Průtoková cytometrie a její využití v rostlinné biosystematice, populační biologii

Průtoková cytometrie a její využití v rostlinné biosystematice,

populační biologii a fyziologii rostlin

J. Suda1,2, P. Trávníček2,1

1 Department of Botany, Faculty of Science, Charles University in Prague &2 Institute of Botany, Academy of Sciences, Průhonice, Czech Republic

0

100

200

300

400

500

0 250 500 750 1000

Num

ber

of n

ucle

i

R e la tiv e f lu o re sc e n c e

2 x3 x 4 x

0

160

320

480

640

800

0 250 500 750 1000


Num

ber

of n

ucle

i

3 x6 x ( s ta n d a rd )

www.ibot.cas.cz/fcmwww.ibot.cas.cz/fcm2 z 26

Principy FCM

Průtoková komůrka

Optická částZákladní předpoklady:

• Zdroj nejlépe monochromatického světla (laser, HBO lampa)

• Fluorescenčně značené partikule či chemické látky

• Znalost použitého fluorescenčního barviva (excitační a emisní maximum)

• Hardware a software schopný zpracovat výstupní signály


Principy FCM - třídění

Zjištění parametrů konkrétní částice

Vytvoření mikrokapiček pomocí piezoelektrického krystalu

Nabití mikrokapiček nábojem dle vlastností obsažené partikule

Vlastní třídění částic dle náboje


FCM v rostlinné biosystematice

Základní východiska:

• nejčastěji analyzován celkový obsah DNA (ploidní úroveň, velikost genomu)

• využití fluorescenčních barviv s vazbou na DNA (DAPI – A-T specifická vazba, PI – interkalace)

• většinou jednoparametrická analýza (počet částic s určitou intenzitou fluorescence)

velmi jednoduché cytometry a levné provozní náklady

0

30

60

90

120

150

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

iG 2

a rv a ls


Aplikace – taxonomie na základě ploidie

Anthoxanthum2x - A. alpinum4x - A. odoratum

Empetrum2x - E. nigrum4x - E. hermaphroditum

Oxycoccus2x - O. microcarpus4x-6x - O. palustris

0

160

320

480

640

800

0 250 500 750 1000

2x 4x

Relative fluorescence

Num

ber

of n

ucle

i

0

80

160

240

320

400

0 250 500 750 1000

4 x2 x

Relative fluorescence

Num

ber

of n

ucle

i

0

70

140

210

280

350

0 250 500 750 1000


Num

ber

of n

ucle

i

2 x 4 x 6 x5 x


0

100

200

300

400

500

0 250 500 750 1000


Num

ber

of n

ucle

i

2 x3 x

0

80

160

240

320

400

0 250 500 750 1000

Num

b er

o f n

ucl e

i

R e la t iv e f lu o re sc e n c e

2 x 8 x

Aplikace – vzácné cytotypy

Vaccinium - 3x Lythrum - 3x, 6x

Campanula patula - 8x

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

Num

be

r of n

ucle

i

Re la tive fluo re sc e nc e

2x

3x

4x

6x


0

80

160

240

320

400

0 250 500 750 1000

2 x 3 x 4 x


Num

ber

o f n

u cle

i

0

60

120

180

240

300

0 250 500 750 1000

2 x5 x 6 x


Num

ber

of n

ucle

i

Aplikace – heteroploidní křížení

0

100

200

300

400

500

0 250 500 750 1000

Num

ber

of n

ucle

i


2 x3 x 4 x

Empetrum - 3x Oxycoccus - 5xGaleobdolon - 3x


0

60

120

180

240

300

0 250 500 750 1000


Num

ber o

f nuc

lei

R. s

a ch a

l ines

is, 2

n =88

R. j

apon

ica,

2n=

88

0

240

480

720

960

1200

0 250 500 750 1000


Num

ber o

f nuc

lei

H. s

c hul

tesi

i2C

=7.

21 p

g

G2

H. a

ura n

tia c

um

2C=

7.80

pg

Aplikace – taxonomie homoploidů

Reynoutria Hieracium subg. Pilosella

Determinace fragmentů rostlin, kořenů, …


Aplikace – homoploidní křížení

0

160

320

480

640

800

0 250 500 750 1000


Num

ber

of n

ucle

i

R H I

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

DDDDDDDCH


Num

ber

of n

ucle

i

Elytrigia repens x E. intermedia

2n = 42

Dryopteris carthusiana x D. dilatata

2n = 164


Aplikace – vnitrodruhová variabilita

0

60

120

180

240

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

137-

611

5-19

117-

6

1 37-6 191 .03 1 .4611 5-19 206 .57 1 .4311 7-6 223 .80 1 .53

R a tios: 11 5-19 / 137-6 1 .081 11 7-6 / 11 5-19 1 .083 11 7-6 / 137-6 1 .172

P e ak C ha n n el C V

Taraxacum stenocephalum (2n = 32)


Aplikace – dedukování příbuznosti

2.052.05 1.98

2.05

1.97

1.88

1.731.811.95

1.882.02

2.03

2.14

Cx-values for 4x cytotypes

Hieracium subg. Pilosella

„základní druhy“

„vedlejší druhy“


Aplikace – distribuce cytotypů

2x

4x3x

EmpetrumVaccinium uliginosum


4x

2x

3x

Aplikace – distribuce cytotypů

KrkonošeEmpetrum

*

*

*

**

**

A

B

2x 2x + 3x 3x 4x*

100 m

Mumlavská hora

Jeřábí louka


Aplikace – sympatrický výskyt

Oxycoccus2x + 4x + 5x + 6x

Campanula patula2x + 4x

Pimpinella saxifraga2x + 4x

Galeobdolon2x + 3x + 4x

dynamika populací a demografické parametry

mechanismy reprodukční izolace

mezi a vnitro cytotypové interakce

ekologické a funkční aspekty polyploidie

Gymnadenia4x + 6x + 8x + 10x +12x

Hieracium echioides2x + 3x + 4x + 5x

Vicia cracca2x + 4x


Aplikace – rostlinné invaze

Lythrum salicaria

0

20

40

60

80

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

2 x

6 x4 x

3 x

Vaccinium - 3x

2x3x4x6x

0

80

160

240

320

400

0 250 500 750 1000

2 x 3 x 4 x

G 2G 2

G 2


Num

ber

of n

ucle

i

Reynoutria


Aplikace – ochrana rostlin

Gymnadenia conopsea

diverzita cytotypů

0

30

60

90

120

150

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

S 1

S 2

S 3

S 4P 2

P 1

0

30

60

90

120

150

0 200 400 600 800 1000

R e la tiv e f lu o re sc e n c eN

umbe

r of

nuc

lei

G 2

a rv a ls

Cerastium alsinifolium

detekce míry introgrese

4x 8x

6x, 10x, 12x


Aplikace – návaznost na jiné obory

Juncus biglumis

- fylogeneze

0

30

60

90

120

0 200 400 600 800 1000

R e la tiv e f lu o re sc e n c eN

um

ber

of

nu

clei

2C = 1.48 pg

2C = 1.39 pg


Determinace pohlaví

Arecaceae

Cannabaceae

Caryophyllaceae

Cucurbitaceae

Loranthaceae

Polygonaceae

Silene latifolia 2n = 24

F – XX, M – XY


Analýza buněčného cyklu

a) KinetikaBrdU – bromodeoxyuridine

b) Synchronizace

Zastavení buněčného cyklu v konkrétní fázi působením rozličných chemických látek

Např. akumulace metafazických buněk pro třídění chromozómů

Kořenový meristém Vicia faba


0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

Num

be

r of n

ucle

i


2C

4C 8C

16C

0

50

100

150

200

250

0 200 400 600 800 1000

Num

be

r of n

ucle

i


2C

4C

8C

0

70

140

210

280

350

0 200 400 600 800 1000

Num

be

r of n

ucle

i


2C

4C

Brassica oleracea – různé stupně endopolyploidizace pletiv

Endopolyploidie


Endopolyploidie u orchidejí

0

20

40

60

80

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

2C

Pis

um

~ 4C

~ 8C

~ 16C

0

50

100

150

200

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i2C

Pis

um

~ 4C

~ 8C

~ 16C

0

40

80

120

160

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

2C

Pis

um

~ 4C

~ 8C

Gymnadenia densiflora G. conopsea (2n = 40) G. conopsea (2n = 80)

Taxon 2C – ~4C ~4C – ~8C

Gymnadenia densiflora

1.794 1.864

G. conopsea (2n = 40) 1.565 1.730

G. conopsea (2n = 80) 1.610 1.765


Reprodukční způsoby


0

600

1200

1800

2400

3000

0 250 500 750 1000

2 x

3 x


Num

ber

of n

ucle

i

sexuální

0

200

400

600

800

1000

0 250 500 750 1000

Num

ber o

f nuc

lei


3 x

6 x

apomiktické


Taraxacum

0

320

640

960

1280

1600

0 250 500 750 1000

Num

ber

of n

ucle

i


4 x

5 x

6 x8 x

1 0 x 1 2 x

velká variabilitaHypericum



0

40

80

120

160

200

0 250 500 750 1000


Num

ber

of n

ucle

i

3 x

5 x

6 x

8 x

6 x d o u b le t s

0

3 0

6 0

9 0

1 2 0

1 5 0

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0

3 x3 x

5 x

6 x

7 x

8 x


Num

ber

of n

ucle

i

Ploidie potomstva:

6x (apomixie)

3x (haploidní partenogeneze)

5x (redukovaná gameta)

7x (redukovaná + nered. gameta)

8x (neredukovaná + red. gameta)

semenáčky semena

Experimentální hybridizace:

6x fakultativní apomikt (♀) x 4x obligátní apomikt (♂)


0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0R e la t iv e f lu o re sc e n c e

Num

ber

of n

ucle

i 2 x4 x

5 x

6 x

Po 1. roce

0

6 0

1 2 0

1 8 0

2 4 0

3 0 0

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0R e la tiv e f lu o re sc e n c e

Num

ber

of n

ucle

i

4 x

Po 1. roce

0

6 0

1 2 0

1 8 0

2 4 0

3 0 0


Num

ber

of n

ucle

i

4 x

Po 2 letech

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0


Num

ber

of n

ucle

i 2 x

4 x

5 x 6 x

čerstvý materiál

Metodika – herbářový materiál

Oxycoccus


0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

0

40

80

120

160

200

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

0

40

80

120

160

200

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

36 měsíců – pokojová teplota

36 měsíců – -80°C (deep freezer)

0

60

120

180

240

300

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

0

60

120

180

240

300

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

0

40

80

120

160

200

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

0

30

60

90

120

150

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

2x 6x5x4x

2x 6x5x4x




Num

ber

of n

ucle

i

4 xL

čerstvý materiál

0

40

80

120

160

200

0 200 400 600 800 1000


Num

ber

of n

ucle

i

4 xL

36-měsíců starý, DF

Závěry:Závěry:

rychlé sušení

uchování v – 80°C (deep freezer)


Děkuji za Děkuji za pozornostpozornost

www.ibot.cas.cz/www.ibot.cas.cz/fcmfcm

Date post:	11-Jan-2016
Category:	Documents
Upload:	heath
View:	56 times
Download:	1 times

Průtoková cytometrie a její využití v rostlinné biosystematice, populační biologii

Documents