

uale

s e

sta

ndarizado

s

40 60 80 100 120 140 160[AGB] (ng mL-1)

0

1

2

3

4

Resis

tencia

al dia

gn

óstico



Figura 8.15. Los residuales estandarizados a la recta de regresión por mínimos cuadrados y

mínima mediana de cuadrados de AGB; resistencia al diagnóstico mediante mínima mediana de

cuadrados.

Capítulo 8

274


confianza del 95% se ilustran en la figura 8.16. Como puede observarse, se obtiene una

precisión muy elevada en la recta de calibrado, incluso en los extremos inferior y superior

del intervalo de calibración escogido. Asimismo, puede constatarse que la zona de mayor

precisión (aquélla donde las bandas de dispersión se hacen más estrechas y, por tanto, en

la cual debería utilizarse el calibrado), se corresponde con un nivel de concentración

entorno a 100 ng L-1

.

60 80 100 120 140[AGB] (ng mL-1)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Inte

nsid

ad

de flu

ore

scencia

x 1

0-5

Figura. 8.16. Bandas de dispersión y recta global de calibrado del AGB.


Con el fin de establecer el error que se comete en la estimación de las

concentraciones de AGB se estudió el intervalo de confianza en una serie de 10

disoluciones de 75 ng mL-1

de concentración. Esta serie se preparó en las mismas

condiciones experimentales que los patrones de calibrado y, una vez obtenidos los

espectros de excitación y de emisión fluorescente, se midió su intensidad a λem= 303 nm,

excitando a λex=280 nm. Los valores de intensidad obtenidos y la concentración estimada

para cada una de las disoluciones, así como el promedio, la desviación estándar y el

coeficiente de variación de cada uno de los 10 replicados, se muestran en la tabla 8.6. El

intervalo de confianza del método propuesto se recoge en la tabla 8.7.

Por otro lado, observando los datos contenidos en la tabla 8.7, podemos comprobar

que el intervalo de concentración de los replicados es menor cuando la fuente de error que

se considera es la banda de dispersión de las estimaciones de la recta de calibrado. Esto es

debido a la forma hiperbólica de las bandas de confianza, que es más estrecha en el centro


275

de gravedad de la recta. Por último, la precisión del método se encuentra definida por el

error puro de los replicados con una desviación estándar relativa de un 1,8%.


Replicado

AGB 75 ng L-1

Intensidad de

fluorescencia

Concentración

(ng L-1

)

1 246440 76,7

2 244574 76,1

3 230507 71,7

4 247428 77,0

5 246001 76,6

6 236715 73,7

7 238473 74,2

8 243967 75,9

9 248361 77,3

10 247400 77,0



Tabla 8.7. Intervalos de confianza del AGB

Fuente de

Error

Grados de

libertad

t teórico

(α = 0,05)

Intervalo

(ng mL-1

)

D.E.R.b

y

E.E.R.c

(%)

TCP 75 ng mL-1


Error puro n - 2 = 16 2,26 71,49-79,81 1,8b

B.D.E.R.C.a

n -1 = 9 2,12 71,68-19,81 1,9c

a: Banda de dispersión de las estimaciones de la recta de calibrado.

b : Desviación estándar relativa.

c: Error estándar relativo.

Capítulo 8

276




calibrado, pero en ausencia de AGB. A continuación, se registraron los espectros de

fluorescencia y se midió su intensidad a la longitud de onda correspondiente al máximo de

emisión del fotoproducto del analito. Los valores de intensidad de cada uno de los

replicados medidos a λem= 303 nm se muestran en la tabla 8.8. Los límites de detección se

encuentran en la tabla 8.9.

Tabla 8.8. Blanco analítico de AGB

Replicado Intensidad de fluorescencia a

λem= 303 nm

1 20096,1

2 18432,6

3 18315,3

4 17709,0

5 19264,3

6 19264,3

7 19205,7

8 18902,5

9 18374,0

10 18012,2

Puede comprobarse que el mayor límite de detección se obtiene considerando el

criterio de Clayton, siendo algo menor el obtenido según el criterio de Long Winefordner

y el menor de todos ellos el proporcionado por el criterio de la IUPAC, lo que concuerda

con los tipos de errores que considera cada uno, tal como ha sido descrito en el capítulo 3

de esta tesis.


277

Tabla 8.9. Límites de detección del AGB


-1)

AGB

IUPAC K 3,00 1,7

G. L. Long y J. D.


Clayton Δ(α = β = 0.05, n – 2 = 16) 3,44 11,6

8. DETERMINACIÓN DE AGB EN FRUTAS, HORTALIZAS

Y PRODUCTOS FITOSANITARIOS

El método propuesto fue aplicado para la determinación de AGB en muestras de

ciruela, madroño, mandarina, tomate y el producto fitosanitario Clemencuaje. Este último

fue analizado por dilución directa del mismo, mientras que para poder analizar el AGB en

las frutas y el tomate fue necesario establecer previamente un proceso de extracción que se

describe a continuación.


Para llevar a cabo la determinación de AGB en diferentes frutas y tomate midiendo

la fluorescencia fotoinducida del mismo en las condiciones establecidas, fue necesario

aplicar un proceso de extracción previa para extraer el analito de dichas matrices

vegetales. Dicho proceso fue llevado a cabo utilizando etanol como disolvente de

extracción.

Las muestras vegetales a las que se aplicó el método propuesto fueron: ciruela,

mandarina, madroño y tomate. Se tomaron 10 g triturados de cada una de estas muestras y

se realizó un estudio preliminar para comprobar que en éstas no contenían AGB. A

continuación, se tomó una cantidad semejante de triturado de las diferentes matrices y se

les adicionó AGB de manera que su concentración en la disolución final de extracción

fuese de 120 ng mL-1

. A cada una de ellas se añadieron 25 mL de etanol, se homogeneizó

la mezcla y se agitó durante 10 min en ultrasonidos con el fin de extraer cuantitativamente

la fitohormona que se pretende analizar en este trabajo. Seguidamente, se filtró con un

Capítulo 8

278

filtro para análisis cuantitativo sin cenizas ALBET DP (125) y el filtrado obtenido fue

analizado en las condiciones propuestas.

8.2. Determinación de la concentración de AGB en las muestras

Las muestras vegetales en las que vamos a llevar a cabo la determinación de AGB

son las mismas que aquellas en las que se realizó el análisis de 2,4-DP descrito en el

capítulo 6, siendo prácticamente iguales las condiciones químicas, en las que sólo varía

ligeramente la concentración de tampón de pH 5 utilizada. Por ello, al realizar el estudio

de fluorescencia que presentan las diferentes matrices, antes y después de ser irradiadas las

correspondientes disoluciones resultantes del proceso de extracción, dieron resultados

semejantes a los descritos en el capítulo 6.

Se comprobó que los extractos de tomate y ciruela presentaban una fluorescencia

bastante intensa sin ser sometidos a ningún proceso de irradiación, mientras que el de

madroño y mandarina no presentaban fluorescencia significativa en las condiciones de

medida establecidas para llevar a cabo la determinación de AGB. Cuando estas matrices

fueron sometidas al proceso de irradiación (6 min) en las condiciones en las cuales el

analito presenta la máxima intensidad de fluorescencia, las matrices de ciruela y tomate

dejan de presentar fluorescencia al igual que las de mandarina y madroño.

A partir de los extractos etanólicos de cada una de las muestras a las que se había

adicionado AGB, se prepararon las muestras de medida conteniendo 5% de etanol, 50 %

de metanol y 0,04 mol L-1

de disolución reguladora de pH 5. La cantidad de extracto

añadida a cada muestra fue la necesaria para que en la disolución de medida la

concentración de AGB fuera de 120 ng mL-1

.

Las muestras se irradiaron durante 6 min, tras los cuales se registraron los

correspondientes espectros de emisión, empleando λex= 280 nm y las condiciones

instrumentales anteriormente optimizadas. A continuación se midieron las intensidades de

fluorescencia a λem= 303 nm. Se comprobó que cuando la muestra que es irradiada es la

que procede del extracto en la que se encuentra tanto la matriz como el analito, la señal

obtenida se debe exclusivamente a la señal procedente del analito y no a la matriz, por lo

que puede ser realizada la determinación directa del AGB en cada una de las muestras

vegetales estudiadas según el método de irradiación propuesto.

El AGB también fue determinado en el producto fitosanitario Clemencuaje 1,6%.

Para ello, se preparó una disolución de 160 ppm de AGB en etanol a partir del producto


279

fitosanitario. De esta disolución se tomó una alícuota y se prepararon las muestras en las

condiciones químicas y de irradiación optimizadas, realizándose las medidas en el máximo

de emisión del AGB.

Se realizaron tres replicados para cada una de las muestras. Para todas ellos se

registró el espectro de fluorescencia excitando a λex = 280 nm, y, a continuación, se

midieron los valores de intensidad a em = 303 nm. Los datos obtenidos se detallan en la

tabla 8.10. Como puede observarse en esta última tabla, los resultados obtenidos mediante

la aplicación del método propuesto permite la determinación del analito AGB en muestras

vegetales, con unos porcentajes de recuperación que concuerdan con las concentraciones

añadidas a las mismas

Tabla 8.10. Estudio del porcentaje de recuperación de AGB en frutas, hortalizas y

productos fitosanitarios mediante PIF.

Muestra Cantidad

añadida (μg g-1

)

Cantidad

encontrada

(μg g-1

)

Porcentaje de

recuperación

,%)( DEx

Ciruela 6,0 5,8 96,3 ± 0,7

Tomate 6,0 5,7 95,3 ± 1,2

Mandarina 6,0 5,9 99,2 ± 0,4

Madroño 6,0 5,9 98,5 ± 1,3

Clemencuaje 120,0 ng mL-1

130,1 ng mL-1

108,4 ± 0,3

CAPÍTULO 9

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO NAFTILACÉTICO Y

TIABENDAZOL EN MATRICES VEGETALES MEDIANTE

FLUORESCENCIA SINCRÓNICA LINEAL

Determinación de NAA y TBZ mediante LSF

283

1. OBJETIVO

El objetivo del presente capítulo consiste en la determinación de una mezcla de

ácido naftilacético (NAA), perteneciente al grupo de las auxinas y, tiabendazol (TBZ), un

derivado bencimidazolico, mediante fluorescencia sincrónica lineal (LSF) (figura 9.1).

Figura 9.1. Estructura química del ácido naftilacético (a) y del tiabendazol (b).

Esta técnica, relativamente reciente, permite realizar determinaciones simultáneas

de mezclas de diversos fluoroforos, incluso cuando presentan espectros de fluorescencia

solapados, sin necesidad de pasos previos de separación o preparación de la muestra.

A lo largo del capítulo se estudiará la influencia de las variables que afectan a la

señal fluorescente de cada analito y, dichas variables, serán optimizadas de forma

secuencial con el fin de obtener la máxima sensibilidad en la determinación de cada uno

de ellos.

2. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DE LOS ANALITOS

Con el fin de obtener una mejor información espectral, se registró el espectro

tridimensional de fluorescencia de ambos analitos. En la figura 9.2 se representa el

espectro de fluorescencia total del NAA, en proyección isométrica y en forma de curvas de

nivel. Como se puede comprobar en dicha figura, el NAA presenta un dos máximos de

excitación a longitudes de onda de 286 y 295 nm y dos máximos de emisión a longitudes

de onda de 325 y 336 nm.

a) b)

Capítulo 9

284

Figura 9.2. Espectro tridimensional de fluorescencia total del NAA (0,1 mg L

-1 ) en proyección

isométrica y representado mediante curvas de nivel.


285

En la figura 9.3 se presenta el espectro de fluorescencia total del TBZ, en donde

puede apreciarse un máximo de excitación a longitud de onda de 304 nm y un máximo de

emisión a longitud de onda de 350 nm.

Figura 9.3. Espectro tridimensional de fluorescencia total del TBZ (0,1 mg L

-1) en proyección

isométrica y representado mediante curvas de nivel.

Capítulo 9

286

En la siguiente figura se muestran los espectros de fluorescencia total del NAA y

del TBZ superpuestos. Como puede observarse, el solapamiento existente entre los dos

espectros imposibilita la determinación directa por fluorescencia convencional de ambos

analitos.

Figura 9.4. Espectros de fluorescencia total de NAA (azul) y TBZ (rosa).


Para llevar a cabo el estudio de estabilidad se prepararon dos disoluciones madre,

una para cada analito en estudio, conteniendo una concentración de 100,0 mg L-1

. Ambas

disoluciones fueron preparadas en etanol, disolvente en el que los dos compuestos son

solubles mientras que en agua son insolubles. Dichas disoluciones fueron conservadas

protegidas de la luz en matraces de color topacio y almacenadas a 4ºC.

Para comprobar la estabilidad de las disoluciones madre se prepararon diariamente

soluciones individuales de 0,1 mg L-1

de cada analito. La medida diaria de la intensidad de


287

fluorescencia de cada compuesto, en las respectivas longitudes de onda de sus máximos,

puso de manifiesto que dichas disoluciones eran estables durante, al menos, un mes.

También se estudió la estabilidad de las diluciones de trabajo con muestras

individuales que contenían 0,1 mg L-1

y la medida de la intensidad de fluorescencia de

estas disoluciones indicaba que éstas eran estables durante, al menos, dos horas.


4.1. Optimización de las variables químicas

4.1.1. Optimización del porcentaje de etanol

El porcentaje de disolvente puede afectar a la intensidad de fluorescencia, por ello,

la primera variable a optimizar fue el porcentaje de etanol en las diluciones de trabajo.

Para la optimización del contenido en etanol en cada una de las muestras, lo que se

hizo fue preparar diluciones de cada uno de los analitos a una concentración de 0,1 mg L-1

en las que se fue variando el porcentaje de etanol de las mismas entre el 5% y el 50%

(figura 9.5).

Figura 9.5. Influencia del contenido de etanol en la intensidad de fluorescencia.

Capítulo 9

288

Teniendo en cuenta datos bibliográficos en los que se indica que el TBZ presenta

una mayor fluorescencia a pH ácido, se optó por introducir en este estudio un pH 3 en sus

disoluciones, mientras que para el NAA se introdujo un pH de 7.

De los resultados experimentales obtenidos observamos que tanto para el NAA

como para el TBZ la intensidad de fluorescencia es máxima para un valor del porcentaje

de etanol del 30%, valor a partir del cual la intensidad disminuye. Así pues, el valor

escogido como óptimo fue del 30% de etanol.

4.1.2. Optimización del pH y de la concentración de la solución reguladora

Para el estudio de la influencia del pH en la señal de fluorescencia, se prepararon

disoluciones de concentración 0,1 mg L-1

para cada uno de los analitos, manteniendo

constante el porcentaje de etanol en un 30%, y se fue variando el pH de las mismas en el

intervalo comprendido entre 2 y 12 mediante la adición de cantidades variables de H2SO4

y NaOH (figura 9.6).

La emisión fluorescente para cada analito fue medida en las longitudes de onda de

sus respectivos máximos para cada una de las disoluciones a los diferentes valores de pH

bajo estudio.

Experimentalmente se observó que a valores de pH inferiores a 6 el NAA presenta

un ligero descenso en la intensidad de la señal fluorescente, mientras que son a esos

valores a los cuales el TBZ presenta una mayor señal. A valores de pH neutros y básicos la

señal para el NAA es máxima manteniéndose prácticamente constante, sin embargo, para

el TBZ la señal se fluorescencia se hace mínima. Este hecho nos lleva a seleccionar un

valor de pH óptimo para ambos analitos de 4,74, valor que coincide con el pKa del tampón

citrato, el cual, se comprobó que era el más efectivo para la determinación que nos ocupa.

Una vez elegido el tampón más adecuado para la determinación se procedió a

optimizar la concentración del mismo en las disoluciones de trabajo. Para ello, se

prepararon disoluciones de concentración 0,1 mg L-1

para el TBZ y 0.05 mg L-1

para el

NAA, manteniendo un 30% de etanol en la disolución de trabajo y un valor de pH de 4,74.

A estas disoluciones se les fue variando la concentración de tampón entre los valores de

0,05 y 0,4 mol L-1

(figura 9.6).


289

Figura 9.6. Influencia del pH y de la concentración del tampón en la intensidad de fluorescencia.

Observando los resultados obtenidos se pudo comprobar que no hay una marcada

variación en la intensidad fluorescente con la concentración del tampón, mostrando una

ligera influencia para el TBZ. Se eligió como valor óptimo de la concentración de tampón

citrato un valor de 0,1 mol L-1

. Con dicha concentración de tampón se garantiza que la

variación de pH sea mínima y, por lo tanto, no se produzcan variaciones importantes en

los valores de intensidad del TBZ, que es el compuesto cuya intensidad de fluorescencia se

ve más fuertemente afectada por la variación del pH en la disolución de trabajo.

4.1.3. Optimización de la temperatura

Para optimizar la temperatura de trabajo se realizó un estudio de la variación de la

intensidad fluorescente con un aumento progresivo de la temperatura. Como es bien

sabido, el incremento de la temperatura reduce la eficacia cuántica de la fluorescencia en

beneficio de otros procesos no radiantes como la conversión interna. El estudio se realizó

empleando las concentraciones anteriormente citadas, es decir, 0,1 mg L-1

para el TBZ y

0.05 mg L-1

para el NAA, así como los parámetros previamente optimizados, y variando

la temperatura en el intervalo entre 15 y 45 ºC (figura 9.7).

Capítulo 9

290

Figura 9.7. Influencia de la temperatura en la intensidad de fluorescencia del NAA y del TBZ.

Experimentalmente se comprueba que la intensidad fluorescente decrece al

aumentar la temperatura siendo, por lo tanto, el valor escogido como óptimo el

correspondiente a 20ºC.


Para la optimización de las variables instrumentales que afectan al desarrollo de la

señal fluorescente se siguió, al igual que en la optimización de las variables químicas, un

procedimiento secuencial, variando una de ellas y manteniendo el resto constantes.

A fin de realizar este estudio, se prepararon disoluciones individuales de cada uno

de los analitos, siendo las concentraciones de éstos 0,1 mg L-1

de TBZ y 0.05 mg L-1

de

NAA. Dichas disoluciones estaban preparadas en las condiciones químicas hasta ahora

optimizadas y que se encuentran recogidas en la tabla 9.1.

Este proceso de optimización se realizó valorando tanto la intensidad de

fluorescencia obtenida como la relación señal-ruido, de manera que lo que se perseguía era

obtener señales de fluorescencia con poco ruido y con valores altos en la intensidad.


291

Tabla 9.1. Variables químicas optimizadas


Etanol 30 %

pH 4,74

[Tampón citrato] 0,1 mol L-1

Temperatura 20 ºC

Para calcular el ruido instrumental, a la señal espectral de emisión obtenida

experimentalmente para cada analito se le restó la misma señal suavizada, concretamente

con un factor de 21 puntos de suavizado, y se calculó la desviación estándar de dicha resta

de un intervalo constante de línea base de 30 nm de longitud.



monocromadores. Una apertura grande de las rendijas nos va a proporcionar una mayor

señal pero también va a aumentar el ruido, de tal manera que será necesario establecer un

valor de compromiso con el que obtener, por un lado, un buen valor de intensidad y, una

buena relación señal/ruido. En la figura 9.8 se puede observar cómo varía la intensidad

fluorescente, así como el ruido y la relación señal/ruido con la apertura de las rendijas para

el NAA y TBZ.

En este estudio, se seleccionó 4 nm como valor óptimo para ambas rendijas dado

que la relación señal/ruido es lo suficientemente buena y, además, eliminamos el riesgo de

saturación de la señal.

Capítulo 9

292


ambos de la señal fluorescente para el NAA y el TBZ.

4.2.2. Optimización del tiempo de integración (int time)

La optimización del tiempo de integración se llevó a cabo entre 0,01 y 0,1 s para

cada uno de los analitos.

Los resultados experimentales obtenidos para el NAA y TBZ se muestran en las

figuras 9.9. Como puede observarse, para el NAA al aumentar el tiempo de integración la

señal no se ve prácticamente influenciada, sin embargo, para el caso del TBZ la señal de

fluorescencia disminuye al ir aumentando el tiempo de integración.

El valor de tiempo de integración escogido como óptimo fue 0,1 s porque, a pesar

de no ser el óptimo en cuanto a la relación señal/ruido para el NAA, si se encuentra

próximo a él para el TBZ y, además, con este tiempo de integración se obtenían tiempos

de registro menores.


293


de la señal fluorescente para el NAA y el TBZ.

5. INFLUENCIA INDIVIDUAL DE LA CONCENTRACIÓN DE NAA

Y TBZ

Establecidas las condiciones óptimas, tanto químicas como instrumentales, para la

determinación de NAA y TBZ, se procedió a estudiar la relación entre la concentración de

cada uno de los analitos y la intensidad de fluorescencia medida en sus respectivos

máximos de emisión.

En primer lugar, se abordó el estudio para el NAA. La relación entre la

concentración de NAA y la emisión fluorescente se estudió preparando diferentes

disoluciones en las que se varió la concentración de analito entre 10 y 500 ng mL-1

. Para

cada nivel de concentración se registró el espectro de emisión fluorescente a ex = 286 nm

y se midió la intensidad fluorescente a em = 325 nm, que se corresponden con el máximo

de mayor intensidad.

En la figura 9.10 se encuentran recogidos los resultados experimentales obtenidos

al representar la intensidad de fluorescencia frente a la concentración de NAA. Como

puede observarse en dicha figura, el comportamiento es lineal entre 10 y 300 ng mL-1

; a

Capítulo 9

294

partir de 400 ng mL-1

se producía la saturación de la señal por lo que no se pudo concluir

nada respecto a la relación tratada.

De la misma manera que en el caso anterior, se estudió la relación entre la

concentración de TBZ y la emisión fluorescente para distintas concentraciones de este

analito. Para ello, se prepararon diferentes disoluciones en las que se varió la

concentración de TBZ entre 10 y 300 ng mL-1

. Para cada nivel de concentración se

registró el espectro de fluorescencia a ex = 304 nm y se midió la intensidad fluorescente a

em = 350 nm, que es la longitud de onda de su máximo de emisión. En la figura 9.10 se

encuentran recogidos los resultados experimentales obtenidos en este estudio donde puede

observarse que, el comportamiento es lineal entre 10 y 200 ng mL-1

de TBZ,

concentración a partir de la cual se pierde el comportamiento lineal.

Figura 9.10. Relación entre la concentración de NAA y TBZ con la intensidad de emisión

fluorescente.

6. RESOLUCIÓN DE LA MEZCLA DE NAA Y NOA

6.1. Selección de la trayectoria sincrónica

Como pudo comprobarse en las curvas de nivel de los espectros de fluorescencia

total de NAA y TBZ representados en la figura 9.2, no existen ni espectros de excitación


295

ni de emisión donde las bandas de ambos analitos estén separadas para resolver esta

mezcla mediante fluorescencia convencional debido al gran solapamiento que presentan.

Por ello, para continuar con la determinación debemos determinar cuál es la

trayectoria óptima para la determinación conjunta de los analitos. Como es lógico la

trayectoria más adecuada será aquella que pase a través de los máximos de intensidad de

los compuestos a determinar. Para dicha selección es necesario estudiar de una forma

detallada el espectro de fluorescencia total de los analitos superpuestos. Se procedió, por

tanto, a estudiar la aplicación de algunas de las técnicas sincrónicas existentes para evitar

dicho solapamiento.

Mediante el uso del programa FTOTAL se trazaron distintas trayectorias con la

finalidad de obtener un espectro sincrónico adecuado para diferenciar los dos analitos,

llegando a la conclusión de que es posible la determinación conjunta de ambos analitos

utilizando un solo corte con un ángulo de 45º en el espectro total, es decir, aplicando la

fluorescencia sincrónica lineal (LSF). Dicha trayectoria junto con el espectro de

fluorescencia total de cada uno de los analitos se encuentra representada en forma de

curvas de nivel en la figura 9.11.

Se obtuvieron los espectros bidimensionales siguiendo la trayectoria sincrónica

seleccionada, los cuales fueron derivados empleando el algoritmo de Savitzky-Golay,

puesto que será en ellos donde se realizará la determinación utilizando la técnica del punto

de corte a fin de poder cuantificar cada analito sin interferencias entre ellos. Dichos

espectros sincrónicos derivados están representados en la figura 9.12.

En dicha figura también vienen representadas las longitudes de onda a las cuales

serán determinados cada uno de los analitos. De esta manera, el NAA será determinado a

una longitud de onda de 304 nm, puesto que a esa longitud de onda la señal del TBZ se

hace cero tras aplicar la primera derivada, y el TBZ será determinado a una longitud de

onda de 286 nm ya que es el valor al cual la señal derivada del NAA se anula.

Una vez seleccionada la trayectoria y localizadas las longitudes de onda óptimas

para la determinación se realizaron los correspondientes calibrados de los analitos.

Capítulo 9

296

Figura 9.11. Representación gráfica de la trayectoria empleada (negro) sobre los espectros de

fluorescencia total de NAA (azul) y TBZ (rosa).

240 280 320 360 400

(nm)

-80000

-40000

0

40000

80000

286 nm

304 nm

Pri

me

ra d

eri

va

da

Figura 9.12. Primera derivada de los espectros LSF del NAA (rojo) y del TBZ (zul).


297


En el siguiente estudio se pretende evaluar la linealidad entre las concentraciones

de los analitos en estudio y sus correspondientes señales de primera derivada medidas a las

longitudes de onda anteriormente seleccionadas. Además, se pretende demostrar la

independencia de las señales derivadas de cada componente de la presencia del otro, y,

consecuentemente, evaluar que la aplicación de la técnica de “zero-crossing” a la primera

derivada del espectro LSF es adecuada para resolver la mezcla de NAA y TBZ.

Para llevar a cabo este estudio, se realizaron los calibrados para cada analito en las

condiciones anteriormente optimizadas y se realizaron sus espectros tridimensionales. Para

obtener los tridimensionales se hicieron 61 espectros de excitación que cubrían el intervalo

de longitudes de onda entre 200 y 488 nm, en cada espectro de excitación se incrementaba

la longitud de onda de emisión en 4,8 nm cubriendo el intervalo entre 260 y 548 nm. Una

vez obtenidos los tridimensionales, se trataron con el programa FTOTAL donde se les aplicó

la trayectoria sincrónica. A continuación, los espectros LSF obtenidos se suavizaron con

un factor de suavizado de 21 y se obtuvo la primera derivada de cada uno de ellos.

El intervalo de concentración establecido para cada uno de los analitos fue entre 10

y 100 ng mL-1

para el NAA y entre 30 y 120 ng mL-1

para el TBZ. Los valores de

concentraciones seleccionados se encuentran dentro de los intervalos de concentración en

los cuales cada analito presenta un comportamiento lineal.

Para llevar a cabo este estudio, se prepararon 3 calibrados para el NAA y otros 3

para el TBZ, en las condiciones químicas previamente establecidas. De los calibrados del

NAA, el primero de ellos se realizó en ausencia del TBZ y los dos restantes, en presencia

de 30 y 80 ng mL-1

de TBZ. Operando de manera similar para el TBZ, uno de los

calibrados se preparó en ausencia de NAA y los otros dos en presencia de cantidades

constantes de éste, de 20 y 80 ng mL-1

. La tabla 9.2 resume los contenidos de estos

calibrados.


capacidad de la siguiente manera: se tomaron alícuotas de NAA y TBZ de tal manera que

su concentración en dichos patrones estuviera comprendida entre 10 y 100 ng mL-1

para

los calibrados de NAA y entre 30 y 120 ng mL-1

para los calibrados de TBZ;

posteriormente, cada muestra fue adecuada a las condiciones químicas seleccionadas, esto

Capítulo 9

298

es, 30% de etanol y 0,1 mol L-1

de tampón citrato de pH 4,74 y, finalmente, fue añadida

agua suficiente hasta enrasar a un volumen final de 10 mL.

Tabla 9.2. Calibrados realizados de NAA y TBZ

Calibrados de NAA (10– 100 ng mL-1

)

NAA (a) NAA (b) NAA (c)

Ausencia de TBZ 30 ng mL-1

TBZ 80 ng mL-1

TBZ

Calibrados de TBZ (30 – 120 ng mL-1

)

TBZ (a) TBZ (b) TBZ (c)


NAA 80 ng mL-1

NAA


de los espectros de fluorescencia total en las condiciones instrumentales previamente

optimizadas. Posteriormente, se obtuvieron los espectros sincrónicos y sus

correspondientes derivadas para los calibrados del NAA, donde se midió su señal a =

304 nm, así como los espectros sincrónicos y sus correspondientes derivadas para los

calibrados del TBZ, midiendo su señal derivada a = 286 nm. Los espectros sincrónicos

derivados correspondientes a los tres calibrados propuestos para la determinación de NAA

se muestran en la figura 9.13 y los propuestos para la determinación de TBZ se presentan

en la figura 9.14.

Los valores de la derivada medidos a = 304 nm para cada una de las muestras de

los calibrados del NAA y los parámetros de regresión de estos calibrados se recogen en las

tablas 9.3 y 9.4, respectivamente. Igualmente, los valores de la derivada medidos a =

286 nm en cada uno de los calibrados del TBZ y los parámetros de regresión de estos

calibrados se recogen en las tablas 9.5 y 9.6, respectivamente. Por otro lado, las

representaciones gráficas de los mismos, tanto del NAA como del TBZ se muestran en la

figura 9.15.


299

Figura 9.13. Primera derivada de los espectros LSF del NAA a diferentes concentraciones (10-

100 ng mL-1

). a) En ausencia de TBZ. b) En presencia de 30 ng mL-1

de TBZ. c) En presencia de

80 ng mL-1

de TBZ.

Capítulo 9

300

Figura 9.14. Primera derivada de los espectros LSF del TBZ a diferentes concentraciones (30-

120 ng mL-1

). a) En ausencia de TBZ. b) En presencia de 20 ng mL-1

de NAA. c) En presencia de

80 ng mL-1

de NAA.


301

Tabla 9.3. Rectas de calibrado de NAA: señales de segunda derivada a λ= 304 nm

[NAA] (ng mL-1

) Ausencia de TBZ 100 ng mL-1

TBZ 200 ng mL-1

TBZ

10 3524,0 3355,0 3096,0

30 10620 11110 10710

50 14870 14870 14290

70 20100 20350 20100

80 22625 23125 22960

100 27150 27900 27820


Parámetro Ausencia de TBZ 30 ng mL-1

TBZ 80 ng mL-1

TBZ

Mínimos cuadrados

a 1,002 · 103 1,752 · 10

3 1,299 · 10

3

b 2,576 · 102 2,653 · 10

2 2,682 · 10

2

sxy 8,0 · 102 7,4 · 10

2 8,5 · 10

2

sa 6,9 · 102 6,4 · 10

2 7,4 · 10

2

sb 1,1 · 101 1,0 · 10

1 1,1 · 10

1

r2

0,994 0,992 0,993

ta = 0a /sa 2,94 2,25 1,75

tb = 0b /sb 25,85 21,89 23,21

tteórico (α=0,05; n-2=16) = 2,77

Capítulo 9

302

Tabla 9.5. Rectas de calibrado de TBZ: señales de primera derivada a λ= 488.5 nm

[TBZ] (ng mL-1

) Ausencia de NAA 30 ng mL

-1 NAA 80 ng mL

-1 NAA

30 15530 14590 14590

50 25690 27090 26310

70 36110 32940 33190

90 41740 40100 39500

100 47370 45920 45920

120 53550 52570 53210

Tabla 9.6. Parámetros de la regresión lineal: y = a + bx

Parámetro


NAA 80 ng mL-1

NAA

Mínimos cuadrados

a 2,622 · 103 4,204 · 10

3 3,584 · 10

3

b 4,527 · 102 4,087 · 10

2 4,157 · 10

2

sxy 1,3 · 103 1,7 · 10

3 1,5 · 10

3

sa 1,5 · 103 1,9 · 10

3 1,7 · 10

3

sb 1,8 · 101 2,3 · 10

1 2,0 · 10

1

r2

0,992 0,985 0,988

ta = 0a /sa 1,77 2,24 2,15

tb = 0b /sb 25,18 17,93 20,54

tteórico (α=0,05; n-2=16) = 2,77


303

0 40 80 120[NAA] (ng mL-1)

0 40 80 120 160[TBZ] (ng mL-1)

Prim

era

deriv

ada x

10

-4

0

1

2

3

Prim

era

derivada x

10

-4

0

2

4

6

0

Figura 9.15. Datos experimentales ajustados mediante mínimos cuadrados para el NAA y el TBZ,

calibrado 1 (azul), calibrado 2 (rojo) y calibrado 3 (verde).

Como se puede observar, tanto en los calibrados de NAA como de TBZ, los

coeficientes de la determinación fueron próximos a la unidad. En cuanto a las ordenadas

en el origen de estas rectas, resultaron no significativamente distintas de cero, excepto

para el calibrado de NAA en ausencia de TBZ, ya que en este caso el valor de ta

experimental fue superior al valor de tteórico.

Con objeto de estudiar la independencia de las señales analíticas del NAA y del

TBZ, es decir, que la señal analítica del NAA es nula a la longitud de onda de medida

seleccionada para la determinación de TBZ y viceversa, se realizaron sendos análisis de

varianza de los calibrados propuestos (tablas 9.7 y 9.8).

En ambos casos resultaron valores experimentales de F1 y F2 menores que los

tabulados, por lo que se aceptó una regresión mediante mínimos cuadrados globales como

calibrados de NAA y TBZ.

Capítulo 9

304

Tabla 9.7. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de NAA


cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática



6 12 6,369 ·10

5



5 2 1,64 · 10

5



5 4 1,699 · 10

5



6 16 5,202 · 10

5


F1 0,27 3,26

F2 0,26 3,84

Tabla 9.8. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de TBZ


cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática



7 12 2,31 · 10

6

Diferencias entre las pendientes


6 2 3,102 · 10

6



7 4 4,932 · 10

6



7 16 2,966 · 10

6


F1 2,14 3,26

F2 1,34 3,89


305

Los parámetros estadísticos más importantes obtenidos mediante regresión por

mínima mediana de cuadrados y mínimos cuadrados de la calibración global, figuran en

las tablas 9.9 y 9.10 para el NAA y TBZ, respectivamente.


mediante el test de la t de Student, con el fin de determinar el grado de sensibilidad. Se

obtuvo un valor de 38,28 y 31,85 para NAA y TBZ, respectivamente, los cuales resultan

ser superiores al valor de tteórico, lo que indica que la sensibilidad del método propuesto es

satisfactoria. Las pendientes de las rectas de regresión mediante mínima mediana de

cuadrados y mínimos cuadrados resultaron muy similares, lo que indica que, si existen

puntos anómalos en el calibrado, éstos ejercen un efecto poco significativo, pues no

provocan un giro en la recta de regresión de mínimos cuadrados.

Tabla 9.9. Recta de calibrado global del NAA


a 4,892·103

b 2,218·102

Escala estimada 9,5·102

r2

0,994


a 4,777 · 103

b 2,143 · 102

syx 7,2 ·102

sa 3,6 · 102

sb 5,6

r2

0,988

ta = 0a /sa 1,33

tb = 0b /sb 38,28

tteórico (α=0.05, n-2=16) = 2,77

Capítulo 9

306

Tabla 9.10. Recta de calibrado global del TBZ


a 7,561 ·103

b 3,751 ·102

Escala estimada 1,5 ·103

r2

0,993


a 3,47 ·103

b 4,257 ·102

syx 1,7 ·103

sa 1,1 ·103

sb 1,3 ·101

r2

0,984

ta = 0a /sa 3,14

tb = 0b /sb 31,85

tteórico (α=0.05, n-2=16) = 2,77

Como puede observarse en las tablas anteriores, las ordenadas en el origen, a un

nivel de confianza del 95 %, no son significativamente distintas de cero para el NAA,

puesto que texperimental es inferior a tteórico, sin embargo para el TBZ el valor de texperimental

resultó superior al valor de tteórico. En la figura 9.16 se ilustran las rectas de regresión por

mínimos cuadrados globales, para el NAA y TBZ, respectivamente.

Con objeto de estudiar con más profundidad las rectas de mínimos cuadrados

globales y mínima mediana de cuadrados globales, se calcularon los residuales

estandarizados y la resistencia al diagnóstico para el NAA y TBZ. Estos residuales se

muestran en las figuras (9.17, 9.18 y 9.19).


307

Figura 9.16. Datos experimentales ajustados mediante mínimos cuadrados globales para el NAA y

TBZ.

Figura 9.17. Los residuales estandarizados a la recta de regresión de NAA por mínimos


Capítulo 9

308

Figura 9.18. Los residuales estandarizados a la recta de regresión del TBZ por mínimos


Figura 9.19. Las resistencias al diagnóstico mediante mínima mediana de cuadrados para

los calibrados de NAA y TBZ.

Como se puede observar, en ambos casos, la distribución de los residuales a la

recta de regresión mediante mínimos cuadrados globales es uniforme, por lo que se puede

aceptar que dichas rectas presentas homocedasticidad, lo que implica que la precisión es

estadísticamente semejante para todas las concentraciones.


309

En cuanto al análisis de residuales cabe destacar que, en el caso del TBZ, se

presenta un residual estandarizado cuyo valor es superior a 2,5 y, por tanto, constituye un

dato anómalos de la recta de regresión. No obstante, este dato no provoca un giro

significativo en la recta de calibrado global. Sin embargo, para el caso del NAA, no se

registró ningún dato anómalo de la recta de calibrado puesto que no existe ningún residual

cuyo valor sea superior a 2,5.

Las rectas de calibrado global y las bandas de dispersión de dichas rectas a un nivel

de confianza del 95% se ilustran en la figura 9.20 para el NAA y el TBZ.

Figura 9.20. Bandas de dispersión y recta global de calibrado del NAA y el TBZ.

Como puede observarse, se obtiene una precisión muy elevada en la recta de

calibrado, incluso en los extremos inferior y superior del intervalo de calibración escogido.



se corresponde con un nivel de concentración entorno a 50 y 80 ng L-1

de NAA y TBZ,

respectivamente. Dichos valores numéricos coinciden, lógicamente, con el centro de

gravedad de cada calibrado, si bien, la recta de calibrado global puede tomar cualquier

valor dentro de sus bandas de dispersión.

Capítulo 9

310


Para poder determinar el error que se comete en la estimación de las

concentraciones de los dos analitos en estudio, se evaluó el intervalo de confianza en una

serie de 10 disoluciones que contenían NAA y TBZ, siendo sus concentraciones 60 y 80

ng mL-1

, respectivamente. Esta serie se preparó en las mismas condiciones experimentales

que los patrones de calibrado y, una vez obtenidos los espectros tridimensionales de

fluorescencia, se les aplicó la trayectoria sincrónica lineal, se les derivó y se midieron sus

valores de primera derivada a λex = 286 nm y λex = 304 nm, para determinar la

concentración de TBZ y NAA, respectivamente. Los valores de la primera derivada de los

espectros sincrónicos medidos a las longitudes de onda antes indicadas, así como la

concentración estimada para cada una de las disoluciones, usando las rectas de los

calibrados globales se muestran en la tabla 9.11.


Replicado

NAA (60 ng L-1

) TBZ (80 ng L-1

)

Primera derivada

(λ = 304 nm)

[NAA]

(ng L-1

)

Primera derivada

(λ = 286 nm)

[TBZ]

(ng L-1

)

1 17340 56,12 37600 80,08

2 17750 57,97 37890 80,86

3 16480 52,24 37700 80,35

4 16940 54,31 37940 80,99

5 17290 55,89 37780 80,56

6 17470 56,70 37410 79,58

7 18160 59,81 37300 79,28

8 17400 56,39 37460 79,71

9 18270 60,31 36650 77,55

10 16670 53,09 36390 76,86


311

Por otro lado, en la tabla 9.12 se muestran los promedios, los intervalos de

confianza de la estimación, la desviación estándar y el error estándar de la banda de

dispersión de las de las estimaciones de la recta de calibrado con 10 replicados.

Tabla 9.12. Intervalos de confianza del NAA y el TBZ

Fuente de

Error

Grados de

libertad

t teórico

(α = 0,05)

Intervalo

(ng mL-1

)

D.E.R.b y

E.E.R.c

(%)

NAA 60 ng mL-1


Error puro n -1 = 9 2,26 53,75-63,84 2,4b

B.D.E.R.C.a

n - 2 = 16 2,12 52,64-64,95 2,7c

TBZ 80 ng mL-1


Error puro n -1 = 9 2,26 73,66-85,81 2,9b

B.D.E.R.C.a

n - 2 = 16 2,12 76,99-82,48 1,2c



c: Error estándar relativo

En ambos casos se obtuvo una precisión aceptable, siendo la desviación estándar

relativa inferior al 3 %.


Se preparó una serie de 10 replicados de un blanco analítico en las mismas

condiciones experimentales que los patrones de calibrado, pero en ausencia de NAA y

TBZ. Se registraron los espectros tridimensionales de fluorescencia, se les aplicó la

trayectoria sincrónica lineal y se derivaron los espectros LSF obtenidos. Para la señal del

blanco fue medida su primera derivada a la longitud de onda ex = 286 nm, que es donde

se determina el TBZ, y, por otro lado, fue medida a ex = 304 nm, en el espectro

sincrónico derivado de primer orden, que es donde se determina el NAA. Estos valores

quedan recogidos en la tabla 9.13 y, los límites de detección encontrados para el NAA y el

TBZ se muestran en la tabla 9.14.

Capítulo 9

312

Tabla 9.13. Blanco analítico de NAA y TBZ

Replicado Primera derivada

(λ = 304 nm)

Primera derivada

(λ = 286 nm)

1 -424,8 -956,2

2 -93,9 -966,7

3 -500,3 -932,0

4 -531,5 -1006,0

5 -460,6 -977,8

6 -436,1 -928,7

7 -467,8 -979,0

8 -412,4 -993,3

9 -660,9 -973,2

10 -440,4 -958,2

Tabla 9.14. Límites de detección del NAA y del TBZ


-1)

NAA TBZ

IUPAC K 3,00 1,99 0,17

G. L. Long y J. D.

Winefordner K 3,00 5,65 7,79

Clayton Δ(α = β = 0.05, n – 2 = 16) = 3,44 8,84 12,0


cuando se emplea el criterio de Clayton, esto es debido, a que el factor de seguridad es

superior ya que tiene en cuenta tanto los errores α como los errores β. El criterio de Long y

Winefordner sólo tiene en cuenta los errores de tipo β, por tanto el factor de seguridad es

superior al del criterio de la IUPAC e inferior al de Clayton.


313

7. DETERMINACIÓN DE NAA Y TBZ EN CÍTRICOS Y MADROÑO

El método propuesto fue aplicado para la resolución de una mezcla de NAA y TBZ

en cítricos y madroño. Para aplicar dicho método fue necesario establecer un proceso de

extracción previo para poder obtener los analitos libres del mayor número de

interferencias procedentes de cada una de las matrices.


En primer lugar, se tomaron 10 g triturados de cada una de las frutas a analizar y,

considerando los estudios preliminares, en los que se descartó la presencia de los analitos

bajo estudio en las muestras analizadas, a cada muestra triturada se le adicionó una

cantidad de NAA y de TBZ de manera que nos permitiera obtener en la disolución final

una concentración determinada dentro de sus respectivas calibraciones. A continuación, a

cada matriz se añadieron 25 mL de etanol, se homogeneizó la mezcla y se agitó durante 10

min en ultrasonidos con el fin de extraer cuantitativamente los compuestos que se

pretendían analizar. Seguidamente, se filtraron los extractos etanólicos con un filtro para

análisis cuantitativo sin ALBET DP (125) y se procedió al análisis cuantitativo de los

mismos.

7.2. Determinación de la concentración problema de NAA y TBZ

Antes de comenzar con la determinación de la mezcla de NAA y TBZ, fue

necesario hacer un estudio de la fluorescencia que procedía de cada una de las matrices de

frutas en las que se iba a llevar a cabo la determinación propuesta. Para ello, se prepararon

las muestras de las mismas siguiendo el procedimiento de extracción indicado

anteriormente pero en ausencia de los analitos. A continuación se registraron sus espectros

tridimensionales de fluorescencia en las condiciones químicas e instrumentales

optimizadas anteriormente. En las figuras 9.21, 9.22, 9.23 y 9.24 se muestran los espectros

tridimensionales en forma de curvas de nivel de las matrices de madroño, mandarina,

limón y pomelo, superpuestos cada uno de ellos con los de los dos analitos.

Capítulo 9

314

Figura 9.21. Espectro de fluorescencia total representado en forma de curvas de nivel de NAA

(azul), TBZ (rosa) y madroño (rojo).


(azul), TBZ (rosa) y mandarina (rojo).


315


(rojo), TBZ (azul) y limón (rosa).


(rojo), TBZ (azul) y pomelo (rosa).

Capítulo 9

316

Como puede observarse en las figuras anteriores, tanto el limón como el pomelo

presentan un espectro de fluorescencia suficientemente separados de los espectros de NAA

y TBZ para no constituir una interferencia. Sin embargo, los espectros de fluorescencia de

la mandarina y del madroño quedan solapados con el espectro del NAA. Este hecho nos

llevó a realizar un estudio de las posibles interferencias que podían inducir las matrices

tanto de mandarina como de madroño en la determinación de dicha auxina. Para ello, se

prepararon muestras siguiendo el procedimiento de extracción previamente indicado, pero

añadiendo la cantidad necesaria de NAA que proporcionase una concentración final de

100 ng mL-1

en 0,05 mL, 0,1 mL y 0,2 mL del extracto etanólico de la matriz. A

continuación se adecuaron las muestras a las condiciones óptimas establecidas y se

obtuvieron sus espectros LSF a partir de la trayectoria seleccionada en el espectro

tridimensional. Finalmente, se derivaron los espectros LSF obtenidos, mostrándose dichas

derivadas en las figuras 9.25 y 9.26 para el madroño y para la mandarina, respectivamente.

Figura 9.25. Primera derivada de los espectros LSF del NAA (100 ng mL-1

), del TBZ (100 ng

mL-1

), de la mezcla de ambos y del valor medio del NAA (100 ng mL-1

) obtenido en diferentes

cantidades del extracto etanólico del madroño (0,05, 0,1 y 0,2 mL).


317


), del TBZ (100 ng

mL-1

), de la mezcla de ambos y del valor medio del NAA (100 ng mL-1

) obtenido en diferentes

cantidades del extracto etanólico de la mandarina (0,05, 0,1 y 0,2 mL).

Como puede observarse, ni la matriz del madroño ni la de la mandarina influye en

la determinación del NAA, así como tampoco lo hace en la determinación de TBZ, puesto

que a la longitud de onda a la cual se lleva a cabo la determinación del NAA ( = 304 nm)

la señal del analito de la disolución estándar coincide con la obtenida cuando éste se extrae

de ambas matrices y con la señal de la mezcla. Puede comprobarse también que la señal

derivada a la longitud de onda en la que se cuantifica el TBZ ( = 286 nm) se hace cero en

el espectro derivado del NAA tanto el estándar como el procedente de la matriz,

coincidiendo la señal para el TBZ y la mezcla.

Por otro lado, es necesario destacar que, este estudio no se llevó a cabo para el

TBZ puesto que su señal no se ve influenciada por la presencia de la matriz como queda

representado en los espectros tridimensionales en forma de curvas de nivel anteriormente

expuestos.

Una vez analizadas cada una de las matrices y comprobado que no influyen en la

determinación de los analitos, se procedió a la resolución de la mezcla.

Capítulo 9

318

Para llevar a cabo la determinación de NAA y TBZ mediante el método propuesto

se prepararon muestras siguiendo el método de extracción detallado anteriormente. Una

vez obtenidos los extractos se prepararon las muestras en matraces aforados de 10 mL, a

las que se añadió el volumen de etanol necesario para mantener un porcentaje constante

del 30%, 0,1 mol L-1

de disolución reguladora de pH 4,74 y cantidades variables de NAA

y TBZ según se recogen en la tabla 9.15.

Las muestras fueron analizadas por fluorescencia sincrónica lineal, para lo cual se

registró el espectro de fluorescencia total de las mismas y se obtuvo el espectro sincrónico,

al que se aplicó la primera derivada (figuras 9.27 y 9.28). Las señales de la primera

derivada se midieron a λex= 304 nm y λex= 286 nm, para determinar la concentración

problema de NAA y TBZ, respectivamente. Este estudio se aplicó a cada una de las

muestras por triplicado, obteniéndose recuperaciones comprendidas entre el 96 y 103 %,

tal como queda reflejado en la tabla 9.15.


), del TBZ (100 ng

mL-1

) y de la mezcla en el extracto de limón.


319


), del TBZ (100 ng

mL-1

) y de la mezcla en el extracto de pomelo.

Tabla 9.15. Estudio del porcentaje de recuperación de NAA y TBZ en cítricos y

madroño mediante fluorescencia sincrónica lineal FSL

Muestra

Cantidad

añadida

(ng mL-1

)

Cantidad

encontrada

(ng mL-1

)

Porcentaje de

recuperación

,%)( DEx

NAA TBZ NAA TBZ NAA TBZ

Pomelo 80 100 80,9 99,9 101,1 ± 0,2 99,9 ± 0,4

Limón 80 100 79 100,5 98,6 ± 0,8 100,5±1,8

Mandarina 80 60 77 61,7 96,6 ± 2,1 102,8±0,7

Madroño 80 120 82 121,8 102,5 ± 1,5 101,5±2,3

Capítulo 9

320

CAPÍTULO 10

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO EN SANDÍA

MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA POR

ISOPOTENCIALES DE LA MATRIZ

Determinación de AGB mediante MISF

323

1. OBJETIVO

En el presente trabajo se propone la determinación directa de ácido giberélico

(AGB) (figura 1) en muestras vegetales que presentan matrices fluorescentes como es la

de la sandía. Hasta el momento no se han reportado en bibliografía métodos para la

determinación de esta fitohormona en dicho tipo de matrices.

Figura 1. Estructura química del ácido giberélico.

La fluorescencia que presenta el AGB cuando es sometido a radiación UV hace

posible su cuantificación en muestras vegetales que de manera natural presentan

fluorescencia, la cual puede ser modificada bajo las condiciones de irradiación

optimizadas para la determinación del analito, aplicando la técnica de fluorescencia

sincrónica por isopotenciales de la matriz (MISF).

Esta técnica permite abordar la determinación directa de compuestos en matrices

intensamente fluorescentes, como es el caso de la sandía, sin necesidad de realizar ningún

tipo de separación o extracción previa, aún existiendo solapamiento entre los espectros de

fluorescencia de los analitos y la muestra. Para ello, se traza una trayectoria isopotencial

que une puntos de igual intensidad fluorescente en el espectro de la matriz. Al derivar el

espectro obtenido con dicha trayectoria, se elimina la contribución debida a la matriz.

Capítulo 10

324


En el capítulo 8 de esta tesis se encuentra descrita la optimización de las

condiciones de fotoirradiación del AGB con la que se consiguen productos fluorescentes

que permiten su determinación cuantitativa mediante la medida de su fluorescencia

fotoinducida.

Las variables optimizadas en dicho proceso y que se decidió seguir manteniendo

para el estudio del mismo analito en matrices vegetales fluorescentes utilizando la técnica

MISF fueron:

- disolvente para la reacción fotoquímica: 5% etanol y 50% de metanol.

- tiempo de irradiación: 6 min.

Para llegar a dicha decisión se siguió el siguiente procedimiento. Primeramente se

determinó si la matriz de sandía presentaba o no fluorescencia natural y si ésta era

constante en diferentes muestras de sandía. Para ello, se trituraron 10 g de muestra, se le

adicionaron 25 mL de etanol y se llevaron durante 10 min a ultrasonidos. A continuación

se recogió el sobrenadante, se tomaron 0,5 mL del extracto preparado y se enrasó hasta 10

mL con agua, siendo medida su fluorescencia. Una vez analizados los espectros

fluorescentes de 10 muestras de sandia de diferentes variedades se pudo llegar a la

conclusión de que todos ellos presentaban la misma forma e intensidad.

Puesto que el analito necesita ser irradiado para presentar fluorescencia, se

procedió a estudiar cómo afectaba dicha radiación UV a la fluorescencia natural que

presentaba la sandía. Así, en las condiciones químicas e instrumentales previamente

optimizadas para el AGB, se sometió a extractos etanólicos de sandía a diferentes tiempos

de irradiación. En la figura 10.2 se representa la influencia del tiempo de irradiación en la

señal fluorescente, tanto para el AGB (descrito antes en el capítulo 8) como para la sandía.

En ella puede observarse como al aumentar el tiempo de irradiación disminuyendo la

velocidad de la bomba peristáltica que impulsa las disoluciones hasta la lámpara UV, la

intensidad de fluorescencia natural del extracto de sandía disminuye. Por otra parte, se

comprueba que el tiempo de irradiación para el cual el analito presenta la máxima

fluorescencia es de 6 min, siendo la fluorescencia de la matriz inferior a la del analito a

este tiempo de irradiación. Esta situación nos permitiría utilizar dicho tiempo de


325

irradiación para llevar a cabo la determinación del AGB en la sandía utilizando la técnica

fluorescente propuesta.


fluorescencia del AGB y de la matriz de sandia.

3. CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES

En las figuras 10.3 y 10.4 se representan los espectros de fluorescencia total del

AGB y de la sandía, respectivamente, en disoluciones que contienen un 5% de etanol, 50%

de metanol y una concentración 0,04 mol L-1

de tampón acético/acetato de pH 5, tras ser

sometidas a un proceso de fotoirradiación durante 6 min. El AGB presenta dos máximos

de excitación localizados a las longitudes de onda de 280 y 315 nm y dos máximos de

emisión a las longitudes de onda de 303 y 420 nm. Por su parte, la muestra de sandía se

caracteriza por una única banda fluorescente con un máximo situado a 290 nm para la

excitación y 350 nm para la emisión.

Capítulo 10

326

Figura 10.3. Espectro tridimensional de fluorescencia total del AGB.

Figura 10.4. Espectro tridimensional de fluorescencia total de la sandía.


327

Como puede comprobarse en la figura 10.5, donde se encuentran representadas las

curvas de nivel de los espectros de fluorescencia total de AGB y sandía, el solapamiento

de los espectros impide la determinación directa de la fitohormona estudiada sin emplear

una técnica de separación previa del analito. Sin embargo mediante el empleo de la técnica

MISF y la primera derivada se hizo posible la determinación directa sin necesidad de

ningún paso previo de separación o tratamiento de la muestra.

Figura 10.5. Espectros tridimensionales solapados de fluorescencia total del AGB (rojo) y de la

sandía (azul) representados mediante curvas de nivel.

4. OPTIMIZACIÓN DE VARIABLES

El estudio de la estabilidad de las disoluciones de AGB fue detallado en el

Capítulo 8 pudiendo concluir que, las disoluciones eran estables durante, al menos, dos

semanas y que las disoluciones de trabajo eran estables durante, al menos, una hora.

Capítulo 10

328

La optimización secuencial de variables que afectan al proceso de emisión

fluorescente del AGB también fue detallada en el Capítulo 8, siendo los valores óptimos

para cada variable, y, por tanto, los que se seleccionan en el presente estudio, los que se

detallan en las tablas 10.1 y 10.2.

Tabla 10.1. Parámetros Químicos


Etanol (%) 5

Metanol (%) 50

pH 5

[Tampón] (mol L-1

) 0,04 (Acético/Acetato)

Temperatura (ºC) 20

Tabla 10.2. Parámetros Instrumentales

Apertura de las rendijas 6 nm

Tiempo de integración 0,1 s

Número de medias 4

Tiempo de Irradiación 6 min

5. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE AGB

La influencia de la concentración de AGB sobre la señal de fluorescencia que se

produce al someter a radiación UV dicho analito en las condiciones químicas

seleccionadas fue presentada en el apartado 6 del Capítulo 8. Para comprobar la linealidad

se realizó un ajuste por mínimos cuadrados de las intensidades obtenidas

experimentalmente, llegándose a la conclusión de que el AGB podría presentar una

relación lineal hasta unos 500 ng mL-1

.


329

6. SELECCIÓN DE LA TRAYECTORIA ISOPOTENCIAL

Establecidos los parámetros químicos e instrumentales en el que llevar a cabo la

determinación del AGB, se procedió a estudiar detenidamente el espectro de la matriz de

la muestra (sandía) para seleccionar la trayectoria isopotencial más favorable para la


Para ello, se obtuvo el espectro tridimensional medio de 10 muestras de sandia de

diferentes variedades y se superpuso al espectro correspondiente del analito. La selección

de la trayectoria isopotencial se realizó de manera que ésta pase lo más cerca posible del

máximo de intensidad del AGB, de manera que se pierda la mínima sensibilidad posible.

En la figura 10.6 puede verse la trayectoria seleccionada, con la que se obtuvieron

a continuación los espectros bidimensionales de fluorescencia sincrónica por

isopotenciales de la matriz (MISF) del analito (AGB) y de la matriz (figura 10.7). Como

se puede comprobar en dicha figura, el espectro de la sandia ha pasado a ser constante por

efecto de la trayectoria isopotencial, de manera que su interferencia en la determinación

del AGB puede neutralizarse mediante el empleo de derivadas. Así pues, al realizar la

derivada del espectro de la sandía, éste quedará anulado al ser constante, obteniéndose

únicamente el espectro derivado del AGB (figura 10.8).

Figura 10.6. Espectros solapados en forma de curvas de nivel de la sandia (azul), del AGB (rojo)

y la trayectoria empleada en la determinación (negro).

Capítulo 10

330

Figura 10.7. Espectros de MISF del AGB (azul) y de la sandia (morado).

Figura 10.8. Espectro de MISF derivados del AGB (azul) y de la sandia (morado).


331

Para derivar los espectros se empleó el algoritmo de Savitzky-Golay con 21 puntos

como factor de filtrado, ya que, es el valor al cual se obtienuvo una mejor relación

señal/ruido, especialmente a concentraciones bajas. La determinación se llevó a cabo

midiendo a una longitud de onda de 276 nm, que se corresponde con el valor mínimo de la

primera derivada como puede verse en la figura 10.8.

7. DETERMINACIÓN DE AGB


Una vez estudiadas todas las variables que afectan al proceso fluorescente se

procedió a realizar el calibrado de AGB en presencia de la sandia. Para cada una de las

muestras de la calibración se trituraron 10 g de sandia a los que se añadió cantidades

variables de AGB de forma que en las disoluciones finales de medida las concentraciones

estuvieran comprendidas entre 40 y 200 ng mL-1

. A continuación, a cada una de las

muestras se le añadieron 25 mL de etanol y se mantuvieron durante 10 min en

ultrasonidos. Se recogió el sobrenadante y de él se tomaron 0,1 mL, al cual se le añadió el

volumen de etanol necesario para que en la disolución de medida el porcentaje de etanol

fuese del 5%, además de, un 50% de metanol y una concentración 0,04 mol L-1

de

tampón acético/acetato de pH 5. Finalmente, tras irradiar durante 6 min cada una de las

disoluciones de la calibración, se registraron sus correspondientes espectros de

fluorescencia, termostatizando a 20 ºC.

Para obtener los espectros tridimensionales de fluorescencia fue necesario registrar

61 espectros de excitación de 288 nm, en el intervalo de longitudes de onda comprendido

entre 200 y 488 nm, tomando un punto cada 0,6 nm. En cuanto a la emisión, se fue

variando la longitud de onda en 4,8 nm entre un espectro y el siguiente cubriendo el

intervalo de longitudes de onda comprendido entre λem = 260-548 nm. De esta manera, se

registraron espectros tridimensionales cuadrados de fluorescencia, a los que se les aplicó la

trayectoria seleccionada para obtener el espectro bidimensional MISF que, posteriormente,

fue derivado. Se realizaron tres rectas de calibrado, presentándose en la figura 10.9 los

espectros bidimensionales MISF tras aplicar la trayectoria isopotencial a los espectros

tridimensionales de cada una de las concentraciones de uno de los calibrados.

Los espectros MISF obtenidos para cada una de las concentraciones de los tres

calibrados fueron derivados, como se muestra en las figuras 10.10, 10.11 y 10.12. En cada

uno de ellos se obtuvo el valor de la primera derivada midiendo a la λex = 276 nm.

Capítulo 10

332

Figura 10.9. Espectros de MISF del AGB en presencia de la sandia para el calibrado 1.

Figura 10.10. Primera derivada de los espectros de MISF d el calibrado 1 del AGB.


333



En la figura 10.13 se representan dichos valores para cada una de las

concentraciones, con los que se construyeron las rectas de calibrado.

Capítulo 10

334

Los valores de la primera derivada medidos a λex= 276 nm para cada una de las

muestras de los calibrados del AGB y los parámetros de regresión de estos calibrados se

recogen en las tablas 10.3 y 10.4, respectivamente. Como se puede observar en los

calibrados del AGB, los coeficientes de la determinación fueron próximos a la unidad. En

cuanto a las ordenadas en el origen de estas rectas, resultaron no significativamente

distintas de cero, ya que los valores de ta experimental obtenidos fueron inferiores al valor

de tteórico.

Figura 10.13. Representación de las rectas de calibrado obtenidas para el AGB ajustadas

mediante mínimos cuadrados.

Tabla 10.3. Rectas de calibrado de AGB: señales de la primera derivada

λex = 276 nm

[AGB] (ng mL-1


40 -1,0433 · 103 -1,1003 · 10

3 -1,0618 · 10

3

50 -1,3567 · 103 -1,3967 · 10

3 -1,3917 · 10

3

75 -2,0351 · 103 -2,0846 · 10

3 -2,0848 · 10

3

100 -2,7134 · 103 -2,7724 · 10

3 -2,7029 · 10

3

150 -3,9134 · 103 -4,2404 · 10

3 -4,1189 · 10

3

200 -5,1134 · 103 -5,1724 · 10

3 -5,1069 · 10

3


335




a -2,784 ·101 -2,855 ·10

1 -2,727 ·10

1

b 6,134 ·101 4,898 ·10

1 -1,917

Escala estimada 2,1 ·101 2,3 ·10

1 3,8 ·10

1

r2

0,999 0,999 0,999


a -1,036 · 102 -1,268 ·10

2 -1,266 ·10

2

b -2,529 · 101 -2,603 ·10

1 -2,554 ·10

1

sxy 6,3 · 101 1,4 ·10

2 1,1 ·10

2

sa 5,3 · 101 1,2 ·10

2 9,7 ·10

1

sb 4,5 ·10-1

1,0 8,3 ·10-1

r2

0,998 0,993 0,995

ta = 0a /sa 1,96 1,08 1,31

tb = 0b /sb 56,05 26,01 30,95

tteórico (α=0,05; n-2=19) = 2,78

Con objeto de estudiar la independencia de las señales analíticas de primera

derivada de los espectros MISF de los calibrados de AGB, se realizó el análisis de

varianza de los calibrados propuestos (tabla 10.5). Los valores experimentales de F1 y F2

fueron menores que los tabulados, por lo que se aceptó una regresión mediante mínimos

cuadrados globales como calibrado del AGB.

Los valores de intensidad y los parámetros estadísticos más importantes obtenidos

mediante regresión por mínima mediana de cuadrados y mínimos cuadrados de la

calibración global se encuentran recogidos en las tablas 10.6 y 10.7, respectivamente.


mediante el test de la t de Student, con el fin de determinar el grado de sensibilidad,

Capítulo 10

336

obteniéndose un valor de 58,07, el cual resultan ser superior al valor de tteórico, lo que

indica que la sensibilidad del método propuesto es satisfactoria.

Tabla 10.5. Análisis de Varianza: comparación de los calibrados de AGB


cuadrados

Grados de

libertad

Media

cuadrática


calibrados individuales 1,448 ·10

5 12 1,206 ·10

4

Deferencias entre las pendientes de

los calibrados individuales

5,369 ·103 2 2,685 ·10

3


individuales 3,453 ·10

4 4 8,632 ·10

3


global 1,793 ·10

5 16 1,121 ·10

4


F1 7,16 ·10-1

3,26

F2 2,23 ·10-1

3,89

Tabla 10.6. Rectas de calibrado global de AGB:

señales de la primera derivada λex = 276 nm

[AGB] (ng mL-1

) Calibrado global

40 -1,0685 ·103

50 -1,3817·103

75 -2,0682·103

100 -2,7296·103

150 -4,0909·103

200 -5,1309·103


337

Como puede observarse en la tabla 10.7, la ordenada en el origen, a un nivel de



Tabla 10.7. Recta de calibrado global del AGB


a -2,744 ·101

b 1,264

Escala estimada 4,7 ·101

r2

0,999


a -1,19 ·102

b -2,562 ·101

syx 1,1 ·102

sa 4,4 ·10-1

sb 5,2 ·101

r2

0,995

ta = 0a /sa 2,30

tb = 0b /sb 58,07

tteórico (α=0.05, n-2=19) =2,78

Capítulo 10

338

Figura 10.14. Recta de regresión global del AGB ajustada mediante mínimos cuadrados.


para el AGB, pudiéndose apreciar su linealidad, como bien indica el coeficiente de la

determinación, r2.

En la figura 10.15 se encuentra recogido el resultado del cálculo de los residuales

estandarizados y la resistencia al diagnóstico para el calibrado global del AGB. Como

puede observarse, la distribución de los residuales resultó ser homocedástica, por lo que se

deduce que los errores cometidos en las medidas son independientes de la concentración

del analito estudiado. Se comprueba que los valores de residuales estandarizados son

inferiores 2,5 y, por tanto, no existen puntos que constituyan datos anómalos de la recta de

regresión.


confianza del 95% se ilustra en la figura 10.16. En ella se puede observar que el método

propuesto presenta una precisión elevada incluso en los extremos inferior y superior del

intervalo de calibración escogido. Por otro lado, podemos decir que la zona de mayor

precisión se corresponde con un nivel de concentración entorno a 90 ng L-1

, coincidiendo

con el centro de gravedad de la recta de calibrado.


339

Figura 10.15. Los residuales estandarizados a la recta de regresión por mínimos cuadrados y

mínima mediana de cuadrados de AGB; resistencia al diagnóstico mediante mínima mediana de

cuadrados.

Capítulo 10

340

Figura. 10.16. Bandas de dispersión y recta global de calibrado del AGB.


Para estudiar la precisión de las estimaciones del método propuesto se prepararon

diez disoluciones de 75 ng mL-1

del analito en presencia de la matriz procedente de la

sandia y en las mismas condiciones que los patrones de calibración. A partir de los

espectros tridimensionales de fluorescencia, obtenidos tras someter a las muestras a

radiación UV durante 6 min, se registraron los espectros MISF y su correspondiente

derivada, en la que se midió la señal analítica a la longitud de onda óptima para su

determinación, esto es, a 276 nm.

Los valores de la señal derivada obtenidos, la concentración estimada para cada

una de las disoluciones, así como el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de

variación de cada uno de los 10 replicados, se muestran en la tabla 10.8. El intervalo de

confianza del método propuesto según dos fuentes de error distintas, error puro y banda de

dispersión de la recta de calibrado, se muestra en la tabla 10.9.

Observando los datos obtenidos podemos comprobar que el intervalo de

concentración de los replicados es menor cuando la fuente de error que se considera es la

banda de dispersión de las estimaciones de la recta de calibrado. Esto es debido a la forma

hiperbólica de las bandas de confianza, que son más estrechas en el centro de gravedad de

la recta.


341


Replicado

AGB 75 ng mL-1

Señal derivada Concentración

(ng L-1

)

1 -2029,1 74,56

2 -2086,3 76,79

3 -2002,3 73,51

4 -2119,4 78,08

5 -2096,1 77,17

6 -2157,4 79,56

7 -2060,9 75,79

8 -2107,4 77,61

9 -2015,1 74,01

10 -2054,2 75,53


Coeficiente de variación 2,4

Tabla 10.9. Intervalos de confianza del AGB

Fuente de

Error

Grados de

libertad

t teórico

(α = 0,05)

Intervalo

(ng mL-1

)

D.E.R.b

y

E.E.R.c (%)

75 ng mL-1


Error puro n - 2 = 16 2,12 69,85-82,68 3,0b

B.D.E.R.C.a

n -1 = 9 2,26 71,90-80,62 1,9c



c: Error estándar relativo




Capítulo 10

342

calibrado, pero en ausencia de AGB. A continuación, se registraron los espectros de

fluorescencia total, y se aplicó la trayectoria isopotencial para obtener los espectros de

MISF, los cuales fueron derivados y se midió la señal de primera derivada a la longitud de

onda seleccionada λex = 276 nm.

Las señales derivadas medidas a λex= 276 nm de cada uno de los replicados se

muestran en la tabla 10.10 y los límites de detección según los diferentes criterios

aplicados en las determinaciones precedentes se encuentran recogidos en la tabla 10.11.

Tabla 10.10. Blanco analítico de AGB

Replicado Primera derivada a λex= 276 nm

1 -110,8

2 -113,8

3 -110,1

4 -112,3

5 -111,7

6 -111,2

7 -112,0

8 -111,5

9 -111,8

10 -109,5

Tabla 10.11. Límites de detección del AGB


-1)

AGB

IUPAC K 3,00 1,39 ·10-1

G. L. Long y J. D.


Clayton Δ(α = β = 0.05, n – 2 = 16) 3,44 10,75


343


cuando se emplea el criterio de Clayton, esto es debido, a que el factor de seguridad es

superior ya que tiene en cuenta tanto los errores α como los errores β. El criterio de Long y

Winefordner sólo tiene en cuenta los errores de tipo β, por tanto el factor de seguridad es

superior al del criterio de la IUPAC e inferior al de Calyton.

345

BLOQUE IV

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES

347

CONCLUSIONES

1.- Se ha demostrado la validez de la fosforescencia a temperatura ambiente

inducida por átomo pesado para abordar la determinación simultánea de dos auxinas de

estructura molecular muy similar, el ácido 1-naftilacético y el ácido 2-naftoxiacético, en

muestras vegetales como son el tomate y diferentes frutas mediante la aplicación de la

espectroscopía de derivadas.

2.- La fluorescencia fotoinducida es una metodología muy selectiva y sensible que

permite la determinación de compuestos en matrices complejas, sin necesidad de limpieza

de la muestra ni etapas previas de separación. Así se han determinado el ácido 2,4-

diclorofenoxipropanoico, el ácido 3,5,6-tricloro-2-piridiloxiacético y el ácido giberélico

directamente en mandarina y madroño.

3.- La inestabilidad frente a la radiación UV de los compuestos responsables de la

fluorescencia natural de algunas matrices vegetales, como la ciruela y el tomate, hace que

se transformen en compuestos no fluorescentes. Por otra parte, la irradiación de los ácidos

2,4-diclorofenoxipropanoico, 3,5,6-tricloro-2-piridiloxiacético y giberélico genera

productos fluorescentes. Aprovechando estas propiedades, es posible la determinación de

dichos compuestos de forma directa en matrices vegetales que presentan fluorescencia

nativa.

4.- Se han desarrollado metodologías para la determinación simultánea de ácido 1-

naftilacético y tiabendazol en matrices fluorescentes que presentan en algunos casos

espectros fuertemente solapados con los de dichos compuestos, especialmente madroño y

mandarina, utilizando fluorescencia sincrónica, obteniendo muy buenas características

analíticas por aplicación directa.

5.- Cuando no es posible destruir por completo la fluorescencia nativa de la matriz

mediante irradiación, la fluorescencia sincrónica por isopotenciales de la matriz ha

demostrado ser muy eficaz para abordar estas situaciones. Así es posible determinar ácido

giberélico en sandía.

6.- La validez de las metodologías luminiscentes propuestas en esta Tesis están

avaladas por las características analíticas obtenidas en cada una de las determinaciones.

Date post:	20-Oct-2021
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Diseño de metodologías luminiscentes para la determinación ...

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