Fluorescenční mikroskopie

Emise záření spontánně nastávajícího při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního

- Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí

- Fotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - excitace je způsobena absorpcí záření

Luminiscence

fosforescence - trvá-li emise až několik sekund po přerušení excitace

fluorescence - emise světla pouze v průběhu absorpce excitačního světla – interval mezi absorpcí excitačního světla a emisí je extrémně krátký (<1/1000000 s)

• pojem „fluorescence" pochází od Sira George G. Stokse, který objevil, že ozařováním fluoritu (kazivec, CaF2) UV světlem lze vyvolat fluorescenci

• primární fluorescence (autofluorescence) - přirozená fluorescence studovaného materiálu (minerály, krystaly, máslo, chlorofyl, vitamíny, některé anorganické sloučeniny)

• sekundární fluorescence - studovaný materiál je "označen" fluoreskující značkou (např. fluorescenčně značené protilátky)

Fluorescence

http://commons.wikimedia.org/wiki/User:Hgrobe

Fluorescence

Princip – excitace fluoroforu absorpcí světla, relaxace vyzářením fotonu

Jablonského diagram energií - schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly

• před excitací je molekula v tzv. základním stavu

• po absorpci fotonu excitačního záření (kratší λ) je elektron uveden do excitačního stavu (vyšší energická hladina) na dobu 10-15 sekundy (femto)

• ztráta části vibrační energie elektronu do prostředí a pokles elektronu do nižší energetické hladiny

• relaxace elektronu do základního stavu – vyzáření energie – delší λ než u excitačního záření

Jablonského diagram

základní úkol fluorescenčního mikroskopu je dovolit vstup excitačního světla na vzorek, ale současně ho separovat od mnohem slabší emitované fluorescence

• vysoká citlivost (50 fluorescentních molekul na μm3)• možnost vícenásobného značení • pod rozlišením pořád můžete říct, zda tam molekula fluoreskuje nebo ne• použití pro organický materiál (fixované či živé vzorky) i anorganický (obzvláště

kontaminanty polovodičů)

mnoho rostlinných i živočišných tkání samovolně fluoreskuje při ozáření světlem krátké vlnové délky (autofluorescence)xfluorochromy - často vysoce specifické, s velkým kvantovým výtěžkem

spektrální překryv - nutno odfiltrovat volbou vhodného excitačního filtru nebo dichromatickým děličem paprsku – jinak ztráta kontrastu kvůli přesvícení excitačním světlempro každý fluorochrom je dán vrchol excitace a vrchol emise (nalezeno monochromátorem a měřením relativní intensity fluorescence)čím větší tzv. Stokesův posun, tím snazší je separovat excitaci od emise

• první fluorescenční mikroskop 1911-1913 Otto Hemstädt + Heinrich Lehmann -pozorování autofluorescence v bakteriích, zvířecích a rostlinných tkáních

• 1940 Albert Coons - značení protilátek fluorescentní barvou - zakladatel imunofluorescence

• Formální dělení• Fluorochromy - kategorie molekul schopných projít elektronovými transicemi,

zodpovědnými za fluorescenci• Fluorofory - fluorochromy konjugované coby značky k větším molekulám (jako

jsou nukleové kyseliny, lipidy, enzymy či proteiny) prostřednictvím kovalentních vazeb nebo adsorbce

• přírodní• syntetické• rekombinantní

• fluorofory obecně mohou projít excitačním cyklem řádově tisíckrát, než dojde k jejich destrukci (fotovybělení), např. FITC (fluorescein isothiokyanát) může projít cyklem excitace-relaxace cca 30 000x, než ztratí schopnost reagovat na iluminaci

FITCTRITC

Fluorofory

Aequorea victoria

GFP

aplikace in vivo:• fluorescenční značky pro vazbu na specifický protein• pro lokalizaci do určité specifické oblasti (cytoskeleton,

mitochondrie, ...).• pro sledování dynamických procesů a proměn prostředí

• monitoring buněčné integrity (živá, mrtvá, apoptotická)

• sledování exocytosy, endocytosy• sledování fluidity membrán, transportu proteinů,

enzymatické aktivity, …..příklady:• akridinová oranž - silná vazba na DNA• DAPI - barvení DNA a chromatinu• Alexa Fluor - vysoký kvantový výtěžek, zvýšená

fotostabilita• cyaniny - vysoká stabilita• spektrálně sensitivní indikátory - Fluo-3, Fura Red• značení organel - MitoTracker, LysoTracker• quantum dots - polovodičové krystaly cca nanometry• fluorescentní proteiny

http://www.tsienlab.ucsd.edu/

Roger TsienNobelova cena za chemii 2008- Objasnění mechanismu fluorescence GFP, modifikace

u fluoroforu hodnotíme:• extinkční koeficient• kvantový výtěžek• životnost fluorescence

extinkční koeficient, resp. molární extinkční koeficient - míra schopnosti fluoroforuabsorbovat světlopřevod jednotek absorbance na jednotky molární koncentrace pro řadu látek (možné porovnání) - získá se měřením absorbance při referenční vlnové délce (charakteristické pro absorbující molekulu) pro jednomolární koncentraci; chromofory s vysokým EK budou s vysokou pravděpodobností mít schopnost fluorescencekvantový výtěžek - míra efektivity fluorescenční emise vzhledem k ostatním způsobům relaxacebývá vyjádřen jako poměr počtu emitovaných fotonů ku počtu fotonů absorbovaných (de facto pravděpodobnost, že daný excitovaný fluorochrom vyzáří foton; nabývá typicky hodnot 0-1). Pro většinu aplikací upřednostňujeme fluorofory s vysokým kvantovým výtěžkem, ten je ovšem dramaticky závislý i na vnějším prostředí (viskozita solventu, iontová síla, pH, hydrofobicita)životnost fluoroforu - průměrný čas, po který zůstává molekula v excitovaném stavu, než emituje fotonobvykle používané fluorescentní sloučeniny mají životnost 0,5 - 20 nanosekund

Fluorofory

existují podmínky, které ovlivní reradiaci světla excitovaným fluoroforem, redukujíce intensitu fluorescence – blednutí (fading, photobleaching)blednutí dělíme na vybělení (bleaching) a zhasínání (quenching)

vybělení – nevratný rozklad fluorescentních molekul v důsledku vysoké intenzity světla v přítomnosti molekulárního kyslíku (trvalá ztráta schopnosti fluoreskovat v důsledku fotonem indukovaného poškození). • závisí na konkrétním fluoroforu a jeho okolí, kolik cyklů excitace-emise dokáže

prodělat než je vybělen - některé fluorofory několik, jiné tisíce i miliony cyklů• fotovybělení se dá zabránit

omezením expozice fluoroforů iluminační energii, tím se ovšem snižuje signál fluorescence

deoxygenací roztoku fluoroforu, což je ovšem problematické např. u živých buněk.

Iluminace se proto omezuje na co nejmenší použitelný čas a tato technika se kombinuje s komerčně dostupnými reagenciemi, snižujícími vybělení

FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleaching (difuse fluoroforů do laserem vybělené oblasti)lze sledovat difuzi v malé oblasti buňky (2-5 μm, buňka má i 100 μm)VIDEO

Fading - blednutí

Bleaching - vybělení

existují činidla bránící blednutí

Efekt rozpouštědla na emisi fluorescence:• mnoho faktorů prostředí ovlivňuje fluorescenci, včetně interakcí mezi fluoroforem a

molekulami rozpouštědla, ostatními rozpuštěnými anorganickými nebo organickými sloučeninami

• pH, teplota, lokální koncentrace fluoroforů• lze ovlivnit absorpční spektrum, emisní spektrum, kvantový výtěžek

jádra barvena DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole; modrá fluorescence)mitochondrie barveny MitoTracker Red (červená fluorescence)aktinová vlákna (cytoskelet) barvena derivátem falloidinu (zelená fluorescence)snímky á 2 min

zhasínání - z mnoha procesů, indukujících neradiační relaxaci (bez vyzáření fotonu) excitovaných elektronů do základního stavu

- procesy intramolekulární nebo intermolekulární. Neradiační relaxace soutěží s fluorescenční relaxací, obvykle dramaticky snižují nebodokonce úplně zruší emisi. Principem většiny zhasínání je redukce životnosti excitace akvantového výtěžku ovlivněného fluoroforu• kolizní zhasínání - kolize excitovaného fluoroforu a jiné nefluorescentní molekuly v

roztoku, výsledkem je deaktivace fluoroforu, většinou bez chemické modifikace molekul. mnoho kolizních „zhášečů“ - kyslík, halogeny, aminy a mnoho elektron-deficientních

organických molekul. lze využít pro detekci přítomnosti „zhášeče“ v určitém místě buňky

• statické či komplexní zhasínání - vytvoření nefluorescentního komplexu mezi zhášečem a fluroforem - snížení absorpce snižením počtu aktivních excitovatelných molekul. Tvoří se vratný komplex quencheru s molekulou v základním stavu, tento jev není závislý na kolizi či difusi, emise fluorescence je snížena bez ovlivnění délky excitovaného stavu.

FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer – měření vzdáleností daleko menších, než je rozlišení světelného mikroskopu

quenching - zhasínání

VIDEO

FRET

Jablonského diagram pro FRET

Förster (Fluorescence) resonance energy transfer (Försterův rezonanční přenos energie)• transfer energie mezi dvěma chromofory, efektivita přenosu je

nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem aakceptorem (reálná hranice je 10 nm)

• umožňuje studovat interakci mezi dvěma různými molekulami• molekuly označeny odlišnými fluorochromy, emisní

spektrum jednoho se překrývá s excitačním spektremdruhého

• při interakci molekul se jejich fluorochromy dostanouvelice blízko , energie excitovaného světla se může přenéstz jednoho fluorochromu na druhý

• při osvícení komplexu excitačním světlem prvníhofluorochromu vidíme emisní světlo odpovídající druhémufluorochromu

• celá řada aplikací

Fluorescenční mikroskop

• Zdroj iluminace

• Excitační/emisní filtry

• Dichromatické/dichroické zrcadlo

• Detektory

Zdroj světla ve fluorescenci

• množství fotonů, které dorazí do oka nebo na detektor je při fluorescenční mikroskopii zpravidla velmi malé - kvantový výtěžek většiny fluorochromů je malý

• pro dostatečné množství emisního světla nutno používat velmi silné zdroje excitace obvykle obloukové lampy (výbojky), nejčastější jsou rtuťové lampy od 50 do 200 wattů a nebo

xenonové výbojky 75-150 wattů• zdroj musí zajistit dostatek energie pro zažehnutí výbojky (ionizací plynných par) a na udržení hoření

s minimem blikání• většinou počítadlo na zdroji, lampa má omezenou životnost, pak klesá efektivita - řádově stovky

hodin (cca 200 rtuťová, cca 900 xenonová)• rtuťová lampa neposkytuje uniformní osvětlení v celém spektru, hlavní intensita je v UV oblasti,

xenonová je uniformnější, ale deficientní v UV oblasti (naopak září hodně v IČ oblasti, musí se dobře chladit)

• lampy se liší velikostí (oblouk se musí vejít do apertury, jinak mrháte světlem), jasností

Zdroj světla ve fluorescenci

• někdy se používají wolframovo-halogenové žárovky, obzvláště pro modrou či zelenou excitaci u silně emitujících vzorků relativně uniformní výstup, deficientní v blízkoUV oblasti nevyžadují drahé zdroje (stačí nizkonapěťový transformátor), vydrží ale jen 30-50

hodin

• v poslední době se často používají lasery, obzvláště argonový laserdrahé, ale pro některé aplikace nezbytné (laser scanning confocal microscopy)mnoho různých typů s unikátními emisními spektry

Fluorescenční mikroskop

dakrfield kondenzátorbrightfield fluorescence

rané fluorescenční mikroskopy využívaly pouze tzv. diaskopickou fluorescenci, čili iluminaci průchozím světlemexcitační filtr byl umístěn na světelném vstupu a barierový filtr, blokující residuální excitační světlo a propouštějící emisní světlo byl nad objektivem

u brightfield fluorescence je poměrně obtížné separovat excitační světlo od fluorescence, protože obě světla vstupují do objektivu, proto se začaly používat olejové dakrfield kondensory (excitační světlo nevstupuje do objektivu)

relativně snadná instrumentace, ale dost nevýhod -obtížné centrování kondensoru do optické osy, často nutno snížit NA vřazením clony, aby excitační světlo nevstupovalo do objektivu, plýtvá se světlem a proto je i emise slabší, nelze použít simultánně s fázovou mikroskopií nebo Nomarskim

Fluorescenční mikroskop

fluorescenční mikroskopie v dopadajícím světle - epifluorescence• poprvé 1920 pro metalurgické vzorky• daleko vyšší jas, než u fluorescenčních mikroskopů v procházejícím světle• pouze pár procent z excitačního světla se dostane do objektivu• největší zlepšení 1940 - dichroická zrcadla, už se nemusela používat zrcadla rozdělující světelný

paprsek (na každém 50% ztráta)• jas fluorescence vyzářené je 1000x až 1000000x nižší, než iluminace. Cílem je tedy zachytit toto

slabé světlo a oddělit ho od excitačního, což zvládnou právě dichromatické děliče svazku

např. vzorek s fluoroforem, excitovaným v zelené oblasti (550 nm) a fluoreskujícím červeně (620-660 nm)výkonný zdroj poskytuje široké spektrum excitačních vlnových délek, světlo narazí nejprve na filtr, který propustí vybranou vlnovou délku pro excitaci (EF). V našem případě 510-560 nm (opět s nějakou účinností, takže v prošlém světle budou i jiné vlnové délky).excitační světlo dále narazí na dichromatické zrcadlo (DM) a je odraženo do objektivu, aby vytvořilo osvětlení vzorkudichromatické zrcadlo je umístěno do světelné cesty pod úhlem 45° a je vyrobeno tak, aby selektivně odráželo pouze určité vlnové délky (zde 490-565 nm), zatímco kratší i delší vlnové délky propouští

dichromatické zrcadlo

• spektrální propouštění (crosstalk) fluorescentní emise• způsobeno širokými pásy a asymetrickýmí spektrálními profily mnoha používaných

fluoroforů• emise jednoho fluoroforu je zaznamenána ve filtru, reservovaném pro fluorofor druhý• komplikace pro interpretaci experimentálních výsledků (kamery jsou často černobílé)• nutno brát v potaz při výběru kombinací fluoroforů v případě vícenásobného barvení

Crosstalk

zobrazovací zařízení rozhoduje o tom, jak malou fluorescenci jsme ještě schopni zachytit, případně jak rychlé procesy jsme schopni zaznamenatelektronické senzory lze popsat mnoha proměnnými:

• spektrální sensitivita• kvantový výtěžek• prostorové rozlišení• stejnoměrnost• poměr signál/šum• dynamický rozsah• rychlost odezvy

• PMT - photomultiplier tube (fotonásobič)• APD - avalanche photodiode (lavinová fotodioda)• CCD - charge-coupled device (zařízení s vázanými náboji)• CMOS - complementary-metal-oxide semiconductor detector (doplňující se kov-oxid-

polovodič)Dokonalý detektor neexistuje, záleží na tom, co potřebujeme nejvíce

Detektory

Konfokální mikroskopie

konfokální mikroskop - vyšší rozlišovací schopnost a kontrastdetekováno pouze světlo z ohniskové roviny

1957 Marvin Minsky- použití bodové iluminace- "pinhole" - malý otvor v opticky konjugované rovině před detektorem, eliminující signál odjinud než z ohniskové roviny=> rozlišení hlavně ve směru tloušťky vzorku je o hodně lepšílze používat tzv. optické řezy s následnou 3D rekonstrukcína druhou stranu opět snížení intensity signálu, vyžaduje dlouhé exposice

2 základní typy• skenovací konfokální mikroskop - velmi

vysoké rozlišení, ale extrémně pomalé• konfokální mikroskop s rotujícím diskem -

nižší rozlišení, ale velmi rychlé - pro dynamické jevy v živých soustavách

Epifluorescenční vs. konfokální mikroskopie

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/livecellimaging/techniques.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/confocalintro.html

Další využítí fluorescence

• Fluorescenční mikroskopy• Fluorimetry• Fluorescenční skenery• Průtokové cytometry (+ FACS)• Superresoluční mikroskopy

By SariSabban - Sabban, Sari (2011) Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high- affinity FcεRIreceptor (PhD thesis), The University of Sheffield, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=18139883

Embryo chobotnice

http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/confocal-microscopes/lsm-700-laser-scanning-microscopy.html

Různé druhy liposomů

http://ohscience.tumblr.com/post/12746455006/giant-liposomes-of-pulmonary-surfactant-40x

vláskové buňky v Cortiho orgánu (sluchové receptory)

http://scienceblogs.com/retrospectacle/2007/11/14/confocal-image-of-cochlea-wins/

Calcofluor white Rhodamine B

Excitation = 365-395 nm, Emission = 420 nm

UV 365 nm, 245 nmRed laser 635 nmGreen laser 520 nm

Chemiluminiscence – oxidace luminolu