Použití rozpustných enzymů

Nevýhody • Jednorázová aplikace• Nízká stabilita rozpustného enzymu • Značně drahé

Možné řešení• Imobilizace enzymu

Imobilizace enzymů

• Definice: enzymy, které jsou fyzikálně uzavřeny v omezené oblasti za zachování jejich enzymové aktivity, a které mohou být použity opakovaně a kontinuálně

Imobilizace enzymů• Imobilizace je proces, který převádí rozpustný

biopolymer (enzym) na formu nerozpustnou nebo oddělenou většinou tvorba heterogenního biokatalyzátoru

• Vazba na pevný nosič, zabudování do (bio)polymeru, vazba na membrány, zesítění...

• Zvýšení stability imobilizovaného enzymu• Odpadá náročná izolace produktu (z heterogenní směsi

je možno získat produkt po filtraci, centrifugaci ....)• Imobilizovaný enzym je možno použít opakovaně • Enzymové procesy mohou být prováděny kontinuálně• Imobilizace může pozitivně ovlivnit stabilitu enzymu

Imobilizace enzymů

• Podmínka úspěšného použití imobilizovaných enzymů dostatečný kontakt reaktantů s katalyzátorem

• Nejčastější uspořádání reaktant (a následný produkt) je ve vodné fázi, která prochází přes pevnou fázi obsahující katalyzátor

• Existují případy, kdy je reaktant ve fázi plynné nebo v kapalné fázi, která je nemísitelná s vodou

Metody imobilizace

Vazba na pevné nosiče – požadavky• Velký povrch• Hydrofilní charakter• Nerozpustnost • Chemická, mechanická a teplotní stabilita• Vhodný tvar a velikost částic • Odolnost proti mikrobiálnímu působení• Možnost opakovaného použití

Vazba na pevné nosiče

• Fyzikální adsorpce – nejstarší metoda imobilizace (1916 – invertasa na alumině) často dochází k uvolňování enzymů

• Vazba na ionexy (nutná volba optimálního pH pro navázání)

• Kovalentní imobilizace na nosiče nesoucí vhodné funkční skupiny

Příklad kovalentní imobilizace

• Nosič nesoucí aminoskupiny, aktivace glutaraldehydem, vazba enzymu přes aminoskupinu

Si CH2 CH2 CH2 NH2 H C

O

CH2 CH2 CH2 C

O

H+

Si CH2 CH2 CH2 N CH CH2 CH2 CH2 C

O

H

CH CH2 CH2 CH2 C

O

HSi CH2 CH2 CH2 N + H2N Protein

N ProteinSi CH2 CH2 CH2 N CH CH2 CH2 CH2 CH

Skupiny v molekulách proteinů využitelné pro kovalentní imobilizaci

• -NH2 (N-koncová, ε-NH2 lysinového zbytku)

• -COOH (C-koncový, β-, γ- COOH asparagové a glutamové kys.)

• -SH cysteinu• -OH serinu a tyrosinu• cyklický systém tyrosinu a histidinu

Oxidace polysacharidů

• Polysacharidová matrice oxidovaná jodistanem

• Reakce s aminoskupinou proteinu

Epoxidová metoda

• Reakce polysacharidové matrice (celulosa, agarosa, dextran) s epichlorhydrinem tvorba glycidového derivátu (obsahuje oxiranový kruh)

• Reakce s NH2, SH skupinou enzymu

Orientovaná a náhodná imobilizace

Zesítění

• Reakce molekul enzymů s bifunkčním činidlem (např. glutaraldehyd)

• Navázání aminoskupin patřících k různým molekulám enzymu zesítění tvorba nerozpustného produktu

Zabudování enzymů

• Zabudování enzymů do struktury (bio)polymerního gelu

• Zabudování enzymů do polopropustné membrány

Zabudování enzymů do geluPoužívané gely

• Polyakrylamid• Alginát (Na+ forma je rozpustná převod do

nerozpustné Ca2+ formy)• Karrageenan (jednomocné ionty (např. K+)

způsobí převod do nerozpustné formy) • Agarosa (tekutá při 45 – 50 °C), převod do

nerozpustné formy ochlazením• Želatina (převod do nerozpustné formy

zesítěním glutaraldehydem)

Zabudování enzymů do membrán

• Umístění enzymu do fyzikálně odděleného prostředí mezi semipermeabilní membrány

• Výhoda použití enzymů v nativním stavu

• Dutá semipermeabilní vlákna, ultrafiltrační membrány

Imobilizace na magnetické nosiče

• Magnetické nosiče polymerní částice obsahující magnetické oxidy železa, silanizovaný magnetovec

• Příprava podobná jako v případě nemagnetických nosičů

• Výhoda možnost práce v suspenzních systémech, po skončení enzymové reakce je možné odstranění imobilizovaného enzymu pomocí magnetického separátoru (všechny ostatní složky jsou diamagnetické)

Zesítěné enzymové krystaly a agregáty

• Příprava krystalů enzymů, následné zesítění glutaraldehydem

• Precipitace proteinů (enzymů) vhodným činidlem tvorba proteinových agregátů následné zesítění glutaraldehydem

Stabilizace enzymů

• Enzym zůstává v rozpustné formě, váží se různé vysokomolekulární sloučeniny

• Vazba polysacharidů (např. dextranu) na molekuly enzymů tvorba umělých glykoproteinů (glykoproteiny jsou obvykle stabilnější než neglykosylované proteiny)

• Přídavek nízko- nebo vysokomolekulárních látek do prostředí (anorganické ionty, polyethylenglykol, polyoly ...)

Aplikace imobilizovaných enzymů

• Použití imobilizovaných enzymů pro provedení specifických reakcí ve vhodných reaktorech

míchané reaktory plněné kolony fluidní lože ultrafiltrační membránové systémy Použití při přípravě antibiotik, steroidních

látek, specifických aminokyselin

J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11242−3

Imobilizace a nanotechnologie• Zabudování

enzymů do nanopórů vhodných nosičů

• Stabilizace pomocí iontových interakcí

• Takto zabudované enzymy jsou velmi stabilní po dlouhou dobu