i
IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*9 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Mensiana Lodvi Putarato
NIM : 168114014
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*9 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Mensiana Lodvi Putarato
NIM : 168114014
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
Saya persembahkan skripsi ini untuk :
Tuhan Yesus
Bapak Victor Ngongo Putarato, Mama Dorkas Lende, Endo
Putarato, Alm. Rian Putarato, Ney Putarato dan Ona.
Keluarga Besar Loli dan Wewewa.
Sahabat dan teman-teman saya tercinta, serta Almamater
saya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Tuhan yang Maha Esa karena atas berkat,
kasih dan penyertaan-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul
“Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*9 pada Subjek Uji Nonperokok Ras
Kulit Hitam Papua Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction” untuk
memenuhi persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program
Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma. Skripsi ini merupakan bagian dari
penelitian Dr. Christine Patramurti, Apt., dengan judul “Identifikasi Gen CYP2A6
Alel *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Suku Tionghoa dan Ras Kulit Hitam Papua di
Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction” .
Selama proses penyusunan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan
bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan
terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan sekaligus dosen
pembimbing atas segala kesabaran, bimbingan, ilmu, semangat, nasihat serta
dukungan kepada penulis.
3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku Kepala Laboratorium Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma dan juga sebagai dosen penguji yang
telah memberi semangat, kritik serta saran yang sangat membangun dalam
penelitian ini.
4. Bapak Maywan Hariono Ph.D., Apt., selaku dosen penguji yang telah
memberi semangat, kritik dan saran yang sangat membangun dalam
penelitian ini.
5. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik
(DPA) atas bimbingannya selama ini.
6. Bapak Kayatno selaku laboran yang telah membantu selama penelitian.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
7. Segenap dosen Fakultas Farmasi yang dengan sabar dan tulus membagikan
ilmu pengetahuan kepada penulis serta karyawan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta atas pelayanan dan bantuannya
selama ini.
8. Bapak Victor Ngongo Putarato, Mama Dorkas Lende serta adik-adik penulis
Yuninto Medvi Putarato, Alm. Aprianto Nidvi Putarato, Nerliyati Radvi
Putarato, Ona Rostanti Pati Iwu, Elisabet Sarinto Ina Kii, dan Devandi
Giovani Porta Lero atas cinta kasih, motivasi, dukungan dan doa yang terus
membuat penulis kuat dan bersemangat dalam menggapai segala harapan dan
cita-cita. Terkhusus untuk satu-satunya adik laki-laki penulis Alm. Aprianto
Nidvi Putarato terima kasih pernah hadir dan membuat hidup penulis
berwarna serta selalu bersyukur atas kebaikan Tuhan dalam keluarga kami
“Terang Indah” dan seluruh keluarga besar kami.
9. Alm. Opa Dato Toda dan Oma Ester Waingu Bella (Ina Ngongo), Alm. Opa
Matius Lende Domba, dan Almh. Oma Apliana Peda Daido, serta Opa
Benyamin Bora Busha dan Oma Lidia K. Wolla atas segala perhatian, cinta
kasih dan dukungan doa yang selalu menguatkan penulis sehingga penulis
dapat melangkah sejauh ini. Terkhusus untuk Alm. Opa Dato Toda yang telah
berpulang sebelum penulis lahir, melalui cerita Bapak dan keluarga penulis
tahu Opa sangat menyayangi penulis dan cucu-cucu Opa yang lain, serta Alm.
Opa Matius Lende Domba dan Almh. Oma Apliana Peda Daido terima kasih
untuk segala kasih sayang dan kenangan dimasa kecil yang pernah Opa dan
Oma berikan kepada penulis.
10. Keluarga besar Loli terkhusus Keretoma dan Kurutepe serta keluarga besar
Wewewa terkhusus Pantendabola yang selalu mendoakan dan memberikan
semangat serta dukungan kepada penulis.
11. Sahabat-sahabat penulis “LORY” yakni Resita Wedu, Ocha Valentine dan
Yani Etna yang selalu setia dan memotivasi penulis untuk terus berkembang
serta selalu menjadi sahabat berbagi cerita baik dalam suka dan duka.
12. Wiwy, Indah Gery Cho, Rani Langkeru, Agatha Maia, dan Ayu P.D. yang
selalu setia mendukung dan memberikan semangat kepada penulis baik dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL ......................................................................................... i
HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. vi
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................ vii
PRAKATA ....................................................................................................... viii
DAFTAR ISI ...................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiv
ABSTRAK ........................................................................................................ xv
ABSTRACT ....................................................................................................... xvi
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ..................................................................................... 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 7
KESIMPULAN ................................................................................................. 13
SARAN ............................................................................................................. 14
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 15
LAMPIRAN ...................................................................................................... 18
BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hubungan polimorfisme CYP2A6 dengan respon substrat/obat... ........ 13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil analisis kemurnian isolat DNA................................................... 9
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen alel gen CYP2A6*1 ............... 10
Gambar 3. Urutan nukleotida alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9 ....... 11
Gambar 4. Hasil identifikasi alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9 ........ 12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical Clearance........................................................................ 19
Lampiran 2. Perhitungan Jumlah Sampel ........................................................ 20
Lampiran 3. Hasil Kuesioner ........................................................................... 21
Lampiran 4. Data Subjek Uji Hasil Kuesioner ................................................. 24
Lampiran 5. Usage Information of FavorPrepTM
............................................. 25
Lampiran 6. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ....................... 27
Lampiran 7. Usage Information of Go Taq Green Master Mix......................... 28
Lampiran 8. Product Information of DNA Ladder ........................................... 29
Lampiran 9. Product Datasheet of primer forward and reverse ....................... 30
Lampiran 10. Hasil Analisis Kemurnian Isolat DNA ......................................... 31
Lampiran 11. Hasil Identifikasi Alel Gen CYP2A6*1 dan *9 ............................ 31
Lampiran 12. Frekuensi Alel Gen CYP2A6 *1 dan *9 ...................................... 32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
ABSTRAK
Tobacco-specific N-nitrosamines (TSNA) seperti 4-(metilnitrosamino)-
1-(3-piridil)-1-butanon (NNK) dan N-nitrosonornikotin (NNN) merupakan
senyawa prokarsinogen yang terdapat dalam asap rokok. TSNA perlu diaktivasi
untuk dapat menjadi senyawa karsinogen yang menyebabkan kanker. Enzim
sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan salah satu enzim yang mengaktivasi
TSNA yang diekspresikan oleh gen CYP2A6 dan diketahui memiliki
polimorfisme yang tinggi. Salah satunya adalah alel gen CYP2A6*9 yang
mengalami single nucleotide polymorphism (SNP) dalam kotak TATA di daerah
promotor (T-48G). Polimorfisme CYP2A6*9 telah dilaporkan terjadi pada
populasi Afrika berkulit hitam di Ghana yang memiliki kesamaan ras dengan ras
kulit hitam Papua Indonesia, yaitu ras Negroid. Penelitian ini adalah studi
deskriptif observasional dengan tujuan untuk mengidentifikasi keberadaan
CYP2A6*9 dan frekuensi CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok ras kulit hitam
Papua Indonesia. Subjek uji berjumlah 30 orang dengan kriteria inklusi dan
eksklusi yang diambil sampel darahnya lalu dilakukan isolasi DNA. Polimorfisme
pada CYP2A6*9 diidentifikasi dengan menggunakan metode Polymerase Chain
Reaction (PCR). Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ditemukan alel gen
CYP2A6*9 dari 30 subjek uji, sehingga enzim CYP2A6 akan bekerja secara
normal dalam proses aktivasi metabolisme TSNA.
Kata Kunci: CYP2A6*9, polimorfisme, TSNA, nonperokok, ras kulit hitam
Papua, PCR.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
ABSTRACT
Tobacco-specific N-nitrosamines (TSNA) such as 4-(metilnitrosamino)-1-
(3-piridil)-1-butanon (NNK) and N-nitrosonornikotin (NNN) are procarcinogenic
compounds found in cigarette smoke. TSNA needs to be activated to change it into
carcinogen that causes cancer. Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) is an enzyme
that activates TSNAs expressed by the CYP2A6 gene and known to have a high
polymorphism. One of them is the CYP2A6*9 gene allele which experiences
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in the TATA box of the promoter region
(T-48G). The CYP2A6*9 polymorphism has been reported in black African
populations in Ghana who have racial similarities to the black Papuan, the
Negroid race. This is an observational descriptive study with the aim to identify
the presence of CYP2A6*9 and the frequency of CYP2A6*9 in black non-smoker
Papua Indonesia. Thirty people are involved as subjects in this study with
inclusion and exclusion criteria. Blood samples were collected and then DNA
furtherly isolated. Polymorphisms in CYP2A6*9 were identified using the
Polymerase Chain Reaction (PCR) method. The results showed that there were no
CYP2A6*9 gene alleles from 30 test subjects, so the CYP2A6 enzyme would work
normally in the process of TSNA metabolism activation.
Keywords: CYP2A6*9, polymorphism, TSNA, non-smoker, black Papuan, PCR.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Polusi asap rokok merupakan salah satu masalah yang sedang
diselesaikan pemerintah Indonesia. Hal ini dilakukan dengan mengeluarkan
Undang-undang No. 36 tahun 2009 tentang Kesehatan pada pasal 115 yang
mengatur tentang larangan merokok di tempat umum atau Kawasan Tanpa Rokok
(KTR) dan menyediakan area khusus untuk merokok (Suryantisa, 2018). Kota
Yogyakarta merupakan salah satu daerah yang telah menerapkan KTR dengan
mengeluarkan Peraturan Daerah Kota Yogyakarta No. 2 tahun 2017 tentang KTR
untuk mengatasi polusi asap rokok. Masalah polusi asap rokok penting untuk
diselesaikan karena asap rokok menyebabkan pencemaran udara yang dapat
dihirup oleh perokok itu sendiri dan juga perokok pasif. Perokok pasif adalah
orang yang bukan perokok tetapi menghirup asap rokok orang lain atau orang
yang berada dalam satu ruangan tertutup dengan orang yang sedang merokok
(Kementerian Kesehatan RI, 2019). Asap rokok yang dihirup oleh perokok pasif
jauh lebih berbahaya bagi kesehatan karena berisiko terkena berbagai penyakit
seperti serangan jantung atau stroke dan kanker paru-paru (Suryantisa, 2018).
Asap rokok merupakan aerosol kompleks yang mengandung sekitar 4000
senyawa toksik dan karsinogenik (Ashley et al., 2010; Geiss and Kotzias, 2007;
Suryantisa, 2018). Asap rokok mengandung Tobacco-specific nitrosamines
(TSNA) (IARC, 2004) seperti 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanon
(NNK) dan N-nitrosonornikotin (NNN) (Ashley et al., 2010) yang merupakan
senyawa karsinogen bagi manusia apabila dimetabolisme aktivasi oleh suatu
enzim, namun apabila tidak teraktivasi maka senyawa ini bersifat prokarsinogen
(Geiss and Kotzias, 2007; IARC 2007). Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6)
merupakan salah satu enzim utama yang mengaktifkan TSNA seperti NNN dan
NNK terutama dalam asap rokok (Liu et al., 2013; Mwenifumbo et al., 2008;
Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012) dan NNAL yang merupakan hasil metabolik
dari NNK. Aktivasi NNK, NNN dan NNAL terjadi melalui reaksi α-hidroksilasi
yang menghasilkan senyawa dengan ion diazonium yang dapat terikat pada DNA
sehingga dapat membentuk DNA adduct yang menyebabkan kanker pada jaringan
yang terpapar asap rokok seperti paru-paru dan laring (Chiang et al., 2011; Hecht
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
and Hoffmann, 1989; Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012). Selain senyawa TSNA,
enzim CYP2A6 juga berperan dalam memetabolisme obat-obatan dan bahan
kimia (Alsanosi et al., 2014; Fujieda et al., 2004). Enzim CYP2A6 merupakan
enzim yang dikode oleh gen CYP2A6 (Rossini et al., 2008). Gen CYP2A6 telah
dilaporkan banyak mengalami polimorfisme (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).
Polimorfisme pada CYP2A6 menyebabkan kerja enzim menjadi
menurun, meningkat atau bahkan menghilang (Mwenifumbo et al., 2010; Raunio
and Rahnasto-Rilla, 2012). Hingga saat ini telah diidentifikasi 89 jenis alel
CYP2A6 (PharmVAr, 2012). Alel gen CYP2A6*1 merupakan bentuk normal atau
wild type dari gen CYP2A6, sedangkan sebagian lainnya merupakan bentuk yang
mengalami polimorfisme. Menurut Minematsu et al. (2006), polimorfisme gen
CYP2A6 yang umum pada populasi Asia adalah variasi alel gen CYP2A6 *4,*7
dan *9. Pada alel gen CYP2A6*9 terjadi single nucleotide polymorphism (SNP)
dalam kotak TATA di daerah promotor (T-48G), yang dapat menurunkan
aktivitas transkripsi dan metabolik in vivo dari CYP2A6 (Minematsu et al., 2006;
Yoshida et al., 2003). Hal ini menyebabkan penurunan aktivasi senyawa TSNA
yang berpotensi mengurangi risiko kanker paru-paru (Liu et al., 2013; Raunio and
Rahnasto-Rilla, 2012).
Alel gen CYP2A6*9 dapat ditemukan pada populasi maupun ras tertentu
dalam jumlah frekuensi yang berbeda. Pada populasi Afrika berkulit hitam di
Ghana ditemukan alel gen CYP2A6*9 dengan frekuensi 5,7% (Gyamfi et al.,
2005). Populasi Afrika di Ghana ini memiliki kesamaan ras dengan ras kulit hitam
Papua Indonesia yaitu ras Negroid (Gayanti, 2017). Hal ini menunjukkan terdapat
kemungkinan populasi Papua di Indonesia juga memiliki polimorfisme
CYP2A6*9. Penelitian yang bertujuan untuk mengidentifikasi CYP2A6*9 telah
dilakukan oleh Prabowo (2017) pada subjek uji perokok ras kulit hitam Papua
Indonesia dan didapatkan frekuensi alel gen CYP2A6*9 adalah 0%. Oleh karena
itu, perlu dilakukan identifikasi alel gen CYP2A6*9 pada subjek uji yang berbeda
yaitu nonperokok untuk mengetahui lebih lanjut mengenai frekuensi polimorfisme
alel gen CYP2A6*9 pada ras kulit hitam Papua Indonesia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Polimorfisme pada alel gen CYP2A6*9 ini dapat dideteksi dengan
metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah metode yang dapat
melipatgandakan (amplifikasi) potongan DNA dalam waktu singkat (Bintang,
2018). Menurut Bintang (2018) dan Querci et al. (2006) metode PCR terdiri atas 3
tahapan yaitu: pemisahan untai DNA (denaturasi), annealing dan sintesis DNA
(extension).
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Sampel darah subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua, Primer
forward: (5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse: (5’-
GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’) (Yoshida et al., 2003), Promega Go Taq
Green Master Mix (yang mengandung taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, dan
buffer), FavorPrepTM
Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell), 10X Tris-
Borate-EDTA (TBE) Buffer pH 8,3 Ultra Pure Grade (Vivantis), agarose
(Vivantis), FluoroVueTM
Nucleic Acid Gel Stain (SMOBIO), 1KB (0.25-10 kb)
DNA Ladder (SMOBIO), loading dye, etanol absolut (Sigma Chemical Co., St.
Louis), dan Water For Injection (WFI) (Ikapharmindo).
Alat Penelitian
Alat-alat gelas, Thermal cycler Perkin Elmer 2400, satu set Elektroforesis
horizontal (Sigma Aldrich), UV Transilluminator (fisher scientific), dispossable
gloves, microtube 1,5 mL, hot plate (Thermo scientific), mikropipet, waterbath,
blue tip, yellow tip, white tip, Microcentrifuge (Thermo fisher scientific), kamera
Mirrorless Fuji Film XA3, spuit injeksi 3 mL (Terumo), vacutainer K2 yang
mengandung EDTA 5,4 mg, PCR® Tubes (Axygen), FABG column, collection
tube 2 mL, timbangan analitik (METTLER AE 260), dan vortex.
Pemilihan Subjek Uji
Subjek uji dalam penelitian ini berjumlah 30 orang dengan kriteria yaitu
nonperokok, berusia ≥18 tahun, keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal
sampai third degree relativies (kakek dan nenek orang Papua asli), dan tinggal di
Yogyakarta. Pada penelitian ini dilakukan eliminasi pada subjek uji yang sedang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
terkena penyakit yang disebabkan oleh virus dan bakteri. Subjek uji dengan sadar
dan bersedia menandatangani inform consent. Penelitian yang dilakukan di
Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma ini telah
memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran
Universitas Kristen Duta Wacana, Yogyakarta.
Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji
Sampel darah dari subjek uji akan diambil oleh petugas profesional
perawat. Sampel darah subjek uji diambil dari pembuluh vena, yang kemudian
ditampung dalam vacutainer K2 yang berisi EDTA 5,4 mg. Sampel darah yang
diperoleh disimpan pada suhu ± 4°C, sebelum dianalisis. Sampel darah ini
kemudian akan digunakan untuk identifikasi alel gen CYP2A6*9.
Isolasi DNA
Sampel darah yang telah disiapkan kemudian diisolasi dengan
menggunakan FavorPrepTM
Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Sampel
darah diambil sebanyak 200 µL dan dipindahkan ke microtube 1,5 mL. Proteinase
K sebanyak 20 µL dan FABG buffer 200 µL ditambahkan ke dalam sampel lalu
divortex sebentar. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 60°C
selama 15 menit untuk melisiskan sampel serta pada setiap menit ke-3 divortex
selama 30 detik. Setelah selesai diinkubasi campuran tersebut disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Kemudian ditambahkan 200 µL etanol
absolut ke dalam sampel dan divortex selama 30 detik. Campuran tersebut
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Kolom
FABG disiapkan dan dipasangkan pada collection tube, lalu campuran sampel
ditransfer dari microtube 1,5 mL ke dalam kolom FABG yang telah terpasang
collection tube. Campuran sampel yang telah dipindahkan disentrifugasi pada
kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit, lalu cairan yang ada pada collection tube
dibuang. Selanjutnya kolom FABG dipasangkan pada collection tube baru. Kolom
FABG segera dicuci dengan ditambahkan 500 µL W1 buffer lalu disentrifugasi
pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit lalu sisa cairan pada collection tube
dibuang. Kolom FABG kemudian dicuci dengan 750 µL wash buffer lalu
disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit lalu sisa cairan pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
collection tube dibuang. Selama 4 menit dilakukan sentrifugasi untuk
mengeringkan kolom FABG. Kolom FABG yang telah kering dipasangkan pada
elution tube dan ditambahkan 200 µL elution buffer pada FABG kolom.
Kemudian dibiarkan berdiri diam selama 3 menit dan disentrifugasi selama 3
menit untuk mengelusi DNA pada kecepatan 13.000 rpm. Isolat DNA disimpan
pada suhu -70°C.
Analisis Kemurnian Isolat DNA
Analisis kemurnian isolat DNA dapat dilakukan dengan metode
elektroforesis yang menggunakan gel agarose 1,0%. Cara pembuatan gel agarose
1,0% yaitu dengan menggunakan 250 mg agarose yang dilarutkan dalam larutan
1x TBE buffer sebanyak 25 mL. Campuran tersebut kemudian dipanaskan dengan
hot plate sambil diaduk dengan magnetic stirrer hingga larut dan menjadi jernih.
Larutan agarose 1% yang telah jernih diangkat, lalu ditambahkan 2,5 μL larutan
Nucleic Acid Gel Stain dan diaduk hingga homogen. Larutan gel agarose yang
telah siap, dituang ke dalam cetakan gel yang sebelumnya telah diberi sisiran pada
tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisiran dicabut setelah gel mengeras
sehingga terbentuk sumur-sumur, kemudian ditempatkan ke dalam gel tray
elektroforesis yang sudah berisi larutan 1x TBE buffer. Isolat DNA diambil
sebanyak 4,0 μL, ditambahkan WFI sebanyak 1,0 μL dan dicampur dengan
loading dye sebanyak 1,0 μL. Campuran tersebut diambil sejumlah 6,0 μL dan
dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel
diisi dengan 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebanyak 3,0 μL sebagai marker dan
dilakukan elektroforesis dengan kecepatan 100 volt/cm selama 30 menit. Pada pH
netral molekul DNA yang bermuatan negatif akan bergerak menuju kutub positif
karena adanya pengaruh medan listrik. Hasil elektroforesis dideteksi di bawah UV
Transilluminator dan didokumentasikan menggunakan kamera Mirrorless Fuji
Film XA3. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus
masing-masing pita sampel isolat DNA dengan posisi pita DNA ladder.
Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR
Fragmen alel gen CYP2A6*9 diidentifikasi melalui proses amplifikasi
menggunakan primer yang diadopsi dari Yoshida et al. (2003), yaitu primer
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'- GGC
TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR
menggunakan bahan yang terdiri atas Promega Go Taq Green Master Mix 12,5
μL, primer forward 1,25 μL, primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, dan WFI
5,0 μL. Kondisi PCR untuk proses amplifikasi yang digunakan didasarkan pada
hasil optimasi yang dilakukan oleh Cindy (2017). Amplifikasi dilakukan dengan
mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR diatur sebagai
berikut: initial denaturasi pada suhu 94ºC selama 3 menit; dilanjutkan dengan
denaturasi pada suhu 94ºC selama 30 detik; annealing pada suhu 60ºC selama 30
detik dan ekstensi pada suhu 70ºC selama 25 detik. Siklus amplifikasi dilakukan
sebanyak 35 kali dan diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72ºC selama 5
menit. Hasil produk PCR disimpan pada suhu -70°C.
Identifikasi Alel Gen CYP2A6*9
Hasil produk PCR dapat dideteksi dengan elektroforesis pada kecepatan
100 volt/cm selama 30 menit menggunakan fase diam agarose 1,5% yang
ditambahkan dengan Nucleic Acid Gel Stain dan fase gerak larutan 1x TBE buffer.
Hasil elektroforesis kemudian dilihat dengan menggunakan lampu UV
Transilluminator. Hasil produk PCR ditunjukkan dengan adanya pita yang
kemudian didokumentasi dengan kamera Mirrorless Fuji Film XA3. Produk PCR
yang terbentuk pada penelitian ini adalah alel gen CYP2A6*1 yang berada pada
pita 368 bp (Yoshida et al., 2003).
Analisis Hasil
Untuk mengetahui adanya alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9
dapat dideteksi dengan metode elektroforesis. Adanya produk yang terbentuk
menunjukkan alel gen CYP2A6*1, sedangkan jika tidak terbentuk produk maka
menunjukkan adanya alel gen CYP2A6*9.
Frekuensi alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9 dapat dihitung dengan
rumus:
Frekuensi CYP2A6*1 =
Frekuensi CYP2A6*9 =
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan alel gen
CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua Indonesia.
Penelitian ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA,
analisis kemurnian isolat DNA, dan identifikasi alel gen CYP2A6*9 pada produk
PCR yang diamplifikasi dengan metode PCR. Metode yang digunakan dalam
mengidentifikasi alel gen CYP2A6*9 adalah metode PCR yang dapat
melipatgandakan (amplifikasi) potongan DNA dalam waktu singkat (Bintang,
2018). CYP2A6*9 merupakan alel yang akan diidentifikasi dalam penelitian ini
karena telah dilaporkan terdapat pada beberapa ras dan populasi di dunia.
Pemilihan Subjek Uji
Subjek uji dalam penelitian ini berjumlah 30 orang yang terdiri atas 19
orang laki-laki dan 11 orang perempuan yang berusia 18-23 tahun (Lampiran 4).
Subjek uji merupakan keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal sampai third
degree relatives dan tinggal di Yogyakarta. Jumlah sampel minimal pada
penelitian genetik menurut B-Rao (2001) adalah 29 orang (Lampiran 2), sehingga
jumlah sampel subjek uji yang digunakan sudah memenuhi kriteria. Pada
penelitian ini terdapat kendala dalam mencari subjek uji yang bersedia
berpartisipasi dalam penelitian ini serta sebagian besar calon subjek uji adalah
perokok. Pada subjek uji yang merupakan seorang perokok akan langsung
dieksklusikan. Hal ini karena penelitian ini hanya akan mengidentifikasi alel gen
CYP2A6*9 pada subjek nonperokok. Pada subjek uji yang sedang sakit akibat
virus dan bakteri juga akan dieksklusikan karena dapat mempengaruhi kemurnian
hasil isolasi DNA.
Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan reagen FavorPrepTM
Blood Genomic DNA
Extraction Mini Kit yang terdiri atas Proteinase K, FABG Buffer, W1 buffer, wash
buffer, dan elution buffer serta etanol absolut. Pada isolasi DNA dengan
Extraction Mini Kit bahan yang digunakan telah dirancang untuk memudahkan
dalam melakukan isolasi DNA serta terdapat fasilitas FABG column yang
merupakan tabung dengan matriks yang berfungsi untuk mengikat DNA. Matriks
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
tersebut terlindung oleh tabung sehingga tidak mudah rusak (Kamaliah, 2017).
Selain reagen terdapat beberapa alat yang digunakan untuk membantu proses
isolasi seperti vortex dan microcentrifuge. Vortex adalah suatu alat yang berfungsi
untuk mencampur sampel darah dengan reagen sehingga dapat tercampur dengan
homogen (Maftuchah et al., 2014), sedangkan microcentrifuge berfungsi untuk
memisahkan suatu bahan berdasarkan berat molekul dengan kecepatan tertentu
(Bintang, 2018).
Pada isolasi DNA dengan Extraction Mini Kit diawali dengan pelisisan
sel dengan menggunakan proteinase K dan FABG buffer (Anonim, 2019;
Khosravinia et al., 2007), selain itu proteinase K juga berfungsi untuk pemurnian
DNA dari protein (penghancuran protein) (Anonim, 2019; Fatchiyah et al., 2011;
Kamaliah, 2017). DNA yang diperoleh setelah pelisisan sel masih tercampur
dengan isi sel yang lain sehingga dilakukan proses presipitasi DNA dengan
menggunakan etanol absolut (Kamaliah, 2017). DNA yang telah terpresipitasi
kemudian akan dicuci dengan W1 buffer untuk menghilangkan residu protein dan
residu RNA serta dicuci juga dengan wash buffer untuk menghilangkan residu
garam serta etanol (Geneaid, 2019). Tahap terakhir ditambahkan elution buffer
untuk melarutkan atau mengelusi DNA. Isolat DNA kemudian disimpan di dalam
freezer pada suhu -70°C. Hasil isolat DNA dapat dianalisis kemurniannya secara
kualitatif dengan teknik elektroforesis.
Analisis Kemurnian Isolat DNA
Analisis kemurnian isolat DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis
sebelum isolat DNA diamplifikasi dengan metode PCR. Elektroforesis merupakan
teknik untuk memisahkan makromolekul seperti DNA dan protein yang
bermuatan karena adanya pengaruh medan listrik berdasarkan berat molekul dan
berguna dalam analisis kualitatif produk PCR. Selain untuk mendeteksi
kemurnian DNA elektroforesis dapat digunakan untuk menentukan berat molekul
(BM) dan menetapkan titik isolistrik (Bintang, 2018). Hasil analisis kemurnian
isolat DNA yang baik ditandai dengan terbentuknya pita tunggal dan tebal serta
tidak terbentuk pita ganda pada ukuran >10.000 bp yang menunjukkan isolat
DNA murni, tidak tercemar oleh protein atau bagian sel lain serta tidak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
terdegradasi (Faatih, 2009; Patramurti et al., 2014). Posisi pita >10.000 bp dapat
diketahui dengan menggunakan 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebagai marker
yang dapat menampilkan pita dari 250 bp sampai 10.000 bp. Berdasarkan hasil
penelitian bentuk pita yang dihasilkan adalah pita tunggal dan tebal yang memiliki
ukuran DNA >10.000 bp (Gambar 1). Hal ini menunjukkan isolat DNA murni dan
tidak terkontaminasi.
Gambar 1. Hasil analisis kemurnian isolat DNA.
Keterangan:
M : 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebagai marker
5, 10, 15, 20, dan 25 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal
Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarose 1%, fase gerak larutan 1x TBE
buffer, kecepatan 100 volt/cm selama 30 menit.
Identifikasi Alel Gen CYP2A6*9
Identifikasi alel gen CYP2A6*9 menggunakan metode PCR. Kondisi
PCR pada penelitian ini diatur menurut hasil optimasi oleh Cindy (2017), yaitu
initial denaturasi pada suhu 94ºC selama 3 menit, denaturasi pada suhu 94ºC
selama 30 detik, annealing pada suhu 60ºC selama 30 detik dan ekstensi pada
suhu 70ºC selama 25 detik. Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak 35 kali dan
diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72ºC selama 5 menit.
Keberhasilan dalam proses amplifikasi juga ditentukan oleh ketepatan
primer dan penggunaan beberapa bahan. Primer merupakan potongan DNA yang
terdiri atas beberapa basa nukleotida yang berfungsi mengawali proses amplifikasi
dengan menempel pada template DNA CYP2A6 sebagai target amplifikasi
(Gambar 2). Penempelan (annealing) primer terjadi setelah pemisahan
(denaturasi) untai DNA ganda menjadi untai DNA tunggal (Yuwono, 2005).
10.000 bp
M 5 10 15 20 25
250 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Primer yang digunakan diadopsi dari Yoshida et al. (2003), yaitu primer forward
5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse 5'- GGC TGG GGT
GGT TTG CCT TTA-3'.
GATTCCTCTCCCCTGGAAC TAAAGGCAAACCACCCCAGCC
CTAAGGAGAGGGGACCTTG ATTTCCGTTTGGTGGGGTCGG
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen alel gen CYP2A6*1.
Keterangan:
: Arah penempelan primer forward
: Arah penempelan primer reverse
Selain primer penambahan bahan-bahan seperti WFI dan Promega Go
Taq Green Master Mix yang mengandung taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2,
dan buffer juga memiliki peran penting dalam proses amplifikasi. Taq DNA
polymerase berperan dalam membuat untai baru atau memperpanjang (ekstensi)
rantai DNA setelah penempelan primer pada template DNA dengan
menambahkan basa nukleotida pada template DNA. Sumber basa nukleotida
dalam amplifikasi DNA secara in vitro dengan PCR ini berasal dari
deoksiribosanukleotida trifosfat (dNTPs), karena dNTPs mengandung
deoksiadenosina trifosfat (dATP), deoksisistidina trifosfat (dCTP),
deoksiguanosina trifosfat (dGTP), dan deoksitimina trifosfat (dTTP). MgCl2
merupakan salah satu faktor penting karena akan mempengaruhi aktivitas enzim
Taq DNA polymerase, sedangkan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH
sehingga Taq DNA polymerase tetap berada dalam kondisi optimum selama
proses amplifikasi berlangsung (Bintang, 2018).
Hasil amplifikasi ditunjukkan dengan terbentuknya pita tunggal dan tebal
pada 368 bp yang menunjukkan alel gen CYP2A6*1, sedangkan bila tidak
terbentuk pita pada 368 bp maka produk merupakan alel gen CYP2A6*9.
Terbentuknya pita pada alel gen CYP2A6*1 karena primer forward yang
digunakan dapat menempel pada ekson urutan 395 sampai 376 dan primer reverse
5’ 3’
5’ 3’
Primer forward
Primer reverse
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
dapat menempel pada ekson urutan 48 sampai 28. Namun, pada alel gen
CYP2A6*9 primer reverse yang digunakan tidak dapat melakukan amplifikasi
karena terjadi SNP dalam kotak TATA di daerah promotor (T-48G) yang
ditunjukkan pada gambar 3. Hal ini mengakibatkan tidak terjadi proses
penempelan primer reverse (Yoshida et al., 2003).
A. CYP2A6*1 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
B. CYP2A6*9 GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC
A. CYP2A6*1 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
B. CYP2A6*9 ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA
A. CYP2A6*1 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
B. CYP2A6*9 TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC
A. CYP2A6*1 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
B. CYP2A6*9 CCTCCTAAATCCACAGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA
A. CYP2A6*1 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
B. CYP2A6*9 GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC
A. CYP2A6*1 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
B. CYP2A6*9 CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA
A. CYP2A6*1 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT
B. CYP2A6*9 TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT
A. CYP2A6*1 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC
B. CYP2A6*9 CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC
A. CYP2A6*1 ACCCCAGCCG
B. CYP2A6*9 ACCCCAGCC
Gambar 3. Urutan nukleotida alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9
(perbedaan pada basa nukleotida berwarna hijau dan biru yang mengalami SNP).
Keterangan :
A. Potongan urutan basa alel gen CYP2A6*1 menurut Gen Bank
B. Urutan basa alel gen CYP2A6*9 menurut Yoshida et al. (2003).
Hasil amplifikasi dianalisis menggunakan elektroforesis dan dilihat di
bawah UV Transilluminator. Berdasarkan hasil analisis, semua sampel produk
PCR menunjukkan terbentuknya pita tunggal, tebal dan terang pada 368 bp.
Namun demikian, terdapat beberapa pita tunggal tipis yang kurang terang pada
368 bp (Gambar 4) yang disebabkan oleh konsentrasi DNA yang kecil. Hal ini
dipengaruhi oleh kecilnya jumlah fragmen DNA yang teramplifikasi serta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
kecilnya konsentrasi template DNA sehingga mempengaruhi intensitas pita yang
dihasilkan (Azizah, 2009; Fahlevi et al., 2017; Rahayu et al., 2016). Hal tersebut
dapat dibuktikan dengan analisis kuantitatif menggunakan Spektrofotometer,
namun karena jumlah sampel terbatas maka analisis tersebut tidak dapat
dilakukan. Terbentuknya pita pada 368 bp dari hasil analisis 30 sampel produk
PCR menunjukkan bahwa semua subjek uji memiliki enzim CYP2A6 yang
bekerja secara normal dalam aktivasi metabolisme senyawa TSNA dalam asap
rokok yang bersifat prokarsinogen. Hal ini dikarenakan semua subjek uji memiliki
alel gen CYP2A6*1 (wild type) dengan frekuensi 100% (n=30) dan tidak
memiliki bentuk polimorfi alel gen CYP2A6*9 dengan frekuensi 0% (Lampiran
12).
Gambar 4. Hasil identifikasi alel gen CYP2A6*1 dan alel gen CYP2A6*9
Keterangan:
M : 1KB (0.25-10 kb) DNA Ladder sebagai marker
15-17, 19 dan 21 : Produk PCR dengan pita tunggal, tebal dan terang
18 dan 21 : Produk PCR dengan pita tunggal, tipis dan kurang terang
Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,5%, fase gerak larutan 1x TBE
buffer, kecepatan 100 volt/cm selama 30 menit.
Selain pada TSNA, CYP2A6 juga memiliki peran dalam memetabolisme
beberapa obat dan bahan kimia seperti nikotin, coumarin, tegafur, dan letrozole
(Tabel 1). Pada individu dengan alel gen CYP2A6*1 proses metabolisme akan
terjadi secara normal sedangkan pada individu dengan bentuk polimorfi
CYP2A6*9 proses metabolisme akan 50% lebih lambat karena terjadi SNP
(Minematsu et al., 2006; Patramurti dan Fenty, 2017). Namun pada bentuk wild
500 bp
250 bp 368 bp
Pita tipis dan
kurang terang
10.000 bp
21 20 19 18 17 16 15 M
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
type maupun polimorfi CYP2A6*9 terdapat keuntungan dan kekurangannya
masing-masing. Berdasarkan hasil identifikasi pada 30 sampel produk PCR
didapatkan hasil bahwa semua sampel memiliki alel gen CYP2A6*1 sehingga
proses metabolisme pada beberapa substrat seperti nikotin, coumarin, tegafur, dan
letrozole oleh enzim CYP2A6 akan terjadi secara normal.
Tabel 1. Hubungan polimorfisme CYP2A6 dengan respon substrat/obat.
Substrat/Obat Alel Efek Sumber
Nikotin *9 Penurunan inaktivasi nikotin
menjadi cotinine melalui reaksi C-oksidasi dan metabolisme cotinine
melalui 3'-hidroksilasi menjadi 3'-
hidroksikotinin sehingga
menurunkan tingkat ketergantungan merokok
dibandingkan *1.
Hukkanen et al.
(2005); McDonagh et al. (2012); Pelkonen et
al. (2000); Raunio and
Rahnasto-Rilla (2012).
Coumarin *9 Penurunan metabolisme coumarin menjadi senyawa 7-
hydroxnycoumarin, sehingga
meningkatkan metabolisme
coumarin oleh enzim CYP lain yang dapat membentuk senyawa
coumarin 3,4-epoxide yang
bersifat hepatotoksik dibandingkan *1
Farinola and Piller (2007); Raunio and
Rahnasto-Rilla (2012).
Tegafur *9 Penurunan metabolisme tegafur
menjadi 5-fluorouracil (5 FU)
yang merupakan metabolit aktif untuk pengobatan kanker
dibandingkan *1.
McDonagh et al.
(2012); Sung et al.
(2009).
Letrozole *9 Penurunan eliminasi letrozole,
melalui penurunan metabolisme letrozole menjadi metabolit
karbinol yang tidak aktif
dibandingkan *1
Bhatnagar, (2007);
McDonagh et al., (2012)
KESIMPULAN
Hasil identifikasi alel gen CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok ras
kulit hitam Papua Indonesia adalah tidak adanya alel gen CYP2A6*9 dengan
frekuensi 0% dari 30 subjek uji.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
SARAN
Penulis menyarankan untuk melakukan penelitian dengan jumlah subjek
uji yang lebih besar. Dapat pula dilakukan penelitian pada gen CYP2A13 yang
juga merupakan salah satu gen yang berperan dalam aktivasi metabolisme
senyawa TSNA dalam asap rokok.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
DAFTAR PUSTAKA
Alsanosi, S.M.M., Skiffington, C., Padmanabhan, S., 2014. Pharmacokinetic
Pharmacogenomics, in: Handbook of Pharmacogenomics and Stratified
Medicine. Elsevier Inc., pp. 341–364.
Anonim, 2019. Genomic DNA Extraction. https://www.prima-
sci.com/14481965/genomic-dna-extraction. Accessed 19 November
2019.
Ashley, D.L., O’Connor, R.J., Bernert, J.T., Watson, C.H., Polzin, G.M., Jain,
R.B., Hammond, D., Hatsukami, D.K., Giovino, G.A., Cummings, K.M.,
McNeill, A., Shahab, L., King, B., Fong, G.T., Zhang, L., Xia, Y., Yan,
X. (Jane), McCraw, J.M., 2010. Impact of Differing Levels of Tobacco-
Specific Nitrosamines in Cigarette Smoke on the Levels of Biomarkers in
Smokers 1389–1398.
Azizah, A., 2009. Perbandingan Pola Pita Amplifikasi DNA Daun, Bunga, dan
Buah Kelapa Sawit Normal dan Abnormal. Skripsi. Fakultas Matematika
Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Bogor.
B-Rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.
Human Heredity, 52(4), 191–200.
Bhatnagar, A.S., 2007. The discovery and mechanism of action of letrozole.
SPringer, 105, 7–17.
Bintang, M., 2018. Biokimia Teknik Penelitian. Edisi 2. Erlangga, Jakarta.
Chiang, H. chih, Wang, C.Y., Lee, H.L., Tsou, T.C., 2011. Metabolic effects of
CYP2A6 and CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-
butanone (NNK)-induced gene mutation-A mammalian cell-based
mutagenesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology, 253(2),
145–152.
Cindy., 2017. Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada
Identifikasi CYP2A6*9. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma. Yogyakarta.
Faatih, M., 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains
dan Teknologi, 10(1), 61–67.
Fahlevi, M.R., Bakti, D., Sitepu, S.F., 2017. Karakterisasi Molekuler Elaeidobius
kamerunicus Faust. (Coleoptera: Curculionidae) Asal Sumatera Utara
Menggunakan Metode Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFLP). Jurnal Agroekoteknologi FP USU, 5(4), 941–953.
Farinola, N., Piller, N.B., 2007. CYP2A6 polymorphisms : is there a role for
pharmacogenomics in preventing coumarin-induced hepatotoxicity in
lymphedema patients ? 8(2), 151–158.
Fatchiyah, Arumingtyas, E.L., Widyarti, S., Rahayu, S., 2011. Biologi Molekular:
Prinsip Dasar Analisis. Erlangga, Jakarta.
Fujieda, M., Yamazaki, H., Saito, T., Kiyotani, K., Gyamfi, M.A., Sakurai, M.,
Dosaka-Akita, H., Sawamura, Y., Yokota, J., Kunitoh, H., Kamataki, T.,
2004. Evaluation of CYP2A6 genetic polymorphisms as determinants of
smoking behavior and tobacco-related lung cancer risk in male Japanese
smokers. Carcinogenesis, 25(12), 2451–2458.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Gayanti, 2017. Pemodelan Hubungan Alometri Tinggi Badan Dan Berat Badan
Menggunakan Ordinary Least Product Regression. Institut Pertanian
Bogor.
Geiss, O., Kotzias, D., 2007. Tobacco , Cigarettes and Cigarette Smoke,
Reproduction.
Geneaid, 2019. Why does the plasmid DNA extraction kit require two washings
with two types of wash buffers (W1 and Wash Buffer) while competitors
kits require one washing?. https://www.geneaid.com/faq/why-does-
plasmid-dna-extraction-kit-require-two-washings-two-types-wash-
buffers-w1-and-wash. Accessed 19 November 2019.
Gyamfi, M.A., Fujieda, M., Kiyotani, K., Yamazaki, H., Kamataki, T., 2005. High
prevalence of cytochrome P450 2A6*1A alleles in a black African
population of Ghana. European Journal of Clinical Pharmacology,
60(12), 855–857.
Hecht, S.S., Hoffmann, D., 1989. The relevance of tobacco-specific nitrosamines
to human cancer. Cancer Surv, 8(2), 273–294.
Hukkanen, J., Iii, P.J., Benowitz, N.L., 2005. Metabolism and Disposition
Kinetics of Nicotine 57(1), 79–115.
IARC, 2007. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans. The International Agency for Research on Cancer, Lyon,
France.
IARC, 2004. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans. International Agency for Research on Cancer, Lyon, France.
Kamaliah, 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi Dna Phenol-Chloroform dan Kit
Extraction pada Sapi Aceh dan Sapi Madura 5(1), 60–65.
Kementerian Kesehatan RI, 2019. Yuk, Mengenal Apa itu Perokok pasif?.
http://www.p2ptm.kemkes.go.id/infographic/yuk-mengenal-apa-itu-
perokok-pasif. Diakses pada tanggal 22 Maret 2019.
Khosravinia, H., Murthy, H.N.N., Parasad, D.T., Pirany, N., 2007. Optimizing
factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood.
African Journal of Biotechnology, 6(4), 481–486.
Liu, T., Xie, C.-B., Ma, W.-J., Chen, W.-Q., 2013. Association Between CYP2A6
Genetic Polymorphisms and Lung Cancer: A Meta-Analysis of Case-
Control Studies. Environmental and Molecular Mutagenesis, 54, 133–
140.
Maftuchah, Winaya, A., Zainudin, A., 2014. Teknik Dasar: Analisis Biologi
Molekuler. Deepublish, Yogyakarta.
McDonagh, E.M., Wassenaar, C., David, S.P., Tyndale, R.F., Altman, R.B.,
Whirl-Carrillo, M., Klein, T.E., 2012. PharmGKB summary: very
important pharmacogene information for cytochrome P-450, family 2,
subfamily A, polypeptide 6. Pharmacogenetics and Genomics, 22(9),
695–708.
Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno,
H., Ishizaka, A., 2006. Limitation of cigarette consumption by
CYP2A6*4, *7 and *9 polymorphisms. European Respiratory Journal,
27(2), 289–292.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Mwenifumbo, J.C., Lessov-schlaggar, C.N., Zhou, Q., Krasnow, R.E., Swan,
G.E., Benowitz, N.L., Tyndale, R., 2008. Identification of Novel
CYP2A6 * 1B Variants : The CYP2A6 * 1B Allele is Associated With
Faster In Vivo Nicotine Metabolism 83(1), 115–121.
Mwenifumbo, J.C., Zhou, Q., Benowitz, N.L., Sellers, E.M., Tyndale, R.F., 2010.
New CYP2A6 gene deletion and conversion variants in a population of
Black African descent. Pharmacogenomics, 11(2), 189–198.
Patramurti, C., Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel CYP2A6 *
4 dan CYP2A6 * 9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa Indonesia 15(1),
50–56.
Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., Martono, S., 2014. Polymorphism of
Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese
Indonesian Smoker and Non Smoker 26(1), 11–19.
Pelkonen, O., Rautio, A., Raunio, H., Pasanen, M., 2000. CYP2A6 : a human
coumarin 7-hydroxylase. Elsevier, 144(2000), 139–147.
PharmVAr, 2012. CYP2A6 allele nomenclature.
https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6. Accessed 17 June 2019.
Prabowo, D.A., 2017. Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) Alel *9
pada Subyek Uji Perokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia. Skripsi.
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Yogyakarta.
Querci, M., Jermini, M., Eede, G. Van de, 2006. The analysis of food samples for
the presence of genetically modified organisms. JRC European
Commission, Europe.
Rahayu, A.R., Pancasakti, H., Budiharjo, A., 2016. Pelacakan Gen Sitokrom
Oksidase Subunit 1 (Co1) DNA Mitokondria Pada Itik Tegal (Anas sp.)
18(2), 114–122.
Raunio, H., Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, structure, regulation,
and function. Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73–88.
Rossini, A., Simao, Tatiana de Almeida Albano, R.M., Pinto, L.F.R., 2008.
Review CYP2A6 polymorphisms and risk for tobacco ‑ related cancers
Review. Pharmacogenomics, 9(11), 1737–1752.
Sung, J.H., Dhiman, A., Shuler, M.L., 2009. A Combined Pharmacokinetic –
Pharmacodynamic ( PK – PD ) Model for Tumor Growth in the Rat with
UFT Administration. Journal of Pharmaceutical Sciences, 98(5), 1885–
1904.
Suryantisa, I., 2018. Situasi Umum Konsumsi Tembakau di Indonesia. Pusat Data
dan Informasi Kementerian Kesehatan RI. Jakarta Selatan
Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J.T., Yokoi, T.,
2003. Effects of polymorphism in promoter region of human CYP2A6
gene (CYP2A6*9) on expression level of messenger ribonucleic acid and
enzymatic activity in vivo and in vitro. Clinical Pharmacology and
Therapeutics, 74(1), 69–76.
Yuwono, T., 2005. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Lampiran 1. Ethical Clearance
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Lampiran 2. Perhitungan Jumlah Sampel
Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal
pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001)adalah :
≥
Keterangan:
: jumlah sampel minimal
: probabilitas alel utama
: frekuensi alel minor
Pada penelitian ini terdapat dua alel yang akan diteliti, yaitu: CYP2A6*1
(alel utama) dan CYP2A6*9 (alel minor). Menurut B-Rao (2001), nilai dan
untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah = 0,95 dan
Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian ini adalah:
=
=
= 28,89
= 29 orang
Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 30 orang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Lampiran 3. Hasil Kuesioner
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 4. Data Subjek Uji Hasil Kuesioner
Subjek Umur (Tahun) Jenis Kelamin
1P 19 Perempuan
2P 23 Laki-laki
3P 22 Laki-laki
4P 19 Perempuan
5P 22 Perempuan
6P 23 Laki-laki
7P 19 Laki-laki
8P 22 Laki-laki
9P 20 Perempuan
10P 19 Perempuan
11P 18 Perempuan
12P 19 Perempuan
13P 22 Laki-laki
14P 20 Perempuan
15P 21 Perempuan
16P 21 Laki-laki
17P 20 Laki-laki
18P 20 Laki-laki
19P 19 Laki-laki
20P 19 Laki-laki
21P 23 Laki-laki
22P 22 Laki-laki
23P 20 Laki-laki
24P 18 Laki-laki
25P 19 Laki-laki
26P 20 Laki-laki
27P 20 Laki-laki
28P 19 Perempuan
29P 20 Laki-laki
30P 22 Perempuan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 5. Usage Information of FavorPrepTM
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 6. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 7. Usage Information of Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Lampiran 8. Product Information of DNA Ladder
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Lampiran 9. Product Datasheet of primer forward and reverse
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Lampiran 10. Hasil Analisis Kemurnian Isolat DNA
Lampiran 11. Hasil Identifikasi Alel Gen CYP2A6*1 dan *9
21 20 19 18 17 16 15 M 28 27 26 25 24 23 22 M
1 2 3 4 5 6 7 M 14 13 12 11 10 9 8 M
29 30 M
M 5 10 15 20 25
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Lampiran 12. Frekuensi Alel Gen CYP2A6 *1 dan *9
Alel Jumlah Frekuensi
CYP2A6*1 30 100%
CYP2A6*9 0 0%
Frekuensi CYP2A6*1 =
=
= 100%
Frekuensi CYP2A6*9 =
=
= 0%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama lengkap Mensiana Lodvi Putarato, lahir di
Waikabubak pada tanggal 31 Mei 1997. Penulis merupakan
anak pertama dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Victor
Ngongo Putarato dan Ibu Dorkas Lende. Penulis menempuh
pendidikan TK sampai SMA di Sumba Barat, Nusa Tenggara
Timur pada TK Pertiwi (2001- 2003), SD Masehi Waikabubak
II (2003-2009), SMP Negeri 3 Waikabubak (2009-2012), dan SMA Negeri 1
Waikabubak (2012-2015). Pada tahun 2016, penulis melanjutkan pendidikan ke
jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta. Selama masa kuliah, penulis aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti
Pharmalympic tahun 2017 sebagai anggota divisi pendaftaran, Tiga Hari Temu
Akrab Farmasi (Titrasi) 2018 sebagai anggota divisi medis, dan Pharmacy
Performance tahun 2018 sebagai koordinator divisi konsumsi. Penulis juga
berpartisipasi sebagai koordinator asisten dosen Biokimia tahun 2019.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI