Jak využít elektrochemii

ke studiu struktury a interakcí

nukleových kyselin a proteinů.

doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.

Olomouc, 23. června 2010

Nobelova cena za polarografii

(Jaroslav Heyrovský)

Elektrochemická aktivita DNA

(Emil Paleček)

Elektrochemické metody … polarografie

-I

-E

Xm-nXmn e-

identifikace elektrochemicky aktivní látky

(co to je)

kvantifikace

(jaká je koncentrace)

kapající rtuťová elektroda

Elektrochemické metody …

-I

-E

Xm Xm-n

n e-

•visicí rtuťová

kapková elektroda

•pevné elektrody

Xm Xm-n

n e-

Elektrochemické metody … voltametrie

elektrochemie proteinů

Elektrochemie proteinů

od dvacátých let XX. století (J. Heyrovský,

R. Brdička)

+1 -1 -2

E/V

-I

WY

elektrochemická oxidace

tryptofanu a tyrozinu

signály peptidů

a proteinů

obsahujících

cystein (cystin)

UHLÍKOVÉ ELEKTRODY RTUŤOVÉ ELEKTRODY

redukce vazby S-Hg

redukce vazby

S-S (cystin)

Brdičkova reakce

(v přítomnosti Co)

katalytické

vylučování vodíku

prenatriová vlna

pík H

Katalytické vylučování vodíku

(CHE)

V této oblasti potenciálu

je elektrochemicky

generována katalyticky

aktivní částice (R)

Brdičkova reakce

Brdička, 1933: polarografické vlny v přítomnosti sérových proteinů a solí

kobaltu

Brdičkova reakce a diagnostika rakoviny

-kdysi poměrně

rozšířený diagnostický

test

-dnes renesance tohoto

přístupu

-R. Kizek a spol

(MENDELU)

-rakovina a

metalothioneiny

pík H: (pořád ještě) nový nástroj

studia proteinů

Tomschik et al., 1998

• katalytický proces na rtuťové elektrodě, ne

zcela objasněný mechanismus (dusíkaté

skupiny; cystein není nezbytně nutný, ale výrazně

přispívá)

• vysoká citlivost detekce peptidů a bílkovin

• citlivost k

agregaci bílkovin

denaturaci bílkovin

změnám redox stavu peptidů a bílkovin

(-SH vs. –S-S-)

agregace a-synucleinu

a-synuclein: hlavní součást tzv. Lewyho tělísek

spojených s Parkinsonovou chorobou

podléhá agregaci vedoucí k tvorbě fibrilárních struktur

pochopení mechanismu agregace a nalezení možností jejího

ovlivnění je důležité pro vývoj léčebných postupů

zdá se, že hlavní toxický efekt mají nízkomolekulární agregáty

v počáteční fázi agregace

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200 250

Norm

ali

zed

flu

ore

scen

ce

Time (h)

-30

-20

-10

0

10

20

195 215 235 255

0 h3 weeks

Wavelength (nm)

Pea

k h

eig

ht

Potential (V)

-50

450

950

1450

1950

-1.76 -1.74 -1.72 -1.7 -1.68

0 h 24 h

48 h 72 h

A

pík H: unikátní citlivost k počátečním změnám vedoucím k agregaci

(Masařík a kol., 2004)

pík H

CD

AFM

Co „vidí“ různé metody:

pík HDLS

Elektorchemie DNA

Struktura DNA…

1953: James Watson, Francis Crick,

Rosalind Franklin, Maurice Wilkins:

dvoušroubovice DNA

1962: Nobelova cena (JW, FC, MW)

vysvětlení základních principů uchování,

předávání a exprese dědičné informace

N

NH2

O

R

NNH

N

O

O

R

CH3

N

N

N

NH2

R

N

N

N

N

O

R

NH

NH2

purinové báze

thymin (T)

pyrimidinové báze

cytosin (C) adenin (A) guanin (G)

dvoušroubovice

O

O

P-OO

O

baseCH2

2-deoxyribóza

fosfát

nu

kle

oti

d

párování bazí v

řetězcích DNA

1958 – 1960 Emil Paleček: polarografie DNA

potential/V vs. SCE-2.0 -1.0 +1.0

-

+

curr

ent

GGox Aox

CA

redukce cytosinu + adeninu

oxidace

oxidace

guaninu a adeninu

rtuťové nebo amalgamové elektrody (převážně) uhlíkové elektrody

tvorba

7,8 –dihydroguaninu

N

NH2

O

R

N

N

N

N

NH2

R

N

N

N

N

O

R

NH

NH2

N

N

N

O

R

NH

NH2

N

N

N

NH2

R

N

tensametrické signály DNA na rtuti

-1.5 -1.0 -0.5E/V

p.z.c.

double-

stranded

ds,

distorted

single-

stranded

12

3

vysoká citlivost ke struktuře DNA

Detekce poškození DNA

jednořetězcový zlom dvouřetězcový zlom

přerušení cukrfosfátové páteře DNA

„abazická“ místa

přerušení

N-glykosidické

vazby

kyslíkové radikály

činnost nukleáz

důsledek poškození bazí

spontánní hydrolýza

(depurinace)

důsledek poškození bazí

Nejčastější „produkty“ poškození DNA

N

N

NH

N

O

NH2

R

NH

N

R

O

O

CH3N

R

NH2

O

N

N

N

NH

N

O

NH

R

OH

OH

OH

N

N

NH

N

O

NH2

R

Pt

N

N

NH

N

O

NH2

R

NH3H

3N

NH

N

R

O

O

NH

N

R

O

O

NH

N

R

O

O

CH3CH

3

guanin

N

N

N

N

NH2

R

N

N

NH

N

O

NH2

R

CH3

N+

N

NH

N

O

NH2

R

CH3

N

N

N

N+

NH2

RCH3

adenin

NH

N

R

O

O

OH

OH

CH3

N

N

NH

N

O

NH2

O

R

N

NN

N

R

N

cytosinthymin

Nejčastější „produkty“ poškození DNA

poškození bazí:chemické modifikace

alkylace bazí

oxidativní poškození

deaminace bazí

poškození UV zářením

(sluneční světlo)

reakce s metabolicky

aktivovanými karcinogeny

reakce s protinádorovými

léky

• v podstatě jakékoli poškození DNA lze v

principu detekovat elektrochemicky

DNA s konci a bez koncůnadšroubovicová otevřená kružnicová lineární

zlomy = poškození DNA – tedy možnost „měřit“ poškození DNA

Rtuťová elektroda modifikovaná kovalentně uzavřenou kružnicovou

(nadšroubovicovou, sc) DNA: senzor pro látky indukující zlomy v DNA

scDNA·OH ocDNA

ACV

E/V -0.8-1.6

1

E/V -0.8-1.6

3 1

ACV

similar responses to DNA damage like with the HMDE can be

obtained

• with mercury film electrodes (Kubičárová 2000)

• with amalgam electrodes (Cahová-Kuchaříková, Fadrná, Yosypchuk, Novotný

2004)

AC voltammograms of sc,

linear ds and denatured DNA

at m-AgSAE

changes in the peak 3 height (at m-

AgSAE) due to scDNA exposure to a

chemical nuclease Cu(phen)2

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

Cu(phen)2

nebojte se rtuti!

nekouše!

hybridizační sonda

sekvence sondy je navržena

(syntetizována) vzhledem k sekvenci

DNA, která nás zajímá

cílová DNA

je pomocí sondy detekována

GCTTATGCTGGAAT

CGAATACGACCTTA

CGAATACGACCTTA

GCTTATGCTGGAAT

Hybridizace DNA (RNA) je založena na principu tvorby

dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců

DNA „čipy“ („arrays“):

•aplikace mnoha sond současně

•aplikace různých (různě“barevných“) fluorescenčních značek

Elektrochemický senzor pro hybridizaci DNA:

elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu

•hybridizace s cílovou DNA se provede stejně

jako v případě optických senzorů

•odezvou na hybridizační událost je

elektrochemický (proudový) signál

I

E

samotná sonda

hybrid

Dvoupovrchová strategie:

povrch H

detekční elektroda

•hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento

účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody

•účinné zachycení a separace cílové DNA

•poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna

a elektrochemicky stanovena

detekční elektroda

Dvoupovrchová strategie:

•hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento

účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody

•účinné zachycení a separace cílové DNA

•poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna

a elektrochemicky stanovena

Magnetické částice („kuličky“) nesoucí různé „biorekogniční

elementy“: všestranné využití v biopreparacích a bioanalýze

oligo(dT)n

streptavidin

protilátky

protein G

protein A

chelát kobaltu

biotinyl.

ss ODN

biotinylovaný

ds ODN

DNA-vazebný

protein

CoN

N

NN

protein

s „His-tagem“

specifická

protilátka

antigen

(protein)

specifická

protilátkabuňky

komplementární

NA řetězec

NA řetězec s

úsekem (A)n

smíchání

inkubace

(vazba)

magnetická separace

promývání

magnetické

částice

odstranění

nespecifických

složek vzorku

další složka

molekulárního

„sendviče“

vstup

(původní vzorek+ matrice)

výstup

(separovaný

vzorek k analýze)

• proceduru lze snadno automatizovat

• kompatibilita s mikrofluidikou, „laboratoř na čipu“

magnetická kulička s

hybridizační sondou

povrch H

cílová DNA

nespecifická

DNA

magnet

detekční elektroda

hybridizace

separace

uvolnění

cílové DNA

detekce

značení a sekven(c)ování DNA

chemická modifikace DNA

oxokomplexy osmia

-selektivní značení ss konců

-detekce abazických míst,

nekanonických párů bazí, inzercí..

Inkorporace značených nukleotidů

pomocí enzymů

F. Sanger

2‘,3‘-dideoxynukleotidy:

terminátory syntézy DNA

(není kam napojit další

nukleotid)

značené dideoxy:

navázání značky podle

komplementární báze

napojování nukleotidů

přes 5‘-OH a 3‘-OH

templát

primer

syntetizovaný úsek

Syntéza DNA in vitro („primer extension“)

Deoxynukleotid trifosfáty (dNTP)

DNA polymeráza

templát

primer

ZNAČENÉ dNTP

DNA polymeráza

vložení značek do DNA pomocí DNA polymeráz

F. Sanger

-směs normálních deoxy

a značených dideoxy

-pro každou bázi jiná barva

-různě dlouhé produkty,

dělení elektroforézou

-značka (barva) odpovídá

koncové bázi

templát

primer

Detekce a identifikace mutací a polymorfismů

-důležité pro diagnostiku (určité mutace v určitých pozicích jsou spojeny s

určitým onemocněním)

-zjišťuje se, jaká (jedna) báze je v konkrétní pozici

G

GC

C T A

T A

potential/V vs. SCE

G Gox Aox

CA

-1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 1.5

13

Tox

Cox

G*

Fc conjugates [Os (bpy)3]3+/2+

nitrophenol

AQ

Os,L (farad)

Os,L (cat) carbon electrodes

mercury and amalgam electrodes

Značení DNA elektroaktivními skupinami

Proč, když je DNA sama elektroaktivní?-odlišení řetězců (hybridizace DNA: značení sond)

-zvýraznění inkorporovaných bazí (monitorování syntézy, SNP typing)

Inkorporace do DNA pomocí DNA polymeráz, magnetická

separace a jednoduchá elektrochemická analýza

primer

template

5‘

3‘

DNA polymerase

dNFcTP (+dNTP)

DBstv

biotin

washing

heat or NaOH

measurement

primer

template

5‘

3‘

DNA polymerase

dNFcTP (+dNTP)

DBstv

biotin

washing

heat or NaOH

measurement

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

0

2

4

6

8

10

I [

A]

E [V]

UFc Gox

CATGGGCGGCATGGGAUFcAUFcAUFcAUFcAUFcA

primer

synthesized stretch

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

0

2

4

6

8

10

I [

A]

E [V]

UFc Gox

CATGGGCGGCATGGGAUFcAUFcAUFcAUFcAUFcA

primer

synthesized stretch

Fc label guanine

dUFcTP+dATP

dUTP+dATP

dUFcTP+dATP, no polymerase

„cizí“ elektrochemicky aktivní

skupina: nový signál

Identifikace jednonukleotidových polymorfismů

pomocí elektrochemie

-0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2

-8

-6

-4

-2

0

2

4

I/A

E/V

…GCCC

dNTP mix:

APhNO2+CPhNH2+UOs+G

…TCCC

…ACCC

…ACCC

…GCCC

…TCCC

Os2+/3+

PhNO2

PhNH2

pomocí jednoduchých levných

elektrod (ne drahých sekvenátorů)

příslib pro levnou

decentralizovanou diagnostiku

Enzymové značky:

biokatalytická amplifikace signálu

substrát

produkt

obvykle se využívají biotinylované sondy a konjugáty (strept)avidinu s vhodným enzymem

tvorba elektroaktivního indikátoru

„biokatalytická“ amplifikace: jedna molekula enzymu přemění mnoho molekul substrátu

substrát substrát

substrát

substrátsubstrát

substrát

substrát

substrátsubstrát

produkt produkt

produktprodukt

produkt

produktprodukt

produkt

produkt

produkt

produkt

electrode

A

BSA

BSABSA

BSABSA

BSABSA

B

BSABSA

BSA

BSA BSA

BSABSA BSA BSA

STV

ALP

STV

STVALP

ALP

OH

O

P

e-

N

biotinylated DNA

tDNA

biotinylated probe

electrode

A

BSA

BSABSA

BSABSA

BSABSA

electrodeelectrode

A

BSA

BSABSA

BSABSA BSABSA

BSABSA BSABSA

B

BSABSA

BSA

BSA BSA

BSABSA

BSA

BSA BSABSA BSA

BSABSA BSA BSA

STV

ALP

STV

STVALP

ALP

OH

O

P

e-

BSABSA BSABSA BSA BSABSA BSA

STV

ALP

STV

ALP

STVSTV

STVSTV

ALPALP

ALPALP

OH

O

P

e-

N

biotinylated DNA

tDNA

biotinylated probe

biotinylated DNA

tDNA

biotinylated probe

PEX-biotinylated DNA

electrode

A

BSA

BSABSA

BSABSA

BSABSA

B

BSABSA

BSA

BSA BSA

BSABSA BSA BSA

STV

ALP

STV

STVALP

ALP

OH

O

P

e-

N

biotinylated DNA

tDNA

biotinylated probe

electrode

A

BSA

BSABSA

BSABSA

BSABSA

electrodeelectrode

A

BSA

BSABSA

BSABSA BSABSA

BSABSA BSABSA

B

BSABSA

BSA

BSA BSA

BSABSA

BSA

BSA BSABSA BSA

BSABSA BSA BSA

STV

ALP

STV

STVALP

ALP

OH

O

P

e-

BSABSA BSABSA BSA BSABSA BSA

STV

ALP

STV

ALP

STVSTV

STVSTV

ALPALP

ALPALP

OH

O

P

e-

N

biotinylated DNA

tDNA

biotinylated probe

biotinylated DNA

tDNA

biotinylated probe

PEX-biotinylated DNA

• pomocí PEX se inkorporuje více

biotinylovaných nukleotidů

• na ně se naváže více molekul enzymu

• vyšší citlivost

hybridizace PEX inkorporace

jednorázové tištěné elektrody

Vícenásobná amplifikace signálu - příklad

green plant

callus culture

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

plan

t-exp

ress

ion

callu

s-ex

pres

sion

plan

t-gen

e

callu

s-ge

ne

non-

com

pl con

trol

no p

robe

RT-PCR(expression)

genomic DNA

PCRcontrols

pla

nt

pla

nt

callu

s

callu

s

non-s

pecific

am

plic

on

no p

robe

I,

A

0

0.6

1.2

1.8

1 2 3 4

B

1 2 3 4

C

frrbcL

A

mRNA

protein

transcription

&splicing

translation

DNA

isolation

PCRgenomic

DNA

PCRRT

cDNA

RNA

isolation

total RNA

total DNAgenomic

DNA

PCR

RT-PCR

green plant

callus culture

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

plan

t-exp

ress

ion

callu

s-ex

pres

sion

plan

t-gen

e

callu

s-ge

ne

non-

com

pl con

trol

no p

robe

RT-PCR(expression)

genomic DNA

PCRcontrols

pla

nt

pla

nt

callu

s

callu

s

non-s

pecific

am

plic

on

no p

robe

I,

A

0

0.6

1.2

1.8

1 2 3 4

B

1 2 3 4

C

frrbcL

1 2 3 4

C

frrbcL

A

mRNA

protein

transcription

&splicing

translation

DNA

isolation

PCRgenomic

DNA

PCRRT

cDNA

RNA

isolation

total RNA

total DNA

mRNA

protein

transcription

&splicing

translation

DNA

isolation

PCRgenomic

DNA

PCRRT

cDNA

RNA

isolation

total RNA

total DNAgenomic

DNA

PCR

RT-PCR

Monitorování genové exprese

PEX

gen rbcL :

exprimován

pouze

v zelených

rostlinných

pletivech

nanoparticle-based detection

systems

x x

x x xx x

dissolving label

in suitable solventstripping

nanoparticle-based detection systems

• amplification: each particle contains many molecules (atoms) of the tracer

Detection in „solid state“: magnetic attraction of the

MB-DNA-nanoparticle assembly to the electrode

electrode

DNA (protilátky) značené uhlíkovými nanotrubičkami

modifikovanými alkalickou fosfatázou

Modifikace povrchů elektrod

• vodivé filmy (+funkční skupiny)

• nanočástice (Au)

• uhlíkové nanotrubky (bývaly populárnější)

• grafenové listy (hit sezóny)

• zvětšení aktivního povrchu, imobilizace sond

• zlepšení přenosu elektronů, elektrokatalytické

vlastnosti

• mnoho autorů, mnoho publikací, některé dobré

Zdrsněné elektrody z grafitu

nebo skelného uhlíku:

-amplifikace signálů volných purinových bazí

-i další purinové metabolity, které reakci s ionty

mědi tak ochotně nedávají

výrazné (alespoň dva

řády) zvýšení citlivosti

pro některé analyty

(kyselina močová,

dopamin, ale nikoli

např. kyselina

askorbová)

není to jen efekt

velikosti povrchu!!!

selektivně ex situ!

vysoká citlivost

bez přídavku mědi

XOXO

XO

alopurinol

oxypurinol

hypoxantin

xantin

kyselina močová

monitorování enzymových přeměn in vitro

analýza moči pacientů

Děkuji za pozornost