Proč isolovat enzymy?

• Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu

• Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou

• Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory snížení aktivity cílových enzymů)

• V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina urokinasa, streptokinasa ...)

Zdroje enzymů

• Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny

• Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu ...)

Selekce bakteriálních producentů amylas

Mikroorganismy

Bakterie, kvasinky, plísně, řasy

Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...)

- selekce mutantů o požadovaných vlastnostech

- genetické inženýrství - termofilní organismy (produkce enzymů

s vyšší teplotní stabilitou)

Živočišné zdroje

• Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci

• Jateční zvířata – orgány, krev

• Člověk – tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin ...; moč urokinasa ...)

• Bezobratlí (hmyz, plži, mlži málo se využívají)

Rostlinné tkáně

Špenát, řepa, hrách

Nevýhoda – problematický růst za

definovaných podmínek

Problémy se vzorkem

• Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek)

• Malá množství cílového enzymu

• Labilita enzymu

Zásady pro práci s biologickým materiálem

1. Pokud možno zpracovat co nejdříve2. V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 oC)3. Rozmrazování – co nejrychleji4. Nízká teplota při isolaci5. Vhodné pH + iontová síla6. Vhodná koncentrace bílkoviny7. Zabránění pěnění8. Omezení nežádoucí proteolytické aktivity9. Přídavek specifických látek (např.

merkaptoethanol, EDTA ...)

Cíl izolace

• Získání homogenní bílkoviny

• Zachování biologické aktivity

Závěr : získat vzorek o patřičné

čistotě s vynaložením

patřičného (optimálního) úsilí

Distribuce enzymů

• Intracelulární

• V periplasmatickém prostoru

• Extracelulární

cytoplasma

periplasma

Membránově vázané bílkoviny

e lek tros ta ticky h yd ro fob n ě

in te rag u jíc í

zan ořen é tran sm em b rá n ové

in teg rá ln í

M em b rá n ové b ílkovin y

Úprava biologického materiálu

• Mletí (kulový mlýnek, masový strojek)

• Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru)

- Elvehjem-Potterův homogenizátor

- třecí miska s pískem - výkonný mixer

Dezintegrace mikrobiálních buněk

• Narušení buněčné stěny

• Způsoby – fyzikální

- chemické

- enzymové

Fyzikální způsoby dezintegrace

• Třecí miska + balotina, písek ...• Střídavé zmražování a

roztávání• French press (protlačování

tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)

• X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem)

• Ultrazvuk• Mlýnek se skleněnými

balotinamiX-press

Chemické způsoby dezintegrace

• Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu)

• Osmotická lyse erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí)

• Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány)

• Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)

Enzymové způsoby dezintegrace

• Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem) rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G+), následné zředění destilovanou vodou

Metody isolace enzymů

• Srážení (precipitace)

• Membránové separační procesy

• Chromatografie

• Elektroforéza

Srážení

• Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu

• První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4

• Filtrace nahrazena centrifugací

Vysolování

I

rozp

ustn

ost

vsolování vysolování

(NH4)2SO4

• Rozpustnost se málo mění s teplotou

• Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3)

• Levný

• Stabilizuje bílkoviny

• Relativně čistý

Srážení - dvojstupňově

0

20

40

60

80

100

% saturace

%

BílkovinaAktivita

Provedení

El. míchačka

ChlazeníMíchání 10-30’Centrifugace

pevný (NH4)2SO4

nebosaturovaný roztok

(NH4)2SO4

úprava pHNH4OH

Srážení organickými rozpouštědly

• Kompletně mísitelné s vodou• Nereagují s bílkovinou• Musí mít dobrý precipitační efekt • Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!! • Možné dvoustupňové srážení

EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

Srážení organickými polymery a sloučeninami

Princip identický jako srážení s rozpouštědly

• DEAE dextran• PEG • Polyakrylová kyselina• Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát)• Kaprylová kyselina

Srážení selektivní denaturací

• Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu.

• Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla

• Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat

Tepelná denaturace

• Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin

• pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno

• Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

0102030405060708090

100

teplota

%

Bílkovina 1Bílkovina 2

Membránové separační metody

• Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul

• Membránová filrace (ultrafiltrace) rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku

• Dialýza difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

Ultrafiltrace

Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

Odstranění nízkomolekulárních složekDialýza

Chromatografické metody – základní rozdělení

• Distribuce složek mezi dvěma fázemi mobilní a stacionární fáze

• Mobilní fáze kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie)

• Stacionární fáze částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry

• Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní

• Nejčastěji sloupcová chromatografie• Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC)

chromatografie

Instrumentace pro LPC

• Pumpa – peristaltická nebo gravitace

• Gradient – mísič gradientu

• Dávkování – přímo pumpou na kolonu

• Kolony – skleněné

• Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm

• Vyhodnocování – zapisovač

• Sběrač frakcí – programovatelný

Částice sorbentu

Chromatografické metody pro separaci proteinů

• Gelová chromatografie

• Ionexová chromatografie

• Chromatografie s hydrofóbní interakcí

• Afinitní chromatografie

Gelová chromatografie

• Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru

• Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina

• Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu nemísitelnost s mobilní fází

• Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později

• Isokratická eluce • Objem vzorku < 2 % objemu kolony• Chromatografické materiály zesítěný dextran

(Sephadex), agarosa, polyakrylamid• Možnost stanovení molekulových hmotností• Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

Gelová permeační chromatografie

Gelová permeační chromatografie

Pořadí eluce :

největší>střední>nejmenší

molekula

Ionexová chromatografie

• Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj

• Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje

• V případě proteinů hraje zásadní roli pH !

• Celulosové a dextranové ionexy

Ionexy

• Katexy – záporný náboj vazba kationtů

silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3-

slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO-

• Anexy – kladný náboj vazba aniontůslabé – diethylaminoethyl (DEAE)silné – triethylaminoethyl (TEAE)

Ionexová chromatografie proteinů

• Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny

• pH < pI bílkovina nese kladný náboj separace na katexu

• pH > pI bílkovina nese záporný náboj separace na anexu

• pH = pI celkový náboj bílkoviny je nulový nelze provést ionexovou chromatografii

Ionexová chromatografie

• Nanášení vzorku – nízká iontová síla

• Eluce – gradientová• Zvyšováním iontové síly • Změnou pH

Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

Typická ionexová chromatografie

Loading starts

Loading ends,Low salt wash begins

Protein absorbance

Peak of unbound protein

Salt gradient

0

1M

Salt gradient begins

Salt gradient ends

Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II)

and tightly bound (III) proteins

IIIII

I

Chromatografie s hydrofobní interakcí

• Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl)

• Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby)

• Interakci podporuje vysoká iontová síla

Hydrofobní chromatografie

• Stacionární fáze – - C8, -fenyl

• Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH4)2SO4)

• Eluce – snižováním iontové síly

Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

Afinitní chromatografie - princip

• Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické)

• Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce

• Látka navázaná na nosič afinitní ligand

• Vazba ligandu přes raménko (spacer)

Předpoklady pro vznik komplexu

• Sterické – použití raménka (spacer)

• Optimální pH, iontová síla

Předpoklady pro vznik komplexu

• Vazebné

• Konformační

Afinitní páry

Interakce mezi DNA a endonukleasou

Afinitní chromatografie

Nosič Raménko

Afinitní ligand

+

Enzym vázaný v aktivním místě

1. Analog substrátu

Nosič Raménko

Protilátka

+

Enzym vázaný na protilátku

2. Imunoafinitní chromatografie

Proteinový epitop

Enzym

Provedení

• Nanesení vzorku – nízká iontová síla

• Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové

síly, polarity

Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)

Chromatografie na imobilizovaných barvivech

• Dye-binding chromatografie

• Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích

• Barviva částěčně podobná některým kofaktorům

• Isolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin)

Metal chelate chromatografie

• Chelatující skupiny navázané na chromatografické nosiče vazba iontů těžkých kovů (např. Ni2+)

• Interakce kovových iontů s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu

• Isolace rekombinantních proteinů s His6 částí

Chromatofokusace

• Použití ionexových chromatografických materiálů pro separaci podle isoelektrických bodů

• Kolona s vhodným ionexem je ekvilibrována v pufru o vysokém pH (vyšší než IEB cílové bílkoviny), vzorek je nanesen v témže pufru, poté je kolona promývána pufrem o nízkém pH obsahujícím amfolyty. Při průchodu pufru s amfolyty kolonou se vytváří pohybující se gradient pH. Proteiny se v koloně rozdělují podle hodnot isoelektrického bodu.

Magnetické separační techniky

• Imobilizace afinitních ligandů nebo iontově výměnných skupin na magnetické nosiče

• Magnetické sorbenty připravené z biopolymerů vykazujících specifitu k cílovému proteinu

• Vsádková separace cílových proteinů• Výhoda – možnost práce v obtížně manipulovatelných

systémech (např. suspenze kultivační média, homogenáty buněk ...)

• Možnost isolace cenných biologicky aktivních látek ze sekundárních surovin (odpadů)

BioMagn. Res. Technol. 2 (2004) 7 http://www.biomagres.com/content/pdf/1477-044X-2-7.pdf

Základní zásady

• Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením velké množství levného vstupního materiálu

• Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná

ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší

• Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace možné snížení výtěžku)

• Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat• Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu

Základní zásady (typické příklady)

• Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí

• Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí

• Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)

Nevhodné kombinace

• Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace)

Sledování průběhu separace

Metoda Celková bílkovina

Celková aktivita

Specifická aktivita

Přečištění Výtěžek

extrakt 100 100 1 - 100 %

HIC 50 99 1.99 1.99 99 %

IEX 25 75 3 3.0 75 %

Elektroforesa

• Proteiny se pohybují v nosiči (obvykle polyakrylamidový gel) vlivem elektrického pole

• Pohyb proteinu závisí na – Náboji proteinu a jeho molekulové hmotnosti– Intenzitě elektrického pole– Typu a porozitě gelu

• Různé typy (PAGE, SDS-PAGE)• Význam: kontrola čistoty separovaného proteinu

PAGE elektroforesa

• Polyakrylamid o různé velikosti pórů použit jako nosič

• Proteiny jsou rozpuštěny v zásaditém pufru

• V elektrickém poli se proteiny pohybují směrem k anodě

SDS elektroforesa

• SDS denaturuje všechny typy proteinů

• Váže se na proteiny v konstantním poměru (1 molekula SDS na 2 aminokyselinové zbytky) všechny proteiny získají vysoký záporný náboj separace probíhá pouze podle velikosti molekulové hmotnosti

Sledování čistoty proteinů

• Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu

• Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou hmotnost isolovaného proteinu (SDS elektroforesou)

Sta

ndar

dy

Pův

odní

vzo

rek

Nen

aváz

ané

prot

einy

Elu

ovan

é pr

otei

ny