Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA

Lucie Navrátilová2. ročník MBB

PřF UP v Olomouci

2007/2008

určení diagnózy co nejdříve

medicína hledá rychlý, snadný a levný způsob identifikace bakterií

Bakterie

• nejjednodušší jednobuněčné organismy, viditelné pod mikroskopem

• patogenní X nepatogenní

DNA(deoxyribonukleová kyselina)

• nosič genetické informace v podobě sekvencí nukleotidů

• podle rozdílností mezi geny se dají organismy identifikovat

GEN = sekvence nukleotidů s biologickou funkcí

Identifikace

• určení izolovaného mikroba

• souboru znaků mikroba porovnává se znaky identifikační maticí

Broad-range PCR-HRMA

PCR(Polymerase Chain Reaction)

• biochemická reakce

• využívá DNA-polymerázy ke klonování DNA

DENATURACE (94-96°C) NASEDÁNÍ PRIMERŮ (cca 53°C) EXTENZE (72°C)

HRMA(High-Resolution Melting Analysis)

• identifikace bakterií na základě odlišností mezi tt jejich DNA

Tm = melting temperature

Příklad

• zvolený gen leží v úseku 16S rDNA

• zkoumané druhy bakterií: Burkholderia cepacia

pickettii Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas malthophilia

Burkholderia cepacia

http://www.wickipedia.cz

Pseudomonas aeruginosa

http://www.wickipedia.cz

Stenotrophomonas maltophilia

http://www.wickipedia.cz

PCR směs pro 1 reakci

destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1

• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl

templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR

oleje

PCR směs pro 1 reakci

destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1

• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl

templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR

oleje

PCR směs pro 1 reakci

destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1

• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl

templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR

oleje

PCR směs pro 1 reakci

destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1

• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl

templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR

oleje

PCR směs pro 1 reakci

destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1

• rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl

templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 • do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR

oleje

Obr.2: Aparatura pro PCR-HRMA

Obr.3: RotorGene

DNA

5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Denaturace DNA

5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’

3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Nasedání primerů

5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’3’-CTAATATC-5’

5’-GCGATTAG-3’3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Extenze primerů

5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGG3’-CTAATATC-5’

5’-GCGATTAG-3’ GCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’

3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

Graf 1: Normalizovaný graf denaturované DNA

teplota °C

fluor

esce

nce

- no

rmal

izov

aná

Graf 2: Normalizovaný graf denaturované DNA

fluor

esce

nce

- no

rmal

izov

aná

teplota °C

Použitá literatura

• deSilva D., Blackett J.,High-Resolution melting & Unlabeled probes Developing a Simple and Inexpensive Genotyping Assay with Lunaprobes, Genetic Engineering & biotechnology News, 27, publish on-line: http://www.genengnews.com/articles/chtitem.aspx?tid=1986&chid=1

• Votava M., Lékařská mikrobiologie - obecná, Neptun, 2005

Děkuji za pozornost!