OPVK CZ.1.07/2.2.00/2/.0184

Základy ADME a toxického hodnocení

léčiv v preklinickém vývoji

OCH/ADME

LS 2012/2013

Absorpce léčiv, faktory ovlivňující

absorpci, optimální fyzikálně-chemické

vlastnosti léčiva

Mgr. Alice Rulcová

20.2.2013

Farmakologie interakce léku a organismu

• Farmakokinetika – vliv organismu na lék (osud léčiva v organismu)

• Vliv dávky, způsob podání, fyziologický stav organismu

• Farmakodynamika – vliv léku na organismus

Farmakokinetika

• Farmakokinetická studie – podání fixní dávky léčiva subjektu (zvíře, člověk)

– v různých časech od podání jsou sbírány vzorky ( obvykle krev/plasma)

– analýza koncentrací parentní látky a metabolitů

– matematická analýza

• Toxikokinetika – farmakokinetika aplikovaná na vysoké dávky

– Toxikologické testování léčiv

– Někdy může podání takto vysokých dávek mít za následek saturační kinetiku – ovlivnění PK profilu

Základní farmakokinetické dějě (ADME)

• Absorpce – podaná látka se vstřebá z místa aplikace do krevního oběhu

• Distribuce – látka přestupuje z krevního oběhu k místu účinku

• Metabolismus – chemická přeměna léku vedoucí ke snížení farmakologické aktivity a k usnadnění vylučování

• Exkrece – vyloučení léku z organismu

• Eliminace – M+E http://health-7.com/Lippincotts%20Illustrated%20Reviews%20Pharmacology/1.%20Pharmacokinetics

Biologická membrána

• Léčivo musí překonat biologickou membránu

• Musí se rozpustit v lipofilní vrstvě

• Proteiny – strukturní funkce, receptory, transportéry (hydrofilní léčiva)

http://www.pharmacology2000.com/General/Pharmacokinetics/kinobj1.htm

http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=Cell_Membranes_and_Compartments

Vliv pKa a pH na ionizaci léčiva

AH ↔ H+ + A− kyselina

B + H+ ↔ BH+ zásada

AH BH+

A− B

http://health-7.com/Lippincotts%20Illustrated%20Reviews%20Pharmacology/1.%20Pharmacokinetics/

Vliv pKa a pH na ionizaci léčiva

• Všechna léčiva – slabé kyseliny nebo slabé baze → ionizace (závisí na prostředí)

• Kysleliny: AH Zásady: B

přes

membránu

Vliv pKa a pH na ionizaci léčiva

• Kyselé prostředí: K neion. → AH

B ion. → BH+ → nemůže se vstřebat

• Zásadité prostředí (např. alkalizovaná moč):

K ioniz. → A- → nevstřebá se

B neion. → B → vstřebá se

Henderson-Hasselbachova rovnice

AH ↔ H+ + A− B + H+ ↔ BH+ kyselina zásada

𝐾𝑎=[𝐴−][𝐻+]

[𝐴𝐻] 𝐾𝑎 =

𝐻+ [𝐵]

[𝐵𝐻+]

𝑙𝑜𝑔

𝑛𝑒𝑖𝑜𝑛𝑖𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛á

𝑖𝑜𝑛𝑖𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛á = 𝑝𝐾𝑎 −𝑝𝐻 𝑙𝑜𝑔

𝑛𝑒𝑖𝑜𝑛𝑖𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛á

𝑖𝑜𝑛𝑖𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛á = pH - 𝑝𝐾𝑎

• Pokud se pKaléčiva = pH prostředí → 50% léčiva bude ionizováno

Ionizace aspirinu (pKa = 3)

pH Neionizovaná frakce (%)

Ionizovaná frakce (%)

1 99,9 0,10

2 90,0 10,0

3 50,0 50,0

4 9,09 91,9

5 1,00 99,0

6 0,10 99,9

pH v organismu Plazma 7,4

Mléko 7,0-7,3

Mozkomíšní mok 7,3

Moč 4-8

Plod 7,3

Na lačno Po jídle

Žaludek 1,4 – 2,1 3,0 – 7,0

Duodenum 5-6

Ileum 3,8 - 8

tlusté střevo 5 – 8

Trávicí trakt

Vliv ionizace na distribuci léčiv

Slabá kyselina HA H++ A− 𝑝𝐾𝑎= 4,4

neionizovaná ionizovaná

[1] [1000] [1001]

HA H++ A−

[1] [0,001] [1,001]

HA H++ A−

Ion trapping

membrána

plasma

žaludeční šťáva

pH = 7,4

pH = 1,4

Total [HA] + [A−]

Přestup látek přes membrány

1. Pasivní difúze

2. Filtrace, bulk flow

3. Facilitovaná difúze

4. Aktivní transport

5. Transport iontových párů

6. Endocytóza

7. Efluxní transportéry

1. Pasivní difúze

• Nejčastější mechanismus přestupu léčiv přes membrány • Hnací silou – koncentrační gradient, do ustálení stavu • Podmínky: léčivo lipofilní, neionizované • Řídí se Fickovým zákonem

𝑑𝑚

𝑑𝑡=

𝑃 ∗ 𝐴 ∗ (𝑐1 − 𝑐2)

ℎ

𝑑𝑚

𝑑𝑡= změna koncentrace léčiva v čase – přestup léčiva

P = fyz – chem. vl. léčiva A = velikost plochy h = tloušťka membrány (𝑐1 − 𝑐2) = koncentrační gradient

2. Filtrace, bulk flow

• Filtrace - léčivo proniká přes póry v membráně nebo paracelulárními kanály – Závisí na tlakovém gradientu a Mr ˂ 100 (skoro

žádné léčivo)

• Bulk flow – rychlý průnik látky intracelulárními póry – Glomerulární filtrace – přestup fenestracemi

ledvinného glomerulu

3. Facilitovaná difuze

• Zprostředkovaná přenašečem

• Nezávisí na dodání energie

• Přestup léčiva ve směru koncentračního gradientu

4. Aktivní transport

• Zprostředkován přenašečem

• Dodávka energie – ATP

• Přenos látky proti koncentračnímu gradientu

• Probíhá v jednom směru

• Substráty nejčastěji léčiva podobné endogenním látkám

6. Endocytóza

• Velké molekuly (léčivo na polymeru)

• Vychytávání látek z cirkulace buňkami

• Využití v řízené distribuci makromolekul

– Cytostatikum na makromolekule – nádorová buňka specifický receptor

http://cellspd7spering.wikispaces.com/Endocytosis-Exocytosis

7. Efluxní transportéry

• ABC transportéry

– P-glykoprotein, BCRP

– Efluxní pumpa – vypuzuje lipofilní látky z buňky

– Chemoterapie – rezistence nádorů k léčivům

– Ovlivnění A, D, E

– Tenké střevo, mozek, placenta – ochrana organismu před účinkem xenobiotik

Absorpce

• fáze farmakokinetiky, kdy dochází k přestupu molekul léčiva z místa podání (např. GIT) do krve (do vena portae)

Faktory ovlivňující absorpci

• Formulace léčiva → úprava tablet, injekčních roztoků, prolongované uvolňování, enterosolventní tablety…

• Fyzikálně-chemické vlastnosti léčiva

• Fyziologické/patologické parametry místa podání → velikost a prokrvení absorpční plochy, pH, motolita GITu

• Fyziologické parametry neměnné, mění se při patologickém stavu

Biologická dostupnost

• F → farmakokinetický parametr

• jaké množství léčiva se dostane do systémové cirkulace v chemicky nezměněné formě

• 0 ˂ F ˂ 1

http://health-7.com/Lippincotts%20Illustrated%20Reviews%20Pharmacology/1.%20Pharmacokinetics

Biologická dostupnost

• Bioavailability = 𝐴𝑈𝐶𝑜𝑟𝑎𝑙

𝐴𝑈𝐶𝑖𝑛𝑗𝑒𝑐𝑡𝑒𝑑× 100

• AUC → plocha pod křivkou – area under curve – množství léčiva, které je systémově dostupné pro organismus v celém čase

• F → frakce 0-1 (0-100%)

• F=0 → 𝐴𝑈𝐶𝑜𝑟𝑎𝑙 = 0 → neabsorbuje se → lokální podání

• F=1 → obě plochy pod křivkou se rovnají, všechno podané léčivo se vstřebá

Faktory ovlivňující biologickou dostupnost

• First-pass efekt – efekt prvního průchodu játry → látka je částečně metabolizována v játrech před vstupem do systémové cirkulace

• Rozpustnost léčiva

• Chemická stabilita

http://health-7.com/Lippincotts%20Illustrated%20Reviews%20Pharmacology/1.%20Pharmacokinetics

Pre-systémová eliminace

• Biologická dostupnost po perorálním podání:

• Je snížena - kyselou hydrolýzou v žaludku

• přítomností efluxních transportérů ve střevní sliznici → P-glykoprotein v enterocytech

• metabolismem ve střevní stěně – biotransformační enzymy

• First-pass efektem

Způsoby podání léčiv

• lokální

• perorální (p.o.)

• sublinguální

• bukální

• rektální

• transdermální

• subkutánní (s.c.)

• intramuskulární (i.m.)

• intravenózní (i.v.)

http://health7.com/Lippincotts%20Illustrated%20Reviews%20Pharmacology/1.%20Pharmacokinetics

Způsoby podání léčiv

• Lokální podání – např. na kůži, sliznici dutiny ústní nebo nosní, do oka (masti, emulze, krémy, zásypy atd.)

• Enterální podání – do trávícího traktu

- perorální, bukální, sublinguální, rektální

• Parenterální podání – léčivo podáno jinak než přes trávicí trakt

–transdermální, inhalační, injekční (i.v, i.m, s.c.)

Absorpce po enterálním podání

• Absorpce z dutiny ústní – obchází játra, velmi rychlý nástup účinku

– Bukální podání -do dutiny ústní- látka se velmi

rychle dostává přímo do cévního řečiště

- absorbovaná látka obchází játra

– Sublinguální podání – pod jazyk - látka se velmi

rychle (2 min.) dostává přímo do cévního řečiště

- látka obchází játra, např. nitroglycerin u angíny pectoris pro

rychlou úlevu

Absorpce po perorálním podání

• Perorální – podání ústy – účinek nastupuje do 30

minut

-látka podléhá kyselému prostředí žaludku, kde

může být degradována

- vstřebává se a vena portae se dostává do jater

• Absorpce ze žaludku – kyselé prostředí (pH = 1,4 – 2,0) – Kyselá hydrolýza léčiv – enterosolventní přípravky

– Vychytávání bazických látek z krve (ion trapping)

Absorpce po perorálním podání

• Absorpce z tenkého střeva – velká absorpční plocha (200 m2, velké prokrvení) – nejčastěji difuze

• Absorpce léčiv je snížena: – first-pass efektem – metabolismem ve střevní stěně – přítomností efluxních transportérů

• Absorpce z tlustého střeva – menší absorpční

plocha (pouze absorpce léčiv, která nebyla vstřebána v tenkém střevě)

Absorpce z rekta

• Per rectum-rektální podání do konečníku – např.

čípky

- lokální i systémové účinky

- vyhne se kyselému prostředí žaludku a enzymům

tenkého střeva

-látka částečně obchází játra, vyhýbá se first-pass efektu

Použití: - léčiva dráždící žaludek

- zvracení

- bezvědomí

Faktory ovlivňující absorpci léčiv z trávicího traktu

• Vyprazdňování žaludku

• Intestinální motilita

• Potrava ↓, Ca2+(tvorba komplexů)

• Lékové formulace

• Metabolismus

• Lékové interakce v gastrointestinálním traktu

Parenterální podání péčiv

• Absorpce z plic

• Absorpce přes kůži

• Injekční formy aplikace

– s.c.

– i.m.

– i.v.

http://health-7.com/Lippincotts%20Illustrated%20Reviews%20Pharmacology/1.%20Pharmacokinetics

Absorpce léčiv z plic

• Lokální i systémové podání

• Inhalace ve formě: - plynů – anestetika

- Aerosolů – antiastmatika, částečky 1um až do alveol – část se může vstřebat a vyvolat NÚ na srdce

• Velká absorpční plocha (50 – 100 m2)

• Bohaté prokrvení – plíce jsou extrémně zásobovány krví

Absorpce léčiv z plic

Absorpce většiny léčiv difúzí

Tuhé částice - také endocytóza

Vliv velikosti inhalovaných částic

http://toxlearn.nlm.nih.gov/htmlversion/module1.html

Absorpce přes kůži

• Většinou lokální působení – masti, krémy

• Kožní bariéra – stratum korneum – velmi pomalé vstřebávání i lipofilních látek

• Necílená absorpce (otrava) – organofosfátové insekticidy – vysoce lipofilní látky

• Nikotin, estrogeny

Injekční formy aplikace

• i.m. podání – difúze do všech stran, absorpce rychlejší a kompletnější než s.c. podání (většina v tukové tkáni)

http://publications.nigms.nih.gov/medbydesign/chapter1.html

Injekční formy aplikace

• + Rychlý nástup účinku

• + Obchází first-pass efekt

• - bolestivost, poškození nervů, (mikrobiální kontaminace)

• i.v. podání – hned do krve, nehovoří se o absorpci

• Špatně absorbovatelná léčiva, dráždící GIT, s velkým first-pass efektem, urgentní stavy

Fyzikálně chemické vlastnosti léčiv

• Lipinského pravidlo pěti: pro p.o. podaná léčiva

– Mr ˂ 500

– logP (rozdělovací koeficient oktanol/voda) ˂ 5 • vysoká rozpustnost ve vodě – rychlý nástup účinku, rychlá

eliminace – krátkodobý účinek

• příliš vysoká lipofilita – riziko akumulace v organismu (DDT)

– ne více než 5 donorů vodíkových vazeb

– ne více než 10 akceptorů vodíkových vazeb

• Stupeň ionizace – ionizované látky nemohou procházet membránami

Fyzikálně chemické vlastnosti léčiv

• PSA – polar surface area (↓BAV po p.o.)

• NRB – number of rotable bonds – molekulární flexibilita (↓BAV po p.o.) → důležité faktory pro dobrou biologickou dostupnost

• Injekčně aplikovaná léčiva - ↑ Mr, ↑počet donorů a akceptorů vodíkových vazeb, ↑NRB, ↓ logP

Fyzikálně chemické vlastnosti léčiv

• Lipofilita – souvisí s metabolismem enzymy cytochromu P450

– P450 metabolizují více než 50% léčiv

– P450 mají lipofilní aktivní místa pro molekuly léčiv

– obecně se clearance léčiv zvyšuje s ↑ lipofilitou

Chemická stabilita

• stabilita in vivo a formulace – důležitá pro p.o. podaná léčiva s dobrou BAV

• Ionizovatelná léčiva nebo léčiva obsahující pH-senzitivní funkční skupiny – důležitá pH stabilita – vliv na absorpci (měří se pH-stabilitní profil látky)

• Hlavní chemické reakce vedoucí k degradaci léčiva v GIT → hydrolýza, oxidace, redukce → často katalyzovány: pH, enzymy v tenkém střevu, bakteriální florou v tenkém a tlustém střevu

Chemická stabilita

• Léčiva podléhající hydrolýze → estery, thioly, amidy, sulfonamidy, imidy, laktamy, laktony, halogenované alifatické uhlovodíky

• Další stability – fotostabilita, hygroskopicita, tepelná stabilita → role ve vývoji lékové formy, skladování, balení

Disoluce a solubilita

• Při p.o. podání je schopnost absorpce léčiva závislá na jeho schopnosti rozpustit se v trávicích šťávách během pasáže GITem, kde může být absorbováno

• Pokud je rychlost rozpouštění limitujícím krokem absorpce → jakákoli vlastnost ovlivňující rychlost rozpouštění – zásadní vliv na BAV

Rychlost rozpouštění

• Rychlost disoluce je vyjádřena difuzním modelem, rovnicí dle Noyes a Whitney:

𝑑𝑐

𝑑𝑡 =

𝐷𝐴

ℎ𝑣 (𝐶𝑠-C)

dc/dt = rychlost rozpouštění látky D = disoluční koeficient h = tloušťka difuzní vrstvy A = plocha látky vystavená disolučnímu médiu v = objem disolučního média Cs= saturovaná solubilita látky v disolučním médiu C = koncentrace látky v roztoku v čase t

Rychlost rozpouštění

• ↑ rychlosti rozpouštění a BAV látek s omezenou absorpcí v praxi → ↓ velikost částic léčiva → zvětšení povrchu

– použití nanočástic u léčiv špatně rozpustných ve vodě

– zmenšení velikosti částic – rozpuštění a rychlá precipitace, rozbití velkých částic mletím

• Vehikulum – kosolventy, emulze, cyklodextriny

In vivo solubilizace

• Rozpustnost léčiva může být zvýšena – jídlem, produkcí žlučových kyselin – žlučové soli a lecitin pomáhají ↑ rozpustnost léčiv – lipofilních

• Lipofilní léčiva – zjištění rozpustnosti ve fyziologicky relevantním médiu

Preclinical tools to predict human ADME behaviour of new drug candidates

In silico modeling and simulation In silico prediction of ADME

parameters

Physiochemical models Chemical models

Animal organs/tissues Animal cells Animal subcellular fraction Animal enzymes

Animal PK studies of different design and complexity

Human exposures to parent drug and metabolites in blood and organs

Human tissues Human cells Human subcellular fractions Human enzymes

In Vivo

Ex Vivo and In Vitro

In Vitro Non-species related

In Silico

Human system Animal system

Rozpustnost a permeabilita

High solubility Low solubility

High permeability Class I Class II

Low permeability Class III Class IV

Biopharmaceutics classification system

Pasivní permeabilita

• Rychlost léčiva procházejícího přes biologickou membránu

• Kinetický parametr – lipofilita

• Fyzikálně-chemický profil léčiva (lipinského pravidlo 5)

• Pasivní difúze – fickův zákon

• Paracelulární, transcelulární

Metody pro zjištění pasivní permeability

• In vivo modely – porovnáni AUC po p.o. s AUC látky ze vzorku odebraného z portální žíly

• In situ a Ex vivo modely – perfuze roztoku léčiva přes izolovaný intestinální segment (2 konce se kanylují, vytvoří se uzavřená cirkulace roztoku léčiva, absorpce léčiva je zjištěna měřením úbytku léčiva z cirkulujícího roztoku)

Metody pro zjištění pasivní permeability

• Ussing chamber - přestup látky přes intestinální mukózu – 2 komůrky, mezi nimi intestinální mukóza – fyziologický systém pro studium transportu iontů, nutrientů a léčiv

Sjoberg A et al., Comprehensive study on regional human intestinal permeability and prediction of fraction absorbed of drugs using the Ussing chamber technique. Eur J Pharm Sci, 2013

Burgess BL, A phospholipid-apolipoprotein A-I nanoparticle containing amphotericin B as a drug delivery platform with cell membrane protective properties. Int J Pharm, 2010

Metody pro zjištění pasivní permeability

• Inverted gut sac – vypreparované tenké střevo se obrátí přes skleněnou tyčinku a rozdělí na segmenty, ponoří se do média s léčivem, měří se akumulace ve vnitřním kompartmentu (viabilita 120 min.)

Santos CA, Correlation of two bioadhesion assays: the everted sac technique and the CAHN microbalance. J Control Release, 1999

Metody pro zjištění pasivní permeability

• Buněčné modely – hlavní metody pro testování pasivní permeabilty

• Různé buněčné linie – CaCo-2, MDCK, LLVK-1

• Imortalizované buněčné linie, na semipermeabilní membráně

• Adherentní buňky, cell monolayer (tight jinctions)

Buněčné kultury

http://www.iclc.it/listanuova.html

http://www.itqb.unl.pt/labs/pharmacokinetics-and-biopharmaceutical-analysis/activities/in-vitro-models-for-prediction-of-drug-absorption-and-metabolism

http://www.xenoblis.com/services/absorption/caco-2-permeability/

Nebuněčné systémy

• PAMPA – artificiální membrána, koreluje s permeabilitou v lidském tenkém střevu

http://www.cyprotex.com/home/

Děkuji za pozornost