1

Imunohematologická vyšetření v těhotenství a po porodu

Dle „Doporučení TS ČLS JEP č. STL2010-06 ze dne 1.3.2010“

Eliška Rýznarová

2

Cílem doporučení je

Prevence hemolytického onemocnění plodu a novorozence

3

Těžkým průběhem HON se rozumí

• Úmrtí plodu• Provedení intrauterinní transfuze plodu (IUT)• Výměnná transfuze novorozence• Transfuze erys během 1. týdne života z důvodu

anémie způsobené HON• V ČR je cca 25 takových těžkých případů za rok

4

Odběr a značení vzorku krve• Vzorek matky, otce: sražený nebo odebraný do citrátu, EDTA, CPD-A• Vzorek plodu: je krev z umbilikální žíly• Vzorek novorozence: pupečníková nebo kapilární krev • Zkumavku označit před odběrem krve ! • Na štítku: jméno

příjmení

číslo pojištěnce (rodné číslo)

datum odběru vzorku• Na štítku plodu: údaje těhotné + označení „plod“• Na štítku novorozence: jméno nemusí být známo

příjmení

číslo pojištěnce vygenerované – unikátní• Po nalepení štítku ověřit identifikaci dotazem, ze zdrav. dokumentace

5

Žádanka• Jméno a příjmení

• Číslo pojištěnce (rodné číslo)

• Datum požadavku

• Diagnóza

• Zdravotní pojišťovna

• Pořadí a týden gravidity

• Transfuzní anamnéza

• Informace o zjištěných protilátkách, specifita, HON

• Informace o provedené RhD profylaxi

• Identifikace žadatele

• Identifikace osoby, která vzorek odebrala

• Bez správného odběru, značení zkumavky a žádanky nelze provést vyšetření !

6

Klinická významnost protilátek proti ery• Klinicky významné: anti-D, -c, -K, -E, -C, -e, -G, -Ce, -cE, -Fya, Jka, anti-A, -B, -AB• Klinický význam zvažovat individuálně: anti-S, -s, - M, -Cw, -ce, - Cx, -Ew, Fyb, - k, -Kpa,b, - Jsa,b, -

PP1Pk, -U, - Jkb, -Tja, -Yta, -LW, -Diego, -Jra, proti Ag s vysokou četností: např. anti-Ena, - Gerbich, proti Ag s nízkou frekvencí: např. anti-Wra • Klinicky nevýznamné: anti-P1, - Lea, -Leb, -H, I, -HI, -N, -Lutheran, panspecifické protilátky (reagují se všemi panelovými diagn.

ery i s ery vlastními), chladové protilátky, protilátky reagující pouze v enzymovém prostředí

7

Protilátky jako příčina HON• HON mohou teoreticky způsobovat jakékoliv alogenní

protilátky třídy IgG• Nejčastější příčinou těžkého HON jsou:

anti-D (85%) anti-c (3,5%) – mohou způsobit i opožděnou anemii novorozence

anti-K (10%) anti-E (2-7%)• Protilátky stejné specifity a síly se in vivo nechovají stejně• Nejčastěji se vyskytující protilátky jako následek předchozí

transfuze jsou: anti-c, -K, Fya

• Z hlediska těžkého HON vyžadují „přísné“ sledování: anti-D, - c, -K, -E

8

Vstupní vyšetření každé těhotné ve 12. týdnu (10.-16.)minimální požadavky

• ABO : monoklonální anti-A, -B, erys A1, B, u dalších těhotenství anti-A, -B, shoda se záznamem !• D: 2 x anti-D IgM, DVI-, různé klony, Rh kontrola, Dw NE

u dalších těhotenství 1 x anti-D IgM, DVI-, Rh kontrola, shoda se zázn.!

• Screening protilátek minimálně se 3 typy diagn. erys LISS NAT s polyspecifickým AGH anti-IgG + C3d, enzymový test u

zkumavkových testů V případě pozitivity identifikace protilátek• Identifikace protilátek minimálně s 8 typy dg. erys LISS NAT s polyspecifickým AGH anti-IgG + C3d, enzymový test doplňující, ověření specif. protilátky typizací antigenu• Titrace protilátky zkumavkovým NAT bez potenciátoru, AGH anti-

IgG, nebo -IgG-C3d nebo sloupcovou aglutinací LISS NAT První zkumavka, sloupec: titr 1 (neředěné sérum/plazma + erys) Sérum/plazmu ředit fyziologickým roztokem

9

Klinicky významný titru protilátek u těhotných

• Zkumavkovým NAT: . Sloupcovou aglutinací LISS NAT: anti-D, - C, -E: ≥ 32 anti-D, - C, -E: ≥ 128 anti-K: ≥ 4 anti-K: ≥ 8 ostatní protilátky: ≥ 64 ostatní protilátky: ≥ 128 (nejsou data)

• Individuálně klinicky významný může být i nižší titr• U protilátky anti-K je význam titru omezený - způsobují efekt

imunitní suprese erytropoézy • Je důležité i stanovení titru protilátek ve směsi• Při titrování je nutná srovnávací titrace s předchozím vzorkem

(používají se vždy jiné dg. erys)• Titrují se pouze klinicky významné IgG a přednostně s

heterozygotními dg. ery• Změna titru o více než 2 stupně je signifikantní• Náhlý pokles titru o více než 3 stupně může být známkou těžkého

postižení nebo i exitu plodu

10

Titrování je screeningový test

• Titrování se uplatňuje jako screeningový test pro rozhodování o tom kdy je třeba začít monitorovat HON jinou metodou než imunohematologickou.

• Titrování se provádí jen do dosažení klinicky významného titru.

• Pokud je v anamnéze HON je vhodné určit genotyp plodu, pokud není otec homozygot pro daný antigen. Antigen-pozitivní plod sledovat jinými metodami než imunohematologickými.

Zde není užitečné pro stanovení tíže fetální anémie stanovení titru klinicky významných protilátek.

11

Opakované vyšetření těhotné ve 28. týdnu (26. – 30.)Všechny ženy D+ a D- bez protilátek nebo s klinicky nevýznamnými.

Minimální požadavky:

• ABO : pokud jsou záznamy !! pak pouze kontrolní vyšetření s monoklonálním anti-A, -B a u dalších těhotenství se neprovádí • D: pokud jsou záznamy !! 1 x anti-D IgM, DVI-, Rh kontrola, Dw NE

u dalších těhotenství se neprovádí • Screening protilátek jako u vstupního vyšetření Odběr vzorku před aplikací Ig anti-D ! minimálně se 3 typy diagn. erys LISS NAT s polyspecifickým AGH

anti-IgG + C3d, enzymový test u zkumavkových testů v případě pozitivity identifikace protilátek• Identifikace protilátek jako u vstupního vyšetření minimálně s 8 typy dg. erys LISS NAT s polyspecifickým AGH anti-IgG +

C3d, enzymový test doplňující, ověření specif. protilátky typizací antigenu• Titrace protilátky jako u vstupního vyšetření zkumavkovým NAT bez

potenciátoru, AGH anti-IgG, nebo -IgG-C3d nebo Sloupcovou aglutinací LISS NAT

12

Požadavky na diagnostické erytrocyty• Zastoupení antigenů u screeningových diagnostických erys: C, Cw, c, D, E, e, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, M, N, Lea

1 x s fenotypem: DCe / DCe (R1R1) 1 x s fenotypem: DcE / DcE (R2R2) Homozygotní zastoupení antigenů: Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s. Poznámka: antigeny Fyb, N a Lea jsou uvedeny spíše z důvodu možné transfuze krve.• Zastoupení antigenů u panelových diagnostických erys: ≥ 1 x fenotyp DCe/DCe (R1R1) a DCe/DCe Cw+ (R1

w R1) a zároveň oboje exprimovat: K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, S, s ≥ 1 x fenotyp DcE/DcE (R2R2) ≥ 1 x fenotyp D- Ccee (r´r) ≥ 1 x fenotyp D- ccEe (r´´r) ≥ 2 x fenotyp D- ccee (rr) a s fenotypy K+, K-, Jk(a+b-), Jk(a-b+),

S+s-, S-s+, Fy(a+b-), Fy(a-b+)

13

Požadavek na monoklonální anti-B

• Diagnostikum anti-B nesmí reagovat se získanou krevní skupinou B.

• Co to je „získaná“ krevní skupina B ? Bakteriální enzymy (deacetylázy) mění imunodominatní cukr krevních skupin A (acetyl-galaktosamin) na imunodominantní cukr krevní skupiny B (na galaktosamin který je základní strukturou galaktósy a některá monoklonální nebo i polyklonální anti-B pak mohou s galaktosaminem reagovat.

V tomto případě pak erys A1 reagují jako by nesly B antigen a krevní skupina se jeví jako AB.

14

Kdy vyšetřovat slabý antigen D u těhotné

• Slabé D je třeba vyšetřit vždy v případě genotypování plodu z plazmy matky. U žen se slabým D nelze genotypizaci plodu z plazmy matky provést nebo jen po

konzultaci s RL

• Na slabý antigen D nebo variantu D je vhodné myslet v případě: - Pozorování slabší reakce než na 2+ s oběma anti-D - Při zjištění zcela diskrepantních reakcí: negativní a pozitivní - Při rozdílu v síle reakcí obou anti-D o 2+ - V případě nečekaného nálezu protilátky anti-D u osoby „ se zdánlivě normálním D“ (a vyloučenou autoreakcí) - Zjistíme-li diskrepance mezi anamnestickým údajem a současným vyšetřením - V tomto případě stanovíme nebo vyloučíme variantu antigenu D - Do té doby a také ve sporných případech klasifikujeme těhotnou jako D- - A laboratoř doporučí anti-D profylaxi

• Vyšetřením antigenu D určíme D- ženy pro profylaxi anti-D (Profylaxe anti-D viz dále samostatná kapitola).

15

Sledování těhotných s klinicky významnými protilátkami anti-D, -c, K, - E

a protilátkami zodpovědnými za těžké HON v anamnéze

Testování 4 týdny po vstupním vyšetření:

• kontrolní vyšetření AB0 D stačí, pokud jsou záznamy!! anti-A, -B, 1x anti-D, Rh kontrola • Identifikace protilátek• Stanovení titru protilátek paralelně s předchozím vzorkem Je nutné testovat každé další 4 týdny, 28. týden a pak 1 x za 14 dnů:

• Identifikace protilátek• Stanovení titru protilátek paralelně s předchozím vzorkem• Titrování se provádí pokud není jednoznačně prokázáno, že je otec pro daný

antigen negativní (otec nejistý)• Po dosažení klinicky významného titru další titrování neprovádět. Pokračovat ve

sledování plodu jinými metodami (např. Dopplerova metoda pro měření krevního průtoku arteria cerebri media).

• V identifikaci protilátek pokračujeme protože je možná tvorba další protilátky, pak se postupuje podle klinické závažnosti protilátky a význam pro transfuzi krve

16

Sledování těhotných s klinicky významnými protilátkami jinými než již zmíněnými (anti-D, -c, -K, -E)

Kontrolní vyšetření se provádí po vstupním vyšetření až ve 28. týdnu těhotenství:

• kontrolní vyšetření AB0 D stačí, pokud jsou záznamy!! anti-A, -B, 1x anti-D, Rh kontrola • Identifikace protilátek• Stanovení titru protilátek paralelně s předchozím vzorkem z 12. týdne Po 28. týdnu pak vyšetřovat každé 4 týdny (může se objevit další specifická protilátka):• Identifikaci protilátek• Stanovení titru protilátek paralelně s předchozím vzorkem• Titrování se provádí pokud není jednoznačně prokázáno, že je otec pro

daný antigen negativní (otec nejistý)• Po dosažení klinicky významného titru další titrování neprovádět.

Pokračovat ve sledování plodu jinými metodami (např. Dopplerova metoda pro měření krevního průtoku arteria cerebri media).

• V identifikaci protilátek pokračujeme, je možná tvorba další protilátky

17

Specifické postupy

V případě výskytu protilátky Anti-K

• Klinicky významný titr je zkumavkově ≥4, sloupcovou aglutinací ≥ 8

• Význam titru omezený – uplatňuje se efekt imunitní suprese erytropoézy

• Vyšetřit otce, je-li heterozygot a vyšetřit plod genotypováním z plazmy matky poprvé 20. týden. Je-li vyšetření negativní opakovat 28. týden. Popřípadě provést genotypizaci ze vzorku získaného kordocentézou. To však přináší vysoké riziko FMH, další aloimunizace matky (30%), riziko potratu (1-3%).

• V případě K pozitivity plodu monitorovat plod pomocí ultrazvuku.• Většina případů tvorby anti-K je způsobena předchozí transfuzí Kell

pozitivních ery• Dívkám a ženám ve fertilním věku se doporučuje v případě transfuze

aplikace Kell negativních ery

18

Další specifické postupy

• V případě zjištění anti-C+D: Je třeba odlišit, zda se nejedná o protilátku anti-C+G, resp.

Anti-G. V tomto případě by těhotné měly podstoupit

Rh profylaxi

• AB0 inkompatibilita: U AB0 inkompatibility neexistuje dostupný test k přesné

prenatální předpovědi HON

Nemá smysl identifikovat těhotné s vysokými titry anti-A, -B ani sledování dynamiky titrů imunních IgG protilátek anti-A, anti-B titrováním NAT s erys A1 nebo B

19

Anti-D profylaxe

• Především je žádoucí monitorovat situaci před podáním Ig anti-D. Odebrat vzorek těhotné a vyšetřit protilátky.

20

Poznámka k Anti-D profylaxi

• Fetal Bleed Screening Kit slouží k průkazu fetomaternálního krvácení při proniknutí 30 ml a více AB0 kompatibilní D pozitivní fetální krve do krevního oběhu D negativní ženy.

• Test je sestaven tak, aby dal negativní výsledek při nejobvyklejším rozsahu fetálního krvácení, což je méně než 2 ml plné krve.

• Pozitivita screeningového testu ukazuje na zvýšené fetomaternální krvácení. Je nutné kvantitativní stanovení a určit profylaktickou dávku Rh imunoglobulinu a aplikovat do 72 hod po porodu.

21

Poznámka: Standardní dávka pro potlačení Rh imunizace:

• Je 1 ml Rh-imunního globulinu o obsahu asi 300 µg protilátky na maximálně 15 ml erytrocytů plodu, což odpovídá asi 30 ml plné krve.

• Negativita screeningového vyšetření fetomaternálního krvácení v indikovaných případech znamená, že k ochraně před tvorbou anti-D u ženy postačí pouze standardní dávka Rh-imunního globulinu o objemu 1 ml.

22

Poznámka:

Fetal Bleed Screening Test pro průkaz fetomaternálního krvácení před aplikací Ig anti-D

kapka mateřských erys + 1 kapka Anti-D modif.

(senzibilizace D pozitivních ery)

15 min 37°C a pak 3 – 4 x proprat v 0,9% NaCl

+ 1 kapka indikátorových erys, centrifugace, mikroskopování

< 1 rozeta / 3 zorná pole = 1 dávka Rh imunního globulinu

> 1 rozeta / 3 zorná pole = nutné kvantitativní stanovení

23

Poznámka: Fetal Bleed Screening Test využití ke stanovení slabého D

z pupečníkové krve

případě, že je PAT pozitivní v souvislosti s protilátkami ABO systému a nelze testovat slabé D

metodou NAT

jednotné aglutinační pole = pozitivní výsledek

24

Poznámka: Kleihauer Kit – kvantitativní test průkazu fetomaternálního krvácení před

aplikací Rh imunoglobulinu

• trvá pouze 15 min. a fixovaný nátěr vydrží 72 hod• tenký nátěr schnout 2 min., fixovat 3 min., promýt• eluce 30 sec., schnout, barvit 2min., hodnotit

hemoglobin fetální - HbF se barví jasně červeně

hemoglogin dospělých - HbA se barví bledě růžově

25

Testování po anti-D profylaxi

Postup v případě, že existuje záznam o podání Ig anti-D:

• Je-li záznam o podání v posledních 8 týdnech a titr nízký, stačí kontrola titru každé 4 týdny

• Pokud je titr anti-D stále stejný nebo klesá nebo protilátka není detekovatelná – kontroly neprovádět

Poznámka:• Anti-D protilátky po profylaxi často reagují pouze v

enzymovém testu a často nereagují se všemi D+ erys• Jejich titry jsou obvykle nízké: (2 zkumavkově, 8 sloupcovou aglutinací, do 1UI/ml)

26

Testování v případě nejasností o anti-D profylaxi

Postup v případě, že neexistuje záznam o podání Ig anti-Dnebo je titr zkumavkově 4 nebo sloupcovou aglutinací 16:

• Stanovit titr anti-D každé 4 týdny až do 28. týdne• Po 28. týdnu stanovit titr 1 x za 14 dnů• Odhalit případnou „maskovanou“ klinicky významnou protilátku testováním s panelem D- diagnostických erys (pro případ transfuze krve)

Poznámka:Odlišení aktivní a pasivní imunizace: • Při aktivní imunizaci – výskytu imunní anti-D je titr obvykle

stabilní nebo se zvyšuje• Při pasivní imunizaci - po anti-D profylaxi titr protilátky klesá

nebo je nedetekovatelná (po potvrzení již není nutné provádět titraci)

27

Tvorba anti-D po aktivní a pasivní imunizaci

V případě aktivní imunizace:• Dochází ke tvorbě anti-D cca 4 týdny po expozici

antigenem D• Vrchol sérologické detekce protilátky je po 6-10 týdnech• Titry imunní protilátky zůstávají obvykle stabilní a zvyšují

se po další stimulaci cizorodým antigenem

V případě pasivní imunizace po podání anti-D profylaxe:• Můžeme pasivní anti-D detekovat NAT po dobu 8 i více

týdnů • Citlivější metodou až 12 týdnů, vyjímečně několik

měsíců• Vrchol sérologické detekce protilátky je cca 3-7 dnů po

podání Ig anti-D

28

Laboratorní testování „otce“

29

Laboratorní testování otce

30

Laboratorní testování otce „pokračování“

• Vyšetřením otce se určuje riziko imunizace mezi matkou a plodem

• Pokud jsou v séru/plazmě těhotné především anti-D, -c, -K, -E, pak je nutné zjistit, zda je otec pro daný antigen homozygot nebo

heterozygot (pravděpodobnost pro plod)

• Genotypování otce se provádí vyjímečně (například nejasné výsledky v případě těžkého HON či nedostupné genotypování plodu)

• Je-li otec v daném antigenu negativní – lze sledovat těhotnou v režimu jako kdyby protilátky neměla (pozor otec nejistý !)

• Testování séra/plazmy matky + ery otce se provádí k vyloučení imunologické reakce proti vzácně se vyskytujícímu antigenu

V případě, kdy u matky nebyly zjištěny protilátky ale bylo zjištěno těžké HON

(Při neshodě v AB0 je třeba předem vysytit aglutininy v séru/plazmě matky opakovanou absorpcí při 4°C a 37°C na příslušné ery dárce.)

31

Laboratorní testování ploduTestování AB0 D se provádí vyjímečně jen v případě kordocentézy u

suspektní anémie způsobené HON před IUT:• aglutinogeny 2x, anti-D IgM DVI- 2 x různé klony, Dw NE • PAT (význam sporný, eluce a identifikace protilátky nepřináší nové

informace)

Genotypování plodu se provádí pokud je reálně dostupné:• Přednostně z plazmy matky PCR metodou • A to v případě klinicky významného titru protilátek u těhotné a je-li otec

heterozygot v daném antigenu • RHD a RHCE genotypizace je možná poprvé v 15.-18. týdnu

(gen RHD produkuje antigen D, gen RHCE antigeny C, c, E, e)• Genotypování Kell je možné poprvé ve 20. týdnu

a je-li negativní, opakovat ve 28. týdnu.• V případě K pozitivity monitorovat plod

32

Poznámka: PCR (polymerase chain reaction)

PCR-SSP s použitím sekvenčně specifických primerů

(alelově skupinově specifických)

PCR-SSOP využití hybridizace se sekvenčně specifickými

oligonukleotidovými sondami

PCR-RFLP stanovení polymorfismu v délce restrikčních

fragmentů (za pomoci panelu restrikčních

endonukleáz, vyhodnocení délky fragmentů DNA)

33

Poznámka: Jak probíhá PCR-SSP

1. Extrakce – izolace DNA z jádra leukocytů natrávením proteinázou K,

precipitace DNA etanolem, rozpuštění DNA v dH2O nebo TRISu.

2. Amplifikace DNA – PCR - polymerázová řetězová reakce je napodobení procesu replikace. Namnožení DNA vzorku. Amplifikují se specifické sekvence DNA za pomoci vždy 1 známého páru primerů, charakteristického pro daný antigen. Pokud se primery nenavážou, pak neodpovídají danému antigenu a k amplifikaci nedojde.

Do reakce: DNA matrice (vyšetřovaný vzorek) + nukleotidy, stavební kameny DNA adenin (A),

thymin (T), cytosin C, guanin(G) + Tag polymeráza syntetizující novou DNA.

PCR probíhá ve 3 krocích, které se opakují až 40 x v cykléru aby se namnožil dostatek vyšetřované DNA:

Denaturace: rozplétá se dvouřetězová DNA při 92-96°C 1 min. Annealing (primerování): dané primery se vážou na rozpletenou DNA při 45-72°C 2 min. Extenze (syntéza): vkládání nukleotidů A-T, C-G

3. Detekce DNA elektroforézou v agarovém gelu (+ vizualizace ethidium bromidem, vyzařuje v UV světle oranžové světlo)

4. Vyhodnocení

34

Vyšetření matky po porodu Rutinní testování po porodu nepřináší žádnou užitečnou informaci• Ani u matek s klinicky významnými protilátkami • Stanovení titru po porodu také nemá význam.

Testování matky po porodu má význam v případě:• Že během těhotenství nebyla vůbec testována• Nebo protilátky u ní zjištěny nebyly ale přesto má novorozenec

známky HON. V tomto případě se testuje sérum/plazma matky + erys otce za účelem odhalení reakce proti antigenu s nízkou frekvencí výskytu (AB0 kompatibilita pro testování nutná, nebo je nutná absorpce aglutininů)

• V případě předtransfuzního testování pro výběr krve k transfuzi matky nebo novorozence. Zkouška kompatibility u novorozence se přednostně provádí ze séra/plazmy matky, kde jsou také jediné protilátky, které se mohou vyskytnout i v séru/plazmě novorozence.

35

Vyšetření novorozence – AB0

Rutinní vyšetření AB0 všech novorozenců se nedoporučuje ani pokud je matka KS 0 (u všech novorozenců je ikterus monitorován)

Vyšetření AB0 se provádí pro případ transfuze: • U suspektního HON nebo AB0 HON • Při výskytu klinicky významných protilátek u

matky• Upřednostňuje se vyšetření z pupečníkové krve• Testují se aglutinogeny 2x

36

Vyšetření antigenu D

Rh D pozitivní

Rh D negativní

Rh Dw/v (weak / variant) se stanoví nepřímým antiglobulinovým testem (NAT)

Klasifikace variantních D antigenů pomocí panelu specifických monoklonálních diagnostik

37

Specifikace antigenu D pomocí panelu monoklonálních protilátek

Summary of Dvariants - Serological and epitope specificity

D Epitopes

D Low Freq.

Category Rh Antigen 1a 1b 2a 2b 3 4 5a 5b 5c 5d 5e 6/7a 6/7b 6/7c 6/7d 6/7e 6/7f 6/7g 6/7h 6/7i 6/7j 8 9 10 11 12 13 14 15

II McI + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + + - +

IIIa C-E-; V-VS+? + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

IIIb G-; hrs-? + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + +

IIIc C+G+V-VS- + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

IVa Go(a+) - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + + - -

IVb - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + - + - + + - -

Va DWiel - - + + + + - - - - - + + + + + + + + + + + + + - + + + +

VI BARC+? - - - - + + - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - - - +

VII Tar+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - - + +

DFR FPTT+ + - + - + + + + - - - + + + + + - - - - - - + + - - - + +

DBT - - - - - - - - - - - + + - - - + + - - - + - - - - - - -

RoHar Rh:33 - - - - - - + - + - - + - + - - + - + - - - - - - - - - -

HMi - + - +/- + + + + + - + + + + + + + + + + - + +

HMii + + + + + + + + + - + + + + - + + + + - + + +

**Note: Suspected Epitope Specificity is based on thirty epitope model; Jones J, Scott ML, Voak D. Monoclonal anti-D specificityand RhD structure; criteria for selection of monoclonal anti-D reagents for routine typing of patients and donors.Transfusion Med. 1995; 5: 171-184.

38

Vyšetření antigenu D u novorozence

Se provádí:• Z důvodu zajištění anti-D profylaxe u D- matek: (2 x anti-D IgM DVI-, Rh kontrola)• Pro případ transfuze krve u suspektního HON: - Kdy u matky jsou přítomny klinicky významné protilátky - Nebo je matka bez protilátek, ale novorozenec má známky HON

Poznámka:• Testování Dw ani variantního D se nedoporučuje: protože není dokázáno, že by ery DVI+ senzibilizovaly matku (je znám 1 případ za 40 let a možná je spíše otázkou diagnostik) a navíc při pozitivitě PAT je testování nespolehlivé• Při nálezu slabých reakcí s anti-D diagnostiky a zjištění slabého D je třeba se po konzultaci vyjádřit k profylaxi anti-D

39

Screening nepravidelných protilátek u novorozence

Screening protilátek u novorozence se provádí:• Pokud nebyl proveden u matky nebo není výsledek znám:

provádí se běžným způsobem se 3 typy diagnostických erys LISS NAT

Dále se provádí speciální testování v případě: • Kdy novorozenec má známky HON ale matka je bez protilátek • Je vhodné hledat protilátku proti antigenu s nízkou frekvencí

výskytu

Nejlépe již zmíněným testováním séra/plazmy matky a erys otce. V případě ABO inkompatibility mezi matkou a otcem se někdy provádí testování: Mezi sérem/plazmou novorozence a erys otce LISS NAT

40

PAT u novorozence

• Se nedoporučuje provádět jako rutinní vyšetření ani u D+ ani D- matek

• Zvláště ne po prenatální anti-D profylaxi Z tohoto důvodu může být u novorozenců

PAT+ až v 3-6% avšak bez klinického významu

• Profylaktické podání anti-D IgG nezpůsobuje destrukci fetálních nebo novorozeneckých

D+ ery

41

Vyšetření PAT u novorozence

Vyšetření PAT u novorozence se provádí:• Pokud byla u matky prokázána potenciálně klinicky

významná protilátka• Pokud u matky protilátky neprokázány nebyly ale

novorozenec má klinické známky HON• V případě suspektního AB0 HON• V případě, že u matky nebyl proveden screening

protilátek ani během těhotenství a ni po porodu nebo není výsledek znám

Poznámky:• Provádí se přednostně z pupečníkové krve sloupcovou aglutinací • PAT falešně negativní – technické chyby• PAT falešně pozitivní – silné chladové autoaglutininy

42

Vypovídající hodnota PAT u novorozence

• Pozitivita PAT nepotvrzuje diagnózu HON U novorozence je nutné vyšetření Hb a sérového bilirubinu

• Prediktivní hodnota pozitivity PAT je cca 23%

• Naopak u PAT negativního mohou být příznaky těžkého HON a nejenom u AB0 inkompatibility

43

Eluční test u novorozence s PAT +Eluce není nutná: • Pokud je protilátka u matky jednoznačně identifikována • U AB0 HON kde je dostatečné vyšetření imunních protilátek

anti-A, anti-B třídy IgG s erys A1, B LISS NAT

Eluce je vhodná:• V případě výskytu směsi protilátek k určení toho, která protilátka

se podílí na HON. Ostatní IgG protilátky přenesené pasivně se neuplatňují, protože novorozenec korespondující antigen nemá. Způsobují však problémy při výběru kompatibilní krve v případě transfuze.

• V případě suspektní reakce proti antigenu s nízkou frekvencí výskytu, kdy nejsou k dispozici výsledky vyšetření matky. Testuje se eluát proti erys otce LISS NAT.

Metoda: Eluce kyselá, tepelná.Testuje se eluát LISS NAT s dg. ery nesoucími korespondující antigen

44

Vyšetření imunních protilátek anti-A, - B třídy IgG u novorozence

• Je základním vyšetřením při podezření na AB0 HON

• Vyšetření metodou LISS NAT

např. sloupcovou aglutinací s ery krevní skupiny A1, B a jako kontrolní se používají ery 0

45

Test kompatibility u novorozence

Provádí se v případě:• Transfuze erytrocytů • Výměnné transfuze modifikované

kompatibilní plné krve

Přednostně se provádí ze séra/plazmy matky, není-li k dispozici, lze použít vzoreknovorozence

(krev kompatibilní pro matku i novorozence)

46

Závěrem důležitá informace:

• Při podezření na HON zaslat do laboratoře i vzorek matky !

• Myslet na odebrání vzorku matky a jeho transport současně při transportu novorozence do jiného zdravotnického zařízení !

47

Děkuji za pozornost