K perspektivám DNA diagnostiky u komplexních nemocí

20.5.2009

Genom ve zdraví a nemociGenetická výbava jedince

(souhrn všech genů=genom) je sice osudově zadána v okamžiku zplození, ale není pro další život konečná, protože v průběhu života se může měnit jak pod vlivem četných faktorů prostředí, tak pod vlivem dalších faktorů epigenetických i genetických.

Genomická stabilita vs. variabilitaStabilita genomu je trvale

ohrožována mnoha mechanismy během replikace buněk

Variabilita genomu zajišťuje optimální míru adaptace populace na rychleji se měnící okolní podmínky

Genové mutace jako příčina variability v genech

Mutace v somatických buňkách Vznikají kdykoliv v průběhu života Jsou buněčně nebo orgánově specifické

a obvykle se nepřenášejí na potomstvo

Mutace v germinativních buňkách Jsou součástí genetické predispozice k

nemocem Jsou přítomny ve všech buňkách jedince Přenášejí se na potomstvo

MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009)The lineage of mitotic cell divisions from the fertilized egg to a single cell within a cancer showing the timing of the somatic mutations acquired by the cancer cell and the processes that contribute to them.

Mutace v somatických buňkách Sporadická rakovina kolorekta

MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009)

Somatické mutace v jednom genomu pacienta s kolorektálním karcinomem

Genové mutace

Mutací vzniklé alely jsou v populaci z různých důvodů vzácné (např. jsou výrazně patologické a tudíž jsou z populace odstraňovány selekcí, nebo vznikly nedávno a nestačily se v populaci rozšířit) a časté (polymorfismy).

Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci

Za genetickou predispozici mnoha biologických procesů, evolučních adaptací a tedy také tzv. komplexních nemocí zřejmě odpovídají kombinace určitých genů a určitých faktorů zevního prostředí.

Interakční efekty a vliv vnějších faktorů však nutně musíme očekávat i v případě mendelisticky děděných nemocí, což se koneckonců projevuje ve všeobecně známé lékařské zkušenosti se  širším klinickým spektrem příznaků stejného onemocnění.

Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci

musíme počítat s tím, že fakticky každá choroba má nějaké genetické pozadí, jehož podíl na manifestaci dané choroby je různý.

Své genetické pozadí mají i tak relativně vzdálené proximální fenotypy, jako je např. kvalita života u nemocných s chronickým kardiovaskulárním onemocněním.

Genetické studiestrategie výběru kandidátních genů. Tato otázka je podstatně jednodušší u

mendelisticky děděných nemocí, kde se změněná funkce jednoho genu snádněji identifikuje.

výběr typu studie (a příslušné statistické metodologie), která zhodnotí sílu asociace genů s chorobami. Možnosti jsou v zásadě dvě:

linkage (vazebná) analýza asociační studie. K detekci specifických genetických oblastí a

genů, které se účastní v transmisi nemoci, je v principu možné použít obě metody.

Asociační studie vyšetřují souvýskyt markeru a nemoci na

populační úrovni, tj. u nepříbuzných jedinců, obvykle srovnáním frekvencí markerů u nepříbuzných nemocných a kontrolních subjektů (studie case-control). Statistickou sílu asociace je možno dále zvýšit obohacením o další kritéria, jako jsou klinické subtypy nemoci (studie case-case), závažnost nemoci, časný začátek nemoci, rizikové faktory pro nemoc včetně pohlaví a vhodné biologické znaky (např. plasmatické hladiny cytokinů při asociaci genetických polymorfismů v cytokinových genech; studie genotyp-fenotyp).

DNA markery U komplexních nemocí se ukazuje, že je možno

asociovat alely mnohých polymorfismů s výskytem komplexní nemoci nebo některými intermediálními znaky onemocnění (hladiny proteinů, rodinná anamnéza aj.) statisticky asociovat, čili přinejmenším najít genetický marker, s touto nemocí asociovaný.

Určitý genotyp nebo alela daného polymorfismu tak představuje vyšší (nižší) riziko pro nemoc.

Odds ratio (OR):

Počet nemocných s riz. genotypem x počet zdravých bez riz. genotypuPočet nemocných bez riz. genotypu x počet zdravých s riz. genotypem

DNA marker nemusí mít kauzální vztah k nemoci. Pro klinicky užitečný markerje třeba, aby jeho asociace s nemocí nebo jeho příznakem byla statisticky co nejužší.

Asociační studie-příklad: I/D ACE

RPR, renin/prorenin receptor; Mas, mas oncogene, receptor for Ang 1–7; AT2R, angiotensin type 2 receptorAT1R, angiotensin type 1 receptor, IRAP, insulin-regulated aminopeptidase; Ang IV receptor AMPA, aminopeptidase A; AMPM, aminopeptidase M; ACE, angiotensin-converting enzyme; ACE2, angiotensin-converting enzyme 2; NEP, neutral endopeptidase.

Fyhrquist F and Saijonmaa O, Journal of Internal Medicine 264: 224-236, 2008

I/D ACE - genotyping

ID

II

DD

Dvě formyTestikulární ACE (ancestral) je exprimován během terminální diferenciace lidských spermatocytů

Somatická ACE (duplikovaná u Chordat) se exprimuje v oblastech vysokého průtoku tekutin

D alela asociovaná s mnoha diagnózami všetně psychiatrických a většiny rakovin. Výsledky kardiovaskulárních studií mnohdy kontraverzní Moskowitz DW et al., Current

Topics in Medicinal Chemistry 4: 1431-1452, 2004

ACE

I/D ACE polymorphism a akutní srdeční selhání

I/D ACE *ASS ; LS MeansWilks lambda=,96581, F(4, 970)=4,2548, p=,00203

Effective hypothesis decompositionVertical bars denote 0,95 confidence intervals

I/D ACE DD I/D ACE ID I/D ACE II

False True

ASS

32

34

36

38

40

42

44

46

48

50

52

54

56

58

EF L

V 10

-90%

Pávková-Goldbergová et al., not published

I/D ACE a akutní srdeční selhání

I/D ACE *ASS ; LS MeansWilks lambda=,96581, F(4, 970)=4,2548, p=,00203

Effective hypothesis decompositionVertical bars denote 0,95 confidence intervals

I/D ACE DD I/D ACE ID I/D ACE II

False True

ASS

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

Pain

(min

)

Pávková-Goldbergová et al., not published

I/D ACE, CAD a diabetesACE ID*CAD*d iabetes; LS Means

W ilks lambda=,98465 , F (3 , 630)=3 ,2730, p=,02081Effective hypo thesis decomposition

Vertica l bars denote 0 ,95 confidence in te rva ls

ACE ID 1 ACE ID 2

d iabetes: 1

CAD: 1 240

45

50

55

60

65

70

EF L

K

d iabe tes: 2

CAD: 1 2

Blahák J et al., not published

I/D ACE, CAD a diabetesACE ID*CAD*d iabetes; LS Means

W ilks lambda=,98465, F (3 , 630)=3,2730, p=,02081Effective hypo thesis decomposition

Vertica l bars deno te 0 ,95 con fidence in te rva ls

ACE ID 1 ACE ID 2

d iabetes: 1

CAD: 1 24,0

4 ,5

5 ,0

5 ,5

6 ,0

6 ,5

7 ,0

7 ,5

8 ,0

8 ,5

9 ,0

glyk

emie

d iabetes: 2

CAD: 1 2

Blahák J et al., not published

I/D ACE, CAD a diabetesACE ID*CAD*d iabetes; LS Means

W ilks lambda=,98465, F (3, 630)=3 ,2730, p=,02081Effective hypo thesis decomposition

Vertica l bars denote 0 ,95 con fidence in te rva ls

ACE ID 1 ACE ID 2

d iabetes: 1

CAD: 1 20,6

0 ,8

1 ,0

1 ,2

1 ,4

1 ,6

1 ,8

2 ,0

2 ,2

2 ,4

2 ,6

2 ,8

TG

d iabetes: 2

CAD: 1 2

Blahák J et al., not published

I/D ACE a CHSSFarmakogenetické aspekty dávkování betablokátorů

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Patients withrecommended

dose of BB(113)

Patients withoutBB (91)

Patients withlower than 50%dose of BB (33)

DD

ID

II

Pg=0.005, Pa=0.002

Vasku A et al., Cas Lek Ces 2006

I/D ACE a CHSSFarmakogenetické aspekty dávkování betablokátorů a ACEI

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Others (177) Patients w ith low er than50% dose of BB and/or

ACEI (60)

DD

ID

IIPg=0.006, Pa=0.009

OR for II in patients with BB and/ or ACEI lower than 50% dose of recommended dose of is 2.84; P=0.002

Vasku A et al., Cas Lek Ces 2006

I/D ACE a pacienti s kožním T-lymfomem

0%

20%

40%

60%

80%

100%

DD 20 43

ID 57 36

II 23 21

CTCL patients with phototherapy (N=44)

CTCL patients without phototherapy (N=42)

Patients with phototherapy have more frequently genotype ID OR= 2.92, 95% CI 1.12-7.57, P=0.02

Vasku V et al., not published

I/D ACE a pacienti s psoriázou

0%

20%

40%

60%

80%

100%

DD 53 22

ID 33 57

II 14 21

Psoriasis patients with diabetes (N=15)

Psoriasis patients without diabetes (N=185)

Patients with psoriasis and diabetes have more frequently DD variant of I/D ACE polymorphism OR= 4.01, 95% CI 1.37-11.73, P=0.01

Pg=0.03Pa=0.04

Vasku V et al., not published

I/D ACE a pacienti s psoriázou

0%

20%

40%

60%

80%

100%

DD 17 28

ID 59 54

II 24 18

Psoriasis patients with repeated tonsillitis (N=66)

Psoriasis patients without repeated tonsillitis (N=134)

Patients with psoriasis and repeated tonsillitis/tonsillectomy history have more frequently DD variant of I/D ACE polymorphism OR= 1.98, 95% CI 0.94 – 4.18, P=0.05

I/D ACE a (TAP1* 0101) (6p21.3) u pacientů s psoriázou

Patients with psoriasis and genotype TAP1* 0101 have more frequently DD+ID variants of I/D ACE polymorphism OR= 2.97, 95% CI 1.17-7.50, P=0.01

Pg=0.03Pa=0.04

0%

20%

40%

60%

80%

100%

DDIDII

DD 29 20

ID 76 35

II 34 6

TAP1*0101 Other TAP1

I/D ACE a TNFbeta NcoI (6p21.3) u pacientů s psoriázou

Patients with psoriasis and genotype B1B1 have more frequently DD variant of I/D ACE polymorphism OR= 2.87, 95% CI 0.92-9.00, P=0.07

Pg=0.03Pa=0.04

0%

20%

40%

60%

80%

100%

B2B2 17 50 20

B1B2 22 55 23

B1B1 1 6 6

II ID DD

I/D ACE a RAGE 6 (6p21.3) u pacientů s psoriázou

Patients with psoriasis and genotype AA have more frequently DD+ID variants of I/D ACE polymorphism OR= 2.04, 95% CI 0.96 - 4.33, P=0.05

Pg=0.03Pa=0.04

0%

20%

40%

60%

80%

100%

GG 6 6 1

AG 15 42 12

AA 14 54 29

II ID DD

Až 50% genetické vnímavosti pro psoriázu je asociováno s PSORS11

1. Trembath RC, et al. Hum Mol Genet. 1997;6(5):813-20.

Chromosome 6 MHC

3500 kb300025002000150010005000

Class IIIClass II Class I

6p21.1- 6p21.3

PSORS1

DP DN DM LMP/TAP DO DQ DR C4 C2 HSP70 TNF B C E FGA

STGCCHCR1POU5F1HCG27 SEEK1

HLA-ECDSNSPR1TCF19PSORS1C3ERVKHLA-CHLA-B

Illustration adapted from: Bowcock AM, Krueger JG. Nat Rev Immunol.

2005;5(9):699-711.

RAGE

Doporučení pro úspěch ve studiu genetiky komplexních nemocíPečlivá příprava návrhu studie se statistickou

rozvahou (prospektivní, multicentrická s ohledem na genetické gradienty)

Výběr optimální molekulárně biologické metodologie

Zajištění adekvátního statistického zpracování (statistické balíky)

Věcně správná interpretace výsledkůÚzká spolupráce s klinikyŠiroká spolupráce s odborníky na různé obory

genetiky (klinická genetika, epidemiologická genetika, odborníci na molekulární evoluce)

Stálé sebevzdělávání!

Děkuji vám za pozornostDěkuji vám za pozornost

„I just need a closer look...“