Life Science & Biotechnology No.11 2 그림 1 GMS 417 Arrayer TM Spotting bed에 독자적인 spotting 방식(Pin&Ring법)을 채용한 arrayer이다. 다른 spotting방식 과 비교하여 spot size를 아주 정확하게 조절할 수 있어 고밀도의 chip을 제작할 수 있다. 발현해석 (1) GMS system의 평가 유전자 발현을 해석하는 경우 대상 시료와 대조 시료를 각각 다른 형광물질로 표식하여 동일한 DNA chip상에서 hybridization한 후 각각의 형광을 검출함으로써 발현량의 비 율을 조사한다. 정확한 검출을 위해서는 각 형광물질양의 비 율이 그대로 발현량의 비율로 반영되는 것이 대전제이다. 만 약 어느 한쪽의 형광물질이 강하게 검출되어 버리면 정확한 발현량의 비율을 얻을 수 없다. 따라서 GMS system이 발현 량의 차이를 정확하게 검출할 수 있는지를 시험해 보았다. [실험방법] 우선 형광기질 analogue Cy3 TM -dUTP와 Cy5 TM -dUTP를 그 림 3에 나타낸 비율로 혼합하여 GMS 417 Arrayer TM 을 이용 하여 slide glass에 spotting한 뒤 GMS 418 Array Scanner TM 로 scanning하였다(scanning 파장 : Cy3 TM -dUTP : 532 nm, Cy5 TM -dUTP : 635 nm). 그 다음 각 spot 내의 각각의 형광 시그널의 강도를 해석 소프트웨어 [ImaGene TM ]을 사용하여 측정하여 그 비율을 계산하였다. 그림 2 GMS 418 Array Scanner TM Scanning bed에 독자적인 scanning 방식(Flying Objective Microscope)을 채용한 confocal laser scanner이다. 이 방식으로 다른 scanner보다 압도적인 고속으로 scanning 할 수 있다 (약 3분/slide glass 전면). 그림 3 Cy3 TM 과 Cy5 TM 의 혼합비 100 nM 100 nM Cy3 TM -dUTP Cy5 TM -dUTP 1 : 9 2 : 8 3 : 7 4 : 6 5 : 5 6 : 4 7 : 3 8 : 2 9 : 1
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Life Science &Biotechnology No.112
그림 1 GMS 417 ArrayerTM
Spotting bed에 독자적인 spotting 방식(Pin&Ring법)을 채용한 arrayer이다. 다른 spotting방식과 비교하여 spot size를 아주 정확하게 조절할 수 있어 고 도의 chip을 제작할 수 있다.
발현해석
((11)) GGMMSS ssyysstteemm의의 평평가가유전자 발현을 해석하는 경우 대상 시료와 대조 시료를
각각 다른 형광물질로 표식하여 동일한 DNA chip상에서hybridization한 후 각각의 형광을 검출함으로써 발현량의 비율을 조사한다. 정확한 검출을 위해서는 각 형광물질양의 비율이 그대로 발현량의 비율로 반 되는 것이 대전제이다. 만약 어느 한쪽의 형광물질이 강하게 검출되어 버리면 정확한발현량의 비율을 얻을 수 없다. 따라서 GMS system이 발현량의 차이를 정확하게 검출할 수 있는지를 시험해 보았다.
[[실실험험방방법법]]우선 형광기질 analogue Cy3TM-dUTP와 Cy5TM-dUTP를 그
림 3에 나타낸 비율로 혼합하여 GMS 417 ArrayerTM을 이용하여 slide glass에 spotting한 뒤 GMS 418 Array ScannerTM로scanning하 다(scanning 파장 : Cy3TM-dUTP : 532 nm,Cy5TM-dUTP : 635 nm). 그 다음 각 spot 내의 각각의 형광시그널의 강도를 해석 소프트웨어 [ImaGeneTM]을 사용하여측정하여 그 비율을 계산하 다.
그림 2 GMS 418 Array ScannerTM
Scanning bed에 독자적인 scanning 방식(Flying Objective Microscope)을 채용한 confocallaser scanner이다. 이 방식으로 다른 scanner보다 압도적인 고속으로 scanning 할 수 있다(약 3분/slide glass 전면).
그림 3 Cy3TM과 Cy5TM의 혼합비
100 nM 100 nMCy3TM-dUTP Cy5TM-dUTP
1 : 9
2 : 8
3 : 7
4 : 6
5 : 5
6 : 4
7 : 3
8 : 2
9 : 1
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((22)) DDNNAA mmiinniicchhiipp을을 이이용용한한 발발현현해해석석
[[실실험험방방법법]]사람 유전자 80종류를 RT-PCR로 증폭(각각 약 700 bp)하
여 GMS 417 ArrayerTM를 이용하여 slide glass에 spot(spot size: 직경 150 ㎛)한 뒤 고정화 처리하여 DNA minichip을 제작하 다. 배양세포 MKN1의 mRNA 2 ㎍을 AMV RTase XL로 역전사반응을 실시하여 Cy3TM-dUTP로 표식하 다. 동일한 방법으로 배양세포 NUGC4의 mRNA 2 ㎍을 역전사반응후 Cy5TM으로 표식하 다. 이 2개의 시료를 혼합하여 DNAminichip에 hybridization시켜 GMS 418 Array ScannerTM로scanning하 다. 해석용 소프트웨어 [ImaGeneTM]을 사용하여scanning data를 해석하 다.
[[결결과과]]Scanning 결과를 그림 5에, 해석결과를 그림 6에 나타내었
다. GMS 418 Array ScannerTM에 부속되어 있는 해석 소프트웨어 [ImaGeneTM](TaKaRa code BD001)은 DNA chip 실험에서 얻은 2개의 data를 취합하여 각 spot의 시그널 강도를 자동측정하고 해석결과를 Scatter Plot이나 원그래프로 표시해준다.
[[결결과과]]측정한 각 spot의 형광 시그널 양의 비율을 그림 4에 나타
내었다. GMS system은 4:6이라는 미묘한 형광물질간의 양비도 정확하게 검출할 수 있었다.
그림 6 해석결과윗 그림 : Scatter Plot (X축 : MKN1, Y축 : NUGC4)아랫 그림 : Gene Pie plot. 각 pie(원그래프)는 각 spot에 대응.
Pie의 size는 형광 시그널의 강도를 나타내며, 각 Pie 내의 적색/녹색의 비율은 발현비율을 나타낸다(적색 : MKN1, 녹색 : NUGC4).
Cy5 concentration/Cy3 concentration
660 nm signal(Cy5)
570 nm signal(Cy3)
Life Science &Biotechnology No.114
그림 7-1 합성 oligonucleotide의 일부각 25 mer oligonucleotide의 13번째 염기를 A, C, G, T(적색으로 표시)로 바꾸고, 나머지 서열은 동일하게 합성하 다.
그림 7-2 Spotting 위치각종 합성 oligonucleotide를 두줄씩 spotting하 다. Wild type의 경우 이 그림의 붉은 spot이 강하게 hybridize하 다.
그림 8 Wild type probe(Cy3TM 표식)의 각 온도에 따른 hybridization 결과65℃에서 wild type의 서열을 읽을 수 있었다.
G G T C A A G A G G
A
C
G
T
37˚C
50˚C
65˚C
A
C
G
T
A
C
G
T
변이해석DNA chip을 이용하여 human c-Ki-ras/61의 변이점 주변의
10 bp를 sequencing(Sequencing by Hybridization ; SBH) 하다.
[[실실험험방방법법]]5’말단을 아미노 수식한 25 mer의 oligonucleotide를 합성하다. 이 때 중앙의 10염기서열 각각의 특정부위를 A, C, G,
T로 바꾸고 기타 서열은 완전히 일치하도록 1염기씩 겹치지않게 합성하 다(그림 7-1). 합성한 각종 oligonucleotide는GMS 417 ArrayerTM을 사용하여 slide glass에 spot(spot size :직경 150 ㎛, 2개씩 spot)하고 고정화처리를 하여 SBH용DNA minichip을 제작하 다(그림 7-2). 다음에 human c-Ki-
ras/61의 변이점을 가지는 ras Mutant set(TaKaRa Code 7243)의 wild type 및 Lys mutant, Pro mutant를 주형으로 하고, 형광 primer(Cy3TM, Cy5TM)를 사용한 PCR로 128 bp의 형광표식probe를 얻었다. 이 probe를 SBH용 DNA minichip에hybridization하여 GMS 418 Array ScannerTM로 scanning하 다.
[[결결과과]]Wild type probe(Cy3TM 표식)을 37℃, 50℃, 65℃에서
hybridization한 결과를 그림 8에, mutant probe(Cy3TM 표식)을65℃에서 hybridization한 결과를 그림 9에 나타내었다. 또,Cy5TM로 표식한 wild type probe와 Cy3TM로 표식한 Promutant probe를 혼합한 뒤 DNA chip에 hybridization하여 635nm와 532 nm에서 scanning한 결과를 그림 10에 나타내었다.
Life Science &Biotechnology No.11 5
그림 9 Mutant probe(Cy3TM 표식)의 65℃에서의 hybridization변이부위(Lys mutant의 경우 4번째 염기, Pro mutant의 경우 5번째 염기)의 시그날이 가장강하고, 그 전후 염기의 시그날은 불명확하다. 이러한 pattern이 생기는 것은 변이가 존재함을 암시해 주는 것이다.
G G T A A A G A G G
A
C
G
T
Lys 변이
G G T C C A G A G G
A
C
G
T
Pro 변이
그림 10 동일 DNA chip상에서 wild type probe(Cy5TM 표식)과 Pro mutantprobe(Cy5TM 표식)의 50℃에서의 hybridization
wild type을 control로 mutant도 동시에 검출할 수 있었다.
G G T C A A G A G G
A
C
G
T
wild type(635 nm)
G G T C C A G A G G
A
C
G
T
Pro 변이(532 nm)
표준사양[GMS 417 ArrayerTM]TTaaKKaaRRaa CCooddee GM100SSppoott ssiizzee 100, 150, 200 μm(표준사양 : 150 μm)SSppoott ssiizzee 오오차차 ±10%SSppoott 간간격격 10 μm 단위로 자유 설정SSppoott 속속도도 4 spot/초사사용용 sslliiddee ggllaassss 표준 size : 25.4 mm × 76.2 mm
set 매수 : 1~42매(표준 slide glass 사용시)사사용용 mmiiccrrooppllaattee 96 well 또는 384 well
ring으로 reserve한 sample 용액을 pin으로 42매의 slide glass에 spotting할 수 있으므로 아주 빠르게 spotting 할 수 있다.
DNA Chip 제작장치
GMS 417 ArrayerDNA Chip 제작장치
GMS 417 ArrayerTaKaRa Code GM100GMS 417 Arrayer는 독자적으로 개발한 pin & ring 방식을 채용한 DNA chip 제작용 micro spotting 장치이다.96 well 또는 384 well titer plate 속의 시료용액을 slide glass 위에 50~300 µm의 크기로 spotting 한다.
▶ 특징 정확하고 재현성이 높은 spotting 실현pin을 교환하므로서 spot 크기 50 µm의 고 도array가 가능고속 spottingsoft touch spotting이므로 slide glass 뿐만 아니라cover glass나 membrane filter에도 spot 가능
spot size : 50~300 µmspot 간격 : 10 µm 단위로 자유설정spot 속도 : 4 spotting/sec외형치수 : 80 cm(W)×53 cm(D)×50 cm(H)기기중량 : 65 kg
TaKaRa Code GM200Confocal microscopy 기술을 근간으로 독자의 scanning 방식(wide field microscopy)을 채용한 DNA chip 해석용 형광scanning 장치이다.
▶ 특징 고속 scanningautofocus 기능으로 정확한 scanninglaser 출력 monitering 기능으로 안정한 scanning대구경 lens를 채용하여 높은 집광능력으로 고감도scanning 실현
Saccharomyces cerevisiae의 형질전환체에서 선택 markerAUR1-C을 함유하는 불필요한 배열을 제거하기 위한 DNA배열을 삽입하여 간단한 방법으로 marker 제거 clone을 우선적으로 선별할 수 있도록 구축한 shuttle vector이다.pAUR135는 형질전환체 선택 marker AUR1-C 유전자를marker 제거주 선별용 GAL10 promoter에 연결한 GIN11M86서열을 가진다. AUR1-C는 실험실효모, 야생형효모, 실용효모 어느 것이든 관계없이 S. cerevisiae에 Aureobasidin A 내성을 부여해 주는 유전자이다1, 2).
GIN11M86을 다량 발현하면 생육저해를 유발하는 자살활성3, 4)을 나타낸다. pAUR135에 의한 형질전환으로 얻은Aureobasidin A 내성 형질전환체를 galactose medium에 이식하면, GAL10 promoter 활성이 유도되어 GIN11M86이 다량발현한다. 따라서 GIN11M86을 함유하는 대부분의 혈질전환체는 생육저해를 받으나 저빈도의 상동재조합(homologousrecombination)으로 생긴 vector 역(AUR1-C나 GIN11M86선택 marker를 함유)을 결실한 주만이 우선적으로 생육한다.여기에는 Aureobasidin A 감수성의 목적 형질전환체와 원래의 형질로 수복한 주 등이 포함된다. 따라서 pAUR135를 다시 형질전환에 사용할 수 있다. 또 AUR1-C marker 뿐만 아니라 vector 배열도 제거되므로 실용효모의 육종에 있어서불필요한 배열이 남을 염려는 없다5). pAUR135는 변이도입이나 유전자기능의 파괴 등에 사용할 수 있다.
원리Marker 제거주 선별의 원리를 stop codon의 도입을 예로
들어 그림 1에 소개하 다.
Plasmid(그림 2)pAUR135 vector는 cloning site로서 Sph I, Sse8387 I, Sma I,
Kpn I, Sac I, EcoR I을 가진다. Marker 제거주 선별용인GAL10p-GIN11M86은 Yamaguchi대학 공학부 응용화학공학과의 Akada R. 교수가 개발한 것이다(Q&A 참조).
그림 1 Marker 제거주 선별의 원리(stop codon 도입의 경우)
사용법 (유전자 기능을 파괴하는 경우)
((11)) 유유전전자자 기기능능 파파괴괴용용 단단편편의의 ppAAUURR113355로로의의 삽삽입입1) 파괴하고자 하는 유전자의 일부 역(pAUR135를 절
단하지 않는 제한효소로 한 군데 절단할 수 있는 최대한 긴 역)을 PCR 등으로 조제한다.
2) Stop codon의 도입(LA PCR in vitro Mutagenesis Kit[TaKaRa Code RR016])이나 일부 역을 결실시킴으
3) 준비한 유전자 기능 파괴용 단편을 pAUR135의 cloningsite에 삽입하고 plasmid를 정제한다.
4) Stop codon 도입용 단편의 1개의 절단부위를 절단하여 직선형태의 plasmid로 만든다.
((22)) 효효모모의의 형형질질전전환환법법((본본지지 11호호 pp..4400~~4444 참참조조))획득한 형질전환체의 유전자 파괴 여부를 형질의 변화나
genome의 검사 등으로 확인한다.
((33)) MMaarrkkeerr 제제거거주주의의 선선별별1) 유전자를 파괴한 형질전환체 수 개~10개 clone을 각
각 YPGalactose plate(2% Galactose, 2% Polypeptone,1% Yeast extract)에 streak하여 single colony를 분리한다.
2) YPGalactose plate에서 생육한 열개~수십개의 colony에 대해 Aureobasidin A 감수성 및 유전자 기능 파괴를 확인하고 marker가 제거된 유전자 기능 파괴주를선별한다.
그림 2 pAUR135 DNA의 개요
Vector의 cloning site의 제한효소 배열을 5’말단에 부가한primer(forward : Sma I ; reverse : Sac I or EcoR I)을 제작하여 출아효모의 genomic DNA를 주형으로 하여 ADE1,ADE2 유전자의 일부 역을 PCR로 증폭하 다.
ADE1 : 1개의 SnaB I 절단부위를 가지는 약 850 bpADE2 : 1개의 Xba I 절단부위를 가지는 약 1.2 kbp
각 단편을 일단 pUC119 vector에 삽입하여 LA PCR invitro Mutagenesis Kit(TaKaRa Code RR016)로 1개의 제한효소 절단부위 근방에 stop codon을 2개 도입하 다. 그림 1의(A) 또는 (B)에 해당하는 상동 역의 비율은 표 1과 같이설정하 다. Stop codon 도입 단편을 pAUR135 vector의 SmaI-Sac I 또는 Sma I-EcoR I 부위에 삽입하여 ADE 유전자 파괴용 plasmid로 이용하 다.
ADE 유전자 파괴용 plasmid를 각각 SnaB I, Xba I으로 한군데 절단한 직쇄 형태로 형질전환하 다. 숙주 1배체 효모로서는 galactose 자화성이 높은 DKD-5D주와 다소 약한 13-1a주를 사용하 다. 형질전환 후 YPD 액체배지에서 하룻밤배양하고 0.5~0.8 ㎍/ml의 Aureobasidin A를 함유하는 YPDplate에 적당히 도포하 다. 30℃에서 3일간 배양한 후 각각으로부터 103 clone/㎍ DNA정도의 형질전환체를 얻었다. 32clone씩 pick-up하여 adenine 요구성 및 AbA 내성이 존재하는지를 확인하 다.
Adenine 요구성(ADE 유전자의 기능파괴)을 확인한 형질전환체 중 8개의 clone을 이쑤시개 등으로 YPGalactose plate에 streak하고 30℃에서 배양하 다. 모든 형질전환체에서 명확한 생육저해가 일어났다. GIN11M86의 다량 발현을 확인하다. Galactose 자화성이 강한 DKD-5D주를 숙주로 한 형질
전환체에서는 배양 2~3일째에 상동재조합으로 marker가 제거된 colony의 생육을 확인하 다(그림 3). 생육 colony에는adenine 요구성을 나타내는 적색의 것과 원래의 상태로 수복한 것으로 판단되는 백색의 것이 혼재해 있었고, 이들 대부분(ADE1은 98% 이상, ADE2는 98.5% 이상의 clone)은Aureobasidin A 감수성을 띠었다(그림 4 및 표 1 참조). 또각 단계의 clone으로부터 DNA를 정제하고 PCR 및 Southernhybridization으로 marker(pAUR135)가 제거되었음을 확인하다(그림 5). 한편 galactose 자화성이 약한 13-1A주를 숙주
로 한 실험에서는 4~5일만에 YPGalactose plate에서 colony의생육을 관찰할 수 있었고, DKD-5D주의 경우처럼 adenine 요구성 clone과 수복한 clone이 혼재하 다. 단, marker 제거율은 ADE1에서는 92% 이상, ADE2에서는 95%이상으로 약간낮았다. 이러한 과정을 통해 얻은 DKD-5D, 13-1A주의ADE1 기능파괴주 및 ADE2 기능파괴주는 숙주균과 동일한수준의 Aureobasidin A 감수성을 나타내었고, pAUR135에 의한 반복 형질전환도 가능하 다.
* 그림 1의 (A) 또는 (B)가 되는 상동 역의 비율(A) : (B) = (파괴체가 되는 상동 역) : (원래의 상태로 수복된 상동 역)
<pAUR135를 절단하지 않는 제한효소(TaKaRa 제품)>Acc III, Afl II, Aor51H I, Bal I, Bgl II, Bln I, Bpu1102 I, BssH II,BstX I, Cla I, Cpo I, Eco52 I, Eco81 I, Fba I, Hind III, Mlu I, Nae I,Not I, Nru I, Nsp V, PmaC I, PshA I, Sac II, Sal I, Sfi I, SnaB I,Spe I, Tth111 I, Van91 I, Xba I, Xho I
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1
3
2
4
1 : 숙주주 DKD-5D2~4 : 형질전환체
그림 3 YPGalacotose plate상의 streak(30℃, 3일)
그림 5 Southern hybridization에 의한 marker(pAUR135) 제거의 확인각 주에서 얻은 genomic DNA를 형질전환에 사용한 plasmid를 절단하지 않는 제한효소Aor51H I과 Nsp V로 절단하여 agarose gel electrophoresis를 하 다. Probe로는 유전자 파괴에 이용한 ADE2의 DNA 단편(A)과 pUC18(B)를 사용하 다.
1) Hashida-Okado, T., Ogawa, a., Kato, I. and Takesako, K.(1998) FEBS Letters 425, 117-122.
2) Hashida-Okado, T., Ogawa, A., Endo, M., Takesako, K. andKato, I. (1996) Mol. Gen. Genet. 251, 236-244.
3) Akada, R., Yamamoto, J. and Yamashita, I. (1997) Mol. Gen.Genet. 254, 267-274.
4) Kawahata, M., Amari, S., Nishizawa, Y. and Akada, R. (1998)Yeast 14, in press.
5) Akada R. (1998) 양조협회보 93, 113-119.
Q&AQ1 GIN11M86이란 어떤 DNA인가?A1 GIN11은 출아효모의 telomere ARS 역을 함유하
는 DNA 배열입니다. GIN11이 다량 발현하면 생육저해를 일으키나, ARS 활성은 생육저해활성과는 직접적인 관계가 없습니다. GIN11M86은GIN11에 인위적으로 변이를 도입하여 ARS활성을소실시킨 것입니다.
Q2 pAUR135는 출아효모라면 모든 주에 사용할 수있는가?
A2 GAL10 promoter를 이용한 유도발현을 하므로galactose 자화성이 없는 주에는 사용할 수 없습니다. 우선 숙주주의 galactose 자화성을 확인해 보시기 바랍니다.[[11배배체체 효효모모의의 경경우우]]galactose 자화성이 높은 주에서는 사용법에 나타낸 방법으로 marker가 제거된 clone을 아주 간단하게 얻을 수 있습니다. 일부분은 효율이 떨어질수 있으나 galactose 자화성이 다소 약한 주일지라도 marker 제거주의 선별이 가능합니다.
[[22배배체체 효효모모의의 경경우우]]역시 galactose 자화성이 중요합니다. 특히 실용효모의 경우, galactose plate상에서의 colony 생육에 차이가 발생하는 주가 많습니다. 예를 들면 galactose 자화성이 강한 일본 소주효모협회 제2호의 경우에서는 1배체와 거의 동등하게 생육저해가 일어나므로 marker의 제거를 기대할 수 있으나 미세한background colony가 생기기 쉬워 확실하게 single colony를 분리할 필요가 있습니다. 또 차이가 상당히 큰 일본협회대연 396호에서는 galactose 자화성이 좋은 colony만 생육저해 및 marker 제거가 일어나는 경향이 있어 다수의형질전환체로 검토하는 것이 좋습니다.한편 자화성이 약한 일본 청주효모 협회 7호 등에서는생육저해까지는 미치지 못하여 약한 생육억제가 전체적으로 관찰되었습니다. 따라서 일단은 형질전환체를YPGalactose의 액체배지로 1~3일간 진탕배양하여 숙주주와의 생육의 차이를 확인한 후, 상동재조합으로 marker제거주가 생육을 시작한 시점에서 YPGalactose plate에서colony를 분리하면 marker 제거체를 쉽게 얻을 수 있습니다.
Life Science &Biotechnology No.1110
Jun Yasuda
AP-PCR법은 사전에 염기서열의 정보가 없더라도 복잡한 genome DNA로부터 복수의 DNA 단편을 동시에 증폭할 수 있는 독특한 기술이다. 본 방법은 다형 marker의 분리를 비롯하여 사람 암에 있어서의유전자 이상의 해석 등 여러 분야에 응용되고 있다. 본 고에서는 그 원리에 대해 자세히 설명하고 기술적인 점에 대해서는 필자 등의 경험을 토대로 설명하 다.
단일 primer로 genome 내의 복수 역을 동시에 증폭하는 기술로 1990년에 Welsh와 McClelland가 개발한 것이다1). 이 방법의 가장 큰 특징은 주형인 genome DNA가 복잡하고 특히 서열정보가 없어도 PCR 증폭산물을 얻을 수 있다는 점이다. 증폭한 PCR 산물 중에는 다형을 나타내는 것도 있어소위 DNA fingerprint로 이용할 수 있다. 다형 marker를 간단히 얻는 방법은 주로 genome project가 그다지 진행되고있지 않은 박테리아, 식물 등 생물의 genome 해석에 주로이용한다2, 3). 특히 최근에는 사람 암세포의 유전자변이 해석4~6)이나 송사리에 방사선을 조사하여 DNA 손상을 해석하는일7)에도 위력을 발휘하고 있다. 여기에서는 주로 사람 암염색체의 양적변화를 해석할 때의 protocol에 대해 설명하으나 실험시 주의하여야 할 점은 다른 목적의 실험에서도마찬가지로 적용된다.
I. AP-PCR의 원리
그림 1에 AP-PCR의 원리를 나타내었다. AP-PCR에서는처음 수회의 PCR 반응시에 primer의 annealing 온도를 낮추고(37~50℃) 또한 반응액의 Mg2+ 이온 농도를 높여(4.5~5.0mM) primer가 annealing할 때의 서열특이성을 줄인다. 그 결과 단일 primer(AP primer)에 mismatch가 삽입된 형태로genome의 복수부위에 annealing하여 각 3’말단끼리 마주본경우에 증폭반응이 시작된다. 전형적인 AP-PCR에 의해 사
람 genome DNA에서 5개부터 많은 경우에는 100개 정도의독립적인 PCR 산물을 얻을 수 있다8). 겔 전기 동으로 이들PCR 산물을 그 길이에 따라 분리하여 DNA fingerprint로서관찰한다.
그림 2에 실례를 나타내었다. 이는 사람 폐암 증례를 AP-PCR fingerprint로 해석한 것으로 약 20개의 강한 signal을 나타내는 밴드와 다수의 약한 signal을 나타내는 밴드가 검출되었다. 이 signal의 강약 패턴은 실험조건을 바꾸지 않는 한재현성 있게 나타난다. 밴드의 크기는 약 300 bp~2 kbp 사이 다. 길이의 다형성을 갖는 밴드는 S밴드 다. 이처럼AP-PCR로 AP Primer 1개당 평균 1~2개의 다형 marker를얻을 수 있다. 또 암세포의 특이적인 변화로서 몇몇 밴드가양적변화를 일으킴을 확인할 수 있었다(그림의 삼각형 화살표).
주형 서열이 어떤 조건을 충족했을 때에 AP-PCR 반응으로 증폭되는 지는 아직 확인되지 않았다.
AP-PCR의 경우 경험적으로 AP primer의 3’말단 6~7염기분이 일치하지 않으면 주형과의 annealing 부위에 효율적으로 결합하지 않는다고 알려져 있다. 한편 필자 등의 경험으로는 3’말단에서 11~12염기만큼 떨어진 두 부위에 변이를주는 것만으로 fingerprint의 패턴은 크게 변화하 다. 따라서3’말단이 일치하여야 하며, primer 서열 전체에서 GTmismatch 등의 열역학적으로 비교적 안정한 mispairing 등을고려하거나 두 primer 사이의 역에서 PCR 증폭반응이 쉽게 일어날 수 있도록 해야 한다.
AP-PCR의 하나의 특징은“반정량성”이다. 즉 각 PCR 산물을 검체간에 비교하면 그 검체의 주형이 되는 서열의 양
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그림 1 AP-PCR의 원리Primer가 실제로 annealing하는 정도에 대해서는 아직 불명확하나 mismatch가 허용되고 있슴을 산 모양으로 나타내었다. 3번째 이후의 cycle에서는 반응이 경합적으로 일어난다. 짝을 찾지 못한 primer가 신장반응하여 background를 형성한다.
비를 반 할 수 있다. 예를 들면 그림 2에서 X염색체 유래의밴드(B0 및 G) signal은 여성의 것으로 확실히 남성보다는강하다. 이는 세포내 X염색체의 copy 수의 차이(여성은 2개,남성은 1개)를 반 하는 것이다. 반정량성에 대하여 엄 한실험적 확인을 거치지는 않았다. AP-PCR과 아주 유사한 원리를 갖는 LS-PCR(low stringent PCR)로 특이적으로 증폭되는 목적의 PCR 산물과 목적 대상이 아닌 비특이적 PCR 산물 사이에 완전한 경합이 일어나 아주 높은 정량성을 나타낸다는 보고가 있었다. 그 결과를 바탕으로 AP-PCR에 대해유추해 보면 적어도 2개의 요소가 AP-PCR 산물의 정량성에 관여하는 것 같다. 즉, 그 하나의 요소는 반응 후반부의배열 특이적인 cycle에서 주형 DNA는 그 단계까지 생산된PCR 산물이라는 것이다. 이는 동일 primer에 의해 증폭되기때문에 경합적 반응을 보증할 수 있다10). 또 다른 하나의 요소는 초기의 완만한 조건에서는 PCR효율이 낮고, PCR cycle
이 증폭의 직선성을 유지하는 범위로진행한다는 것이다. AP-PCR 산물 중특정 PCR 산물이 어느 정도 생산되었는지를 고찰하 다. Mismatch가 허용되는 경우 polymerase 반응이 잘 일어날 확률을 부위별로 각각 P1, P2라 하고 완전히 match한 경우는 polymerase반응이 100% 일어난다(즉 1 cycle로 2배가 된다)고 가정한다.
반응튜브 내의 주형 DNA의 copy 수를 N0로 한다.또 PCR시의 incorporation error를 무
시한다면 PCR 산물의 copy 수는 다음식으로 계산할 수 있다.
Nχ=N0P1P2(2χ-χ-1)
P1=P2=0.1, χ=5일때, Nχ=0.26·N0
가 되어 원래의 주형과 동일한 copy수가 되려면 다시 2 cycles가 필요함을알 수 있다. 따라서 동량의 주형 DNA를 사용한 통상의 PCR과 비교하면 위의 경우에는 30-5-2=23 cycles로 통상의 PCR에 비해 2~7 cycles 적다. 따라서 보다 정량성을 유지하는 범위 내에서 증폭이 이루어 지고 있슴을 추측할수 있다.
* 10× PCR Buffer를 사용할 경우에는 그 내용물을 확인하여 MgCl2의 양을조절한다.
전기 동
1번째 cycle : mismatch를 수반한 채 annealing하고 신장반응을 한다.
2번째 cycle : primer는 mismatch를 수반하여 annealing하지만, 3’말단에서는 정확하게 primer의 배열을복제한다.
3번째 이후 : 새로 복제된 DNA 단편에서 효율적인 PCR 반응이 일어난다.
제 13염색체3’
5’
5’
5’5’
5’5’
5’5’
5’
Ch. 13
Ch. 20
5’
3’
3’
3’
3’
3’
제 20염색체
제 13염색체
제 20염색체
제 13염색체 유래
제 20염색체 유래
Life Science &Biotechnology No.1112
앞의 시약을 혼합한 뒤 Thermal Cycler로 아래의 프로그램에 따라 PCR을 실시하 다.
94℃에서 5분 반응 후, 94℃에서 30초, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 cycle을 5회 실시하고, 이후는 94℃ 15초, 60℃ 15초, 72℃ 1분을 25회 반응한 뒤 72℃ 7분간 신장반응하여 종료한다.
PCR 반응액 5 ㎕를 취하여 12 ㎕의 formamidide로 희석한다.
22.. 겔겔 전전기기 동동아래에 기술한 제조법은 GENOQUENCER 전기 동장치
(ATTO사)를 이용한 것이다. 이 실험에서는 PCR-SSCP와같이 엄 한 온도조절이 필요없으므로 이러한 장치가 없다고 해서 실험이 안되는 것은 아니다.
Mili Q H2O로 약 90 ml까지 채우고 magnetic stirrer로urea를 완전히 녹인 후 최종적으로 100 ml로 채운다. 내경0.2 μm의 필터로 여과한 다음 용액이 든 비커를 10~20분
정도 얼음물 속에 담가 용액을 충분히 냉각한다.
유리판(세로 40 cm×가로 30 cm)의 조립은 통상의 poly-acrylamide gel과 같은 방법으로 세 변을 테이프로 봉한다.Spacer는 Stratagene사의 Wedge Spacers(0.4~1.2 mm, Cat.400138)를 사용하고 고무는 동 회사의 64 well용 shark toothcomb(400125)를 사용하 다. 이 spacer는 GENOQUENCER장치의 유리판에 비해 약간 길므로 두꺼운 쪽의 끝을 잘라낸다. 또 이 spacer는 폭이 넓으므로 세로로 잘라 1 셋트분을1개로 만들 수도 있다. 냉각한 겔에 100 ㎕의 TEMED를 넣고 혼합하여 유리판 사이에 그대로 주입하여 제조한다. 겔이굳을 동안(1 시간 이상) 전기 동장치를 셋트한다.
전기 동 완충액으로는 1× TBE를 사용하고 정전력은 55W를 유지한다. 온도조절은 필요없으나 순환펌프를 사용하는경우에는 55℃에 설정한다. 위의 조건으로 30분간 pre-run한후 시료를 2.5 ㎕씩 loading 6시간 30분간 전기 동한다. 전기동이 끝나면 gel dryer로 건조(80℃, 1시간 30분)하고 형광
펜으로 위치를 표시한 후 실온에서 하룻밤 동안 X선 필름을노광한다. 이 조건으로 약 300 bp~2 kbp 까지의 PCR 산물을 확인할 수 있다.
33.. 산산물물의의 cclloonniinngg해석하고자 하는 밴드는 잘라내어 cloning할 수 있다4, 6).
Cloning한 산물이 실제로 AP-PCR fingerprint에서 관찰한 밴드와 동일한 것인지를 최종적으로는 PCR fingerprint에 대한Southern Blotting을 실시하여 확인할 필요가 있다8).
목적 밴드는 건조한 겔에서 약 2 × 2 mm의 크기로 잘라낸다. 이에 대해서는 PCR-SSCP법의 각종 매뉴얼을 참고한다. 이 겔은 다음 해석에 절대 필요하므로 잘 보관한다. 잘라낸 겔을 100 ㎕의 Mili Q H2O에 넣은 후 80℃에서 15분간 가열하여 PCR 단편을 용출한다. 용출한 산물은 동일한 primer를 사용하여 통상의 방법으로 PCR을 실시한 후 TA cloning법으로 clone화 한다.
위의 시약을 혼합한 후 Thermal Cycler로 다음의 프로그램으로 PCR을 실시한다.
94℃에서 5분간 변성한 후 94℃ 15초, 60℃ 15초, 72℃ 1분의 조건으로 30회 반응하고, 72℃ 7분간 신장반응을 한 뒤종료한다.
PCR 산물을 아가로스 겔 전기 동으로 확인하여 TAcloning을 실시한다.
그림 2 AP-PCR본문에 나타낸 조건으로 실험하 다. 이는 사람 폐암조직 내 염색체의 증감을 해석한예이다. N은 정상조직 유래, T는 암조직 유래의 DNA fingerprint이다. 두개씩 나열한 것은각각 25 ng, 50 ng으로 시료의 양을 바꾸어 재현성을 확인하기 위해서이다. 사진의 왼쪽에는 각 밴드의 이름을 오른쪽에는 크기를 나타내었다. Case 3은 여성이다. ▲는 signal의 증가를, ▼는 signal의 감소를 나타낸다. 오른쪽 밑에는 밴드 S의 다형을 나타낸 각allele를 삼각형으로 표시하 다.
통상 AP-PCR 산물은 polyacrylamide gel로 전기 동한다.Polyacrylamide gel로부터 DNA를 transfer하기 위해서는 모세관 원리로는 곤란하여 electro-blotting을 실시한다. 건조한 변성 polyacrylamide gel의 DNA를 electro-blotting을 이용하여 효과적으로 transfer하기 위해서는 조건검토가 필요하다. 그러나 여기서는 PCR 산물을 이용하므로 분자량이 비교적 작고copy 수가 많은 상태이므로 모세관현상에 의한 DNA의transfer로도 1개의 DNA 단편의 확인이라면 통상 문제없이Southern Blotting으로 signal을 확인할 수 있다.
또 alkali 처리로 polyacrylamide가 분해된다는 설도 있으나거의 문제가 되지는 않는다.
III. 유의점
우선 AP-PCR에 사용하는 primer는 현 단계로서는 시행착오를 거치면서 유용한 것을 찾을 수 밖에 없다. 실제로 새로운 것을 제작하려 한다면 다른 연구자가 별도의 목적으로합성한 primer를 받아 확인해 보는 것도 좋다. 일단은 GC 함량이 높은 것이 다형과 밴드가 많이 출현할 것이다. 필자 등은 몇개의 시료를 실제로 시험해 보고 밴드 패턴의 결과에따라 primer를 선택하 는데 대체로 10~20% 정도가 아주좋은 primer 다.
다음으로는 재현성을 유지하는 것이 매우 중요하므로 아래의 사항들에 유의한다.
AP-PCR 반응은 각종 시약의 질, 농도 등에 향을 크게받기 때문에 실험을 자주하는 경우에는 PCR에 사용하는 시약류를 한번에 대량으로 조제한 후 분주하여 freezer에 보존해 두는 것이 좋다.
AP-PCR은 반응에 사용하는 내열성 polymerase에 따라 나타나는 밴드 패턴이 다른 경우가 있다. 동일한 원리을 적용하는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)9)는 똑 같은 재조합 Taq Polymerase라도 제조회사에 따라 패턴이 다르게 나타난다는 보고가 있다11). 최근 Perkin Elmer사는Stoffel fragment라는 exonuclease 활성이 없는 내열성polymerase로 AP-PCR, RAPD 등을 보다 높은 재현성으로실시할 수 있다고 선전하고 있다12).
실험의 재현성을 좌우하는 요소의 하나로 주형이 되는genome DNA의 순도를 들 수 있다. 필자 등도 사람의 각종종양 중에서 조직중에 다당류를 다량 함유하는 종양 유래DNA와 함유하지 않는 조직의 DNA를 동일한 조건으로 반응하 으나 나타나는 밴드 패턴에 차이가 생기는 경우가 있었다.
실제로 결과의 해석상의 문제점으로서, 상기 실험조건으로전기 동을 실시한 경우 1개의 밴드 내에 복수의 AP-PCR산물이 존재하는 경우가 있다. 이것은 예를 들면 다형성을갖는 AP-PCR 산물의 다형성 모드(양성/음성다형 또는 길이의 다형)를 판단하는 데 중요하다. 또 각 PCR 산물의 양적변화로부터 암세포의 산물이 국재하는 염색체의 양적 이상을 추정하고자 할 경우에는 이러한 밴드의 형태로서는 해
석하기가 곤란하다.
맺음말최근에 필자 등은 사람의 AP-PCR 각 산물의 염색체 국
재를 사람/설치류 잡종세포의 DNA panel을 이용하여 비교적 간단하면서도 거의 모든 밴드를 결정할 수 있는 방법을개발하 다(SHARP법). 이 방법으로 필자 등은 약 4~5개의primer로 사람의 모든 염색체에 대하여 AP-PCR 산물로 최저 한 부위를 확보할 수 있슴을 판명하 다. 이 방법으로 위에서 서술한 바와 같이 밴드 내에 PCR 산물이 복수 존재하는 경우도 밝혀 내었다. 또한 이 방법으로 암세포 염색체의양적 이상을 분자생물학적으로 해석하는 방법이 현실화 되었다. 금후에는 형광색소에 의한 AP-PCR의 자동해석 등 임상분야에서의 응용도 기대할 수 있을 것이다.
2) Welsh, J., McClelland, M. : in The polymerase chain reaction(ed. Mullis, K. B., Ferrè, F., Gibbs, R. A.), pp. 295-304,Birchaüser, Boston (1994)
3) Sorbral, B. W. S., Honeycutt, R. J. : in The polymerase chainreaction (ed. Mullis, K. B., Ferrè, F., Gibbs, R. A.), pp 304-319, Birchaüser, Boston (1994)
4) Ionov, Y., Peinado, M. A., Malkhosyan, S., Shibata, D.,Perucho, M. : Nature, 363, 558-561 (1993)
5) Kohno, T., Morishita, K., Takano, H., Shapiro, D. N., Yokota,J. : Oncogene, 9, 103-108 (1994)
6) Peinado, M. A., Malkhosyan, S., Velazquez, A., Perucho, M. :Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America, 89, 10065-10069 (1992)
7) Kubota, Y., Shimada, A., Shima, A. : Mutation Research, 283,263-270 (1992)
8) Perucho, M., Welsh, J., Peinado, M. A., Ionov, Y.,McClelland, M. : in Methods in Enzymology, 254, pp. 275-290, Academic Press, Orland (1995)
9) Williams, J. G., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A.,Tingey, S. V. : Nucl. Acids Res., 18, 6531-6535 (1990)
10) Siebert, P. D., Larrick, J. W. : Nature, 359, 557-558 (1992)11) Schierwater, B., Ender, A. : Nucl. Acids Res., 21, 4647-4648
(1993)12) Lawyer, F. C., Stoffel, S., Saiki, R. K., Chang, S. Y., Landre,
P. A., Abramson, R. D., Gelfand, D. H. : PCR Methods &Applications, 2, 275-287 (1993)
Life Science &Biotechnology No.1114
Hiroyuki Aburatani, Tatsuhiko Kodama
RDA법은 복잡한 genome간의 변이를 민감하고 특이적으로 검출하는 방법으로 positional cloning의 제 1단계에서 흔히 사용한다. 이 방법은 whole genomic PCR로 증폭한 genome DNA의 일부(representation)를subtraction법으로 비교함으로써 변이 DNA를 검출, 증폭하는 방법이다. 암세포의 유전자변이와 미지의병원체 검출, 다형성 marker의 제작 등에 응용할 수 있으며 기존의 유전자 지도가 없어도 유전해석이가능하다. 필자 등은 RDA법을 이용하여 각종 암세포 DNA의 해석을 시도하 으며 이미 자궁경부암,신장세포암, 위암 등에서 동형결실 역을 검출하 다. 또 암억제유전자좌의 상세한 동정도 시도하기에, 이 과정을 PCR법의 응용기술로 소개한다.
서론Genome 연구가 진전함에 따라 positional cloning에 의한 질
환유전자의 cloning이 급속도로 진행되고 있다. 그러나 그 제1단계인 질환유전자좌의 동정이 율속단계이다. 종래에는genome DNA의 변이를 검출하기 위하여 subtraction법을 널리 사용하 다. 일반적으로 한 검체(tester)를 대량의 다른 검체(driver)와 혼합함으로써 tester 검체에만 존재하는 DNA 단편을 농축 및 고정할 수 있다. 현재까지는 Y염색체에 특이적인 DNA 단편의 cloning, X염색체 결실부위로부터 DNA단편을 동정, 암세포에서 증폭한 DNA 단편을 검출하는데사용하 다. 그러나 고등동물의 genome은 복잡하여 종래의방법으로 이들을 비교하기에는 감도가 불충분하 다. 즉genome DNA의 복잡도(complexity)가 높으면 tester와 driver의 혼합액 내의 각 DNA의 농도를 충분히 높일 수 없어hybrid 형성이 불충분하므로 subtraction 조작을 여러번 반복해도 100배 정도밖에 농축(enrichment)할 수 없었으므로 효율적인 방법의 개발이 필요하 다. RDA(representationaldifference analysis)법은 PCR의 특성을 충분히 살린 기법으로whole genomic PCR로 증폭한 genome DNA의 일부(representation)를 subtraction법으로 비교하여 변이 DNA를검출 및 증폭하는 것이다1~3). PCR 과정에서 경합반응이 일어나면 짧은 DNA 단편이 높은 효율로 증폭된다. PCR 반응으로 얻은 DNA 단편의 pool은 genome 전체에 비해 복잡도가 낮기 때문에 효율적인 subtraction을 실시할 수 있다. 따라서 PCR로 선택한 산물을 기하급수적으로 증폭할 수 있다.Genome 전체를 해석하는 기술로는 RLGS(restrictionlandmark genome scanning)법 등이 있다. RLGS법은 1000개가 넘는 spot을 어떻게 하면 재현성 있게 2차원 전기 동으로 전개하는 방법과 spot의 위치 및 농도를 해석 처리하는문제가 해독의 포인트로 그 해상력은 spot의 수에 의존한다.이에 비해 RDA법으로는 특수 장치가 없어도 즉시 해석 가능한 marker를 얻을 수 있어 whole genome을 해독하는 기술로서 높은 해상력을 갖는다. 아래에 그 원리 및 응용례를 개설한다.
그림 1 RDA법의 개요두개의 서로 다른 genome간에는 제한효소 절단단편의 길이에 의한 패턴의 다형, 즉RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 비롯한 변이가 존재한다. 이들 genome간의차이를 검출하기 위하여 whole genomic PCR로 genome의 일부를 증폭하여 복잡도를 줄인 “amplicon”을 서로 비교함으로써 효율적인 subtraction을 할 수 있다.
I. RDA법의 원리(그림 1)
RDA법은 subtraction의 효율을 높이기 위하여 repre-sentation과 kinetic enrichment(농축)를 조합한 것이다.Representation 과정에서는 두개의 genome DNA를 제한효소로 소화한 후 adaptor 분자를 부가하여 whole genomic PCR로 genome의 일부인 0.1~1.5 kb의 DNA 단편을 증폭한다.즉 크기가 긴 DNA 단편은 PCR로 증폭하지 않고 일부만이증폭될 수 있으므로 genome의 복잡도가 낮아져 subtraction법의 효율을 높일 수 있다(그림 2a). 제한효소가 인식하는 염기배열의 빈도에 따라 genome 전체 중 2~15%를 선택적으로 증폭할 수 있어 비교하는 grnome의 크기를 60~450 Mb
제한효소 representation 복잡도BamH I 2% 1/55Bgl II 7~8% 1/13Hind III 12% 1/8
= 두 genome간의 차이
Amplicon DNA
변이산물
A B
“B-A” “A-B”
or
전기 동
Subtraction/Amplicon
Life Science &Biotechnology No.11 15
로 줄일 수 있다. 물론 representation을 높임에 따라 복잡도도 증가하기 때문에 6염기를 인식하는 효소 BamH I, Bgl II등이 적당하다. 이 과정에서 제한효소의 인식부위에 다형이존재하는지의 여부에 따라 amplicon DNA pool에서의representation의 유무에로 변환된 것이 된다. 다음으로 농축과정에서는 subtraction법과 PCR에 의한 동적농축의 조합으로 tester에 특이적인 DNA 단편이 증폭된다(그림 2b). DriverDNA amplicon에 포함되지 않은, 즉 tester DNA amplicon에만존재하는 DNA 단편은 hybridization 과정에서 homoduplex를형성하므로 tester DNA 단편에만 미리 adaptor 분자를 부가한 것이 되어 이후의 PCR 반응에서 기하급수적으로 증폭할
수 있다.
한편 driver DNA 분자와 double strand를형성한 heteroduplex는 한쪽 말단에만primer가 결합하기 때문에 직선적인 증폭이 일어나 목적의 DNA 단편을 선택적으로 증폭할 수 있다(그림 4). Subtraction과PCR 증폭을 반복할 경우 두개의 다른adaptor 분자를 준비하여 서로 이용함으로써 앞 step에서 생기는 비특이적인 산물의 증폭을 방지할 수 있다. Rosenberg 등4)
은 homoduplex 분자를 biotin화하여 선별함으로써 농축 과정을 더욱 효과적으로 하여 hybridization 과정을 간소화한 변형방법을 개발하 다.
1. 주의점RDA법은 contamination에 민감하다. 처
음의 실험에서는 virus DNA 등의 양성대조와 함께 실시하는 것이 바람직하다. 재현성을 높이기 위해서도 일련의 실험에서동일 batch의 완충액, 효소를 사용하는 것이 좋다.
AA.. DDNNAA의의 품품질질비교하는 검체간에 동일한 representation
을 얻기 위해서는 제한효소로 완전히 소화하는 것이 중요하다.
BB.. 시시약약의의 순순도도합성 oligonucleotide 등에서의 혼입물은
간혹 DNA ligase 등의 반응을 저해한다.Ligase 반응의 가부 판정을 위하여 ligase반응액의 일부를 전기 동하여 adaptor를부가함으로써 좋다. 윗쪽으로의 shift가 일어나는 지를 확인하는 것이 좋다. 또 충분한 증폭량을 얻기 위해서는 활성이 확실한 Taq Polymerase를 충분한 양으로 사용하는 것 또한 중요하다.
CC.. 반반응응의의 정정 도도정확한 tester와 driver의 비를 결정하는
것은 효율적인 subtraction에 있어 중요하다. Amplicon DNA의 농도를 확인하기 위
하여 기존의 방법에 따라 전기 동한 시료를 형광으로 정량해 보았으나 정량성이 부족하여 필자 등은 primer를 함유하는 저분자의 산물을 Centricon-100(Amicon) 및 Sephacryl 1-S300(Pharmacia) 등의 column으로 제거한 후 분광광도계로측정하 다.
II. RDA법의 응용
1. 새로운 병원체의 검출감염 세포 유래의 DNA를 tester로 하고 비감염 세포의
그림 2 RDA법(a) Representation 과정. 화살표는 제한효소의 절단부위를 나타낸다. 절단으로 생긴 짧은 DNA 단편만이 whole genomicPCR로 증폭되고 복잡도가 감소한 DNA pool, 즉 amplicon을 만든다. DNA 1과 DNA 2 사이에 존재하는 제한효소부위의차이는 tester와 driver amplicon을 구성하는 DNA 배열의 차이로 전환된다. 예를 들면 DNA 단편 A는 amplicon 1에 포함되지만 amplicon 2에는 포함되지 않는다. (b) 농축 과정. tester amplicon DNA에 새로운 adaptor 분자를 결합한 후 tester와driver를 혼합하여 열변성하고 hybridization한다. 재결합한 duplex 분자는 3종류로 존재한다. tester에만 포함되는 DNAstrand는 homoduplex를 형성하고 양 5’ 말단에 adaptor 분자를 갖는다. driver와 tester의 hybrid duplex로 한쪽 말단에만adaptor 분자를 갖는다. driver DNA 유래의 homoduplex로 adaptor 배열를 갖지 않는다. Primer가 결합하는 배열을 만들어 Taq Polymerase로 fill-in 한 후 PCR 증폭한다. 이 과정을 3~4회 반복하며 새로운 hybridization을 시작하기 전에 앞step과 다른 adaptor를 결합한다.
(a)
(b)
Amplicon 1(tester)
DNA 1
A B C
CA+B CA+B
CA+B
DNA 2
Tester
Tester
Primer
기하급수적 증폭증폭안됨 증폭안됨
제한효소 소화
변이산물
Cloning/해석
선택적 증폭(PCR)
Tester/Driver Driver
AdaptorDriver
열변성/Annealing
부가반응
Amplicon 2(driver)
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DNA를 driver로 하여 비교하면 감염병원체를 검출할 수 있다. 원리적으로는 동일개체의 검체를 비교해야 하지만 목적병원체가 혈액 등에도 존재할 경우에는 비감염 검체에 혈액이 혼입하여 감염 세포 또는 병원체가 미량이지만 섞이는경우가 있고, 또 다른 조직을 사용하면 조직에 독특한 상재균이 존재함에 따라 subtraction에 지장을 초래하는 경우도있다. 그러므로 경우에 따라서는 일란성 쌍태아의 어느 한쪽에서 비감염조직을 채취하는 것도 한 가지 방법이다. Chang등5)은 AIDS 환자에 생긴 capodi 육종조직으로부터 병원체를동정하기 위해 RDA를 실시하 는데, subtraction을 3회 실시한 결과 herpes virus와 유사한 염기배열을 얻었다.
22.. 질질환환관관련련 DDNNAA mmaarrkkeerr의의 분분리리RDA법은 단일인자 유전형질의 책임유전자좌의 근방에 위
치하는 다형성 marker를 얻는데 응용할 수 있어 mouse 등실험동물의 유전자 해석에 유용하다. 또 사전에 DNAmarker를 필요로 하지 않으므로 다른 동물의 유전자 해석에도 유효하다. 첫번째 접근법은 congenital mouse를 이용하는것이다. 여러번 야생형과 역교배함으로써 다른 계통의 근교mouse와 책임유전자좌를 이동시킨 congenital mouse의 원계통 유래의 DNA는 책임유전자의 주변을 포함하여 genome전체의 약 0.1%, 즉 3~4 MB의 크기를 갖는 것으로 예상한다. 이 congenital mouse를 tester 야생형 mouse를 driver로 하여 RDA를 실시하면 원래의 계통에 독특한 다형을 나타내는DNA 단편이 증폭한다. Lisityn 등은 pudgy나 tottering이라불리는 변이 mouse의 유전자좌 주변의 marker를 제작하 다
고 보고하 다6). 그러나 congenital mouse를제작하기 위해서는 2년 이상의 시간이 소요된다는 것이 난점이다. 따라서 다른 계통의 근교 mouse와 교배할 때 F2 intercross를 이용하여 변이형질을 갖는 개체를 모으면 목적의 유전자좌 주위만을 원래의 계통으로 균일화하여 RDA를 실시할 수 있다(genetically directed RDA;GDRDA, 그림 3).
즉 상염색체 열성의 변이형질을 갖는mouse 계통을 A, 교배는 가능하지만 유전적 다형을 갖는 mouse 계통을 B로 규정한다. 교배한 F2 개체중에서 변이형질을 갖는것은 반드시 책임유전자좌 주변의 genome역을 포함하고 있으므로 다수 개체의
DNA를 모으므로써 주변만이 A유래가 되고 다른 역은 재조합으로 인하여 A와 B가 혼합된다. 이를 driver로, B의 DNA를tester로 하여 RDA를 실시하면 책임유전자좌 주변에 존재하는 B에 특이적인 다형성marker는 driver pool에 포함되지 않으므로subtraction을 받지 않고 증폭된다. A에 특이적인 allele가 우연히 균일하게 잔존하는것을 방지해 주거나 균질한 역을 좁히기위하여 F2 개체는 최소한 10개 이상을 pool하는 것이 바람직하다. 또 목적유전자좌의주변에 존재하는 기지의 marker를 이용하
그림 3 Genetically directed RDA계통 A는 열성혈질 m을 가지며, 계통 B는 야생형이다. 각 유전자 형을 흰색과 검정색으로 표시하 다. F1 교배로 F2를제작하고 F2 개체중에서 변이형질을 띠는 개체만을 선별한 뒤, 이 DNA를 driver DNA로 이용하 다. 선택한 F2 개체는모든 유전자좌의 주변에 계통 A 유래의 균질성을 갖는 집단으로, RDA법에 의한 계통 A에 특이적인 marker의 제작에이용할 수 있었다.
계통A 계통B
부모
F1
F2
그림 4 Amplicon DNA와 RDA 산물(a) 당초 whole genomic PCR로 만든 DNA pool은 약 1.5 kb 까지의 DNA 단편으로 구성되며 전기 동상에서 smear하게 나타난다. Subtraction과 증폭을 반복하면 여러 개의 특이한 밴드가 생긴다. 증폭된 DNA를 적당한 plasmid 등에 subcloning하여 실제의 변이 유무를 해석한다. (b) Vector primer로 48개 subclone의 삽입배열을 PCR로 증폭하 다.
(a)
(b)
M : фX174/Hae III
M N T N TBamH I Bgl II
M N T N TBamH I Bgl II
Life Science &Biotechnology No.11 17
여 그 사이에서 재조합을 일으키는 F2 개체를 pool하면 균질한 역을 더욱 축소할 수 있어 보다 주변에 가까운 marker를 효율적으로 증폭할 수 있다. 또 상염색체의 우성 형질에대해서도 열성인 형질을 갖는 개체의 DNA를 pool한 것을driver로 사용하면 동일하게 해석할 수 있다.
33.. 암암세세포포의의 유유전전적적 변변이이의의 검검출출암화 과정에서는 유전자 결실, 증폭 등의 변이가 축적되는
데 whole genome를 대상으로 scanning 하는 방법으로는RDA법이 유용하다. Tester와 driver를 어떻게 설정하는냐에따라 2가지 응용이 가능하다. 첫째, 정상세포 DNA를 driver로 이용하면 종양에서 증폭한 DNA를 검출할 수 있다. 둘째,암세포 DNA를 driver로 이용하면 암세포 DNA에 특이한DNA 변이, 즉 염색체 결실을 검출할 수 있다. 암억제유전자는 암화 과정에서 양쪽 allele가 불활성화되기 때문에 동형결실 역에 포함될 가능성이 높다. 일반적으로 그 범위가 작은 경우가 많으므로 동정은 억제유전자좌의 해석에 아주 유용한 정보가 된다.
최근에는 LOH(loss of heterozygosity) 검출에서 (CA)n 반복 배열을 이용함으로써 종래의 RFLP 해석과는 달리 다수의 marker를 해석하기가 훨씬 쉬워졌다. 물론 (CA)n 해석에서 얻은 정보로는 어디까지나 두 allele간의 비율만 해석할수 있으며, 또 Southern Blot Analysis에 비해 신중을 기해야한다. 특히 정상조직의 혼입이 많은 경우에는 PCR로 동형결실을 검출하기는 어렵다. LOH 부위에서 얻은 marker는 다형을 갖는 자체만으로 한정되지만 RDA법에서는 amplicon에포함된 DNA 단편 중 동형결실 역은 모두가 증폭되므로marker로 획득할 수 있다. 획득한 marker를 probe로 하여Southern Hybridization을 하면 반결실인지 동형결실인지를 구별할 수 있다. 반결실 marker도 그 다형성을 활용하면 다른검체의 LOH 빈도를 알 수 있다(그림 4, 5).
실제로 최근 RDA법을 이용하여 신장세포암, 대장암,barret 식도7), 췌장암8) 등에서 동형결실 역을 검출하 다.필자 등도 해석을 실시한 16가지 중 11가지의 예에서 변이산물을 증폭하 는데 그 중 3가지는 동형결실이었다. 자궁경부
그림 5 암세포에서의 염색체 동형결실의 동정(a) 자궁경부암세포주 CC6에서의 동형결실. (A) Amplicon blot에 의한 변이산물의 해석. 산물 1~3은 종양 DNA(T)에 결실이 일어난 것이며 산물 4는 비특이적인 증폭산물이다. (B) SouthernBlot에 의한 변이산물의 해석. BamH I 및 Bgl II를 사용하여 해석한 결과, 11개의 동형결실 marker를 얻었고 이들 모두가 사람의 3번 염색체의 short arm 역 중 3p12~13에 mapping 되었다. 얻은 반결실 marker도 거의 동일한 수로 나타났는데 이는 효율적으로 동형결실 산물을 얻을 수 있슴을 의미한다. (C) 폐암세포주 U2020와 경암세포주 CC6의 공통 동형결실 역. (b)신장암세포주에서의 동형결실. 얻은 동형결실 marker 1Bgl-55는 제 9염색체의 short arm 역 중 9p21로 mapping 되었으며 동일한 위치에 존재하는 p16 및 p15 유전자에는 동형결실이 일어났다.
2) Lisitsyn, N. A. : Trend in Genet., 11, 303-307 (1995)3) Jonsson, J., Weissman, S. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 83-
85 (1995)4) Rosenberg, M., Przybylska, M., Straus, D. : Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 91, 6113-6117 (1994)5) Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M., Culpepper, J., Knowles,
D., Moore, P. : Science, 266, 1865-1869 (1994)6) Lisitsyn, N., Segre, J., Kusumi, K., Lisitsyn, N., Nadeau, J.,
Frankel, W., Wigler, M., Lander, E. : Nature Genet., 6, 57-63(1994)
7) Lisitsyn, N., Lisitsyn, N., Dalbagni, G., Barker, P., Sanchez,C., Gnarra, J., Linehan, W., Reid, B., Wigler, M. : Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 92, 151-155 (1995)
8) Schutte, M., Da Costa, L., Hahn, S., Moskaluk, C., Hoque, A.,Rozenblum, E., Weinstein, C., Bittner, M., Meltzer, P., Trent,J., Yeo, C., Hruban, R., Kern, S. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 5950-5954 (1995)
10) Kamb, A., Gruis, N., Weaver-Feldhaus, J., Liu, Q., Harshman,K., Tavtigian, S., Stockert, E., Day, R. R., Johnson, B.,Skolnick, M. : Science, 264, 436-440 (1994)
11) Hubank, M., Schatz, D. : Nucl. Acid. Res., 22, 5640-5648(1994)
암 CC6에서는 제 3염색체의 short arm에 존재하는 동형결실역으로부터 11개의 동형결실 marker를 얻었으며, YAC 해
석 결과 모두 약 3~4 MB의 contig에 포함되어 있슴을 알수 있었다. 이 역은 이미 보고된 폐암세포주 U2020에서 검출된 동형결실 역에 포함된 것이었다9)(그림 5a). 또 신장세포암에서는 9p21에서 동형결실 역이 검출되었고, 이를상세하게 해석하여 p15 및 p16 유전자10)가 결실되어 있슴을확인하 다(그림 5b). 이처럼 기지의 암억제유전자 또는 그후보 역을 검출할 수 있었기에 RDA법은 암억제유전자좌를상세하게 결정하기 위한 유력한 방법으로 활용될 수 있다.한편 변이산물을 얻지 못한 경우 그 원인으로는 이형성병변(dysplasia) 등의 전암병변에서는 DNA 변이가 일어나지 않았고 또 정상세포가 종양검체에 혼입하 다는 것을 들 수있다. 다시 말하여 종양조직의 DNA를 조제할 때에는 세심한 주의가 필요하다. 또 세포로서는 정상부위가 혼입되지 않게 잘 분획한 종양, 종양세포주, sorting 세포, nude mouse에이식한 종양 등을 사용하는 것이 좋다. 또 남성유래의 종양은 Y염색체가 비특이적으로 탈락하기 쉬우므로 유의해야 한다.
맺음말Genome science의 급격한 진전 특히 유전자 지도나 cDNA
sequencing 분야의 비약적인 진보로 사람의 다양한 질환에있어 그 원인이 되는 유전적 이상을 발견할 수 있었다. 금후수년은 positional candidate cloning 방법에 의해 암유전자 해석이 진행되리라고 여겨진다. 그 중에서도 RDA법은 유전자좌의 positioning에 유용하고 범용성이 높은 기술이다. 또RNA 수준에서의 변화 해석에도 응용함으로써11) DifferentialDisplay법(DDA)과 동일하게 이용할 수 있다.
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Life Science &Biotechnology No.1124
γ
TaKaRa는 다음의 Anti-Osteocalcin Monoclonal Antibody를 판매하고 있다(OC4-5는 제외).
Clone 번호 특이성* TaKaRa Code Subclass 용량OC4-30 17위치의 γ-carboxyl화 glutamine산(Gla) 부근 M041 IgG2a 0.1 mg
(탈탄산 osteocalcin에는 반응하지 않는다)OCG2 45~49 위치 M042 IgG2 0.1 mgOCG3 21~31 위치 M043 IgG3 0.1 mgOCG4 4~9 위치 M044 IgG1 0.1 mgOC4-5 21 및 24 위치의 Glu 부근 판매하지 않음
각 clone의 반응성
Clone 번호 반응성OC4-30 소, 사람, 쥐(rat), 토끼, 돼지, 개 유래의
osteocalcin과 반응한다.OCG2 소, 사람 유래의
osteocalcin과 반응한다.OCG3 소, 사람, 쥐(rat), 토끼, 돼지 유래의
osteocalcin과 반응한다.OCG4 소, 사람, 토끼, 돼지, 개 유래의
osteocalcin과 반응한다.
상기의 anti-osteocalcin monoclonal antibody는 소의 골 유래의 OC에 대한 항체이지만, 사람 유래의 OC와도 동등하게반응한다. 본 고에서는 이러한 각종 anti-osteocalcinmonoclonal antibody를 이용하여 사람 골 종양 파라핀 절편의면역조직염색을 실시한 예를 소개한다. 파라핀 절편은Novagen사의 Hybrid-Ready Tissues 중 Human DiseaseTissues, Bone Tumor : Chondroma(Novagen Code 70305-3) 및Osteosarcoma : Synovial Sarcoma(Novagen Code 70386-3)을사용하 다.
2) 부활처리(proteinase K 처리)proteinase K 0.4 mg/ml, 실온 5분
3) 내인성 peroxidase의 blocking 3% H2O2, 실온 5분
4) 비특이성의 blockingblockase(원액) 실온 20분
5) 1차 항체반응 실온 60분6) ENVISION Plus 실온 30분7) DAB 발색8) 핵염색(hematoxylin)9) 탈수·투철·봉입
* 항체가 인식하는 OC상의 epitope(아미노산의 위치)
그림 1 Anti-bovine osteocalcin monoclonal antibody의 인식 epitope
Life Science &Biotechnology No.11 25
그림 2 Anti-osteocalcin monoclonal antibody를 이용한 사람 골 종양조직의 염색례
Chondroma
OC4-30
OCG2
OCG3
OCG4
OC4-5
Synovial Sarcoma(부위A) Synovial Sarcoma(부위B)
1) Koyama, N. et al. (1991) J. Immunological Methods 139, 17-23.2) Miura, M. (1998) The BONE 12, No. 4, 47-51.
Life Science &Biotechnology No.1126
개요청주에 함유된 유기산은 향미와 접한 관계가 있어 지금
까지 이에 대한 수 많은 연구들이 진행되었다. 최근 변화하는 소비자의 기호에 걸맞는 청주의 품질의 다양화가 이루어지고 있으며, 종래의 청주와는 다른 유기산 조성을 갖는 주질을 실현하기 위하여 변이기술이나 유전자 재조합 기술을활용한 다양한 청주효모가 개발되었다. 청주에는 약 40종류의 유기산이 함유되어 있는데1), 그 중에서 succinate, lactate,malate, citrate가 대부분을 차지한다. Lactate의 대부분은 효모또는 첨가 lactate에서 유래하고 citrate의 대부분은 누룩에서유래하며 malate, succinate는 효모에 의한 청주 발효과정에서생성되는 것으로 알려져 있다. 청주 속의 citrate, malate는 관능적으로 상쾌한 맛을 부여하며, succinate는 느끼하고 무거운 맛을 준다는 보고2)가 있다.
청주속의 주요한 유기산은 효모세포 내의 TCA cycle에서생성하며, 최근에는 청주 발효과정에서의 유기산 생성 경로를 해명하고 있다. 청주 발효의 초기에는 pyruvate로부터citrate, isocitrate, α-ketoglutarate에 이르는 산화적 방향의 cycle이 진행되며, 중기에서 말기의 혐기조건하에서는 pyruvate로부터 oxaloacetate, malate, fumarate를 거쳐 succinate에 이르는환원적 방향의 cycle이 주로 진행된다3)(그림 1). 따라서 TCAcycle의 산화적 방향에서 작용하는 isocitrate dehydrogenase에착안하여 양요구성을 가지지 않는 청주 효모 등에 대단히유용한 Aureobasidin A 내성효모 형질전환 시스템4)을 활용하여 이 효소유전자를 파괴함으로써 청주 중의 유기산 조성을변화시키는 실험을 하 다5).
효모의 isocitrate dehydrogenase에는 NAD를 보효소로 하는 IDH, NADP를 보효소로 하는 IDP1, IDP2 등 3개의isozyme이 존재함이 밝혀졌다. 이러한 3개의 효소중에서 IDH는 mitochondria에 국재하여 TCA cycle에서 유기산 생성에관여하는 것으로 예상하므로 IDH의 유전자를 파괴하여 청주속의 유기산 조성의 변화를 조사하 다. 또 IDH는 IDH1,IDH2 유전자가 발현하는데, 어느 쪽이든 한쪽 유전자를 파괴하면 IDH의 효소활성이 소실되는 것으로 알려져 있다.
그림 1 청주 발효과정에서의 유기산 생성 경로 그림 2 유전자 파괴용 plasmid pIDH1의 구조
[[방방법법]]pAUR101의 Sma I site에 일본 청주효모협회 701호(K701)
의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭한 IDH1 유전자의 ORF 부분서열 625 bp를 삽입하여 유전자 파괴용plasmid pIDH1(그림 2)를 제작하 다. pIDH1을 Afl II(pIDH1유전자 부분서열 내에 절단부위가 1개 존재)로 절단하여 직쇄형태로 만든 후 이를 사용하여 K701 유래의 일배체 효모a10(접합형 : a형)을 Lithium-Acetate법으로 형질전환하고,Aureobasidin A 내성주(0.5 ㎍/ml로 선택)로서 IDH1 유전자파괴주를 얻었다. 유전자 파괴의 확인은 Southern BlotAnalysis를 통하여 실시하 고, 효소활성이 소실한 사실도 확인하 다.
이와 같이 얻은 유전자파괴주 a10ΔIDH1을 사용하여 청주소량사입시험(총미 200 g 규모)을 실시하 다. 이 사입배합
환원적
산화적
Life Science &Biotechnology No.11 27
1) 신판 양조성분 일람 (1997) 일본 양조협회편2) Sato, N. et al. (1997) 양조협회보, 72, 801-805.3) Muratsubaki, H. (1987) J. Biochem., 102, 705-714.4) Hashida-Okado, T., Ogawa, A., Kato, I. and Takesako, K.
(1998) FEBS Letters, 425, 117-122.5) Asano et al. (1998) 일본농예화학회 1998년도 대회 강연
요약집, p41.
[[결결과과]]표 2에 상조주의 일반 분석 결과를, 표 3에 유기산 조성을
분석한 결과를 나타내었다. 유전자 파괴주 a10ΔIDH1에서는대조주에 비하여 낮은 알코올 생성량을, 일본주도는 단 맛을띠었다(표 2). 이로서 IDH는 발효능력과 깊은 관계를 가짐을알 수 있었다. 또 대조주에 비해 malate, citrate(isocitrate)가증가하 고, succinate는 감소하 다(표 3). 이는 IDH를 파괴함으로써 본래 TCA cycle의 산화적 방향에서 생성되었던succinate는 생성되지 않아 감소하 고, 산화적 방향으로 진행되었기 때문이다. Pyruvate의 대사가 환원적 방향으로 진행하여 malate가 증가한 것 같다. 또 IDH의 기질인 isocitrate또는 그 한단계 앞의 citrate가 증가한 것은 IDH 유전자가 파괴되었슴을 간접적으로 증명해 주는 것이다.
pAUR101을 재조합한 a10AUR 대조주가 친주인 a10과 거의 동일한 주질을 나타내는 것으로 보아 AUR1-C 및 그것을함유하는 pAUR101은 청주 발효중의 효모세포 대사에 향을 미치지 않는다는 사실을 예측할 수 있다. 또 유첨 후 15일째에도 plasmid의 유지율이 95% 이상인 것으로 보아pAUR101은 vector로서 충분한 실용적 기능을 갖추고 있슴을알 수 있다. 이상에서 설명한 바와 같이 효모의 IDH 유전자를 파괴함으로써 발현능력은 낮아지지만, 관능적인 면을 향상시키는 malate, citrate가 증가하는 반면, 그렇지 않은succinate는 감소함을 확인하 다. 최근 청주 발효과정에서의유기산 생성 경로에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며,가까운 장래에는 Aureobasidin A 형질전환 시스템을 이용한청주효모의 유전자 재조합이나 변이 등의 육종으로 청주의산도 및 유기산 조성 등을 자유자재로 변화시킬 수 있는 청주 제조 기술이 확립될 것으로 기대한다.
Shimazu 고속 액체 Chromatography “유기산 분석 시스템”으로 분석하 다. 이 분석 시스템에서 citrate와 isocitrate는 동일한 위치에서 용출된다.
관련제품
제품명 TaKaRa Code 규격
Aureobasidin A 9000 1 mg9000B 1 mg×5
pAUR101 DNA 3600 20 ㎍pAUR112 DNA 3601 20 ㎍pAUR123 DNA 3602 20 ㎍pAUR224 DNA 3603 20 ㎍pAUR135 DNA 3604 20 ㎍pAUR316 DNA 3605 20 ㎍
을 표 1에 나타내었다. 대조주로는 pAUR101을 BstP I(AUR1-C 내에 절단부위가 1개 존재)로 절단하여 직쇄형태로 만든 DNA로 1배체 효모 a10을 형질전환하여 얻은Aureobasidin A 내성주(a10AUR) 및 친주(a10)을 사용하다. 15℃의 정온조건에서 15일간 발효한 후 원심분리, 여과를실시하여 상조하 다.
생물질 Aureobasidin A와 그 내성유전자를 selection marker로가지는 vector를 조합한 형질전환 시스템이다. 약제내성 형질에 의한 선택이므로 Aureobasidin A에 감수성을 나타내는 진균에 이용할 수 있다. 사상균 Aspergillus nidulans 유래의Aureobasidin 내성유전자 aurAR을 cloning하고1), 이 유전자를selection marker로 하고 A. nidulans를 숙주로 하는 사상균·대장균 shuttle vector pAUR316(그림 1)을 개발하 다. 이vector는 A. nidulans의 복제개시점 AMA12)을 함유하므로Aspergillus 균체 내에서 plasmid 상태로 존재한다.
그림 1 pAUR316의 구조
그림 2 SD선택배지에서 형성한 형질전환체의 colony(왼쪽 그림)
pAUR316의 cloning site에 A. oryzae의 amylase 유전자의promoter, E. coli의 β-glucuronidase(GUS) 유전자, terminator를삽입한 plasmid pAUR316-GUS를 제작하여 이를 사용하여A. nidullans FGSC89주를 형질전환하 다. 선택배지로서는 2㎍/ml의 Aureobasidin A을 함유하는 SD 배지를 이용하 다.획득한 형질전환체의 whole genome을 추출한 후 PCR로GUS 유전자가 존재함을 확인하 다. 형질전환 효율은 8.4×102 transformant/㎍ plasmid DNA 다.
에서는 2.3×103 transformant/㎍ plasmid DNA 다. 형질전환체는 명료하게 colony를 형성하 다(그림 2).
* 본 주는 FGSC (Fungal Genetics Stock Center, Department of Microbiology,University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS 66160-7420, USA ; fax 913-588-7295) 등에서 취득하 다.
+ plasmid - plasmid
Life Science &Biotechnology No.11 29
관련제품
제품명 TaKaRa Code 포장량Aureobasidin A 9000 1 mg
9000B 1 mg×5 YatalaseTM(사상균 세포벽 용해효소) T107 2 g
맺음말pAUR316 vector는 A. nidulans 유래의 Aureobasidin A 내성
유전자 aurAR을 selection marker로 가지는 A. nidullans용vector이다. Aureobasidin A를 함유하는 완전배지에서 형질전환체를 선택할 수 있다.
추기pAUR316을 이용하여 Aureobasidin A에 감수성을 나타내
는 A. niger ATCC 6275 [IFO6341]의 형질전환체를 선택할수 있었다. 기타 Aspergillus에 대해서도 Aureobasidin A에 대하여 감수성이라면 이용할 수 있을 것이다.
[본 제품 사용상의 주의사항]1. 본 제품은 연구목적 이외에는 사용할 수 없습니다. 사람,
동물의 치료 및 임상진단 등에는 사용하지 않도록 주의하여 주시기 바랍니다.(또 본 제품으로 획득한 생물재료를 제 3자에게 양도할수 없습니다.)
2. 본 제품을 연구목적 이외에 사용하는 경우는 사전에 당사와 협의하여 주시기 바랍니다.
1) Kuroda, M. et al. Mol. Gen. Genet. (in press).2) Gems, D. et al. (1991) Gene 98, 61-67.3) Tada, S. et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229, 301-306.
1) 100 ml의 PD배지에 A. nidullans의 포자 현탁액(0.5ml)을 식균하고 30℃에서 12~20 시간 진탕배양한다.
2) 유리여과기(3G1)로 여과하여 균사를 모은다.멸균수로 세정한 후 spatula 등으로 균사를 눌러 수분을 충분히 제거한다.
3) 적당량의(수 백 ㎕ 상당) 균사를 50 ml polypropylene원심튜브 내의 10 ml의 protoplast화 용액에 첨가하여현탁한다(첨가하는 균사의 양은 용액 내에서 가볍게움직일 정도로 한다).
조직별 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 일반적으로 Northern Blotting 등을 이용한다. 그러나 다수의 조직에서 RNA를 조제하고 blotting 조작을 실시하는데는 상당한 노력과 시간이 필요하다. 이러한 특별한 조작을 필요로 하지 않고 단시간내에 상세한 결과를 얻을 수 있도록 개발한 것이 Rapid-ScanTM Gene Expression Panel이다. 사람 또는 mouse의 24종류의 조직으로부터 조제한 first-strand cDNA를 actin 유전자를 marker로서 표준화하여 4단계의 10배 희석계열을 만든 후 1장의 96-well plate에 모아 놓은 것이다(그림 1). 따라서 목적유전자를 증폭하는 primer가 들어있는 PCR 반응액을 각 well에 직접 첨가하여 PCR을 실시한 뒤 전기동으로 판정하는 것만으로 24종류의 조직간에 있어서 목적유전자의 발현양상과 발현량을 단시간에 비교할 수 있다. 사람용과mouse용의 2종류가 있다.
특징· PCR과 전기 동의 조작만으로 실시할 수 있고
hybridization 조작은 필요 없다.
· 24종류의 조직에 대한 발현해석을 단 한번에 실시할 수있다.
· PCR에 의한 고감도의 판정이므로 발현량이 적은 target일지라도 검출할 수 있다.
· Housekeeping gene(β-actin)에 의한 표준화 확인을 위한plate를 첨부하 다.
· First-strand cDNA는 4단계의 10배 희석계열로 되어 있으므로 발현량을 비교할 수 있다.
내용
96-well plate 2매(1매는 β-actin에 의한 표준화 확인에 사용)
β-actin Primer Pair (100반응분) 각 1 nmol(표준화 확인에 사용)
96-well plate용 seal 2매
DNA marker (20 lane 분) 100 ㎕
Loading dye (200반응분) 1.5 ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
[cDNA]
1000× A
100× B
10× C
1× D
1000× E
100× F
10× G
1× H
1. Brain5. Liver9. Muscle
13. Salivary Gland17. Ovary21. PBL
1. Brain5. Thymus9. Muscle
13. Adrenal Gland17. Embryo e8.521. Breast/Virgin
2. Heart6. Colon
10. Stomach14. Thyroid Gland18. Uterus22. Bone Marrow
그림 1 Human Rapid-Scan Panel과 Mouse Rapid-Scan Panel
Life Science &Biotechnology No.11 31
Human Rapid-ScanTM Gene Expression Panel을 이용하여 첨부한 control 반응용 β-actin Primer Pair로 표준화의 확인과함께 α-actinin 2 mRNA의 조직간에서의 발현해석을 동시에실시하 다(그림 2).
전기 동 결과 α-actinin 2 mRNA의 발현을 lane 1(Brain),2(Heart), 및 9(Muscle)에서 확인할 수 있었고 다른 조직에서
는 발현하지 않았다. 또 단계별로 희석한 주형에 대한 증폭량으로부터 골격근에서는 심근의 약 2.5배의 α-actinin 2mRNA가 발현함을 알 수 있었다. 또 Brain에서의 발현량(neuron에 있어 NMDP receptor에 관한 발현)은 골격근의100분의 1정도로 낮았다.
· Control Template EC3PCR 반응이 정상적으로 실시되고 있는지를 확인하기 위한 positivecontrol template이다. Primer EVC-1&2를 이용한 PCR이 정상적으로실시되면 이 주형으로부터 685 bp의 증폭산물을 얻을 수 있다.
· TaKaRa Ex TaqTM
TaKaRa Ex TaqTM은 proof reading(교정기능)을 가진 PCR용 DNApolymerase이다. 종래의 Taq DNA polymerase보다 증폭효율이 높으므로 미량의 verocytotoxin 유전자의 검출 감도가 우수하다.
· Ex TaqTM Buffer
· dNTP Mixture
검출용 Components
1) GeneCombTM Card* 3매각 comb에는 8개의 nitrocellulose teeth가 부착되어 있고, 각 teeth에는 3개의 DNA probe가 spot되어 있다(그림 1).
2) Streptavidin/AP Conjugate 2.2 ml3) Chromogenic Substrate 2.2 ml4) Stop Solution 2.2 ml5) Denaturation Solution 100 ㎕6) HybriRunTM 1.5 ml7) Positive Control DNA for color development 50 ㎕
*GreenCombTM은 BIO-RAD사에서 제조한 것이다.
Dip Chromatography에 의한 검출Dip Chromatography는 다음의 원리를 근간으로 한 것이다
(그림 2 참조). 우선 microplate의 1~4열에 PCR 증폭 후 변성처리한 시료와 Streptavidin/AP Conjugate, 발색시약, 반응정지액을 각각 순서대로 넣는다(그림 3 참조).
3종류의 probe가 spot되어 있는 nitrocellulose teeth의 선단을1열째의 시료에 담가 액을 전개한다. 증폭 DNA가nitrocellulose위로 이동하여 probe가 spot된 역에서hybridization을 일으키며, 전개는 거기에서 멈춘다. 그 다음은이 teeth의 선단을 2~4열째의 각 시약에 순서대로 담가 액을 전개시켜 Streptavidin/AP Conjugate와 색소기질에 의한발색반응을 실시한다. 이상의 조작으로 목적의 증폭산물을teeth상에서 검출할 수 있다.
O-157:H7을 비롯한 장관출혈성 대장균(EHEC)은 혈변과 격심한 복통을 수반하는 출혈성 대장염 및 용혈성 요독증 증후군을 일으키는 병인성 대장균의 일군이다. 이 증상은 EHEC가 생산하는 세포독소인 verocytotoxin 때문에 일어난다. EHEC의 검출에 있어서 이 독소의 생산능력의 유무를 정확하고 신속하게 확인하는 검사방법의 중요성이 현재 지적되고 있다. 본 kit은 PCR법을 이용하여 verocytotoxin 유전자를 특이적으로 증폭함으로써 EHEC를 간편하게 검출하기 위한 One Shot PCR Kit이다. PCR에 필요한모든 시약을 0.2 ml PCR tube에 미리 분주해 놓았기 때문에 시료를 넣는 것만으로 PCR 반응을 시작할 수 있다. 또 종래의 Taqpolymerase보다 증폭효율이 우수한 TaKaRa Ex TaqTM을 사용함으로써 보다 단시간 내에 고감도로 반응을 실시할 수 있다. 반응저해 등에 의한 false negative를 막기 위하여 각 tube에는 PCR 반응의 positive control로서 Control Template EC3을 첨부하 다. 검출을위하여 Dip Chromato-Hybridization법을 사용하므로 전기 동을 하지 않고도 신속하게, 그리고 고감도로 verocytotoxin 유전자의 유무를 확인할 수 있다.
PCR반응 positive controlprobe
target 검출용 probe(VT1, VT2 공통 probe)
발색반응 확인용probe
그림 1 3종류의 probe를 spotting한 nitrocellulose teeth
TaKaRa Code RR121A 24회
Life Science &Biotechnology No.11 33
조작순서
((11)) MMiiccrroowweellll의의 준준비비① 이웃한 열에 액이 혼입되지 않도록 주의하여 아래의 각
시약을 첨가한다(그림 3).
· 1열째 처음에는 비워둔다.· 2열째 Streptavidin/AP Conjugate 1 drop· 3열째 Chromogenic Substrate 1 drop· 4열째 Stop Solution 1 drop
② 마지막으로 well을 가볍게 좌우로 흔들어주면서 액을 균일하게 한다.
③ HybriRunTM을 50 ㎕ 첨가하여 중화한다. 충분히 교반하면청색이 없어진다.
④ 이 액 50 ㎕를 1열째의 well에 넣어 준다.주)1개의 comb으로 8개의 well에서 assay를 할 수 있지만, 적어도 1개의 well
Positive Control DNA for color development)를 tube에 넣는다.
② 2 ㎕의 Denaturation Solution을 tube에 첨가하여 pipetting으로 충분히 섞어준 후 실온에서 5분간 반응한다.
그림 4 발색반응의 확인과 시료의 판정례
발색반응 확인 시료의 판정
PCR반응 positive controlprobe
target 검출용 probe(VT1, VT2 공통 probe)
발색반응 확인용probe
pattern 예
이 경우만 O.K. 음성 양성
Life Science &Biotechnology No.1134
그동안 호평을 받아 온 Fibronectin EIA kit(MK015)이 precoat type으로 거듭났다. 따라서 측정 전날 실시해 온 고상항체의 coating 처리나 blocking 조작을 하지 않아도 되므로 바로 측정에 들어갈 수 있다. 조작시간이 약 2시간 30분으로 단축되어 동시재현성이나 일차재현성도 만족할 수 있다. 발색기질을 종래의 OPD에서 고감도의 TMBZ로 변경하여 폐기물 처리문제가 해소되었고 발색감도도 보다 예민해졌다. 여기서는 본 킷트에 대하여 간단히 소개한다.
나 extracellular matrix 및 혈액속에 존재하는 접착인자이다.각종 배양세포들이 생산하여 분비하는 fibronectin은 세포표면의 특이적 수용체(integrin)에 인식되어 세포의 접착이나 운동을 제어한다. FN은 특히 혈액속에 대량 존재하므로 최근에는 암진단과 관련해 암환자의 혈중 FN 수준을 측정하는조사가 증가하는 추세이다.
최근 암환자의 뇨에서 검출되는 FN(urinary FN : uFN)이보고되었다1~3). 이 보고에 의하면 다양한 크기의 FN 단편이존재하며, 그 중 대부분은 cell-binding domain을 함유한 단편이다. 종래의 native FN에 대한 rabbit polyclonal antibody는이 단편을 인식할 수 없었으므로 충분히 정량할 수 없었다.Cell-binding domain에 대한 2개의 monoclonal antibody를 획득함으로써 뇨속의 FN 단편도 처음으로 정량할 수 있게 되었다.
본 kit은 human FN의 cell-binding domain에 대한monoclonal antibody를 이용하는 ELISA kit으로 사람의 혈액뿐만 아니라 뇨 속이나 사람 배양세포의 상청에 존재하는미량의 FN 및 그 분해물의 정량에 유용하다. 고상에 고정화한 항체는 human FN에만 특이적으로 반응하고 bovine FN과는 교차반응을 일으키지 않으므로 소 태아혈청을 함유하는 배지로 배양한 human cell의 상청을 그대로 측정시료로사용할 수 있다.
그림 3 임상례에 있어서 creatinine 보정뇨 FN 값건강인 8명의 경우와 종양을 가진 암환자 32명의 예에 대하여 FN을 측정한 것으로 위암중에는 원격전이를 수반하는 3경우(○)가 포함되어 있다.뇨 중 FN의 cut-off값은 점선으로 표시하 다(0.21 unit/㎍ Cr.). 32경우의 암환자 중 27경우(84.4%)는 뇨 중 FN값이 cut-off값을 상회하 다.
그림 2 각종 세포의 배양상청액에 존재하는 세포성 Fibronectin+S : 10% FCS/RPM1640, SF : 혈청배양 후 무혈청배지로 교환하여 2일 배양
HepG2 : 사람 간암세포 A431 : 사람 편평 상피세포HUVEC : 사람 제대혈관 내피세포 Lu65 : 사람 폐암세포HT1080 : 사람 섬유 육종세포 OST : 사람 골육종세포Colo205 : 사람 결장암세포 KM101 : 사람 골격 스트로마세포HL60 : 사람 전골격성 백혈병세포 SIRC : 토끼 각막세포T24 : 사람 방광암세포 D-17 : 개 골육종세포NSK : 사람 정상상피세포 FLamnion : 사람 양막세포MG63 : 사람 골육종세포 N.K. : 사람 정상 선유아세포HGH : 사람 심장세포 CPAE : 소 혈관내피세포SQ5 : 사람 폐암세포
측정례 1여러 가지 배양세포를 이용하여 그 배양상청액속의
FN(이 경우 세포성 FN)을 본 kit으로 측정하 다. 이 중에는 개, 토끼, 소의 배양세포도 포함되어 있으나 FN이 검출되지 않으므로 소 태아혈청을 사용한 배양상청일지라도 그대로 시료로 측정할 수 있다(그림 2).
측정례 2종래 kit(TaKaRa Code MK015)을 사용하여 암환자의 뇨에
서 FN을 측정한 예이다. 측정값은 creatinine으로 보정한 것이다3)(그림 3).
1) Katayama, M. et al. (1989) Exp. Cell. Res. 185, 229.2) Katayama, M. et al. (1991) Clin. Chem. 37, 466.3) Katayama, M. et al. (1993) Clin. Chim. Acta. 217, 115.
세포주
Life Science &Biotechnology No.1136
특징· 목적 핵산과 표식시약을 혼합하는 것만으로 간단히 표식
할 수 있다.
· 비효소적 방법으로 고효율의 높은 재현성으로 표식할 수있다.
· Single strand 및 double strand DNA, supercoil DNA, linearDNA, RNA, oligonucleotide를 intact한 상태로 표식할 수있다.
· Scale-up이 용이하다.
· 표식한 핵산의 변성·중화제를 첨부하 다.
Label IT 에 의한 핵산표식 순서
Label IT Cy3TM, Cy5TM 시리즈제품명 TaKaRa Code 포장량Label IT Cy3TM Labeling Kit V3625 1 Kit (25 ㎍용)
본 제품은 완전히 새로운 형태의 single reagent로 구성한 one-step non-RI 핵산 표식용 시약이다. 종래의 non-RI 표식법(randomlabeling법이나 nick translation법 등)에서는 효소를 이용하여 표식반응을 실시하므로 표식효율이 균일하지 않았으나, 본 제품은 비효소적인 표식법을 이용하여 핵산을 고효율과 높은 재현성으로 표식할 수 있다. 또 핵산에 열처리 등의 전처리가 필요없고,intact한 상태로 guanine잔기를 화학적으로 표식한다. Label IT 로 표식한 핵산은 다양한 hybridization(예를 들면, FISH, SouthernBlotting, Northern Blotting 등)에 이용할 수 있다. 표식물질로서 종래의 Rhodamine, Fluorescein, Digoxin, Biotin 등 네가지 형태에 새롭게 Cy3TM, Cy5TM version을 추가하여 발매하 다.
PanVera사 제품입니다.
Label IT Reagent
표식하고자 하는 DNA or RNA
37℃, 1시간
표식 핵산
표식반응
ethanol 침전or
G50 Microspin Purification Column
미반응 표식시약 제거
추첨결과 아래의 분들이 당첨자로 확정되었습니다. 알차고 유익한 Bio21 정보제공서비스를 꾸준히 제공해 드릴것을 약속드립니다. 감사합니다.
[5.8 g NaCl, 2 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl(pH7.5),5 ml 2% gelatin/1ℓ
준비 기구 및 기기· Nylon membrane filter(Amersham Hybond N+ 등)· Filter용 핀셋· 주사 바늘(18 G)· Whatman 3MM 여과지· 고온건조기 또는 UV crosslinker· Hybridization 용 bag· 항온조 또는 hybridization용 이온
Hybridization법의 순서
((AA)) PPllaattiinngg cceellll의의 조조제제1) Vector에 맞는 적당한 대장균(single colony)을 0.2%의
((BB)) FFiilltteerr의의 제제작작1) Nylon membrane filter에 연필로 번호를 기입하고 고압멸
균(90℃에서 10분간)을 해 둔다.
2) 미리 titer를 측정해 둔 phage용액을 약 600 ㎕의 platingcell에 첨가하여(phage액은 300 ㎕ 이상 첨가하지 않는다), 37℃에서 15분 정도 보온한다. 이를 48℃에 보온한약 6~7 ml의 LB top agarose에 첨가하고 직경 약 150mm의 LB plate에 기포가 생기지 않도록 균일하게plating한다. 이때 약 5만개의 plaque가 형성되도록 한다(즉 첨가하는 phage의 양은 plate 1매당 3~5×104 pfu로한다).
3) Top agarose가 굳은 것을 확인하고 뒤집어 37℃에서 배양한다. 6~8시간 후에 plaque가 나타나기 시작하며 plaque의 크기가 직경 1.0~1.5 mm 정도 될때까지 배양한다(plaque가 서로 겹치지 않을 정도에서 배양을 멈추면 된다). 배양 후에는 plate를 4℃에 보존한다.
4) Plate를 4℃에 1시간 정도 차게한 후 nylon membranefilter를 기포가 생기지 않도록 주의하여 plate 위에 얹는다(filter의 양 끝을 핀셋으로 집어 filter 중앙 부근을 아래로 하여 살며시 내린다). 일단 흡착하면 filter가 움직이지않도록 주의한다.
5) 주사 바늘(18 G)을 사용하여 filter 위로부터 LB plate를수 군데(비대칭으로 5~7 군데 정도)관통하여 plate의 뒷면에는 매직으로 바늘 구멍과 filter 번호를 표시해 둔다.1매의 plate에서 2매의 filter replica를 만드는 경우에는 2매째 filter의 경우 plate에 접촉하는 시간을 약간 길게(2분정도)한다. 또 바늘 구멍과 filter 번호 표시를 다른 색의매직을 이용하여 1매째와 구별할 수 있도록 한다.
6) 2매의 Whatman 3MM 여과지를 stainless tray(또는 plastictray)의 크기에 맞게 자르고 2매를 겹쳐 tray에 펴 놓는다. 이를 2셋트 준비한다.tray 1에는 변성액을 tray 2에는 중화액을 첨가하여 여과지를 적셔둔다. 이 때 거품이 들어가지 않도록 주의하고거품이 들어가면 제거한다. 여분의 용액은 버린다.
7) Membrane filter를 plate에서 떼어내고 plate와 접촉한 면이 윗쪽이 되도록 하여 거품이 들어가지 않도록 tray 1에옮기고 5분간 방치한다.
이번 호에는 간편한 plaque hybridization법에 의한screening에 대하여 간단히 소개한다.
((CC)) HHyybbrriiddiizzaattiioonn 조조작작Probe의 조제법이나 hybridization법에 대한 상세한 protocol
은 관련 실험서를 참조한다. 여기에서는 200 bp 이상의 DNA단편을 probe로 하여 hybridization을 실시한 예를 소개한다.
1) 수 매의 filter를 hybridization bag에 넣고 hybridization 용액을 첨가한다. 42℃에서 1시간 이상 pre-hybridization한다.이때 거품은 가능한 한 제거한다.
2) RI로 표식한 DNA probe를 100℃에서 10분간 가열하고급냉한다.
3) Pre-hybridization 용액을 버리고 새로운 hybridization 용액을 첨가한 후 RI 표식 DNA probe를 첨가한다. 이때 거품은 가능한 한 제거한다.42℃에서 하룻밤 천천히 진동하여 hybridization한다(첨가하는 RI 표식 DNA probe의 양은 1×106~5×106 cpm/mlhybridization이 바람직하다).
4) Filter를 조심스럽게 꺼내어 수 백 ml의 세정액 1에 옮긴다. 실온에서 15~30 분간 세정한다.
5) Filter를 수 백 ml의 세정액 2에 옮겨 50~65℃에서15~30분간 세정한다. filter의 세정조건은 probe에 따라 다르므로 세정할 때마다 survey meter로 filter위의 방사활성을 조사해 둔다. 방사활성이 강렬하게 남아있으면 세정조건을 까다롭게 하여 다시 세정한다.
7) X선 film을 현상한다. X선 film상에 양성 signal이 검출되면 membrane filter의 바늘구멍 위치를 X선 film상에 표시한다. X선 film상의 표시와 plate의 바늘구멍의 위치를 맞춘다. 선단을 잘라 구경을 크게 한 micropipette tip를 사용하여 양성 signal에 대응하는 역의 복수 plaque를 각plate에서 채취하여(1st screening) 25 ㎕ 정도의 chloroform을 함유한 500 ㎕의 SM Buffer에 현탁한다. 실온에 1시간방치하여 phage를 추출한다. phage액은 4℃에서 보존한다.
8) 양성 plaque를 함유한 이 용액의 일부를 SM Buffer로 적당히 희석하고 (B)의 step 2)와 같은 방법으로 직경 90mm(또는 직경 150 mm)의 LB plate에 plating한다.
단, 1매의 plate 당 200~1000개의 plaque가 형성되도록 한다. 직경 90 mm의 plate를 사용하는 경우 plating cell은200 ㎕를 사용하고 top agarose는 3 ml이면 충분하다.
9) 1st screening의 경우와 마찬가지로 filter 처리, hybridization을 실시하여 양성 plaque를 채취한다(2nd screening) (직경 150 mm의 plate를 사용하는 경우에는 이 시점에서 단일 plaque를 회수할 가능성이 있다).
10)채취한 양성 plaque를 SM buffer로 적당히 희석하고 직경90 mm의 LB plate에 10~100개의 plaque가 형성되도록plating한다.
11)1st, 2nd screening의 경우와 마찬가지로 filter 처리,hybridization을 실시한다. 획득한 양성 signal은 단일plaque로 회수할 수 있다.최근에는 non-RI로 검출할 수 있는 성능이 우수한 kit이시판되고 있다. Hybridization 조작을 non-RI로 할 경우에는 kit에 첨부한 protocol에 따라 screening한다.
참고문헌1) D. M. Glover 등 공저, Ikunoshin Kato 감역(1997) 「DNA
Cloning 1 -기본기술-」(Takara Shuzo Co., Ltd.)
Life Science &Biotechnology No.1140
Schistosomal glutathione-S-transferase(GST)는 E.coli에서 단백질을 발현할 때 일반적으로 사용하는fusion partner이다1). GST·TagTM sequence는 생산량을 증가시켜 주고, 어떤 경우는 fusion partner의 용해성(solubility)도 증가시킨다. 가용성으로 적절히folding된 형태로 발현할 경우 GST·Tag fusionprotein은 immobilized glutathione으로 정제할 수 있다.Gentle solution을 환원된 glutathione이 들어있는 buffer로 얻을 수 있다.
Transferase 활성을 측정함으로써 가용성 GST 융합체의 정량도 가능하다. Fusion tag으로서 GST를 보다 광범위하게 활용하기 위해 Novagen사는 두 종의새로운 multi-frame pET vector(pET-41a~c(+)와pET-42a~c(+))를 개발하 다. 이 vector들은 강력한T7 lac promoter 뿐만 아니라 GST·Tag(220 aa),proteolytic site, His·Tag(6 aa), S·Tag(15 aa) 서열을갖는다.
pET vector는 10 ㎍의 정제 plasmid DNA로 공급한다. 각 제품에는 glycerol stock 형태의 InductionControl Strain을 첨부한다. pET GST Fusion System은 목적유전자의 cloning과 expression에 필요한 vector와 host strain으로 구성되어 있다.
[참고문헌]1. Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67, 31-40
관련제품
Product Size Cat. No.
pET GST Fusion System 41 70559-3pET GST Fusion System 41 plus Competent Cells
70560-3pET GST Fusion System 42 70564-3pET GST Fusion System 42 plus Competent Cells
70565-3pET-41a(+) DNA 10 ㎍ 70556-3pET-41b(+) DNA 10 ㎍ 70557-3pET-41c(+) DNA 10 ㎍ 70558-3pET-42a(+) DNA 10 ㎍ 70561-3pET-42b(+) DNA 10 ㎍ 70562-3pET-42c(+) DNA 10 ㎍ 70563-3100 mM IPTG Solution 15 ml 70527-3
Novagen사는 glutathione에 결합하는 재조합glutathione S-transferase(GST) 융합단백질, nativeglutathione S-transferase 또는 기타 단백질들을 신속하게 one-step으로 정제할 수 있는 affinitychromatography support, GST·BindTM Resin을 새로발매하 다.
220개의 아미노산으로 구성된 GST domain을 함유하는 GST·Tag 융합 단백질을 신속하고 간편하게한 단계의 chromatography로 균일하게 정제할 수 있다. 또한 10 mM reduced glutathione을 사용하여 부드러운 조건에서 elution을 하므로 target protein이 변성할 염려가 없다.
GST·Bind Resin은 sulfide linkage로 환원glutathione에 공유결합하기 위하여 11-atom spacerarm을 활용한다. 높은 결합능력으로 인하여 1 ml의resin당 5~8 mg의 GST 융합단백질을 생산할 수 있다. Resin은 결합능력의 손실 없이 수 회정도는 재사용할 수 있다.
Novagen사는 관련제품으로서 GST·Bind BufferKit을 공급한다. 이 제품은 목적단백질이 GST·BindResin에 적절하게 결합하는지의 여부와 washing 및elution 능력을 사전에 시험하여 놓은 것이다. 또한GST·Tag Assay Kit은 direct colorimetric assay로GST 융합 단백질을 검출할 수 있다. 그 과정은 신속하고, GST 효소 활성에 특이적이므로 협잡단백질이많이 존재하여도 기능성 GST를 4 pmol까지 측정할수 있다.
Protein Refolding Kit에는 간편한 protocol을 사용하여 불용성단백질을 가용화하고 refolding하는데 필요한 모든 시약이 들어 있다. 불용성 단백질은 inclusionbody내로 모으면 초기 정제과정을 쉽게 진행할 수있으며 발현 단백질의 분해를 미연에 방지할 수 있다. 본 kit의 시약과 protocol로 N-lauroylsarcoma가 존재하는 약한 변성조건하에서 분리한 inclusion body를녹일 수 있다. Clarification 후 가용 분획을 disulfidebond의 형성을 교정해주는 환원제를 함유하는neutral pH buffer로 투석한다. 이어 두번째의 투석과정에서 과잉량의 환원제를 제거하고, 그 다음 선택buffer로 옮긴다.
본 kit으로 2 g의 inclusion body를 처리할 수 있다.
Components100 ml 10× IB Wash Buffer50 ml 10× IB Solubilization Buffer200 ml 50× Dialysis Buffer3.2 ml 1 M DTT10 ml 30% N-lauroylsarcosine
Perfect DNA Markers는 사용하기 편리하며 겔 분석을 위해 기억하기 쉬운 크기의 단편으로 구성하다. 각 marker는 각각 동량으로 제공한다(2배 농도의reference band 제외).
이러한 새로운 marker로 광범위한 크기의 DNA들을 확인할 수 있으며, routine work에 최적이다. 100lane에 apply할 수 있는 이들 marker는 dye를 함유한,편리한 ready-to-use 형태로 제공하며 여분의 6×Loading Buffer도 첨부한다.
관련제품
Product Size Cat. No.
Perfect DNA Markers, 0.05-10 kbp 100 lanes 70540-3Perfect DNA 50 bp Ladder 100 lanes 70538-3Perfect DNA 100 bp Ladder 100 lanes 70539-3Perfect DNA 1 kp Ladder 100 lanes 70537-3
한편 아래의 상품은 상품명이 변경되었으므로 주의하시기 바랍니다.(구)CBD-Tag Protein Solubilization Kit → (신) Protein Refolding Kit NV758 70123-3
Novagen사 신제품
Life Science &Biotechnology No.1142
본 제품은 single donor 유래의 Normal Human Dendritic Cells(NHDC)이다.이 세포는 전용배지 킷트인 LGMTM-3 BulletKit 으로 배양한다. 배지에 첨가하면 세포가 배양용기에 접착하는 것을 억제하고 세포의 회수율을 높여주는 Autologous Human Plasma도 별도로 판매한다.
Recombinant Human Interleukin-4 0.3 mlRecombinant Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor 0.3 ml
Autologous Human Plasma(5 ml) B4250
본 제품은 single donor 유래의 Human Peripheral Blood Mononuclear Cells(HPBMC)이다.이 세포는 전용배지 킷트인 LGMTM-3 BulletKit 으로 배양한다. 배지에 첨가하면 세포가 배양용기에 접착하는 것을 억제하고 세포의 회수율을 높여주는 Autologous Human Plasma도 별도로 판매한다.
PrProSieveoSieve Color PrColor Protein Markersotein MarkersProsieve Color Protein Markers는 SDS-PAGE gel에서 visible marker로 사용하기 위한 단백질의 혼합물이다. 본 제품은 전기 동과정에서 분리 효율을 육안으로 감지할 수 있을 뿐만 아니라, WesternBlotting의 transfer과정에서 단백질의 이동도 확인할 수 있다. Marker 단백질은 fluorescent dye로 표식하여 전형적인 laemmli buffer system에서 사용하는 buffer salts와 detergent를 함유하는 lyophilized solid형태로 되어 있다. 본 제품은 10, 15, 20, 25, 40, 55, 85, 130, 195 kDa의 적절량의 9개 단백질로 나뉘어지며, 각 lot별로 unstained ProSieve Protein Marker를 사용하여 정확한 보정을 실시하는 철저한 품질관리를 통해 제공한다.
Product ListProduct Size Cat. No.ProSieve Color Protein Markers (mini gel 50 lane분) 500 ㎕ F50550
Code No. 제품명 규격 기존가격 인하가격 인하율F50000 SeaKem LE Agarose 125 g 252,000 223,000 12%F50001 SeaKem LE Agarose 25 g 60,000 54,000 10%F50010 SeaKem ME Agarose 125 g 285,000 247,000 13%F50011 SeaKem ME Agarose 25 g 72,000 64,000 11%F50021 SeaKem HE Agarose 25 g 78,000 71,000 9%F50031 SeaKem HEEO Agarose 25 g 87,000 76,000 13%F50041 SeaKem HGT Agarose 25 g 87,000 69,000 21%F50070 SeaKem GTG Agarose 125 g 369,000 323,000 12%F50071 SeaKem GTG Agarose 25 g 81,000 74,000 9%F50080 NuSieve GTG Agarose 125 g 483,000 394,000 18%F50081 NuSieve GTG Agarose 25 g 150,000 115,000 23%F50090 NuSieve 3:1 Agarose 125 g 462,000 394,000 15%F50091 NuSieve 3:1 Agarose 25 g 144,000 118,000 18%F50101 SeaPlaque Agarose 25 g 171,000 162,000 5%F50111 SeaPlaque GTG Agarose 25 g 264,000 191,000 28%F50152 SeaKem GOLD Agarose 25 g 162,000 140,000 14%F50181 MetaPhor Agarose 25 g 165,000 154,000 7%F50513 SYBR GREEN I 10 X 50 ㎕ 300,000 191,000 36%F50611 50% Long Ranger Solution 250 ml 255,000 154,000 40%F50615 50% Long Ranger Solution 1 ℓ 702,000 559,000 20%F53440 GELBOND FILM 0.1 mm 102 mm X 16.5 m 246,000 162,000 34%F53734 GELBOND FILM 0.2 mm 85 X 100 mm (100매) 123,000 86,000 30%F54711 GELBOND PAG FILM 0.2 mm 138 X 158 mm (50매) 183,000 120,000 34%
FMC FMC 전제품전제품 가격가격 대폭대폭 인하인하30년 전통의 FMC Agarose를 비롯한 전기 동제품은 실험목적에 맞추어 최상의 결과를 보증합니다. 금번 환
율의 안정과 당사의 원가절감 노력으로 가격을 대폭 인하합니다. FMC로부터의 도입 가격이 전년에 비하여 약15% 이상 인상되었기 때문에 실제 인하율은 30% 정도에 상당합니다.
▶ 주요제품 안내
Life Science &Biotechnology No.1144
당사는 금번 Bio21 인터넷 쇼핑몰 및 정보제공 서비스 체제를 구축하 습니다. 지난 연초부터 준비해 온 인터넷 쇼핑몰이 완성되어 고객은 24시간 정확하고 편리하게 주문할 수있고, 당사는 보다 빠르게 제품을 공급할 수 있는 체제를 완성하게 된 것입니다.
제품에 대한 정보를 알고 있는 경우나 제품 정보가 없어도 쉽게 검색하여 주문할 수 있는 체제로 되어 있으며 흔히사용하는 제품은 바로 주문할 수 있도록 편리성도 도모하습니다. 또한 Bio21 종합정보 제공 서비스는 정보 내용을 충실화하고 사용하기 편리하도록 구성을 새롭게 하 으며 이용자의 궁금증을 적극적으로 해결할 수 있도록 하 습니다.
한편 지난 5월 15일까지 실시한 Bio21 종합 정보제공 서비스 회원가입 경품 대잔치에는 1,500여 명이 가입하여 많은관심을 보여주었습니다. 그 중 서울대학교 병원 비뇨기과 김인걸 선생님이 1등으로 당첨되어 휴대용 컴퓨터(모빌리안익스프레스)를 경품으로 받은 것을 비롯하여 2등 TaKaRaTaq(5명), 3등 제한효소(10명) 등 126명이 경품에 당첨되었으며 전 회원에게는 가입 기념품을 제공하 습니다(당첨자발표 홈페이지, 본지 37페이지 참조). 주변의 분들도 가입할수 있도록 소개하여 주시기 바랍니다.
당사는 지난 4월 30일 아주대학교 의과대학에서 개최된 한국생화학회 춘계학술대회에서 신제품, 신기술 설명회를 개최하 습니다.
한국생화학회와 공동으로 주최한 이번 행사는 최근에 주목을 받고 있는 DNA Chip System, 전자동 핵산 추출장치,초고속 PCR효소 등^Post Genome 시대의 대량해석 기술_이라는 주제로 약 2시간에 걸쳐 진행되었습니다.
약 150명의 회원이 참석하여 당사의 이제현 박사가 전자동핵산 추출장치 Genextractor TA-100의 원리 기계적인 특징,장치를 이용한 다양한 실험 데이터를 소개하 으며, 미국의Genetic MicroSystems 사의 Stanly D. Rose 박사는 DNA ChipSystem GMS417 Arrayer와 GMS418 Array Scanner에 관하여자세한 설명과 응용 데이터를 설명하여 DNA Chip System을이해하는데 커다란 도움을 주었습니다.
또한 당사의 이윤한씨는 PCR의 속도를 5배이상 빠르게실시하면서도 증폭효율, 정확도, 증폭길이에서 Ex Taq과 견줄 수 있는 Z-Taq의 특징 및 응용 결과를 소개하고 새로 개발한 PCR Thermal Cycler SP에 관하여도 소개하 습니다.
당사는 관련학회의 발전과 회원 여러분에게 새로운 정보를 제공할 수 있는 행사를 계속 마련하고자 합니다.
당사는 관련학회의 99년도 춘계학술대회에 참여하고 있습니다.
아래의 일정과 같이 7월 15~16일 서울대학교 문화관에서열리는 한일 식품생명공학 심포지움을 마지막으로 춘계 학술대회 참가의 일정을 마칩니다.
전시회 참가를 통하여 회원 여러분께 신제품 기술정보 등을 소개함은 물론, 궁금증이나 애로사항을 직접 해결하고자노력하고 있습니다.
4. 16~17 한국미생물학회 서경대학교
4. 23~24 한국산업미생물학회 서강대학교
4. 30~5. 1 한국생화학회 아주대학교 의과대학
5. 7 한국분자생물학회 대전 생명공학연구소
7. 15~16 한일 식물생명공학 심포지움 서울대학교 문화관
7월 15일에 개최하는 한일 식물생명공학 심포지움의 공식프로그램인 workshop에도 참여할 예정입니다.
당사는 생명공학 벤쳐기업인 ㈜PepTron(대전시 KAIST의과학 연구센터 내 소재, 대표 최호일, 전화 042-862-6455)의합성 펩타이드를 일본으로 수출하게 되었습니다.
그동안 국내연구자가 개발한 제품을 해외에 공급하는 사업을 꾸준히 추진하여, 연세대 생물학과 김 민 교수의 제한효소 Xsp I, 서울대 유전공학연구소 김선 교수의 유전자치료 연구용 벡터 pDON-AI에 이어 세번째의 결실을 이루게되었습니다.
지난 수개월간 펩트론사와의 협의와 당사 일본본사의 철저한 품질점검과 생산 및 공급체계의 검토끝에 금번 본격적으로 수출하게 된 것입니다.
이로서 열악한 국내 생명공학 연구용 제품시장에서 벗어나 세계를 상대로 합성 펩타이드를 생산하게 되므로서 가동율을 높이고 국내벤쳐기업의 기술의 우수성을 소개하여 생명과학 벤쳐산업 발전에도 기여할 것으로 기대됩니다.
당사는 펩트론사의 제품을 금년중에 약 1억원 정도를 수출할 예정입니다. 앞으로도 국내 연구자의 개발제품의 상품화와 벤쳐기업과의 협력사업을 더욱 확대해 나갈 예정입니다.
Takara 바이오연구소는 Fibronectin의 단편 위에서 Retrovirus Vector를 이용한 유전자 도입방법에서 laminin의 당쇄분자가유전자 도입효율을 높여준다는 사실을발견하 다.유전자 치료는 현재 세계에서 약3000
예 정도 시험적으로 실시하고 있으나 최대의 기술적 문제점은 목적하는 세포, 특히 조혈모세포에 치료용 유전자의 도입효율이 극히 낮다는 것이다. 그러나Takara 바이오연구소와 미국의 Indiana 대학 의과대학 팀이 공동으로 개발한Fibronectin의 recombinant protein CH-296(Retronectin)을 사용함으로서 유전자도입효율이 극단적으로 개선되어 유전자치료를 현실화 할 수 있게 되었다.Fibronectin은 조혈모세포를 둘러싼 미소환경을 형성하는 세포외 기질의 하나이다.이 recombinant retronectin은 치료용 유전자를 갖고 있는 retrovirus vector와 표적세포를 그 분자 위에서 양자간에 결합하여근접하게 하므로서 유전자 도입 효율을대폭 향상시킨다. 현재까지 유전자 도입이 아주 어렵다고 알려져 있는 조혈모세포에 있어서도 90%의 효율로 치료용 유전자의 도입이 인정되고 있다.Retronectin은 조혈모세포와 특이적으로
결합하는 peptide와 치료용 유전자를 삽입한 retrovirus vector의 각각에 특이적으로결합하는 두 종류의 peptide가 연결된 한개의 polypeptide이다. 그러나 이들 두 부분을 절단하여 칵테일처럼 혼합하여도원래의 rectronectin 분자와 같은 작용을나타내 이를 칵테일 유전자 도입법이라고 부르고 있다.Laminin도 fibronectin과 같이 기저막의
당단백질로 세포 접착능력이 있는 것으로 fibronectin과 같은 유전자 도입 효율의증강 효과를 연구하여 왔으나 백혈구계의 표적세포에 rectronectin의 일부분과laminin 분자의 단백질을 전혀 포함하지않는 당쇄 부분을 칵테일 유전자 도입법에 이용하면 유전자 도입 효과가 두 배이상 증강함을 발견하 다.당쇄의 인식기구를 응용한 유전자 도
입법으로는 간장세포나 macrophage에의
당쇄의 결합삽입능력을 이용한 연구가있으나 이번 발견은 retrovirus vector에 의한 혈구계 세포의 유전자 도입 효율을당쇄가 증강시킨다는 최초의 결과이다.칵테일 유전자 도입법을 이용하면 표
적 세포인 조혈모세포와 특이적으로 결합하는 peptide를 다른 여러 가지 세포와특이적으로 결합하는 물질로 바꿈으로써표적 세포를 자유롭게 선택할 수 있다는것을 의미한다. 바이오연구소에서는 이미여러 가지 세포에 대한 특이적 항체로치환함으로써 특이적인 세포에 미사일유전자 도입이 가능함을 밝혔고, 이를 작년 일본 유전자 치료학회와 일본 생화학회에서 발표하 다. 이 발견은 여러 가지다른 세포가 섞여있어도 특정의 세포만을 목표로 유전자 도입이 가능함을 의미한다. 한편 당쇄는 세포의 얼굴이라 할만큼 세포의 다양한 성질을 결정한다. 세포는 다채로운 당쇄를 통하여 인식하고상호작용한다. 혹시 이 당쇄의 특이성을이용하여 유전자 도입의 targetting이 가능하다면 항체 특이적 결합력을 이용하여복잡한 체내에 있어서 유전자 치료가 가능할 것으로 생각된다. 즉 체내의 특정기관이나 조직에 대하여 특이적인 치료용유전자를 도입할 수 있어, 금후 체내 유전자 치료법에 열쇠가 될 것으로 기대된다.
유유전전자자 변변형형 작작물물 인인증증업업무무 검검토토개개시시
Takara biomedical 사업부문은 Mitsubishi상사와 DNA 분석 및 유전자 변형 작물의 인증업무를 개시하기 위한 공동 검토작업을 시작하 다.미국에서 선적하기 전의 콩을 미국의
Takara 연구시설(위스콘신주)에서 PCR검사를 실시하고 또한 수입 운반과정에서 문제가 없었는지를 다시 일본 Takara의 연구시설에서 검사한 후 유전자 변형free임을 인증하는 것을 검토 내용으로한다. 양사는 인증증을 발행하기 위하여양사 공동으로 신회사를 설립하는 것도검토중이다. 엄격한 test를 거쳐 발행한recombinant free 콩의 인증증은 소비자의판단에 귀중한 기준이 될 것으로 생각된다. 유전자 변형 작물(GMO : Genetically
Modified Organism)은 콩, 옥수수, 감자, 토
마토, 유채 등 유전자의 일부를 변경한것까지 합하면 현재 수 십종이 알려져있다. 일본에서는 식용 대두 연간 소비량약 100만 톤에 90% 이상을 수입하고 있고, 그 중 80% 이상이 미국으로부터의수입이다. 일본이 수입하고 있는 대두에GMO가 어느 정도 함유되어 있는가는 밝혀져 있지 않으나 현재 미국에서 재배하고 있는 30% 이상이 GMO로 해마다 증가하는 경향이다. GMO의 안정성에 관하여는 미국 FDA에 의해 실시된 과학적 심사로 안전하다라는 결과가 나와 있다. 일본후생성도 22품종에 관하여 안전하다고발표하 다. 그러나 감자에 관하여는 20명 이상의 미국 및 국의 연구자가 안전성에 문제가 있다고 학술잡지(Science,Vol. 283, P94, 19 Feb. 1999)를 통하여 보도하 다. 일본에서는 일반 소비자나 판매점 등에서 유전자 변형 대두의 사용/불사용 표시를 해 줄 것을 요구하고 있으며 식품제조회사에서는 recombinant free의 증명서가 첨부된 대두를 구입하고 싶다는 요망이 강하나 인증 업무를 해주는곳은 없다. 일본에서는 GMO 검사의 공정검사법도 없고 농수산부가 작년 표시안을 발표하 으나 현 단계로서는 법제도의 정비도 진행되고 있지 않은 상황이다.이러한 상황을 고려하면 GMO 인증 업무의 필요성은 높을 것으로 생각되며 이는소비자가 구매할 때 선택을 위한 바른정보를 제공하는데 그 의의가 있다.Takara는 일본에서는 유일하게 식품 분
석에 관한 PCR 검사의 권리를 Roche로부터 받아 PCR 관련 연구와 관련제품의 제조, 판매에서 선구자적 역할을 하고 있다. 작년부터 GMO 분석 Kit을 판매하고있을 뿐만 아니라 소비자 단체나 제조회사로부터 대두의 GMO 검사 서비스를 수탁받아 실시하고 있다. 현재까지 1,500여 건의 의뢰가 있고 빠른 증가 추세이다. Takara는 multiplex PCR법으로 실시하고 있는데 그 검출 한계는 0.1%로 1,000립 중 1립의 GMO만 섞여 있어도 검출할수 있다.Mitsubishi 상사는 일본 최대의 식품용
대두 수입회사로 독자의 유통시설과 유통경로를 갖고 있어 유전자 recombinantfree 작물을 미국에서 선적하여 일관된장거리 운송으로 수입할 수 있다. 양사는각각의 기술과 능력을 조합하여 고도의GMO 인증 업무를 개시함을 목표로 검토를 시작하 다.
Life Science &Biotechnology No.1146
Adenovirus Expression Vector Kit(TaKaRa Code 6150)을 사용하여 cosmid vector에 insert DNA를 삽입할 때vector를 Swa I으로 절단한 후 탈인산화 하지 않아도 되는가?
Cosmid vector를 탈인산화 하지 않아도 ligation한 후 Swa I으로 다시 절단하여 insert를 갖지 않는 cosmid의 출현을 억제할 수 있습니다. 단 insert 내에 Swa I 부위가 존재할 경우에는 이 조작을 실시할 수 없습니다. 이러한 경우 또는 Swa I으로 다시 절단하여도 background가 높을 경우 등에는 cosmid vector를 탈인산화 해 줄것을 권장합니다.
S·Tag purification Kit에는 thrombin과 rEK의 두 종류가 있는 데 어느 것을 선택하면 되는가?
S·Tag purification Kit는 S·Tag 융합 단백질의 정제에 사용합니다만 S·Tag 서열과 삽입한 목적 유전자의서열 사이에 있는 protease 절단부위의 차이에 따라 두 종류가 준비되어 있습니다. pET Vector의 경우 pET29에는 thrombin을 pET30 및 pET32에는 rEK를 사용하여 주시기 바랍니다.
pET Dsb Fusion System 39b와 40b의 차이는?
pET Dsb Fusion System을 이용하여 목적의 단백질을 Dsb 서열과 융합하여 발현시키면 융합 단백질이periplasm에 분비되어 그 결과 비환원상태에서의 가용화와 단백질의 folding을 촉진합니다. pET39b에는DsbA(disulfide 결합의 형성을 촉진하는 효소)가 pET40b에는 DsbC(disulfide 결합의 이성화를 촉진하는 효소)가 Tag 배열로서 포함되어 있으므로 목적 단백질에 존재하는 disulfide 결합의 형태에 따라 선택하십시오.
PyrobestTM DNA polymerase(TaKaRa Code R005A/B)를 사용하여 PCR할 때 주의할 점은?
· 반응액을 조제할 때 PyrobestTM DNA polymerase는 dNTP Mixure를 첨가한 후에 넣어 주십시오, 본 효소는 3’→ 5’exonuclease 활성이 강하기 때문에 dNTP가 존재하지 않은 경우에는 primer가 분해될 염려가 있습니다. Primer는 가능하면 마지막에 첨가하여 주시기 바랍니다.
· 반응액은 얼음속에서 조제하고 조제 후는 되도록이면 신속하게 반응을 시작하고, 필요한 경우에는 primer의 양을 늘리거나 primer를 길게 설계하여 주시기 바랍니다.
Anti-Cadherin Antibody의 희석액은 TBS인데 PBS로는 희석할 수 없는가 ?
검체중의 cadherin을 안정화 하기 위해서는 염화칼슘이 존재해야합니다. PBS에서는 칼슘이 침전되므로 TBS를 사용하십시오.
Single Tube ProteinTM System 3(STP3)(TaKaRa Code NV712, NV713)을 이용하여 1회 반응했을 때에 생성하는 단백질의 양은?
1회의 반응으로(40 ㎕ 반응계)으로 생성하는 단백질의 양은 control인 β-galactosidase의 경우 약 60 ng입니다.
Single Tube ProteinTM System 3으로 합성한 단백질의 검출방법은?
STP3는 Rabbit 망상 백혈구의 lysate 내에서 반응을 실시하므로 반응액은 상당히 crude하고 통상의 SDS-PAGE 염색으로는 목적 단백질을 검출할 수 없습니다. 검출은 35S-methionine을 이용한 autoradiography나 목적 단백질에 대한 항체를 이용한 Western Bloting으로 하십시오.
Label IT non-RI Labeling Kit로 표시한 DNA나 RNA를 전사·번역 반응에 사용할 수 있는가?
할 수 없습니다. Label IT 에서는 표식물질이 핵산에 공유결합합니다. 이로 인하여 핵산의 구조가 변화하기때문에 효소반응에 의한 전사·번역 반응은 불가능합니다.
Catenin은 cadherin의 cytoplasmic domain에 작용하는 세포질 단백질로 α-, β-, γ- Catenin의 3종류로 존재한다.Cadherin을 통한 세포접착 및 세포간의 정보전달에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 여겨진다. α-Catenin은cadherin의 세포골격과의 상호작용이나 cadherin의 접착성에 필요하다. β-Catenin은 cadherin의 cytoplasmic domain에직접 결합하여 세포접착이나 signal 전달에 관여할 뿐만아니라 암억제유전자인 APC 유전자(adenomatouspolyposis coli gene)의 산물과 복합체를 형성하는 등 발암에도 관여하는 것으로 예상한다. TaKaRa가 판매하는 β-Catenin의 각 부위에 특이적인 항체는 암세포에 있어서의β-Catenin의 돌연변이나 결손 연구에 유용하다.
Wide-Range DNA Ladder(50-10,000bp)
TaKaRa Code 3415A 100 applications (10 ㎕/lane)
본 제품은 16종의 DNA fragment(50 bp, 100 bp, 200 bp,300 bp, 400 bp, 500 bp, 750 bp, 1,000 bp, 1,400 bp, 1,550 bp,2,000 bp, 3,000 bp, 4,000 bp, 6,000 bp, 8,000 bp, 10,000 bp)로구성된 DNA Marker이다. 50-10,000 bp라는 넓은 범위를갖고 있으며 각 밴드에 함유된 DNA의 양이 정확하기 때문에 동한 시료 DNA의 크기를 결정하고 또 동시에 정량도 할 수 있다. 밴드패턴을 쉽게 식별하기 위하여 500bp, 1,000 bp, 2,000 bp의 밴드가 약하게 나타나도록 하 고또 ladder의 중앙 부근에는 1,400 bp와 1,550 bp의 2중 밴드가 나타나도록 하 다.
ypical PCR conditions† generate a mixture of products with heterogeneous termini.1,2 This heterogeneity results in difficulty ligating PCR products to either blunt or dT-tailed vectors3 for cloning purposes. Novagen’s new
Perfectly BluntTM Cloning Kits simplify cloning of any DNAfragment regardless of composition of condition of 3’ termini; blunt ends, 3’ overhangs, or ragged ends ligate with equal ease and greater cloning efficiency(3-fold to 24-fold higher). The kits contain everything needed for end conversion, ligation, and transformation.
T
End Conversion Reaction
References1. Brownstein, J. M., et al. (1996) BioTechniques 20, 1004-1010.2. Magnuson, V. L., et al. (1996) BioTechniques 21, 700-709.3. Novy, R. E., Yaeger, K. W., and Kolb, K. M. (1996) InNovations 6, 7-11.
*The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche.†Conditions that use DNA polymerases lacking 3’→5’ exo-activity(e. g., Taq, Tth )
Heat Inactivation(5 minutes)
Homogeneous Products,Blunt and Phosphorylated
Ligation Reaction
Perfectly Blunt VectorInsert is combined with ready-to use vector and ligated(15 minutes). Subsequent transformation into NovaBlue Competent Cells generates recombinant colonies that are visualized easily by blue/white screening
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