Kompletn skripta 2008 - Přírodovědecká fakulta UP...V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a...

Univerzita Palackého Přírodovědecká fakulta

Katedra biochemie

LABORATORNÍ CVIČENÍ Z BIOCHEMIE

Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. a kolektiv

Olomouc 2008

2

3

OBSAH

Laboratorní řád.................................................................................................................. 6

Bezpečnost práce v chemické laboratoři...................................................................... 7

První pomoc při nehodě..................................................................................................... 8

1. Aminokyseliny

1.1. Identifikace aminokyselin................................................................................................ 9

1.2. Dělení směsi aminokyselin chromatografickými metodami....................................... 15

1.2.1. Dělení směsi aminokyselin na iontoměniči..................................................................... 17

1.2.2. Dělení směsi aminokyselin chromatografií na tenké vrstvě silikagelu....................

18

2. Proteiny

2.1. Stanovení celkových proteinů.......................................................................................... 19

2.2. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu………………………………………………………………….. 25

2.2.1. Stanovení relativní molekulové hmotnosti bílkovin metodou diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE)……………………………………………

27

2.2.2. Diskontinuální elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za nativních podmínek....

29

2.3. Chemické modifikace proteinů........................................................................................ 31

2.4. Gelová chromatografie barevného derivátu albuminu................................................ 36

3. Enzymy

3.1. Amylasy................................................................................................................................ 40

3.1.1. Aktivita diastasy................................................................................................................ 43

3.1.2. Substrátová specifita α−amylasy a sacharasy............................................................. 43

3.1.3. Optimální pH enzymové reakce α-amylasy.................................................................... 44

3.1.4. Teplotní optimum enzymové reakce sacharasy............................................................ 46

3.2. Aminoxidasa........................................................................................................................ 48

3.2.1. Izolace aminoxidasy ze semenáčků hrachu.................................................................. 48

4

3.2.2. Stanovení kinetických parametrů aminoxidasy............................................................ 51

3.3. Proteolytické enzymy........................................................................................................ 59

4. Lipidy

4.1. Chemické vlastnosti lipidů................................................................................................ 67

4.1.1. Preparace lipidových frakcí z vaječného žloutku....................................................... 72

4.1.2. Identifikace lipidů............................................................................................................. 73

4.2. Stanovení lipofilních listových barviv a jejich rozdělení adsorbční chromatografií...................................................................................................................

76

5. Sacharidy

5.1. Chemické vlastnosti sacharidů - kvalitativní reakce.................................................. 79

5.2. Papírová chromatografie sacharidů............................................................................... 88

6. Nukleové kyseliny

6.1. Izolace DNA a RNA, identifikace složek nukleových kyselin................................... 91

Příprava činidel a roztoků................................................................................................ 95

Použitá literatura............................................................................................................... 98

5

PŘEDMLUVA

Skripta jsou sepsána pro základní cvičení z biochemie určené studentům oborů biochemie,

chemie, biofyziky a biologie. Jsou koncentrátem zkušeností a výsledkem práce autorského

kolektivu Katedry biochemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého.

Prakticky pokrývají celou oblast biochemie a částečně také molekulární biologie. Úloh je

početně daleko víc, než je možné v semestrálním cvičení zvládnout. Řada úloh je alternativních

a budou zařazovány podle náročnosti, dostupnosti chemikálií a přístrojů.

Autoři skript byli vedeni myšlenkou prakticky představit logickou stavbu biochemie

a experimenty vedoucí k jejímu objasnění. Biochemie je intenzivně, ba dokonce dynamicky

a exponenciálně se rozvíjejícím oborem. Experimentální metody původně převzaté z jiných oborů

chemie jsou překonány a biochemický experiment už tím, že pracuje s biologickým materiálem, se

stal samostatnou disciplinou s původními postupy. Jen pro představu: běžná bakterie E. coli

obsahuje 70 % vody a 30 % ostatních chemických sloučenin. Z těchto 30 % připadají na ionty

a malé organické molekuly 4 %, fosfolipidy 2 %, DNA 1 %, RNA 6 %, polysacharidy 2 % a proteiny

15 %.

Úkolem biochemika je např. izolovat a charakterizovat (také sekvenovat = stanovit pořadí

bází) bakteriální DNA. Bez nadsázky se takový experiment dá přirovnat k hledání jehly v kupce

sena.

Mohli bychom popisovat další obtížné experimentální úkoly, před které postavila

biochemiky Příroda. Není to účelem úvodu, to vše najdete ve skriptech. Snad jen poznamenáme, že

autoři by byli velmi spokojeni, kdyby si uživatelé skript osvojili základní biochemické postupy,

pochopili strategii a zvláštní charakter práce s biologickým materiálem a odnesli si do své budoucí

praxe poznání, že biochemie je těžký, ale krásný a užitečný obor, který budou dále rozvíjet.

Olomouc, 2008 Autoři Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Prof. Mgr. Marek Šebela, Dr. Doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D.

Prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D. RNDr. Ludmila Zajoncová, Ph.D.

RNDr. Marek Petřivalský, Dr.

6

LABORATORNÍ ŘÁD 1. Student je povinen se seznámit před zahájením práce v laboratoři s laboratorním řádem,

s bezpečnostními předpisy a s poskytováním první pomoci. 2. Pro získání zápočtu je nutná 100% účast na cvičení. V případě nemoci si lze cvičení nahradit

v rámci zápočtového týdne (vyjímečné situace se budou řešit individuálně, př. pobyt v nemocnici).

3. Každá absence musí být omluvena. Má-li student vážné osobní důvody, pro které se nemůže

zúčastnit cvičení, sdělí to vedoucímu předem. Každá zameškaná úloha musí být nahrazena. Na termínu náhradního cvičení se dohodne posluchač s vedoucím cvičení.

4. Student je povinen přicházet do laboratoře včas. 5. Student musí být na praktické cvičení teoreticky připravený. Před zahájením cvičení vyučující

ověřuje znalosti studentů. Pokud student nemá dostatečné znalosti k řešení dané úlohy, cvičení vykoná v náhradním termínu. Maximální počet náhradních cvičení je 2.

6. Při práci v laboratoři musí mít student pracovní plášť a přezůvky. 7. Studenti pracují ve dvojicích. Před zahájením práce zkontrolují podle přiloženého seznamu

pracovní stůl, na případné nesrovnalosti upozorní vyučujícího. 8. Při práci je nutné postupovat přesně podle zadané úlohy a pokynů vyučujícího. Před používáním

přístrojů se musí student nejprve seznámit s jejich obsluhou. 9. Průběh práce a dosažené výsledky si každý student zaznamenává do protokolárního sešitu. Po

skončení cvičení předloží výsledky k ověření vedoucímu cvičení. 10. Následující cvičení dvojice studentů, řešící spolu danou úlohu, odevzdá jeden společný

protokol, který musí obsahovat: jména studentů, studijní kombinaci, datum, název úlohy, stručný princip úlohy, stručný pracovní postup, výsledky, diskusi, závěr (tabulky, grafy) a odpovědi na otázky uvedené u každé úlohy.

11. Po skončení práce je student povinen dát své pracovní místo do pořádku, řádně umýt sklo a

opláchnout je destilovanou vodou. 12. Student smí opustit laboratoř až po kontrole dosažených výsledků a stavu pracovního stolu

vyučujícím. 13. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit. 14. Studenti jsou povinni dodržovat bezpečnostní předpisy. 15. Práce s jedovatými těkavými a páchnoucími látkami se provádí pouze v digestoři. 16. Zvláštní opatrnosti je třeba dbát při manipulaci s otevřeným ohněm, hořlavinami, žíravinami

a jedovatými látkami. 17. Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění je nutné ihned hlásit vyučujícímu

a v případě potřeby poskytnout okamžitě první pomoc.

7

BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI Všichni studenti musí být před zahájením cvičení seznámeni a přezkoušeni ze zákona č. 356/2003 Sb. V chemické laboratoři může dojít k poranění při práci se sklem, při neopatrné manipulaci s elektrickými přístroji a zejména při práci s chemikáliemi. Aby nedocházelo k poškození zdraví, je nutné dodržovat základní zásady bezpečnosti práce: 1. Provádíme pouze práce podle pokynů vyučujícího. 2. Seznámíme se s rozmístěním hasících přístrojů a s únikovými východy z laboratoře. 3. V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a nekouříme. K jídlu a pití nikdy nepoužíváme chemické

sklo. 4. Po skončení práce si důkladně umyjeme ruce. 5. Tašky a oblečení uložíme na vyhrazené místo mimo laboratoř. 6. Při práci v laboratoři vždy nosíme pracovní plášť a vhodnou obuv. 7. Neprovádíme samovolné opravy nebo úpravy na elektrické instalaci a přístrojích. 8. Chemikálie nikdy nezkoušíme ústy a neinhalujeme výpary. 9. Nepipetujeme ústy! 10. Při práci se žíravinami a jinými nebezpečnými látkami si chráníme obličej a oči ochranným

štítem, ruce gumovými rukavicemi. 11. Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu. Dbáme, abychom vnější stěny nádob nebo pracovní

místo nepotřísnili chemikáliemi. 12. Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem

po tyčince do vody za současného míchání a chlazení. 13. Při provádění pokusů ve zkumavkách držíme ústí zkumavek odvrácené od obličeje (svého

i spolupracovníků). 14. Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň. 15. Zbytky jedů likvidujeme podle pokynů vyučujícího. 16. Při práci s étherem dbáme úzkostlivě na bezpečnostní opatření (možnost vznícení i od horkých

součástí). 17. V případě nehody okamžitě informujeme vyučujícího a poskytneme první pomoc. 18. Po skončení práce uzavřeme vodu a vypneme elektrické spotřebiče.

8

PRVNÍ POMOC PŘI NEHODĚ

1. Při poleptání kůže silnou zásadou nebo kyselinou zasažené místo ihned důkladně omyjeme proudem vody. Při poleptání kyselinou provedeme neutralizaci roztokem hydrogenuhličitanu sodného (20 g.L-1), při poleptání zásadou zředěnou kyselinou octovou (5 g.L-1).

2. Při zasažení oka chemikálií ihned oko vypláchneme slabým proudem vody. V případě zasažení

zásadou oko vypláchneme borovou vodou (roztok kyseliny borité 30 g.L-1), jedná-li se o kyselinu použijeme k výplachu roztok boraxu (20 g.L-1). V každém případě je nutné vyhledat odborné vyšetření u očního lékaře.

3. Při poleptání sliznice v ústech provedeme důkladný výplach úst vodou a následně neutralizaci

výplachem kyselinou octovou (poleptání zásadou) nebo hydrogenuhličitanem sodným (poleptání kyselinou).

4. Při požití

− louhu se doporučuje pít zředěnou kyselinu octovou (0,5 - 2,0 g.L-1), − kyseliny pijeme suspenzi oxidu hořečnatého nebo hydroxidu hlinitého ve vodě, − jedů je charakter první pomoci specifický podle druhu otravy, doporučuje se vypít

aspoň 0,5 L vody a vyvolat zvracení, − chemikálií je nutné vyhledat odborné lékařské ošetření.

5. V případě vzplanutí hořlavých látek okamžitě vypneme elektrický proud a odstraníme všechny hořlavé látky z blízkosti požáru. Hořící oděv hasíme přikrývkou nebo sprchovou vodou. Při likvidaci větších plamenů použijeme hasící přístroje. Při malých popáleninách ošetříme postižené místo mastí na spáleniny a zakryjeme sterilním obvazem. Větší popáleniny ošetří lékař.

6. Při pořezání sklem odstraníme z povrchové rány sklo, okolí otřeme zředěným peroxidem vodíku

(0,9 mol.L-1) a ovážeme sterilním obvazem. Větší zranění ošetří lékař.

9

1. AMINOKYSELINY

1.1. IDENTIFIKACE AMINOKYSELIN TEORETICKÝ ÚVOD

Všechny proteiny na Zemi se skládají z dvaceti základních aminokyselin, které se nazývají proteinogenní (Obr. 1). Jsou to, až na prolin, α−aminokyseliny. Prolin obsahuje sekundární aminoskupinu a je tak vlastně α-iminokyselina. Proteinogenní aminokyseliny třídíme podle polarity postranního řetězce do tří skupin. Takovéto dělení není ani tak podstatné pro samotné aminokyseliny, ale pro charakterizaci proteinů, které jsou aminokyselinami tvořeny. Hydrofobní postranní řetězce aminokyselin v proteinech odpuzují vodu a naopak hydrofilní jsou vodou solvatovány. Obr. 1 Vzorce proteinogenních aminokyselin.

NH3+ C

H COO

CH2CH

NH

CH

CH C

H

CH

NH3+ C

H2

COO

NH2

+ CH

CH2C

H2

CH2

COO

NH3+ C

H COO

CH3

NH3+ C

H COO

CH CH3CH2

CH3

NH3+ C

H COO

CH2

CH

CH3

CH3

NH3+ C

H COO

CH2

CH2

SCH3

NH3+ C

H COO

CH2

CHCH

CH

CHCH

NH3+ C

H COO

CH CH3CH3

A. Nepolární

Glycin (Gly, G) L-Alanin (Ala, A) L-Valin (Val, V)

L-Leucin (Leu, L) L- Isoleucin (Ile, I) L-Prolin (Pro, P)

L- Methionin (Met, M) L-Fenylalanin (Phe, F) L-Tryptofan (Trp, W)

-

-

-

-

--

- -

-

10

NH3+ C

H COO

CH OHCH3

- NH3+ C

H COO

CH2

CH2

CONH2

-NH3+ C

H COO

CH2

CONH2

-

B. Polární

L-Threonin (Thr, T) L-Asparagin (Asn, N) L-Glutamin (Gln, Q)

NH3+ C

H COO

CH2

COO

-

-

COO

NH3+ C

H COO

CH2

CH2

- NH3+ C

H COO

CH2

SH

-

NH3+ C

H COO

CH2

CHCH

CHCH

OH

- NH3+ C

H COO

CH2

OH

-

NH3+ C

H COO

CH2CH

NH

CH

NH+

- NH3+ C

H

CH2

CH2

CH2

NH

NH2NH2+

COO- NH3+ C

H COO

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

-

C. S odštěpitelným protonem -pKa 3, 9 4, 1 8, 4

10, 5

13, 7

L-Asparagová kys.(Asp, D) L-Glutamová kys.(Glu, E) L-Cystein (Cys, C)

L-Tyrosin (Tyr, Y) L-Serin (Ser, S)

6, 0 12, 5 10, 5

L-Histidin (His, H) L-Arginin (Arg, R) L-Lysin (Lys, K)

KYSELÉ

11

Aminokyseliny a proteiny mají výrazné acidobazické vlastnosti. Všechny aminokyseliny mají dvě nebo tři (s postranním řetězcem odštěpujícím proton) acidobazické skupiny charakterizované hodnotami pKa. Ve fyziologickém rozmezí pH jsou karboxylové i α-aminoskupiny úplně disociovány (amfoterní elektrolyty).

α−Aminokyselina Zkratky Symboly pK1 (α−COOH)

pK2 (α − NH3

+) pKR postranní řetězec

Alanin Ala A 2,35 9,87 Arginin Arg R 1,82 8,99 12,48 (guanidium) Asparagin Asn N 2,10 8,84 Asparagová kyselina Asp D 1,99 9,90 3,90 (β−COOH) Cystein Cys C 1,99 10,78 8,33 (-SH) Fenylalanin Phe F 2,16 9,18 Glutamin Gln Q 2,17 9,13 Glutamová kyselina Glu E 2,10 9,17 4,07 (γ-COOH) Glycin Gly G 2,35 9,78 Histidin His H 1,80 9,33 6,04 (imidazolium) Isoleucin Ile I 2,33 9,76 Leucin Leu L 2,33 9,74 Lysin Lys K 2,16 9,18 10,79 (ε-NH3

+) Methionin Met M 2,13 9,28 Prolin Pro P 2,95 10,65 Serin Ser S 2,19 9,21 Threonin Thr T 2,09 9,10 Tryptofan Trp W 2,43 9,44 Tyrosin Tyr Y 2,20 9,11 10,13 (fenolický -OH) Valin Val V 2,29 9,74

Hodnotě pH, při které má molekula celkový nulový elektrický náboj, se říká izoelektrický

bod, pI. Molekula nemigruje ve stejnosměrném elektrickém poli a je nejméně rozpustná. Z Henderson-Hasselbachovy rovnice pro α-aminokyseliny vyplývá, že

2

ji pKpK pI

+=

kde Ki a Kj jsou disociační konstanty dvou ionizací, jejichž výsledkem je elektroneutrální forma molekuly. Pro monoaminokarboxylové kyseliny, jako alanin (Ala), Ki a Kj odpovídají K1 a K2. Pozor! Pro kyselinu asparagovou (Asp) nebo glutamovou (Glu) jsou však Ki a Kj rovny K1 a KR, zatímco pro histidin (His), lysin (Lys) a arginin (Arg) je třeba dosadit hodnoty K2 a KR. S výjimkou glycinu (Gly) jsou všechny aminokyseliny izolované z proteinů hydrolýzou opticky aktivní, to znamená, že stáčejí rovinu polarizovaného světla. Molekuly se rozdělují na pravotočivé (+) a levotočivé (-). Směr otáčení se zjistí polarimetrem. Míru optické aktivity molekul kvantitativně vyjadřuje specifická otáčivost:

[ ]dc

Dωα =25

Index 25 odpovídá teplotě (25 oC) a index D označuje vlnovou délku monochromatického světla užívaného v polarimetrii, tzv. čáru D sodíkového spektra (589,3 nm) a ω je změřená rotace ve stupních, d je optická dráha v dm a c je koncentrace látky v g.mL-1. Hodnota specifické otáčivosti se mění s pH. Specifická otáčivost nic neříká o skutečné (absolutní) konfiguraci.

12

Krokem k určení absolutní konfigurace skupin na chirálním centru bylo zavedení tzv. Fischerova pravidla. Rozmístění skupin kolem chirálního centra se připodobňuje ke konfiguraci glyceraldehydu. E. Fischer zavedl konvenci, že (+) a (-) stereoizomery glyceraldehydu jsou označeny jako D-glyceraldehyd a L-glyceraldehyd. U α-aminokyselin odpovídá rozmístění amino-, karboxy-, R- a H skupin kolem atomu C umístění hydroxylu, aldehydu, CH2OH a vodíku v glyceraldehydu. Tak bylo možné říci, že L-glyceraldehyd a L-aminokyseliny mají shodnou relativní konfiguraci. Všechny α-aminokyseliny obsažené v proteinech mají prostorové uspořádání L. Fischerova volba se ukázala jako správná, neboť v roce 1949 byla pomocí rentgenové strukturní analýzy potvrzena. Relativní konfigurace se tak shoduje s absolutní. Užitečný Fischerův systém nebyl zcela jednoznačný u látek s více asymetrickými centry. V roce 1956 byl zaveden Robertem Cahnem, Christopherem Ingoldem a Vladimírem Prelogem nový obecnější způsob označování konfigurace. Podle něho jsou čtyři skupiny obklopující chirální centrum seřazeny podle klesající důležitosti. Substituenty s vyšším atomovým číslem jsou zařazeny před ty s nižším atomovým číslem. Pro stanovení konfigurace orientujeme chirální centrum tak, že nejméně důležitý substituent směřuje v pohledu od nás dozadu. Jestliže jsou ostatní tři skupiny, od nejdůležitější k nejméně důležité, uspořádány ve směru hodinových ručiček, označujeme konfiguraci chirálního centra jako (R ), jestliže je uspořádání proti směru pohybu hodinových ručiček, centrum asymetrie se označí (S). V tomto konceptu odpovídá L-glyceraldehydu (S)-glyceraldehyd a podobně L-alaninu, (S)-alanin. Všechny L-aminokyseliny obsažené v proteinech jsou (S)-aminokyseliny s jedinou výjimkou: L-cystein je (R)-cystein! S použitím systému (S/R) jsou dvě α−aminokyseliny obsahující dvě chirální centra označeny takto: L-threonin je (2S/3R)-threonin a L-isoleucin je (2S/3S)-isoleucin. Vedle acidobazických a optických vlastností jsou některé aminokyseliny charakteristické chemickými reakcemi vedlejších řetězců, které mohou být do jisté míry využity k jejich identifikaci, případně stanovení. 1. Sakaguchiho reakce (vyslov sakagučiho). Působením alkalického bromnanu a α-naftolu na guanidinovou složku argininu (Arg) vzniká charakteristické červené zbarvení vzniklého produktu oxidace - substituovaného 1,4-naftochinonu.

NaBrO

O

NaBr

OH

NH CHNH2

NH2+

NH C NH2

R ++ + +

R

NH4+

2. Xanthoproteinová reakce. Aromatické aminokyseliny (Tyr, Trp, slabě Phe) se lehce nitrují nitrační směsí za vzniku příslušných žlutých produktů, které v alkalickém prostředí přechází na oranžové až červené soli aciformy nitrosloučenin.

CHNH3

+COOH

OH

CH2

NO2O-

CHNH2

COOCH2

NO2

-

H2O2+ +2OH -

3. Paulyho reakce. Reakcí tyrosinu (Tyr) a histidinu (His) s diazotovanou kyselinou sulfanilovou v alkalickém prostředí vznikají oranžové až červené kopulační produkty (azobarviva).

13

N N+

N N

N NOH

CH2CH OH

CH2CH

+

COO-

NH3+ HO3S

2

-COO-

NH3+

HO3S

HO3S

4. Adamkiewiczova reakce. Kondenzací tryptofanu (Trp) s kyselinou glyoxylovou v silně kyselém prostředí kyseliny sírové vzniká červenofialový produkt. Reakce je citlivá a k její realizaci stačí stopy kyseliny glyoxylové obsažené ve starší kyselině octové, kde vzniká její oxidací.

CHOCOOHN

H

R

NH

R

NH

R

NH

R

CHCOOH

R = CH2CH(NH3)COOH+

+ + H2O+

5. Ninhydrinová reakce. Oxidačněredukční reakcí ninhydrinu (2,2-dihydroxy-1,3-indandion) s volnými amino- a iminoskupinami vznikají barevné produkty. Reakcí s primárními aminoskupinami modrofialový, který se nazývá Ruhemanova violeť (λmax = 570 nm). Reakcí s iminoskupinami, např. u prolinu (Pro) a jeho derivátů, žlutý (λmax = 440 nm). V peptidech a proteinech, kde jsou aminokyseliny vázány peptidovou vazbou, reaguje pouze volná ε−aminoskupina lysinu (Lys). Pro zvýšení citlivosti reakce se přidává do reakční směsi částečně redukovaný ninhydrin zvaný hydrindantin, který reaguje s reakcí uvolněným amoniakem za výrazného prohloubení zbarvení.

OOHOH

O

O

ONCH(R)COO

O

O

N = C HR

CO2

ONH2

O

NH3OHOH

O

RCH(NH3)COOH3O

RO

ON

O

O

O

+ 100oC-

ketimin

aldimin

H2O

intermediální amin

ninhydrin

Ruhemanova violet´

H2O

hydrindantin ninhydrin

-+

HC

λmax = 570 nm

+ +

14

6. Aminokyselina cystein (Cys) a její oxidací vzniklý dimer cystin (Cys-S-S-Cys) působením alkálií uvolňují za tepla sulfan, který lze dokázat srážením rozpustnou olovnatou solí za vzniku černé sraženiny sulfidu olovnatého PbS. 7. Důkaz peptidové vazby. Biuretová reakce spočívá ve tvorbě fialově zbarvených měďnatých komplexů v alkalickém prostředí. Název reakce je odvozen od sloučeniny biuretu, což je produkt kondenzace dvou molekul močoviny za odštěpení amoniaku (tavení močoviny). Vzniklé seskupení H2N-CO-NH-CO-NH2 je modelem dvou peptidových vazeb. Vlastní fialové zbarvení komplexu (λmax = 540 nm) vzniká interakcí Cu2+ a čtyř dusíkatých atomů peptidových vazeb. Citlivost se pohybuje v rozmezí od 200 do 2000 mg.mL-1 proteinu. Reakci poskytují všechny sloučeniny mající alespoň dvě peptidové vazby. Z aminokyselin reagují pozitivně v koncentrovaných roztocích histidin (His) a asparagin (Asn). MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: standardy aminokyselin - 2% roztoky (w/v) ve vodě, 10% hydroxid sodný, kyselina dusičná, 1% síran měďnatý, 0,5% octan olovnatý, 0,2% ninhydrin v EtOH, 0,2% α-naftol v EtOH, kyselina octová, koncentrovaná kyselina sírová, bromnan sodný, Paulyho reagens I (5% roztok dusitanu sodného ve vodě), Paulyho reagens II (900 mg kyseliny sulfanilové rozpustíme v 9 mL koncentrované kyseliny chlorovodíkové a doplníme destilovanou vodou do 100 mL), 1,5 mol.L-1 uhličitan sodný. Materiál: stojan se zkumavkami, pipety, kahan. PRACOVNÍ POSTUP Chemické reakce vedlejších řetězců aminokyselin 1. Sakaguchiho reakce. K 0,5 ml roztoku argininu přidáme 3 kapky 10% hydroxidu sodného, 0,25 mL ethanolického roztoku α-naftolu a poté několik kapek bromnanu. Vznikne malinově červené zbarvení. 2. Xanthoproteinová reakce. Zahřátím 0,5 mL roztoku tyrosinu nebo tryptofanu s 0,25 mL koncentrované kyseliny dusičné vzniká žluté zbarvení, případně sraženina. Po ochlazení a zalkalizování 10% NaOH se barva změní na oranžovou až červenou. 3. Paulyho reakce. Ve zkumavce smícháme 0,25 mL Paulyho činidla I s 1 mL Paulyho činidla II. K 0,5 mL roztoku tyrosinu přidáme 0,25 mL reakční směsi a zalkalizujeme 1,5 mol.L-1 uhličitanem sodným. Vznikají oranžově červené kopulační produkty. 4. Adamkiewiczova reakce. Do zkumavky s 0,5 mL roztoku tryptofanu přidáme 0,25 mL kyseliny octové obsahující kyselinu glyoxylovou. Velmi opatrně v nakloněné zkumavce podvrstvíme 0,5 mL koncentrované kyseliny sírové. Po chvíli se na rozhraní obou kapalin objeví červenofialový prstenec. 5. Ninhydrinová reakce. K roztoku 0,5 mL aminokyseliny přidáme 0,3 mL roztoku ninhydrinu a povaříme. Vzniká tmavě modré zbarvení. Prolin poskytuje žluté zbarvení. 6. Důkaz síry v aminokyselinách. Do zkumavky nalijeme 0,25 mL 0,5% octanu olovnatého a 0,25 mL 10% hydroxidu sodného. Nejdříve se vytvoří jemná bílá sraženina (netřepat), kterou rozpustíme dalším přídavkem hydroxidu. Poté přidáme 0,5 mL cysteinu a směs opatrně povaříme. Přítomnost síry se projeví mírným zašednutím roztoku.

15

Důkaz peptidové vazby. Biuretová reakce. Reakci provedeme nejprve pro srovnání s biuretem získaným tavením močoviny. Do suché zkumavky dáme několik krystalků močoviny a zahříváme na slabém plameni, až močovina roztaje a rozkládá se za uvolnění amoniaku. Poté přerušíme zahřívání a necháme močovinu ztuhnout. Ke vzniklému biuretu přidáme asi 0,5 mL 10% NaOH, zamícháme a přikápneme několik kapek 1% roztoku CuSO4. Po protřepání se objeví charakteristické fialkové zbarvení vzniklého komplexu. Stejné zbarvení poskytují aminokyseliny histidin a asparagin, ale pouze v pevném stavu. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Do tabulky přehledně uvedeme výsledky provedených chemických reakcí. 2. Identifikujeme složení aminokyselin v neznámém vzorku. 1.2. DĚLENÍ SMĚSI AMINOKYSELIN CHOMATOGRAFICKÝMI METODAMI TEORETICKÝ ÚVOD Klasickou úlohou biochemie je dělení směsi látek. Směs aminokyselin můžeme získat např. úplnou hydrolýzou proteinů. Hydrolýza se provádí v kyselém prostředí, kde dochází obvykle k destrukci tryptofanu (Trp) a z velké části serinu (Ser) a threoninu (Thr), které nelze stanovit kvantitativně. Amidy asparagin (Asn) a glutamin (Gln) se hydrolyzují na příslušné aminodikarboxylové aminokyseliny (asparagová a glutamová). V tomto případě se uvádí po rozdělení směsi např. Asx, což reprezentuje jak původní kys. asparagovou, tak asparagin. Cystein se oxiduje na cystin. Hydrolýza v alkalickém prostředí vede k destrukci všech aminokyselin kromě tryptofanu (Trp). Šetrná je enzymová hydrolýza při použití proteas jako např. subtilisinu (EC 3.4.21.14), papainu (EC 3.4.22.2). Téměř ve všech případech je nutným dalším krokem dělení směsi aminokyselin. Nejvhodnějšími metodami pro dělení směsi aminokyselin jsou různé typy chromatografie. Hlavní rozdíly mezi aminokyselinami jsou v náboji a polaritě. Tyto diference lze využít při papírové, tenkovrstvé, iontoměničové, plynové chromatografii a vysokotlaké kapalinové chromatografii (HPLC). Pro použití ve studentské laboratoři se jako optimální jeví chromatografie na iontoměniči s následnou identifikací aminokyselin adsorbční chromatografií na tenké vrstvě silikagelu. Principem dělení směsi aminokyselin při iontoměničové chromatografii je rozdíl v náboji jednotlivých aminokyselin. Iontoměniče jsou syntetické pryskyřice, které mají bazické (anexy) nebo kyselé (katexy) funkční skupiny. Na dělení aminokyselin se používají katexy obsahující sulfoskupiny -SO3H.

Obrázek 2 ilustruje dělení směsi aminokyselin na katexovém iontoměniči. Prezentováno je sedmnáct aminokyselin, v pořadí jak jsou příslušnými pufry eluovány z kolony. Proč ne dvacet? Směs aminokyselin na chromatogramu je výsledkem hydrolýzy typického proteinu. Za těchto podmínek se tryptofan (Trp) rozkládá a amidové vedlejší řetězce asparaginu (Asn) a glutaminu (Gln) jsou hydrolyzovány na volné karboxyly. Dalším produktem je na chromatogramu patrný amoniak. Částečně jsou rozloženy i serin (Ser) a threonin (Thr), a proto nemohou být po kyselé hydrolýze kvantifikovány. Pro rychlé určení interakce iontů s iontoměničem slouží jako pomůcka celkový náboj iontu. Pro jeho výpočet platí:

pH-pIp =∆ kde pI je izoelektrický bod (např. aminokyseliny) a pH je pH použitého pufru. Když je ∆p pozitivní, aminokyselina nese kladný náboj. Aminokyselina s vyšším ∆p je vázána ke katexu silněji než s nižším. Když je ∆p negativní, nese aminokyselina negativní náboj. Čím je ∆p negativnější, tím více je aminokyselina od katexu odpuzována.

16

Jako příklad si uvedeme oddělení kyselin asparagové a glutamové. Obě aminokyseliny mají při pH 3,25 přibližně stejný celkový náboj. Izoelektrický bod (pI) kys. asparagové je 2,98 a kyseliny glutamové 3,22. To znamená, že při pH 3,25 má kyselina asparagová efektivní náboj -0,27 a kyselina glutamová -0,03. Obě aminokyseliny nesou záporný náboj. Kyselina asparagová je však daleko efektivněji odpuzována iontoměničem, než kyselina glutamová. Obecně se dá říci, že aminokyseliny jsou z kolony eluovány v pořadí od polárnějších k nepolárním a od nesoucích negativní náboj k těm, které mají náboj pozitivní. Jak je patrno z obrázku 3, aminokyseliny jsou eluovány změnou pH pufru (od kyselých 3,25 po téměř neutrální pH 6). V případě pufru o pH 6 je iontová interakce mezi aminokyselinami a katexem přerušená přidáním soli do pufru (v tomto případě 0,8 mol.L-1 NaCl). Vysoká koncentrace Na+, na rozdíl od nízké koncentrace aminokyselin s pozitivním nábojem, je vytěsní z vazby na iontoměnič. Aminokyseliny v eluátu jsou bezbarvé. K jejich zviditelnění, případně stanovení, se využívá reakce s ninhydrinem. Identifikovat jednotlivé aminokyseliny lze použitím standardů aminokyselin, které se nanesou na kolonu a určí se objem pufru nutný k eluci (eluční objem) každé z nich. Poté porovnáme eluční objemy standardů a směsi. V našem experimentu použijeme ke zjištění přítomnosti aminokyselin v eluátech kapkové reakce s ninhydrinem a k jejich případné identifikaci papírové chromatografie. Obr. 2 Dělení směsi aminokyselin na katexovém iontoměniči.

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: standardy aminokyselin - 2% roztoky (w/v) v 50 mmol.L-1 citrátovém pufru pH 3, směs aminokyselin v 50 mmol.L-1 citrátovém pufru pH 3 (neznámý vzorek), 50 mmol.L-1 citrátové pufry pH 3 a 6, 50 mmol.L-1 Tris/HCl pufr pH 9 (Tris = Tris(hydroxymetyl)aminometan), Dowex 50 v 50 mmol.L-1 citrátovém pufru pH 3 (v množství k naplnění kolonky), mobilní fáze ethanol-voda (7 : 3). Materiál: skleněná kolona s uzávěrem (25 cm), rozprašovač aerosolu, Silufol, chromatografický papír Whatman 3MM (3 x 10 cm), malá nálevka (do kolony), chromatografická nádoba se sklem na překrytí (22 x 22 cm), pipety, špičky na nanášení vzorků, zkumavky, elektrický fén, pravítko, tužka. Přístroje: sušárna.

17

1.2.1. DĚLENÍ SMĚSI AMINOKYSELIN NA IONTOMĚNIČI PRACOVNÍ POSTUP 1. Příprava kolony. Malou kolonku (20 - 25 cm) upevněnou vertikálně ve stojanu a dole uzavřenou kohoutem naplníme 15 - 20 mL katexu DOWEX 50 v 50 mmol.L-1 citrátovém pufru pH 3. Až se katex usadí, pomalu otevřením kohoutu vypustíme nadbytečný pufr přesně po hladinu katexu. Nikdy nenechávejte sloupec katexu úplně vyschnout! Obr. 3 Schéma rozdělení směsi aminokyselin na iontoměniči Dowex 50. 2. Nanesení vzorku a sbírání frakcí • Připravíme si 30 zkumavek, na jejichž stěně fixem označíme obsah 1 mL (odměřením 1 mL

vody). • Pomocí dávkovače opatrně aplikujeme na povrch katexu vzorek 0,5 mL směsi aminokyselin.

Otevřením kohoutu zachytíme první frakci. Jakmile se vzorek vsákne do katexu, zavřeme kohout a přidáme na kolonu 1 mL 50 mmol.L-1 citrátového pufru pH 3. Pootevřením kohoutu necháme vsáknout a jímáme další 1 mL frakci. Zavřeme kohout a přidáme 10 mL pufru, otevřeme kohout a jímáme další 1 mL frakce.

• Abychom zjistili, ve kterých zkumavkách jsou aminokyseliny, odebereme z každé zkumavky dvě kapky vzorku a necháme je vsáknout do filtračního papíru (3 x 10 cm), kde máme čísly označené body jako frakce. Skvrny necháme na vzduchu vyschnout a poté v digestoři postříkáme aerosolem ninhydrinového činidla a dáme do v digestoři umístěné sušárny zahřát 10 minut na 110 oC. Frakce obsahující aminokyselinu se zbarví červeně. V této fázi jsou z neznámé směsi odděleny kyselé aminokyseliny.

směs neznámých aminokyselin

Dowex

eluce citrátem, pH 3,0

frakce 1 - 10kyselé aminokyseliny

identifikace na Silufolu

eluce citrátem pH 6,0

frakce 11 - 20neutrální aminokyseliny

identifikace na Silufolueluce Trisem, pH 9,0

frakce 21 - 30bazické aminokyseliny

identifikace na Silufolu

Schéma rozd ělení sm ěsi aminokyselin na iontom ěniči Dowex 50

18

• Pokud už nejsou ve zkumavkách číslo 11 a dalších aminokyseliny, uzavřeme kohout a přidáme na kolonu 10 mL 50 mmol.L-1 citrátového pufru pH 6. Pokračujeme v jímání frakcí. V této fázi by měly být odděleny neutrální aminokyseliny.

• Poté přidáme 10 ml 50 mmol.L-1 Tris/HCl pufru pH 9 a jímáme další frakce, které obsahují bazické aminokyseliny.

1.2.2. DĚLENÍ SMĚSI AMINOKYSELIN CHROMATOGRAFIÍ NA TENKÉ VRSTVĚ SILIKAGELU

PRACOVNÍ POSTUP • Chromatografii na silikagelu uskutečníme v provedení na tenké vrstvě na hliníkové folii zvané

Silufol (5 x 15 cm). Jedná se o chromatografii adsorpční. • Na Silufolu vyznačíme jemně slabou čáru tužkou 2,5 cm od okraje (start). Výběr aplikovaných

vzorků učiníme na základě konzultace s vedoucím cvičení. • Vzorky nanášíme jemnou kapilárou (každý 3-4 na stejné místo, skvrnu vždy před dalším

nanesením vysušíme pomocí fénu). Skvrny vzorků nesmí být v průměru větší než 3 - 5 mm. • Folii vložíme do chromatografické komůrky s rozdělovací směsí (mobilní fáze) tak, aby mobilní

fáze vstupovala na fólii u startu. Čelo mobilní fáze se asi po 45 minutách dostane 2 cm od konce folie.

• Poté fólii vyjmeme, vysušíme na vzduchu nebo opatrně fénem, postříkáme aerosolem ninhydrinového činidla a zahřejeme v sušárně 10 minut na 110 oC (vše v digestoři).

VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Do tabulky zapíšeme hodnoty Rf standardních aminokyselin. U každé z nich změříme délku

dráhy skvrny od startu a pro všechny délku dráhy mobilní fáze (start - čelo). Hodnota Rf je bezrozměrný podíl dráhy skvrny k dráze mobilní fáze.

2. Vypočteme hodnoty Rf neznámých aminokyselin ze směsi. 3. Porovnáme a zaznamenáme barvu skvrn. 4. U aminokyselin, pro které existují specifické chemické reakce, potvrdíme jejich identitu. KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Napište iontové formy lysinu, které mohou existovat ve vodném roztoku při pH 2, 5, a 11. 2. Jaké bude relativní pořadí hodnot Rf aminokyselin směsi: Ser, Lys, Leu, Val, a Ala? Podmínky

dělení budou stejné jako u experimentu s dělením směsi aminokyselin na Silufolu. 3. Vypočtěte celkový náboj každé z aminokyselin při daném pH: Ala pH 3, Asp pH 4, Lys pH 8,

Ser pH 6, His pH 9. 4. Jaké bude pořadí eluce směsi aminokyselin z kolony katexu za stejných podmínek jako

v experimentu: Glu, Ala, Ser, Pro a Arg? LITERATURA Berg J.M., Tymoczko J.L. a Stryer L. (2002) Biochemistry (5. vydání), W.H. Freeman (New York). Macholán L., Skurský L. a Zbořil P. (1980) Skripta Laboratorní cvičení z biochemie I, vydavatelství UJEP (Brno). Zbořil P., Macholán L., Dadák V., Skurský L. a Kovář J. (1978) Skripta Pokročilá cvičení z biochemie, vydavatelství UJEP (Brno). Stryer L. (1981) Biochemistry, 2. vydání, W. H. Freeman and Company (New York).

19

2. PROTEINY

2.1. STANOVENÍ CELKOVÝCH PROTEINŮ

TEORETICKÝ ÚVOD Pro kvantifikaci celkových proteinů existuje celá řada metod (Tab. 1). Základním

problémem je výběr nejvhodnější metody pro daný případ. Vhodnou strategií je kombinovat dvě metody založené na různých chemických principech, jako např. měření absorbance při 280 nm a tvorbu měďnatých komplexů. Metody stanovení celkových proteinů můžeme rozdělit do pěti skupin: 1. Metody založené na interakci proteinů s ionty mědi

a) Biuretová metoda, b) Hartree – Lowryho metoda, c) Bicinchoninová metoda.

2. Ninhydrinová metoda po kyselé hydrolýze proteinů. 3. Stanovení z UV spektra. 4. Metoda Bradfordové s vazbou barviva Coomassie modř na proteiny. 5. Stanovení celkových proteinů ze sušiny. Biuretová metoda Metoda je založena na chelataci měďnatého iontu imidovými strukturami polypeptidu ionizovanými v silně alkalickém prostředí za vzniku červeno-fialového komplexu. Je pojmenována podle sloučeniny biuretu, vznikajícího tavením močoviny za odštěpení amoniaku, která je modelem dvou peptidových vazeb a vytváří za těchto podmínek barevný komplex s mědí. Se stanovením interferuje glukosa a jiné měď redukující látky jako např. proteiny bohaté na sulfhydrylové skupiny (keratin). Taktéž interferují vysoké koncentrace amonných solí a některé fosfáty užívané při purifikaci proteinů. Biuretová metoda je vhodná pro vzorky obsahující protein v koncentraci 1 až 10 mg.mL-1, které se ředí zhruba 5 x přidáním činidla na konečnou koncentraci proteinu 0,2 až 2 mg.mL-1. Většina proteinů poskytuje tmavě červené zbarvení s maximem absorbance při 550 nm. Hartree – Lowryho metoda Původní Lowryho metoda z roku 1951 patří k nejcitovanějším pracem v biochemii. Stanovení je kolorimetrické, založené na dvousložkovém činidle. První složkou je biuretové činidlo (viz biuretová metoda), druhou složkou je Folin-Ciocalteau (čti Folin-Čikoltovo činidlo) na fenoly. Jsou to polykyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové, které se redukují tyrosinovými zbytky proteinů a barví se modře. Metoda byla mnohokrát upravena. Prezentované stanovení je modifikace, kterou vypracoval Hartree v roce 1972. Verze využívá tři činidla, z nichž první dvě jsou pro biuretové stanovení, namísto původních pěti. Dochází k tvorbě daleko intenzivnějšího zbarvení (zvýšená citlivost) a stanovení je lineární v širším rozsahu koncentrací. Konečně, činidla jsou stabilnější a metoda méně pracná. Bicinchoninová metoda (BCA metoda) Metoda využívá kyseliny bicinchoninové (BCA) ke spektrofotometrickému stanovení celkových proteinů založeném na alkalické redukci měďnatého iontu na měďný proteinem a následné chelataci měďného iontu kyselinou bicinchoninovou za vzniku červeného zbarvení. silná báze BCA činidlo

Protein + Cu2+ → Cu+ → BCA Cu+ komplex

20

Bicinchoninová metoda je variabilní. Její citlivost je závislá na době a teplotě inkubace, na charakteru proteinu použitého k standardizaci atd. Některé skupiny látek jako např. redukující sacharidy a amonné ionty interferují velmi silně. Pokud jsou však odstraněny (např. dialýzou), je metoda srovnatelná s metodou Lowryho. Ninhydrinová metoda po kyselé hydrolýze proteinů Při tomto stanovení jsou proteiny hydrolyzovány na aminokyseliny 6% kyselinou sírovou při 100 °C. Hydrolyzáty jsou neutralizovány a aminokyseliny kvantifikovány derivatizací ninhydrinem a měřením absorbance při 570 nm. Při stanovení neinterferují fenoly a podobné sloučeniny jako při stanovení Folinovým činidlem. Jednotlivé aminokyseliny při reakci s ninhydrinem neposkytují stejný ”barevný výtěžek”. Většina proteinů, kromě těch, které mají neobvyklé složení, jako je např. vysoký obsah hydroxyprolinu a prolinu (kolageny), vysoký obsah síry (cystein; např. alkoholdehydrogenasa, thionein), nebo hustě glykosylované proteiny (např. invertasa a glykoforin) poskytuje uspokojivé výsledky při použití leucinu jako kalibračního standardu. Amonné ionty se ninhydrinem silně barví, přibližně stejně jako leucin. Pokud se před hydrolýzou proteiny vysráží kyselinou trichloroctovou, amonné ionty zůstanou v supernatantu. Metoda je časově náročná. Osvědčuje se při stanovení proteinů v pevném a suchém materiálu, který lze získat z rostlin. Výhodou je také to, že při stanovení neinterferují báze nukleových kyselin. Stanovení z UV spektra Proteiny, obsahující vedlejší řetězce tyrosinu a tryptofanu, absorbují světlo v UV oblasti spektra při 275 až 280 nm. Při vhodném naředění proteinového vzorku je možné takto stanovit celkové proteiny z UV absorbance za použití kyvet z křemenného skla. Fenylalanin absorbuje slabě a jeho absorbanci je možné v řadě případů zanedbat. Absorpční koeficient vztažený na hmotnost proteinu A1% (koncentrace suchého proteinu v gramech na objem 100 mL nebo hmotnost/objem. procento) se pohybuje mezi 3 - 30 A280 jednotek 100 mL.g-1.cm-1 u většiny proteinů. Pokud je známa molekulová hmotnost proteinu, molární absorpční koeficient ελ L.mol-1.cm-1, potom existuje rovnice, která upravuje vztah k hodnotě A1% při stejné vlnové délce.

10 x ελ = Aλ

1% x molekulová hmotnost

Molární absorpční koeficient může být vypočten z aminokyselinového složení založeném na tyrosinovém a tryptofanovém příspěvku molekuly proteinu. Hodnoty ε275-280 tyrosinu (v neutrálním nebo kyselém roztoku) a tryptofanu jsou 1470 respektive 5700 L.mol-1.cm-1. Například 0,04% až 0,12% roztok proteinu obsahuje 4 až 12 tyrosinů, 2 až 6 tryptofanů a při ε280 ~ 8, by A280 = 0,2 - 1 v 1-cm kyvetě. Metoda je v tomto případě dostatečně citlivá pro stanovení čistých proteinů nebo jejich směsí v koncentračním rozsahu 0,1 - 1 mg.mL-1.

Existuje řada dalších metod spojených s měřením v UV oblasti spektra, jako je absorpce při 205 nm a 224 až 236 nm. Zvláště stanovení spojené s měřením při 205 nm je atraktivní, ale provedeno pouze s čistými proteiny a za vyloučení kyslíku z reakční směsi. Navíc v této oblasti absorbuje velká spousta dalších látek, jako např. některé kofaktory.

Proteiny, které vykazují absorpční maximum při 280 nm, se často nacházejí ve směsích s nukleovými kyselinami, které absorbují při stejné vlnové délce. Poměr absorbancí 280/260 nm se používá k eliminaci nukleových kyselin. Proteiny také absorbují při kratších vlnových délkách pod 240 nm, což je způsobeno přítomností Trp, Tyr, Phe, His, Met, Cys a peptidových vazeb. Při kratších vlnových délkách je absorbance různých proteinů méně závislá na aminokyselinovém složení a je podstatně vyšší. Absorbance při 205 nm je z větší části způsobena peptidovými vazbami.

21

Metoda Bradfordové s vazbou barviva Coomassie modř na proteiny Coomassie barvivo (Brilliant blue G250) se váže na proteinové molekuly v kyselém pH dvěma způsoby. Trifenylmethanová skupina se váže na nepolární části proteinu a anion sulfoskupiny se váže na vedlejší řetězce aminokyselin nesoucí kladný náboj (např. arginin a lysin). Po vazbě barviva na proteiny dochází k barevné změně, která je úměrná množství proteinu. Reakce je velmi citlivá u albuminu a řady globulárních proteinů. Stanovení je rušeno řadou interferujících látek, které jsou známy (Tab. 2). Metoda je díky své jednoduchosti a citlivosti široce používána. Jako kalibrační protein se používá hovězí sérový abumin (BSA). Metoda je zhruba třikrát až čtyřikrát citlivější než Hartree-Lowryho a BCA metoda. Stanovení celkových proteinů ze sušiny Sušením proteinů v sušárně do konstantní váhy při 104 °C až 106 °C po dobu několika hodin se odstraní voda a těkavé látky. Poté se vzorek zváží na vahách. Takto zjistíme hmotnost proteinu a přidružených netěkavých látek jako jsou např. soli. Tabulka 1 Souhrn stanovení celkových proteinů.

Stanovení Vzorek Detekční limit (g.L-1) Biuretová metoda 1 mL 1 – 10 Hartree – Lowry metoda 1 mL 0,1 – 0,6 Bicinchoninová metoda 100 µL 0,2 – 1,0 Ninhydrin po hydrolýze 1 mL 0,02 – 0,05 UV absorpce 1 mL 0,03 – 0,3 Bradfordové metoda 100 – 200 µL 0,06 – 0,3 Sušina 0,5 – 10 mL 2 – 10

Tabulka 2 Interferující látky při stanoveních celkových proteinů.

Stanovení Interferující látky Biuretová metoda Síran amonný, glukosa, sulfhydrylové sloučeniny,

fosforečnan sodný Hartree – Lowry EDTA, guanidin.HCl, Triton X-100, SDS, > 0,1 mol.L-1

Tris, síran amonný, 1 mol.L-1 octan sodný, 1 mol.L-1 fosforečnan sodný

Bicinchoninová kyselina EDTA, > 10 mmol.L-1 sacharosa nebo glukosa, 1 mol.L-1 glycin, > 5% síran amonný, 2 mol.L-1 octan sodný, 1 mol.L-1 fosforečnan sodný

Ninhydrin po kyselé hydrolýze Síran amonný, aminosacharidy UV adsorpce Barviva, fenolové látky, organické kofaktory, > 0,5 %

Triton X - 100 Metoda Bradfordové > 0,5% Triton X–100, > 0,1% SDS, deoxycholan sodný Sušina Soli všech pufrů

Vysvětlivky: EDTA - ethylendiamintetraoctová kyselina, Triton X-100 - polyoxyethylenový detergent s alkylfenylovými skupinami, SDS - sodiumdodecylsulfát (dodecylsíran sodný), Tris - Tris (hydroxymethyl) aminomethan, pufr.

22

Časová náročnost metod stanovení celkových proteinů K realizaci biuretové, Hartree-Lowryho a BCA metody je třeba jedna hodina. Metoda ninhydrinová spojená s kyselou hydrolýzou vyžaduje první den jednu hodinu, poté hydrolýzu přes noc a druhý den jednu až dvě hodiny na vlastní měření. Metoda měření v UV oblasti spotřebuje jen 30 minut. Metoda Bradfordové 20 až 30 minut. Metoda vedoucí k sušině proteinu spotřebuje na odpaření vody 4 hodiny až přes noc a následně 10 až 20 min na vážení. MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: hovězí sérový albumin (BSA), 0,8 mol.L-1 NaOH, Biuretové činidlo 1,5 g CuSO4.5H2O (6 mmol.L-1 konečná koncentrace), 6 g vinan sodno-draselný tetrahydrát - C4H4KNaO6.4H2O (21 mmol.L-1 konečná koncentrace), 300 mL 10% (w/v) NaOH (0,75 mol.L-1 konečná koncentrace), převařená destilovaná voda do 1 litru. Lowryho činidlo CTC roztok: 0,1% CuSO4.5H2O, 0,2% vinan draselný, 10% Na2CO3 (uhličitan se rozpustí v jedné polovině konečného objemu a přidá se pomalu k druhé polovině konečného objemu obsahujícího roztok vinanu draselného a síranu měďnatého). Folin-Ciocalteuovo činidlo: 100 g wolframanu sodného Na2WO4.2H2O a 25 g molybdenanu sodného Na2MoO4.2H2O se smísí v 1,5 L baňce se 700 mL vody, přidá se 50 mL 85% kyseliny fosforečné a 100 mL konc. HCl, roztok se přivede k varu pod zpětným chladičem a vaří se 10 hod, ke konci doby varu se přidá 150 g síranu lithného, 50 mL vody a několik kapek bromu, směs se poté vaří v digestoři bez chladiče 15 min, po ochlazení se doplní do 1 L a zfiltruje. Roztok A: směs 1 dílu CTC roztoku se 2 díly vody a 1 dílem 0,8 mol.L-1 NaOH. Roztok B: směs 1 dílu Folin-Ciocalteuova činidla s 5 díly vody. BCA činidlo Roztok A: 1 g 4,4'-dikarboxy-2,2'-bichinolin, dvojsodná sůl (Na2BCA, 26 mmol.L-1 konečná koncentrace), 2 g Na2CO3.H2O (0,16 mol.L-1 konečná koncentrace), 160 mg vinan sodný (7 mmol.L-1 konečná koncentrace), 0,4 g NaOH (0,1 mol.L-1 konečná koncentrace), 0,95 g NaHCO3 (0,11 mol.L-1 konečná koncentrace), 100 mL H2O (pouze dvojsodná sůl kyseliny bicinchoninové Na2BCA je rozpustná v neutrálním pH; volná kyselina není dostatečně rozpustná, dokonce ani v alkalickém roztoku). Roztok B: 4 g CuSO4.5H2O (16 mmol.L-1 konečná koncentrace), 100 mL H2O. BCA činidlo (roztok A + roztok B): smícháme 50 objemů roztoku A s 1 objemem roztoku B. Připravíme pouze nutné množství na několik dní, protože směs není stálá, BCA činidlo má lehce nazelenalou barvu, po smíchání a rozpuštění složek upravíme pH na 11,3 přídavkem pevného NaOH pro zvýšení pH, nebo NaHCO3 ke snížení pH. Činidlo Bradfordové 100 mg Coomassie Brilliant Blue G250 (0,01% w/v), 50 mL 95% ethanolu (5% konečná koncentrace), 100 mL 85% kyseliny fosforečné, doplnit do 1 L vodou. Materiál: skleněné a křemenné kyvety do spektrofotometru (1 cm), stojan se zkumavkami, pipety, střička s destilovanou vodou, kádinky, špachtle. Přístroje: spektrofotometr, váhy. PRACOVNÍ POSTUP 1. Biuretová metoda • Připravíme řadu alespoň pěti kalibračních standardů při použití hovězího sérového albuminu

(BSA). Konečné koncentrace albuminu v rozmezí 0,4 – 2,5 mg.mL-1 poskytují při 550 nm absorbance v rozsahu 0,1 – 0,7 v 1 cm kyvetách.

• Do zkumavek přidáme k 1 mL BSA standardu 4 mL biuretového činidla a inkubujeme 20 min při laboratorní teplotě. Totéž s neznámým vzorkem.

23

• Pro referenční vzorek (blank) obsahující pouze 1 mL vody a 4 mL biuretového činidla nastavíme nulovou absorbanci a poté změříme absorbance standardů a vzorku při vlnové délce 550 nm.

2. Bicinchoninová metoda • Připravíme sérii kalibračních standardů od 0,2 do 1,0 mg.L-1 v pufru nebo roztoku použitém

k přípravě vzorku. • Ve zkumavkách smícháme 200 µL kalibračního standardu, pufru nebo vzorku se 4 mL BCA

činidla. • Inkubujeme standardy a vzorek 30 min při 37 °C, poté ochladíme na laboratorní teplotu. • Změříme absorbance vzorku, kalibračních standardů a referenčního vzorku při 562 nm (A562). 3. Hartree – Lowryho metoda • Připravíme si 100 mL standardního roztoku proteinu o koncentraci 100 µg.mL-1 (10 mg proteinu

rozpustíme ve 100 mL H2O). • Pomocí standardního roztoku proteinu si připravíme sadu 10 zkumavek obsahujících 1 mL

roztoku proteinu o vzrůstající koncentraci proteinu 10 - 100 µg. Slepý vzorek obsahuje pouze 1 mL vody.

• Ke každé zkumavce přidáme 1 mL činidla A, zamícháme a necháme stát 10 minut. • Poté přidáme 0,5 mL činidla B a rychle promícháme. • Po 30 minutách měříme absorbanci při 750 nm. Zbarvení se vyvíjí 20 až 30 min a poté se ztrácí

rychlostí 1 % za hodinu při 20 oC. • Stejným způsobem změříme obsah proteinů v neznámém vzorku. 4. Metoda Bradfordové s vazbou barviva Coomassie modř na proteiny • Připravíme si standardní roztok proteinu o koncentraci 25 µg.mL-1 naředěním standardního

roztoku proteinu připraveného pro Hartree – Lowryho metodu. • Pomocí standardního roztoku proteinu si připravíme sadu zkumavek obsahujících 1 mL roztoku

proteinu o vzrůstající koncentraci proteinu 2,5 - 25 µg. Slepý vzorek obsahuje 1 mL vody. • Ke každé zkumavce přidáme 2 mL činidla Bradfordové, rychle promícháme. • Po 5 minutách měříme absorbanci při 595 nm. • Stejným způsobem změříme obsah proteinů v neznámém vzorku. 5. Stanovení proteinu měřením absorbance při 4 různých vlnových délkách • Změříme absorbance vzorku obsahujícího protein při vlnové délce 205, 235, 260 a 280 nm

(blank je destilovaná voda). Pozor, pro měření používáme křemennou kyvetu! • V případě naměřených vysokých hodnot absorbance vzorek zředíme. • Podle následujících vzorců vypočteme koncentraci proteinu:

c (mg.mL-1) = 1,45 A280 - 0,74 . A260 c (mg.mL-1) = (A235 - A280) / 2,51 c (µg.mL-1) = A205 . [27 + 120 . (A280 / A205)] Změřit celé UV absorpční spektrum, od 230 po 310 nm je velmi užitečné pro zjištění

interferujících sloučenin. Pokud měříme čisté proteiny v kyselém pH, mělo by spektrum mít konvexní oblast kolem 250 nm, výrazný pík při 275 až 280 nm a velmi nízkou absorpci kolem 310 nm, pokud proteiny neobsahují kofaktory nebo prosthetické skupiny (Obr. 1).

24

Obr. 1 Závislost hodnoty molárního absorpčního koeficientu (L.mol-1.cm-1) glycyl-L-tyrosinu v prostředí s různým pH na vlnové délce.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

230 240 250 260 270 280 290 300 310

Vlnová délka (nm)

mol

ární

abs

orpč

ní k

oefic

ient

pH - 4,6

pH - 9,7

pH - 13

VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Vynesením absorbancí kalibračních standardů proti koncentraci proteinu vytvoříme kalibrační

graf. 2. Interpolací určíme koncentraci proteinů ve vzorku. 3. Naměřené absorbance v UV oblasti použijeme pro výpočet koncentrace proteinu ve vzorku na

základě uvedených vzorců. 4. Porovnáme hodnoty koncentrace proteinů stanovené různými metodami. KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Stručně charakterizujte principy chemických metod stanovení proteinů. 2. Objasněte princip, výhody a nevýhody metody stanovení proteinů založené na interakci

s kyselinou bicinchoninovou. 3. Vyjmenujte rozdíly mezi původní metodou Lowryho a modifikací dle Hartreeho. 4. Proč je ninhydrinová metoda citlivější u hydrolyzátů proteinů než u samotných proteinů? 5. Srovnejte tyrosinový a tryptofanový příspěvek k absorpci proteinu při 280 nm u proteinu,

který obsahuje stejný počet obou aminokyselin. 6. Proč interferují při stanovení proteinů dle Bradfordové povrchově aktivní látky? LITERATURA Peterson G.L. (1983) Methods in Enzymology, 91, 95-119, Academia Press (New York).

25

2.2. ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU TEORETICKÝ ÚVOD

Elektroforéza, neboli migrace iontů v elektrickém poli, se velmi často používá pro analytické dělení biologických látek. Gelová elektroforéza patří mezi nejpraktičtější a nejvýkonnější metody používané pro dělení makromolekul. Používané nosiče by měly být stabilní a inertní, musí být vodivé a jejich struktura nesmí bránit putování iontů ve vodném prostředí. U běžně používaných gelů, jako je agarosa nebo polyakrylamid, je možné ovlivnit velikost jejich pórů. Separace molekul je založena jednak na elektroforetické pohyblivosti dělených látek, jednak na velikosti molekul. Při gelové elektroforéze se velké molekuly oproti malým relativně zpožďují (obtížněji pronikají gelem).

Běžně používaným nosičem je polyakrylamidový gel, který je inertní, mechanicky pevný, průhledný a skýtá možnost přípravy nosiče různých předem určených vlastností (hustota zesíťování gelu, gradient hustoty gelu aj.). Polyakrylamidový gel vzniká polymerací akrylamidu a N,N´-methylenbisakrylamidu (BIS), která je zahájena volnými radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného (APS) (S2O8

2- → 2 SO4-.) nebo při rozložení riboflavinu působením světla za

přítomnosti malého množství O2. Do směsi se vždy přidává stabilizátor volných radikálů TEMED (N, N, N´, N´-tetramethylethylendiamin).

CH2CH

O

NH2

CH2CH

NH

CH2

NH

CH

CH2

O O

polyakrylamid

akrylamid N,N´-methylenbisakrylamid

+

Fyzikální vlastnosti gelu a velikost porů jsou dány podílem polyakrylamidu v gelu a stupněm

zesíťování (lineární řetězce vznikají spojováním monomerů akrylamidu, příčné vazby mezi nimi jsou tvořeny BIS - stupeň zesíťování lze ovlivnit změnou poměru akrylamid/BIS). Nejčastější celkové koncentrace akrylamidu jsou 3 – 15 % (značí se % T), přičemž koncentrace N,N´-methylenbisakrylamidu obvykle odpovídá 5 % celkového množství akrylamidu (značí se % C).

T

baV

%

100)( ×+= C

bba

%

100)(

×=+

(a - hmotnost akrylamidu v g, b - hmotnost N,N´-methylenbisakrylamidu v g, V - objem v mL)

Uspořádání elektroforézy může být v trubičkách nebo v tenké vrstvě (mezi dvěma skleněnými deskami). Zásadní dělení technik elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE) není podle typu gelu či jeho tvaru, ale podle toho, zda je v kontinuálním nebo diskontinuálním systému. Diskontinuita může být jak v koncentracích gelu, tak především v pH a iontové síle.

Velmi ostré zóny získáme při diskontinuální elektroforéze, která používá dva různé gely a několik odlišných pufrů o různém pH. Dělící (separační, dolní) gel se překryje asi jednocentimetrovou vrstvou tzv. zaostřovacího (koncentračního, horního) gelu s velkými póry. Zaostřovací gel a vzorkovací pufr obsahují Tris-chloridový pufr, jehož pH (6,8) je asi o dvě jednotky nižší než má pufr dělícího gelu (9,2). Elektrodový roztok obsahuje Tris-glycinátový pufr pH 8,3. V prostředí zaostřovacího gelu je nejpohyblivějším aniontem chloridový, pohyblivost komponent vzorku (bílkovin) je menší. Za zónou chloridů následují zóny bílkovin seřazené podle elektroforetických pohyblivostí. Poslední zónu tvoří glycin. Hodnota intenzity proudu je nastavena na určitou konstantní velikost. Seřazené zóny se pohybují stejnou rychlostí, dochází k vzniku ostře ohraničených za sebou těsně následujících zón iontů (uvedený princip je základem elektromigrační metody - izotachoforézy). Vzhledem k tomu, že rychlost pohybujících se zón je konstantní, vytváří se stupňovitý gradient potenciálu. Projevuje se tzv. „samozaostřující efekt“.

26

Zpozdí-li se některý ion za „svou“ zónou, tj. zónou odpovídající příslušné pohyblivosti, octne se v prostředí s větší hodnotou potenciálu, který ho okamžitě urychlí tak, aby „dohnal“ svou zónu (a naopak). Po vstupu seřazených iontů do dělícího gelu, který má vyšší hodnotu pH, se glycin stává druhým nejpohyblivějším iontem po chloridových iontech a současně v důsledku různé pohyblivosti v gelové matrici dochází k rozdělení zón od sebe (dělení podle náboje a velikosti molekul). Pohyb čela se indikuje přidáním nízkomolekulárního barviva (bromfenolové modři) ke vzorku, které vytváří ostrý pruh putující s čelem.

Častou variantou PAGE je elektroforéza v přítomnosti dodecylsíranu sodného (SDS), který se váže na bílkoviny v poměru přibližně 1,4 g SDS na gram bílkoviny a udílí jim uniformní náboj. Přesná povaha vzniklých asociátů není známá, předpokládá se micelární struktura, uvnitř které dochází k nekovalentním interakcím mezi uhlovodíkovými řetězci dodecylsulfátu a hydrofobními oblastmi bílkoviny. Nabité skupiny na povrchu micely jsou pak v kontaktu s pufrem. Celkový náboj částice je přitom záporný. Aby tyto komplexy mohly vzniknout, je nutné rozštěpit disulfidové můstky mezi řetězci bílkovin, nebo uvnitř těchto řetězců pomocí látek redukujících tyto můstky (př. merkaptoethanol, dithiothreitol). Některé bílkoviny je nutné ještě zahřát na 60 či 100 oC po několik minut, proto se tento krok provádí ve všech případech. Vzniklé asociáty mají uniformní náboj a tvar tyčinky o konstantním průměru a délce úměrné relativní molekulové hmotnosti (SDS musí být přítomen ve vzorku i v gelu). Z kalibračního grafu (závislost relativní vzdálenosti Rf na logaritmu relativní molekulové hmotnosti (log Mr) standardů) lze stanovit molekulovou hmotnost neznámého vzorku. Nevýhodou této metody je skutečnost, že nepodává informace o nativním stavu bílkoviny.

Elektroforetická separace probíhající v nedenaturujícím prostředí, kdy si proteiny zachovávají své přirozené vlastnosti (např. enzymatickou aktivitu, sérologické vlastnosti) a jsou děleny podle svého tvaru/velikosti a náboje se využívá při: 1. detekci enzymové aktivity, 2. stanovení isoenzymových spekter, 3. separaci biologicky aktivních molekul. Z důvodů zachování enzymatické aktivity je nutné při přípravě vzorku (extrakci) provádět všechny kroky při nízké teplotě, poměrně rychle, a případně používat látky blokující proteasy. Spektrum isoenzymů se mnohdy výrazně liší u rostlin v různých ontogenetických fázích, v různých rostlinných orgánech, proto je zapotřebí rostliny pěstovat za definovaných a kontrolovatelných podmínek a vzorky odebírat z rostlin ve stejné vývojové fázi. Peroxidasy (POX, EC 1.11.1.7) jsou enzymy, které redukují peroxid vodíku (nebo i jiné peroxidy) za současné oxidace další sloučeniny. Mezi nejlepší substráty peroxidas lze řadit fenoly a aromatické aminy. Podle charakteru aktivního místa jsou POX děleny do tří skupin – nejpočetnější skupinou jsou hemové, dále vanadové a ostatní peroxidasy. Obsah sacharidů se u jednotlivých POX velmi liší. Relativní molekulová hmotnost je v rozmezí 42 000-158 000. O peroxidasách je známo, že se vyskytují ve velkém množství forem, např. křenová peroxidasa – 14 forem. Jsou-li tyto formy skutečnými izoenzymy, které jsou dány i geneticky podmíněnými rozdíly v primární sekvenci aminokyselin nebo se jedná o posttranslační modifikace není dosud známo. Peroxidasy byly nalezeny prakticky ve všech rostlinných pletivech. Mohou být přítomny buď volné (v cytoplazmě, vakuolách, mezibuněčném prostoru) nebo vázané (buněčná stěna, plazmatická membrána, organelové membrány). Vazba může být iontová, ale i kovalentní.

27

2.2.1. STANOVENÍ RELATIVNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI BÍLKOVIN METODOU DISKONTINUÁLNÍ ELEKTROFORÉZY V POLYAKRYLAMIDOVÉM

GELU (SDS-PAGE) MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: elektrodový pufr (0,025 mol.L-1 Tris, 0,192 mol.L-1 glycin, 0,1% (w/v) SDS, pH 8,3), akrylamid-N,N´-methylenbisakrylamid (30% (w/v) akrylamid, 0,8% bisakrylamid (w/v) ve vodě), pufr do zaostřovacího (horního) gelu (0,75 mol.L-1 Tris/HCl, pH 6,8), pufr do dělícího (spodního) gelu (2,25 mol.L-1 Tris/HCl, pH 9,2), SDS - zásobní roztok (10% (w/v) SDS ve vodě), persíran amonný (NH4)2S2O8, 10% (w/v persíran amonný ve vodě), vzorkovací pufr (1% (v/v) pufr pro zaostřovací gel, 5% (v/v) zásobní roztok bromfenolové modři, 10% (w/v) SDS, 5% (v/v) β-merkaptoethanol ve vodě), TEMED, standardy molekulové hmotnosti (upřesní vedoucí cvičení), fixační roztok (12,5% kys. trichloroctová), barvící roztok (0,1% (w/v) CBB R-250 v 15% (v/v) kys. octové a 45% (v/v) methanolu), odbarvovací roztok (40% (v/v) methanol, 10% (v/v) kys. octová), neznámý vzorek. Materiál: kádinka (4 x 50 mL, 1 x 600 mL), teflonová míchadla, vodní lázeň (hrnec), automatické pipety, Hamiltonova pipeta (50 µL), nalévací stojánek, elektroforetická komůrka, skla pro elektroforézu, mezerníky (spacery), hřebínek, šablona, střička s destilovanou vodou, střička s lihem. Přístroje: třepačka, zdroj pro elektroforézu, vařič, mikrocentrifuga. UPOZORNĚNÍ Akrylamid a N,N´- methylenbisakrylamid jsou neurotoxické látky. S jejich roztokem vždy pracujeme s největší opatrností a v gumových rukavicích. PRACOVNÍ POSTUP 1. Příprava skel

Obě skleněné desky (s a bez zářezu) důkladně odmastíme lihem. Připravíme skla k nalévání gelu (konkrétní postup vysvětlí vedoucí cvičení). Mezi skla vložíme hřebínek a na skleněnou desku popisovačem označíme vzdálenost jednoho cm od konce zubů hřebínku. Poté hřebínek odstraníme. 2. Příprava polyakrylamidového gelu

Přichystáme si dvě označené kádinky na přípravu zaostřovacího a dělícího gelu. Podle následující tabulky 1 napipetujeme jednotlivé roztoky (složky gelu) do příslušných kádinek. Tabulka 1 Objemy jsou uvedeny v mL.

Typ gelu AA/BIS (30%/0,8%)

Tris HCl 1,5 mo.L-1

pH 8,8

Tris HCl 0,5 mo.L-1

pH 6,8

H2O SDS TEMED startovat APS

dělící 12%

4 2,5 - 3,2 0,1 0,01 0,06

zaostřovací 4%

0,65 - 1,25 2,95 0,1 0,01 0,06

Přídavkem čerstvě připraveného roztoku persíranu amonného do kádinky, obsahující

komponenty pro dělící gel, je zahájena polymerace gelu. Připravenou směs po promíchání rychle přeneseme pomocí Pasteurovy pipety do prostoru mezi skla. V roztoku mezi skly se nesmí objevit vzduchové bubliny. Gel naléváme až po značku na skle (tj. 1 cm pod hřebínek). Gel převrstvíme n-butanolem. Po 15 minutách polymerace odstraníme n-butanol a povrch gelu opláchneme destilovanou vodou a vysušíme pomocí filtračního papíru.

28

Po nastartování polymerizace přídavkem roztoku persíranu amonného do kádinky, obsahující komponenty pro zaostřovací gel, přeneseme připravenou směs pomocí Pasteurovy pipety do prostoru mezi skla na již zpolymerovaný dělící gel. Do gelu vložíme opatrně hřebínek. Pod zuby hřebínku se nesmí dostat vzduchové bubliny. Stane-li se tak, hřebínek rychle vyjmeme a znovu vsuneme. Pozor, roztok se stává silně viskózní během několika minut. Po nalití necháme gel tuhnout 30 min. 3. Příprava vzorků

Ke 20 µL vzorku bílkoviny o neznámé molekulové hmotnosti (cca. 0,5 µg bílkoviny v 1 µL) přidáme 20 µL 10% SDS a 20 µL vzorkovacího pufru. Směs dobře promícháme a 5 min povaříme. Po ochlazení v ledové lázni vzorek centrifugujeme 5 min při 6 000 g. 4. Aplikace vzorků

Skla s připraveným gelem vložíme do elektroforetické komůrky (konkrétní postup vysvětlí vedoucí cvičení). Popisovačem vyznačíme zuby hřebínku. Hřebínek opatrně vyjmeme. Do elektroforetické komůrky nalijeme elektrodový pufr. Do jamek aplikujeme vzorky Hamiltonovou pipetou podle doporučení vedoucího cvičení. Krajní jamky (č. 1, 10), ve kterých dochází k deformaci zón, se nevyužívají. Před uzavřením aparatury odstraníme vzduchové bubliny na spodní hraně desek. 5. Vlastní elektroforetické dělení

Elektrodovou nádobu uzavřeme víkem a připojíme ke zdroji. Na zdroji nastavíme 100 V. Jakmile zóna bromfenolové modři doputuje na rozhraní zaostřovacího a dělícího gelu nastavíme zdroj na 200 V. Po doputování zóny bromfenolové modři (čelo dělících se látek) téměř na úroveň dolního okraje skla (cca 45 min) vypneme zdroj napětí. Odstraníme víko a odstraníme pufr. Pomocí plastové špachtle oddělíme od gelu skla a gel označíme odkrojením levého dolního rohu (nutné pro orientaci ve vzorcích při vyhodnocování gelu). Poté přeneseme gel do připravené nádoby obsahující cca 15 mL barvícího roztoku. Nádobu umístíme na třepačku. Po vybarvení gelu (cca 3h) barvící roztok vrátíme do zásobní láhve a gel po propláchnutí destilovanou vodou umístíme do odbarvovacího roztoku. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Změříme vzdálenost zón bílkovin od horního konce dělícího gelu (mobilita látky). 2. Sestrojíme graf lineární závislosti mobility proteinu (cm) na log Mr. Molekulové hmotnosti

použitého bílkovinného standardu dodá vedoucí cvičení. 3. Z grafu stanovíme molekulovou hmotnost neznámé bílkoviny. KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Vysvětlete na jakém principu dochází k zaostření vzorku v horním gelu při diskontinuální

elektroforéze. 2. Při SDS elektroforéze budou putovat rychleji velké nebo malé molekuly? LITERATURA Ferenčík M. a Škárka B. (1981) Biochemické laboratorné metódy, VTEL (Bratislava). Anzenbacher P. a Kovář J. (1986) Skripta Metody chemického výzkumu pro biochemiky, MŠ ČSR (Praha). Voet D a Voet J. G. (1995) Biochemie, Victoria Publishing (Praha). Westermeier R. (1993) Electrophoresis in Practice, VCH (Weinheim).

29

2.2.2. DISKONTINUÁLNÍ ELEKTROFORÉZA V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU ZA NATIVNÍCH PODMÍNEK

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: extrakční pufr (0,1 M Tris/HCl, pH 7), akrylamid-N,N´-methylenbisakrylamid (30 (w/v) akrylamid, 0,8% bisakrylamid (w/v) ve vodě), pufr do zaostřovacího gelu (0,5 M Tris/HCl, pH 6,8), pufr do dělícího gelu (1,5 M Tris/HCl, pH 8,8), N,N´-tetrametyléndiamin (TEMED), 10% (w/v) persíran amonný ((NH4)2S2O8 ) (připravovat vždy čerstvý), vodou nasycený n-butanol, elektrodový pufr (0,025 mol.L-1 Tris, 0,192 mol.L-1 glycin, pH 8,3), 60% roztok glycerol bromfenolová modř (příprava: 1 mg bromfenolové modři rozpustit v 5 ml vody, k 2 ml roztoku bromfenolové modři přidat 1 ml 60% glycerolu), barvící roztoky s pyrokatechinem a p-fenylendiaminem (příprava: k 10 mg pyrokatechinu a 25 mg p-fenylendiaminu přidáme 25 ml 50 mM Tris/HCl, pH 7, směs po rozpuštění přefiltrujeme a přidáme 100 µl 26% H2O2) Materiál: klíční rostliny hrachu (etiolovaný i zelený), kukuřice, pšenice, listy rajčete, libovolný rostlinný vzorek, kádinky, centrifugační kyvety, ledová lázeň, teflonová míchadla, automatické pipety, střička s destilovanou vodou, střička s lihem, Hamiltonova pipeta (50 µL), Přístroje: nalévací stojánek, elektroforetická komůrka, skla pro elektroforézu, mezerníky (spacery), hřebínek, třepačka, zdroj pro elektroforézu, chlazená centrifuga. UPOZORNĚNÍ Akrylamid a N,N´- methylenbisakrylamid jsou neurotoxické látky. S jejich roztokem vždy pracujeme s největší opatrností a v gumových rukavicích. PRACOVNÍ POSTUP 1. Příprava vzorků K 1 g rostlinného materiálu (př. semenáčky hrachu nebo obilovin, listy rajčete) přidáme do třecí misky 1 ml extrakčního pufru, špetku mořského písku a na ledové lázni rozetřeme. Obsah misky přeneseme do centrifugační zkumavky a 15 min centrifugujeme (12 000 ot/min). Supernatant přeneseme do čisté zkumavky a uložíme v ledové lázni. Vzorek pro elektroforézu si připravíme smícháním rostlinného extraktu s 60% glycerolem v poměru 3:1 (v:v). 2. Příprava skel Obě skleněné desky (s a bez zářezu) důkladně odmastíme lihem. Připravíme skla k nalévání gelu (konkrétní postup vysvětlí vedoucí cvičení). Mezi skla vložíme hřebínek a na skleněnou desku popisovačem označíme vzdálenost jednoho cm od konce zubů hřebínku. Poté hřebínek odstraníme. 3. Příprava polyakrylamidového gelu Přichystáme si dvě označené kádinky na přípravu zaostřovacího a dělícího gelu. Podle následující tabulky 1 napipetujeme jednotlivé roztoky (složky gelu) do příslušných kádinek. Tabulka 1: Složení separačního a zaostřovacího gelu. Objemy jsou uvedeny v ml.

Typ gelu AA/BIS 30%/0,8%

Tris HCl 1,5 M, pH 8,8

Tris HCl 0,5 M, pH 6,8

H2O TEMED start APS

8% dělící 2,6 2,5 - 4,6 0,01 0,15 4% zaostřovací 0,65 - 1,25 2,95 0,01 0,10

Přídavkem čerstvě připraveného roztoku persíranu amonného do kádinky, obsahující

komponenty pro dělící gel, je zahájena polymerace gelu. Připravenou směs po promíchání rychle přeneseme pomocí Pasteurovy pipety do prostoru mezi skla. V roztoku mezi skly se nesmí objevit

30

vzduchové bubliny. Gel naléváme až po značku na skle (tj. 1 cm pod hřebínek). Gel převrstvíme n-butanolem. Po cca 15 minutách polymerace odstraníme n-butanol a povrch gelu opláchneme destilovanou vodou a vysušíme pomocí filtračního papíru.

Po nastartování polymerizace zaostřovacího gelu přídavkem roztoku persíranu amonného, přeneseme připravenou směs pomocí Pasteurovy pipety do prostoru mezi skla na již zpolymerovaný dělící gel. Do gelu vložíme opatrně hřebínek. Pod zuby hřebínku se nesmí dostat vzduchové bubliny. Stane-li se tak, hřebínek rychle vyjmeme a znovu vsuneme. Pozor, roztok se stává silně viskózní během několika minut. Po nalití necháme gel tuhnout 30 min. 4. Aplikace vzorků

Skla s připraveným gelem vložíme do elektroforetické komůrky. Popisovačem vyznačíme zuby hřebínku. Hřebínek opatrně vyjmeme. Do elektroforetické komůrky nalijeme elektrodový pufr. Do jamek aplikujeme max. 25 µl vzorků. Krajní jamky, ve kterých dochází k deformaci zón, využijeme pro aplikaci směsi bromfenolové modři s glycerolem v poměru 3:1 (v:v) (důležitá pro monitorování průběhu elektroforézy). Před uzavřením aparatury odstraníme vzduchové bubliny na spodní hraně desek. 5. Vlastní elektroforetické dělení

Komůrku pro elektroforézu uzavřeme víkem a připojíme ke zdroji. Na zdroji nastavíme konstantní napětí 100 V. Jakmile zóna bromfenolové modři doputuje na rozhraní zaostřovacího a dělícího gelu nastavíme zdroj na konstantní napětí 180 V. Po doputování zóny bromfenolové modři (čelo dělících se látek) téměř na úroveň dolního okraje skla vypneme zdroj napětí. 6. Barvení gelu

Odstraníme víko a vylijeme do odpadu elektrodový pufr. Pomocí plastové špachtle oddělíme od gelu skla a gel označíme odkrojením levého dolního rohu (nutné pro orientaci ve vzorcích při vyhodnocování gelu). Poté přeneseme gel do připravené nádoby obsahující cca 15 ml 0,1 M Tris/HCl pH7. Po 5 min pufr odlijeme a přidáme barvící roztok. Po cca 15 – 30 min slijeme barvící směs a gel několikrát propláchneme destilovanou vodou. Dokumentaci izoenzymového zastoupení provedeme s využitím dostupného dokumentačního zařízení. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Izoenzymové zastoupení peroxidas ve vzorcích dokumentujeme fotografií opatřenou popisky vzorků. Uvedeme počet pozorovaných izoenzymů u studovaných rostlin a jejich mobilitu. LITERATURA 1. Kolektiv: Laboratorní cvičení z biochemie, ed. Kodíček M., Valentová O., Nakladatelství

Olomouc, 2000. 2. Pingoud A., Urbanke C., Hogget J., Jeltsch A.: Biochemical Methods, Wiley-VCH Verlag GmbH,

Weinheim, 2002. 3. Ferenčík M. a kolektiv: Biochemické laboratórne metódy, Alfa – VTEL, Bratislava 1981. 4. Chromá L., Macková M., Macek T., Martínek V., Stiborová M.: Rostlinné cytochromy P450 a

peroxidasy a jejich úloha při degradaci kontaminantů životního prostředí, Chem. Listy 95, 212-222, 2001.

31

2.3. CHEMICKÉ MODIFIKACE PROTEINŮ TEORETICKÝ ÚVOD Pro fyzikálně-chemické a biologické vlastnosti proteinů a pro jejich uspořádání v prostoru mají rozhodující roli postranní řetězce aminokyselin vázané na Cα. Přímé studium významu jednotlivých aminokyselinových zbytků pro biologickou aktivitu nebo fyzikálně-chemické vlastnosti je velmi obtížné a v řadě případů i nemožné. Proto se tento problém často řeší nepřímo, chemickou modifikací příslušného aminokyselinového zbytku. Tento přístup přináší velmi cenné poznatky o vztahu struktury a funkce proteinů, jmenovitě při řešení těchto otázek:

• studium topologie a architektury aktivních a vazebných míst enzymů a jiných proteinů • studium topologie membrán buněk a organel a podílu jednotlivých proteinů a jejich zbytků

na organizaci membrány • stanovení počtu některých aminokyselin v polypeptidových řetězcích a jejich sterické

dostupnosti • změna fyzikálně-chemických vlastností proteinů (např. náboje) • příprava hybridních molekul spojených kovalentní vazbou (využití síťovacích a bifunkčních

činidel) • příprava afinitních chromatografických nosičů • stabilizace proteinů a jejich vazebných a aktivních míst • sekvenční analýza proteinů a peptidů a jejich chemická syntéza

Cílem chemické modifikace je strukturní změna jednoho typu funkční skupiny, aniž by do reakce vstupovaly ostatní skupiny, při co nejšetrnějším zásahu do nativní konformace proteinu. Ve skutečnosti existuje pouze několik modifikačních činidel, která jsou výrazně specifická. I v jejich případě však nelze zcela vyloučit lokální změny konformace. Modifikační reakce rovněž neprobíhají stechiometricky, neboť i okolí jednoho typu zbytku může být výrazně odlišné co do polarity, sterické dostupnosti atd. Tuto zdánlivou nevýhodu lze velmi často úspěšně použít při studiu dostupnosti a okolí modifikovaného zbytku. Molekuly proteinů mají v prostoru definovaný tvar. Polypeptidový řetězec je určitým způsobem tvarován a zohýbán. Tyto ohyby nevznikají náhodně, nýbrž jsou důsledkem vazebných sil mezi různými úseky polypeptidového řetězce. Pokud jde jen o samotný řetězec, tj. atomy peptidové vazby, mluvíme o tzv. sekundární struktuře. Prostorovou polohu všech atomů (tedy také těch, které jsou v postranních řetězcích) označujeme jako strukturu terciární. V případě globulárních proteinů jsou však za definované ohyby zodpovědné právě funkční skupiny postranních řetězců. Výrazy sekundární a terciární struktura shrnujeme společným pojmem konformace řetězců. Na stabilizaci trojrozměrné struktury proteinů se podílí několik typů vazeb: kovalentní, iontové, vodíkové a hydrofobní vazby. Nejdůležitějším typem hlavních valencí mezi postranními řetězci aminokyselin je vazba disulfidová, nazývaná také disulfidový či cystinový můstek. Disulfidová vazba se tvoří oxidací dvou sulfhydrylových skupin cysteinu, vzniklý dimer cysteinu se pak nazývá cystin. Disulfidové můstky jsou nejvýznamnějším faktorem pro tvorbu a stabilizaci terciární struktury proteinů. Proteiny obsahující velký počet disulfidových vazeb jsou velmi odolné vůči tepelné denaturaci, kyselinám a zásadám, detergentům, odolávají i působení proteolytických enzymů. Disulfidové vazby mohou být štěpeny redukcí i oxidací. Redukčními činidly jsou 2-merkaptoethanol, dithiothreitol a jeho stereoizomer dithioerythritol. Oxidačním činidlem je např. jodičnan v kyselém prostředí. Tvorba i štěpení disulfidových vazeb v živém organismu jsou enzymově katalyzovány. Nejlépe prostudovaným enzymem je proteindisulfidreduktasa (EC 1.8.4.2), jejímž koenzymem je tripeptid glutathion. Chemické či enzymové štěpení disulfidových vazeb spolu s denaturací proteinu často předchází vlastní přípravě peptidových fragmentů pro aminokyselinovou sekvenční analýzu.

32

Štěpení specifických disulfidových vazeb rovněž poskytuje užitečné informace o vztazích mezi strukturou a funkcí proteinů. Počet disulfidových vazeb v molekule proteinu lze odhadnout na základě jeho reakce s tzv. Clelandovými činidly - dithiothreitolem (DTT) a dithioerythritolem (DTE). Vzniklá oxidovaná (tj. cyklická neboli dithianová) forma činidla se stanoví spektrofotometricky, neboť vykazuje absorpční maximum při 283 nm (ε283 = 273 L.mol-1.cm-1).

S S

OH

OH

C

CH2SH

CH2SH

C

HO

OHH

H+ +

Clelandovo činidlo (DTT) dithian

Protein

S S HS

Protein

SH

Stanovení počtu -SH a -NH2 skupin je založeno na chemické modifikaci uvedených funkčních skupin za vzniku barevných produktů, které lze díky jejich vysokému molárnímu absorpčnímu koeficientu stanovit s velkou citlivostí spektrofotometricky. Ellmanovo činidlo, tj. kyselina 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoová (DTNB), selektivně reaguje s volnými sulfhydrylovými skupinami. Intenzivně žlutě zbarvený redukční produkt (thionitrobenzoátový dianion), lze stanovit při 412 nm (ε412 = 13 600 L.mol-1.cm-1). Tato reakce je specifická i pro -SH skupiny proteinů.

O2N NO2S S

OOC COO--

-

--

+

+

Ellmanovo činidlo (DTNB)

modifikovaný protein thionitrobenzoátový dianion

pH > 7SHProtein

NO2

COO

SProtein S S NO2

COO

Pro stanovení volných aminoskupin se obdobně používá kyselina trinitrobenzensulfonová

(TNBS). Reakce TNBS s primárními aminoskupinami je silně závislá na pH, z důvodu reaktivity pouze neprotonované aminoskupiny, navíc ještě při pH 7,4 se TNBS váže i na -SH skupiny, vzniklý reakční produkt je však labilní v alkalickém prostředí. ε-N-trinitrofenyllysin a α-trinitrofenylaminokyseliny jsou spektrálně velmi podobné. Jejich absorpční spektrum sahá až ke 420 nm (maximum při 345 nm). Snadno dostupné -SH a -NH2 skupiny se stanoví přímo, „pohřbené“ (tj. skryté, hůře dostupné) po denaturaci bílkoviny tenzidem, například dodecylsulfátem sodným (SDS).

33

+Protein NH2 NO2

O2N

O2N

HO3SpH > 7

Protein NH NO2

O2N

O2N

+ SO3H H++-

činidlo TNBS

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: 10 mmol.L-1 DTNB v methanolu (99 mg DNTB v 25 mL), 0,5% TNBS (kyselina pikrylsulfonová, 2,4,6-trinitrobenzensulfonová) ve vodě (stabilní po dobu maximálně 14 dní), 0,2 mol.L-1 DTT nebo DTE, 0,1 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 8 obsahující 20 mmol.L-1 EDTA, 4% hydrogenuhličitan sodný, pH 8.5, 10% SDS v 0,1 mol.L-1 K-fosfátovém pufru pH 8, 1% SDS ve 4% hydrogenuhličitanu sodném, pH 8,5, 1 mmol.L-1 cystein (17,5 mg cysteinu do 100 mL vody), hovězí sérový albumin (10 mg.mL-1), ovalbumin (10 mg.mL-1); hovězí trypsin (10 mg/mL-1), 1 mg.mL-1 kyselina 6-aminokapronová (6-aminohexanová). Materiál: sada zkumavek, ponorný stojánek na zkumavky, pipety, plastové kyvety, hliníková folie. Přístroje: termostat, spektrofotometr, vibrační třepačka (vortex). PRACOVNÍ POSTUP 1. Stanovení počtu disulfidových vazeb činidlem DTT Do zkumavek napipetujeme roztoky dle rozpisu v tabulce 1. Roztoky ve zkumavkách důkladně promícháme a necháme stát ve stojanu 2 h při laboratorní teplotě. Po uplynutí této doby změříme v křemenné kyvetě na spektrofotometru UV/VIS absorbanci při 283 nm proti slepému vzorku. Tabulka 1 Zkumavka 1%

roztok bílkoviny

(mL)

0,1 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 8 obsahující

20 mmol.L-1 EDTA (mL)

10% SDS v 0,1 mol.L-1

K-fosfátovém pufru pH 8 obsahující 20 mmol.L-1 EDTA

(mL)

Voda (µL)

DTT (µL)

1 (blank) 0,5 0,5 - 50 - 2 0,5 0,5 - - 50 3 (blank) 0,5 - 0,5 50 - 4 0,5 - 0,5 - 50 2. Stanovení obsahu sulfhydrylových skupin činidlem DTNB a) Sestrojení kalibračního grafu

Před stanovením obsahu sulfhydrylových skupin je třeba sestrojit kalibrační graf pro látku se známým obsahem volných -SH skupin (např. cystein). Při přípravě roztoků pro kalibrační graf postupujeme podle tabulky 2. Jednotlivé roztoky se připraví ve zkumavkách smísením příslušného objemu roztoku cysteinu (viz tabulka) a 0,3 mL v 0,1 mol.L-1 K-fosfátového

34

pufru pH 8 s 20 mmol.L-1 EDTA, směs se doplní 20 µL roztoku DTNB. Každý vzorek standardu se připraví dvakrát. Po 30 minutách stání za laboratorní teploty se měří absorbance vzorků při 412 nm na spektrofotometru proti slepému vzorku. Tabulka 2

Zkumavka 1 mmol.L-1 cystein (mL)

Pufr (mL)

Voda (mL)

10 mmol.L-1 DTNB (µL)

1 (blank) 0 0,3 1,68 20 2 0,02 0,3 1,66 20 3 0,04 0,3 1,64 20 4 0,06 0,3 1,62 20 5 0,08 0,3 1,60 20 6 0,10 0,3 1,58 20

b) Stanovení počtu snadno dostupných -SH skupin

Do zkumavek napipetujeme roztoky dle rozpisu v tabulce 3. Roztoky ve zkumavkách důkladně promícháme a necháme stát ve stojanu při laboratorní teplotě a po 30 minutách změříme absorbanci při 412 nm proti slepému vzorku, ve kterém je 0,1 mL 0,1 mol.L-1 K-fosfátového pufru pH 8 místo bílkoviny. Tabulka 3 Zkumavka 1% roztok

bílkoviny (µL)

0,1 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 8 obsahující 20 mmol.L-1 EDTA

(mL)

DTNB (µL)

Voda (mL)

1 100 0,3 20 1,58 2 100 0,3 20 1,58 3 100 0,3 20 1,58 4 (blank) - 0,4 20 1,58 c) Stanovení počtu „pohřbených“ -SH skupin

Do zkumavek pipetujeme roztok bílkoviny, SDS a K-fosfátový pufr dle rozpisu v tabulce 4. Směs se po promíchání inkubuje 30 minut při 40 oC a po vychlazení na laboratorní teplotu se k ní přidá roztok DTNB a voda. Po opětovném promíchání na třepačce a 30 minutách stání při laboratorní teplotě se měří absorbance při 412 nm proti slepému vzorku obsahujícímu 0,1 mL destilované vody místo roztoku bílkoviny. Tabulka 4 Zkumavka 1% roztok

bílkoviny (µL)

0,1 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 8 obsahující 20 mmol.L-1 EDTA

(mL)

2% SDS (mL)

DTNB (µL)

Voda (mL)

5 100 0,3 1 20 1,58 6 100 0,3 1 20 1,58 7 100 0,3 1 20 1,58 8 (blank) - 0,4 1 20 1,58 3. Stanovení obsahu primárních aminoskupin činidlem TNBS Stanovení počtu volných a „pohřbených“ aminoskupin Principem stanovení volných aminoskupin je odečtení hodnoty absorbance z kalibrační přímky po reakci proteinu s činidlem TNBS. Kalibrační přímka se sestrojí s použitím standardu

35

kyseliny 6-aminokapronové, která obsahuje ε-aminoskupinu podobně jako lysylový zbytek proteinu. Volný lysin obsahuje dvě aminoskupiny (α- a ε-) a jako standard by proto poskytoval dvojnásobnou reakci. Do šesti zkumavek nejdříve pipetujeme 950 µL 4% NaHCO3. Do zkumavky, kterou označíme jako slepý vzorek dále pipetujeme 50 µL vody, do ostatních zkumavek pak postupně pipetujeme 10, 20, 30, 40 a 50 µL zásobního roztoku kyseliny 6-aminokapronové a doplníme vodou tak, aby ve všech zkumavkách byl celkový objem 1 mL. Obdobně připravíme vzorky proteinů. Pipetujeme 950 µL 4% NaHCO3 a pak pro každý protein 20 a 50 µL. Doplníme vodou na celkový objem 1 mL. Pro určení příspěvku skrytých aminoskupin připravíme obdobně vzorek proteinu záměnou 950 µL 4% NaHCO3 za 950 µL 4% NaHCO3 obsahujícího 1% SDS. Nakonec ke všem vzorkům (kalibrační přímka + proteinové vzorky) pipetujeme 500 µL 0.01% roztoku TNBS. Obsah všech zkumavek důkladně promícháme na vibrační třepačce a inkubujeme 1 hodinu v termostatu při 40 oC ve tmě. Temné prostředí v termostatu zajistíme jeho překrytím hliníkovou fólií (alobal). Po skončení inkubace změříme absorbanci směsí ve zkumavkách při 345 nm proti slepému vzorku. Kalibrační přímka by měla poskytnout hodnoty A345 v rozmezí 0,14-0,58. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Odhadneme obsah disulfidových vazeb v molekule hovězího sérového albuminu. Je-li jejich

skutečný počet 15, zdůvodníme zjištěný výsledek. 2. Z kalibračního grafu pro cystein určíme obsah sulfhydrylových skupin v proteinu. 3. Na základě naměřených hodnot sestrojíme kalibrační přímku a z lineární regrese určíme její

rovnici. Z kalibrační přímky odečteme, jakému množství kyseliny 6-aminokapronové odpovídá námi pipetované množství proteinu. Výpočtem následujícího poměru získáme hodnotu počtu volných aminoskupin v molekule proteinu:

počet odpovídajících molů kyseliny 6-aminokapronové

počet molů proteinu v námi pipetovaném vzorku Porovnáme rozdíl ve výsledcích v závislosti na užití detergentu SDS. K výpočtům látkového množství vycházíme z následujících údajů: Mr (k. 6-aminokapronová) = 131,18, Mr (hovězí sérový albumin) = 67 000, Mr (ovalbumin) = 45 000, Mr (hovězí trypsin) = 23 000. Z kalibrační přímky určíme absorpční koeficient TNB-derivátu kyseliny 6-aminokapronové. Vycházíme přitom z Lambert-Beerova zákona A = ε.l.c.

KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Uveďte názvy a vzorce sirných aminokyselin. 2. Jaké aminoskupiny mohou obsahovat proteiny? 3. Proč se ke stanovení obsahu skrytých -SH a -NH2 skupin používá prostředí obsahující

dodecylsulfát sodný? 4. Od jakých látek jsou odvozeny názvy Clelandových činidel? 5. Jaký aminokyselinový zbytek obsažený v proteinech je nejreaktivnější? LITERATURA Lundblad R. L. a Noyes C. M. (1985) Chemical Reagents for Protein Modification, Vol. I, 3rd ed.,

CRC Press Inc (Boca Raton). Scott T. a Eagleson M., ed. (1988) Concise Encyclopedia Biochemistry, Walter de Gruyter, (Berlin - New York). Krajhanzl A., Hladík J. a kol. (1991) Skripta Biochemické metody, Návody k pokročilým praktickým cvičením, Karolinum (Praha). Habeeb A.F.S.A. (1966) Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 14, 328-336.

36

Fields R. (1971) The measurement of amino groups in proteins and peptides. Biochem. J. 124, 581-590. Kidway S.A., Ansari A.A., Salahuddin A. (1976) Effect of succinylation (3-carboxypropionylation) on the conformation and immunological activity of ovalbumin. Biochem. J. 155, 171-180. Cayot P., Tainturier G. (1997) The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal. Biochem. 249, 184-200.

2.4. GELOVÁ CHROMATOGRAFIE BAREVNÉHO DERIVÁTU ALBUMINU

TEORETICKÝ ÚVOD Modifikace bílkovin patří k důležitým metodám studia jejich struktury. Funkční skupiny

vyčnívající z polypeptidického řetězce reagují s běžnými chemickými činidly. Konformační struktura bílkoviny však musí být těmito reagenty ovlivněna co nejméně. Modifikace funkčních skupin enzymů vede velmi často ke ztrátě enzymové aktivity zvláště tehdy, je-li modifikovaná funkční skupina poblíž aktivního centra. Při práci se vyhýbáme drastickým postupům vedoucím k denaturaci bílkoviny (extrémní pH, zahřívání, apod.).

Klasickou metodou přípravy „barevných derivátů“ bílkovin je metoda značení N-terminálních aminokyselin reakcí s 1-fluor-2,4-dinitrobenzenem. Modifikovanou aminokyselinu je možno detekovat po hydrolyze bílkoviny chromatografickými metodami. Další často užívaná metoda je reakce s 1-dimethylaminonaftalen-5-sulfonylchloridem. Toto činidlo specificky reaguje s aminoskupinami za vzniku fluoreskujícího derivátu, který je snadno detekovatelný. Fluoreskující derivát bílkoviny se využívá při imunologických studiích nebo při chromatografických metodách. Na základě značeného derivátu bílkoviny, který je substrátem proteolytických enzymů, lze stanovit jejich aktivitu. Nezreagovaná bílkovina se vysráží deproteinačním činidlem a v roztoku se stanovují uvolněné barevné produkty hydrolýzy. Fluoreskující funkční skupiny mohou být velmi citlivým indikátorem konformačních změn enzymu, ke kterým může docházet při interakci se substráty nebo inhibitory.

Jedním z nejjednodušších postupů přípravy značeného derivátu bílkoviny je kopulace s diazoniovou solí. Aromatické jádro tyrosinu nebo imidazolové jádro histidinu reaguje s diazotovanou kyselinou sulfanilovou, p-aminobenzoovou nebo různými diazotovaným aromatickými či heterocyklickými aminy (princip Paulyho reakce). Kopulaci, která probíhá v alkalickém prostředí, je nutno provádět v pufru při konstantním pH, aby denaturace bílkoviny byla co nejmenší.

Gelová chromatografie (gelová permeační chromatografie, gelová filtrace) je jednou z nejdůležitějších metod v preparativní i analytické chemii biopolymerů (Obr. 1).

Termín gelová filtrace se užívá většinou pro oddělování látek s velmi rozdílnými molekulovými hmotnostmi (př. odsolování bílkovin) a název gelová permeační chromatografie označuje nejčastěji proces separace látek s blízkými molekulovými hmotnostmi. Z teoretického hlediska je nejvhodnější termín kapalinová vylučovací chromatografie, jedná se o rozdělovací chromatografii, kdy se látky dělí mezi mobilní kapalnou fázi a stacionární kapalnou fázi stejného složení, která je obsažena v pórech gelových částic a je omezeně přístupná. Princip metody spočívá v separaci látek na základě rozměrů molekul. Na pórovitém gelu (molekulovém sítě) dochází k tzv. stérickému vyloučení (exkluzi) větších molekul (podle rozměru pórů gelu), naopak malé molekuly pronikají do nitra částic gelu, tzn. že velké molekuly procházejí sloupcem rychleji a látky o menších molekulových hmotnostech se eluují později v pořadí svých zmenšujících se relativních hmotností. Látky o nižších molekulových hmotnostech, než je velikost nejmenších pórů, se od sebe neoddělí.

37

Obr. 1 Separace vysokomolekulární a nízkomolekulární látky na molekulovém sítu a schématické znázornění částice molekulového síta s póry (VM - mrtvý objem, VS - objem stacionární fáze, VGM - objem gelové matrice).

Molekulová síta lze využít při zakoncentrování a odsolování biopolymeru, purifikaci

biopolymerů, určení relativních molekulových hmotností biopolymerů. Pro gelovou chromatografii se používají následující materiály: Sephadexy - fragmenty dextranu (polysacharid o vysoké relativní molekulové hmotnosti 107-108) jsou zesíťovány příčnými vazbami pomocí epichlorhydrinu. Jsou vhodné pro odsolování i pro separaci bílkovin (podle velikosti částic). Při separaci na Sephadexech řady LH se uplatňují adsorbční i rozdělovací efekty (separace nepolárních látek - triacylglyceridů a mastných kyselin, aromatických uhlovodíků, steroidních hormonů...)

fragment dextranu CH2 CH

CH2

ClO

dextran O CH2

CH

CH2

O dextranOH

+

Sepharosy - na bázi agarosy, která je součástí agaru (agarosa + agaropektin; agarosa - nerozvětvený polysacharid složený z D-galaktopyranosy a 3,6-anhydro-L-galaktopyranosy, agaropektin - kyselý rozvětvený polysacharid). Sepharosy se liší od jiných typů molekulových sít tím, že jednotlivé řetězce polymeru nejsou vázány kovalentně, ale pouze slabými silami, dále mají velké póry a do jisté míry kyselý charakter. Hodí se pro separaci bílkovin s relativní molekulovou hmotností nad 200 000. Bio-gely P - připravují se polymerací akrylamidu a methylenbisakrylamidu. Výhodou v porovnání se Sephadexy je vyšší rozsah frakcionace, lepší průtok a nevýhodou nižší rozlišovací schopnost. Styragel - na bázi styrenu, Merckogel OR-PVA - na bázi vinylacetátu, Spheron P, Separon - na bázi glykolmethakrylátu, Bio-Glass - skleněné porézní náplně, Porasil, Spherosil - porézní silikagel. MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: 0,3 mol.L-1 kyselina sulfanilová v 0,1% uhličitanu sodném, 1 mol.L-1 dusitan sodný, 0,2 mol.L-1 kyselina chlorovodíková, 5% albumin v uhličitanoborátovém pufru pH 10. Materiál: kádinky (2 x 25 mL, 1 x 800 mL), pipety, kruhové stojany se zkumavkami, odměrný válec (50 mL), kolona se Sephadexem G-25, odměrná baňka (1 L), teflonová míchadla, pH indikátorové papírky, injekční stříkačka s hadičkou, plastová miska, střička s destilovanou vodou, kyvety do spektrofotometru (1 cm). Přístroje: elektromagnetická míchačka, spektrofotometr. PRACOVNÍ POSTUP

V této úloze připravíme azoderivát albuminu kopulací s diazotovanou kyselinou sulfanilovou. Vedlejší autokopulační produkty kyseliny sulfanilové oddělíme od albuminu gelovou chromatografií.

38

1. Příprava barevného derivátu bílkoviny Do 10 mL kádinky napipetujeme 0,7 mL 0,3 mol.L-1 kyseliny sulfanilové. Kádinku vložíme do ledové lázně v plastové misce a mícháme na elektromagnetické míchačce. Po vychlazení roztoku přidáme 0,15 mL 1 mol.L-1 dusitanu sodného a 0,925 mL 0,2 mol.L-1 kyseliny chlorovodíkové. Po několika minutách odstavíme roztok vzniklé diazoniové soli z míchačky, ale udržujeme neustále v chladu. Vlastní kopulaci diazoniové soli s bílkovinou provedeme za pokojové teploty. Do čisté 25 mL kádinky napipetujeme 1,25 mL 5% albuminu v uhličitanoborátovém pufru. Za stálého míchání na elektromagnetické míchačce přidáváme po kapkách 1 mL připravené diazoniové soli. V průběhu diazotace kontrolujeme pH (alkalická oblast) roztoku bílkoviny indikátorovým papírkem. Směs ponecháme při pokojové teplotě 30 minut. Poté oddělíme vedlejší produkty kopulace od značeného derivátu bílkoviny gelovou chromatografií. 2. Průběh gelová chromatografie Do kruhového stojánku vložíme očíslované zkumavky. Z kolony obsahující Sephadex G-25 opatrně odstraníme zátku a pootevřením kohoutu necháme odkapat vodu (mobilní fázi) nad povrchem gelu. Jakmile hladina vody dosáhne úrovně gelového sloupce, kohout uzavřeme. Pozor, gel nesmí vyschnout! Pod ústí kolony vložíme 50 mL odměrný válec. Na povrch gelu v koloně velmi opatrně o pomalu napipetujeme 1,5 mL analyzovaného roztoku kopulačních produktů. Pootevřením kohoutu necháme roztok vsáknout do gelu, poté kohout opět uzavřeme a čistou pipetou naneseme na povrch gelu cca 2 mL destilované vody, kterou necháme vsáknout. Nanesení destilované vody opakujeme ještě 2x. Při čtvrtém nanesení destilované vody kohout kolony otevřeme až po napojení kolony na zásobní rezervoár mobilní fáze. Do odměrného válce odpustíme cca 30 mL vody. Dále budeme jímat eluát do zkumavek po 5 mL. Sledujeme pohyb jednotlivých barevných pásů na koloně. Jakmile z kolony vytéká pouze čistá voda, pokus ukončíme. U jednotlivých frakcí změříme absorbanci při 420 nm proti destilované vodě. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Do tabulky zapisujeme eluční objem (připočítáme objem jednorázově odpuštěné vody na

počátku pokusu) a absorbanci jednotlivých frakcí. 2. Zakreslíme eluční profil dělení směsi kopulačních produktů (závislost absorbance na elučním

objemu). V grafu označíme píky odpovídající eluovanému barevnému derivátu albuminu a nízkomolekulárním produktům.

KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Jaké je praktické využití modifikovaných bílkovin? 2. Jakým způsobem můžete připravit modifikovanou bílkovinu? 3. Vysvětlete princip gelové chromatografie. 4. Uveďte čtyři možnosti využití molekulových sít. 5. Jaké materiály se používají pro gelovou chromatografii? LITERATURA Ferenčík M. a Škárka B. (1981) Biochemické laboratorné metódy, VTEL (Bratislava). Anzenbacher P. a Kovář J. (1986) Skripta Metody chemického výzkumu pro biochemiky, MŠ ČSR (Praha).

39

3. ENZYMY

3.1. AMYLASY TEORETICKÝ ÚVOD

Amylasy jsou enzymy vyskytující se u člověka, zvířat i u rostlin. Tyto enzymy mají využití v technologické praxi (lihovarnictví, pivovarnictví). Výborným zdrojem amylas pro praktické použití je slad (naklíčený ječmen). Směs sladových amylas se nazývá diastasa. Obsahuje zejména dva enzymy: endoamylasu - α−amylasu (systematický název 1,4-α-D-glukanglukanohydrolasa, EC 3.2.1.1) a exoamylasu - β-amylasu (1,4-α-D-glukanmaltohydrolasa, EC 3.2.1.2) a také malé množství enzymu glukoamylasy (1,4-α-D-glukanglukoamylasa, EC 3.2.1.3). Amylasy patří mezi hydrolasy (3. třída enzymů), které štěpí substráty za účasti vody. Amylasy štěpí zásobní polysacharidy jako je škrob, glykogen a kratší dextriny. Konečným produktem je hlavně redukující disacharid maltosa (4-O-α-D-glukopyranosyl-D-glukosa).

Amylasy se liší vedle struktury a mechanismu působení také místem výskytu. U člověka a zvířat se vyskytuje α-amylasa v slinách a pankreatu a glukoamylasa v játrech. U rostlin se nachází α i β−amylasa společně s glukoamylasou pouze v semenech. Živočišné amylasy vyžadují přítomnost chloridů a rostlinné amylasy podobně jako živočišné obsahují vápenaté ionty.

α-Amylasa štěpí řetězec polysacharidu ve vnitřní části za vzniku dextrinů, což jsou ve vodě rozpustné krátké oligosacharidy obsahující minimálně 4 - 6 glukosových jednotek. β-Amylasa štěpí polysacharid počínaje předposlední vazbou na neredukujícím konci řetězce na disacharid maltosu. Glukoamylasa odštěpuje z neredukujících konců oligosacharidů glukosu. Dextriny vznikající působením amylas lze charakterizovat na základě barevné reakce s jodem jako amylodextriny (modré) obsahující 30 a více glukosových jednotek erythrodextriny (červené) obsahující 8 - 12 glukosových jednotek a achroodextriny (složené ze 4 - 6 glukos), které nedávají barevnou reakci s jodem a mají nízkou molekulovou hmotnost.

Dalším enzymem, se kterým budeme v této úloze pracovat, je sacharasa známá pod názvem invertasa (β-D-fruktofuranosid-fruktohydrolasa, EC 3.2.1.26). Sacharasa se nachází např. v pekařských kvasnicích. Katalyzuje hydrolýzu sacharosy na D-glukosu a D-fruktosu. Tato reakce má značný průmyslový význam: směs glukosy a fruktosy je podstatně sladší než ekvivalentní množství sacharosy. Sacharasa je glykoprotein o molekulové hmotnosti 270 000, lokalizovaný na vnější straně kvasničné buňky, jiná forma enzymu je přítomna jen v malém množství uvnitř buňky. Stanovení enzymové aktivity

Aktivitu sacharasy lze stanovit z přírůstku redukujících cukrů D-glukosy a D-fruktosy (produktů enzymové reakce). Podstatou kolorimetrického stanovení podle Somogyi-Nelsona je redukce komplexní měďnaté soli na oxid měďný, který redukuje přidaný arsenomolybdenan na molybdenovou modř. Její koncentraci měříme kolorimetricky při 720 nm.

Kvantitativní stanovení účinnosti diastasy spočívá v tom, že roztok diastasy v odstupňovaných koncentracích necháme působit na stejné množství škrobu a stanovíme, v jaké koncentraci je enzym schopen během 30 minut rozložit všechen škrob. Detekci provádíme činidlem obsahujícím jod. Modré zbarvení signalizuje přítomnost škrobu, působením enzymu přechází ve zbarvení červené (erythrodextrin), žlutá barva roztoku potvrzuje úplné rozštěpení škrobu. Této poměrně rychlé metody se používá např. při kontrole kvality sladu (pivovarnictví). Substrátová specifita enzymů

Katalytická účinnost enzymů je zpravidla vysoce specifická pro několik příbuzných látek, někdy i pro jednu jedinou. Obecně vzato je místo, které váže substrát, tvořeno otiskem substrátu v povrchu enzymové molekuly (geometrická komplementarita). Kromě toho jsou aminokyselinové

40

zbytky tvořící vazebné místo sestaveny tak, aby účinně interagovaly s molekulami substrátu (elektronová komplementarita). Vazebné místo pro substrát může podle hypotézy „zámku a klíče“ existovat bez přítomnosti navázaného substrátu nebo podle hypotézy „indukovaného přizpůsobení“ se vytvoří teprve v okamžiku navázání substrátu. Rentgenová strukturní analýza ukázala, že vazebná místa většiny enzymů jsou z větší části vytvořena předem, ale že vazba substrátu u nich navozuje určitou strukturní úpravu.

Charakteristickou vlastnost enzymů „substrátovou specifitu“ si ověříme na příkladu α-amylasy a sacharasy. α-amylasa, obsažená ve slinách, odbourává škrob za vzniku dextrinů, na sacharosu vůbec nepůsobí. Naproti tomu sacharasa rychle hydrolyzuje sacharosu, ale je zcela neaktivní vůči škrobu. Účinek obou enzymů lze snadno sledovat např. Fehlingovou reakcí (důkaz vznikajících redukujících cukrů) nebo reakcí s jodem (škrob dává modré zbarvení). Glukosu vznikající hydrolýzou sacharosy lze specificky dokázat indikátorovým papírkem. Jedná se o papírek napojený směsí glukosaoxidasy (β-D-glukosa:O2-oxidoreduktasa, EC 1.1.3.4), peroxidasy (donor:H2O2-oxidoreduktasa, EC 1.11.1.7) a o-tolidinu. Principem reakce je oxidace glukosy enzymem glukosaoxidasou za vzniku peroxidu vodíku, který se prokáže indikační reakcí katalysovanou peroxidasou za přítomnosti o-tolidinu. Pozitivní reakce se projeví modrým zbarvením během 1-10 minut. Poněvadž reakci zpomalují silná redukční činidla, např. askorbát, jsou papírky „Glukophan“ opatřeny redoxním indikátorem (spodní proužek), který za přítomnosti askorbátu vybledne. Papírky se používají v klinické praxi k rychlému stanovení glukosy v moči. Závislost enzymové aktivity na pH

Enzymy jsou jako proteiny značně citlivé na změnu pH. Většina proteinů je ve skutečnosti aktivní jen v úzkém rozmezí pH, mezi 5 - 9 (Obr. 1). Účinky pH ovlivňují vazbu substrátu na enzym, katalytickou aktivitu enzymu, ionizaci substrátu a změnu struktury proteinu (obvykle je významná jen při extrémních pH, může docházet k ireverzibilní denaturaci proteinu). Počáteční rychlosti pro mnoho enzymových reakcí vykazují zvonovité křivky v závislosti na pH. Hodnota pH, při které je enzymová reakce nejrychlejší, se označuje jako pH optimum daného enzymu. Určitou roli zde hraje složení pufru, jeho koncentrace a použitý substrát.

V této úloze stanovíme optimální pH pro štěpení škrobu α-amylasou ze slin. Stupeň štěpení určíme jednak orientační reakcí s jodem a jednak kvantitativně podle Somogyi-Nelsona. Obr. 1 Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na pH.

0

2

4

6

8

4 5 6 7 8 9 10

pH

v

Závislost aktivační energie na teplotě

Se stoupající teplotou se zvyšuje kinetická energie molekul, zvyšuje se počet jejich srážek a dochází ke zvýšení rychlosti chemických reakcí. Obecně to platí i pro enzymové reakce, u nichž se však uplatňují i další vlivy. Teplota ovlivňuje stabilitu enzymu, ionizaci funkčních skupin, afinitu enzymu k substrátu, rychlost štěpení komplexu ES, změnu pH pufrů, rozpustnost kyslíku

41

nezbytného pro oxidační reakce apod. Zvyšuje-li se teplota, zvyšuje se reakční rychlost a současně se zvyšuje i rychlost denaturace enzymu. Vyneseme-li aktivitu enzymu při různých teplotách do grafu proti teplotě, obdržíme křivku, která má obvykle vrchol, tzv. teplotní optimum. Jeho hodnota závisí na době inkubace enzymu se substrátem. Čím je inkubace delší, tím je naměřená optimální teplota nižší (Obr. 2). Tepelnou stabilitu enzymu ovlivňuje pH a iontová síla prostředí. Vysoká koncentrace bílkovin a přítomnost substrátu nebo kompetitivního inhibitoru obvykle chrání enzym před tepelnou denaturací. Kinetická měření pro stanovení teplotní závislosti a pH optima budeme provádět s enzymem sacharasou s použitím metody podle Somogyi-Nelsona. Obr. 2 Vliv teploty na reakční rychlost enzymové reakce: a) časový průběh (teplota v legendě je udána ve oC), b) teplotní optimum při dvou různě dlouhých inkubačních dobách.

a)

0 4 8 12 16čas (min)

v

30 40 50 60 70

b)

20 40 60 80teplota (oC)

v

doba inkubace - 2 min

doba inkubace - 14 min

42

3.1.1. AKTIVITA DIASTASY

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: slad, škrob, Lugolův roztok, 0,9% NaCl (fyziologický roztok), 0,1 mol.L-1 fosfátový pufr pH 7,2. Materiál: Erlenmayerova baňka (200 mL), stojan s filtračním kruhem, kádinka (2 x 100 mL), stojan se zkumavkami, pipety, filtrační papír, odměrná baňka (100 mL), váženka, lžička, střička s destilovanou vodou. Přístroje: termostat (38 oC, 45 oC), vařič. PRACOVNÍ POSTUP 1. Příprava roztoku škrobu 0,1 g škrobu rozsuspendujeme ve 100 mL 0,1 mol.L-1 fosfátovém pufru pH 7,2 a 5 minut povaříme. 2. Příprava vodného roztoku diastasy Jeden gram jemně rozemletého sladu extrahujeme v 50 mL0,9% NaCl po dobu 30 min na vodní lázni nastavené na 45 oC. Extrakt opakovaně přefiltrujeme (filtrát musí být čirý). Nachystáme si sadu 8 zkumavek, které očíslujeme. Následujícím ředěním si připravíme 8 roztoků se snižující se koncentrací diastasy (extraktu sladu). Do první zkumavky napipetujeme 2 mL extraktu a 2 mL vody. Z této zkumavky po promíchání roztoků odpipetujeme 2 mL do zkumavky č. 2 a přidáme 2 mL vody. Promícháme a pokračujeme stejným způsobem v dalších zkumavkách v přípravě zředěných roztoků diastasy. Ze zkumavky č. 8 odpipetujeme 2 mL roztoku do odpadu. V každé zkumavce máme 2 mL roztoku vždy 2 x koncentrovanějšího, než ve zkumavce následující. 3. Stanovení aktivity diastasy Do každé zkumavky napipetujeme rychle 4 mL 0,1% škrobu a vložíme do termostatu nastaveného na teplotu 38 oC. Po 30 minutách zkumavky ochladíme (ledová lázeň) a doplníme vodou 2 cm pod okraj zkumavky. Poté přidáme 1 kapku Lugolova roztoku (obsahuje jod). Za základ výpočtu bereme množství extraktu v té zkumavce, ve které je roztok zbarven červeně. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Konvenční jednotka aktivity diastasy (označuje se D 38o, 30 min) je definovaná jako množství

roztoku diastasy v mililitrech, jež stačí k rozštěpení 1 mL 0,1% roztoku škrobu do stupně erythrodextrinu. Diastasa má ve zkumavce, ve které je roztok zbarven červeně, aktivitu 4 jednotek.

2. Vypočítáme aktivitu diastasy v připraveném extraktu sladu.

3.1.2. SUBSTRÁTOVÁ SPECIFITA α−α−α−α−AMYLASY A SACHARASY

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: škrob, sacharosa, kvasnice, 0,1 mol.L-1 fosfátový pufr pH 7,2, Lugolův roztok. Fehlingovo činidlo: roztok I: 40 g CuSO4.5H2O rozpustíme v 500 mL vody a doplníme do 1 L, roztok II: 200 g Seignettovy soli (vinan sodnodraselný - C4H4O6KNa.2H2O) a 150 g NaOH se rozpustí v menším množství vody a doplní na 1 L. Materiál: Erlenmayerova baňka (200 mL), kádinka (3 x 50 mL), stojan se zkumavkami, pipety, odměrná baňka 100 mL, váženka, lžička, hrnec, střička s destilovanou vodou. Přístroje: termostat (38 oC), vařič, spektrofotometr.

43

PRACOVNÍ POSTUP 1. Příprava substrátů 0,5 g škrobu rozsuspendujeme v 50 mL 0,1 mol.L-1 fosfátovém pufru pH 7,2 a 5 minut povaříme. 1 g sacharosy rozpustíme v 50 mL destilované vody. 2. Příprava enzymů a) 1 mL vlastních slin zředíme 2 mL vody (α-amylasa) b) 0,1 g pekařských kvasnic suspendujeme ve 20 mL vody (sacharasa) 3. Vlastní pokus Podle schématu v tabulce napipetujeme do šesti označených zkumavek 0,5 mL enzymových preparátů (α-amylasy a sacharasy). Zkumavky 2 a 5 povaříme 5 minut a pak do všech zkumavek přidáme 2 mL substrátu, tj. škrobu nebo sacharosy (Tab. 1). Všechny zkumavky inkubujeme 30 min při 38 oC v termostatu. Tabulka 1

Zkumavka 1 2 3 4 5 6 Amylasa (mL) 0,5 0,5 - - - 0,5 Sacharasa (mL) - - 0,5 0,5 0,5 - Povařit - + - - + - 1% Škrob (mL) 2,0 2,0 2,0 - - - 2% Sacharosa (mL) - - - 2,0 2,0 2,0 Vyhodnocení Fehlingova reakce Zbarvení jodem

Po ukončení inkubace použijeme 1 mL vzorku pro stanovení přítomnosti redukujících látek Fehlingovu reakci. Ve zkumavce smísíme 1 mL Fehlingova činidla I a 1 mL Fehlingova činidla II s 1 mL vzorku. Opatrným povařením vzniká oranžově červená sraženina Cu2O. Zkumavky se zbytkem vzorku doplníme 1 cm pod okraj destilovanou vodou a přidáme kapku Lugolova roztoku (roztok jodu). VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Výsledky zkoušek zapíšeme do tabulky. 2. Vyhodnotíme z hlediska substrátové specifity enzym obsažený ve slinách a v pekařských

kvasnicích.

3.1.3. OPTIMÁLNÍ pH ENZYMOVÉ REAKCE αααα-AMYLASY MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: škrob, Lugolův roztok, 2% maltosa, 0,9% NaCl (fyziologický roztok), 0,2 mol.L-1 Na2HPO4, 0,1 mol.L-1 kyselina citronová. Činidlo Somogyi-Nelsonovo: roztok I: 24 g bezvodého Na2CO3, 16 g NaHCO3, 144 g bezvodého Na2SO4 a 12 g vinanu sodnodraselného (Seignettova sůl) v 800 mL destilované vody, roztok II: 4 g CuSO4.5H2O a 24 g bezvodého Na2SO4 v 200 mL destilované vody, roztok III: 25 g molybdenanu amonného v 450 mL vody a 21 mL konc. H2SO4 a poté přidat 3 g Na2HAsO4.7H2O v 25 mL vody.

44

Materiál: Erlenmayerova baňka (200 mL), kádinka (2 x 50 mL), stojan se zkumavkami, pipety, odměrná baňka (3 x 100 mL), váženka, lžička, hrnec, miska na led, střička s destilovanou vodou. Přístroje: termostat (30 oC), vařič, spektrofotometr. PRACOVNÍ POSTUP 1. Příprava substrátu 0,5 g škrobu rozsuspendujeme v 50 mL destilované vody a 5 minut povaříme. 2. Příprava enzymu (αααα-amylasy) a pufrů (pH 3,0 - 8,3) Odměříme 1 mL vlastních slin do 100 mL odměrné baňky a doplníme fyziologickým roztokem přesně na 100 mL. Do sady označených čistých zkumavek napipetujeme roztok hydrogenfosforečnanu sodného a kyseliny citronové (Tab. 2). Získáme tak sadu pufrů v rozmezí pH 3 - 8,3. Do všech zkumavek přidáme 1 mL 1% škrobu a 1 mL naředěných slin (roztok α-amylasy), promícháme a dáme inkubovat do termostatu při 30 oC. Jako slepý vzorek si připravíme 4 mL kyseliny citronové, do které přidáme 1 mL 1% škrobu a 1 mL naředěných slin (roztok α-amylasy). Tabulka 2

Zkumavka č. Kys. citronová (mL)

Na2HPO4 (mL)

pH

1 3,20 0,80 3,0 2 2,60 1,40 4,0 3 2,00 2,00 4,8 4 1,75 2,25 5,4 5 1,60 2,40 5,8 6 1,10 2,90 6,6 7 0,70 3,30 7,0 8 0,25 3,75 7,6 9 0,10 3,90 8,0 10 0,00 4,00 8,3

3. Stanovení aktivity Somogyi-Nelsonovou metodou Po 15 minutách inkubace odpipetujeme 0,5 mL obsahu zkumavky č. 7 do čisté zkumavky, zředíme vodou 1 cm pod okraj zkumavky a pomocí Lugolova roztoku vyzkoušíme, zda došlo k úplnému rozštěpení škrobu amylasou (modré zbarvení škrobu se musí změnit na žluté). Pokud je roztok stále modrý, pokračujeme dále v inkubaci a zkoušku provedeme za dalších 5 minut. Jakmile zjistíme, že škrob ve zkumavce č. 7 se působením α-amylasy zcela rozštěpil, vytáhneme zkumavky z termostatu. Odpipetujeme 1 mL z každé reakční směsi do nové označené zkumavky a přidáme po 0,5 mL Somogyi-Nelsonova činidla I a poté II. Zkumavky umístíme do vroucí vodní lázně a vaříme. Po 10 minutách ochladíme vodou, přidáme 0,5 mL Somogyi-Nelsonova činidla III a intenzivně promícháme, až se rozpustí vzniklý Cu2O. Po doplnění objemu na 10 mL změříme absorbanci proti slepému vzorku při 720 nm. Je-li zbarvení příliš intenzivní (absorbance vyšší než 1,0), je možné vzorek zředit odpovídajícím množstvím destilované vody. Koncentraci redukujícího cukru zjistíme z kalibrační křivky. 4. Určení stupně rozštěpení substrátu Zbytek reakčních směsí inkubovaných při 30 oC dalších 15 min (celkem tedy 30 min) využijeme pro stanovení stupně rozštěpení škrobu. Roztok ve zkumavkách doplníme odhadem asi na 10 mL destilovanou vodou, poté přidáme kapku Lugolova roztoku. Visuálně odhadneme intensitu zbarvení v závislosti na pH prostředí enzymové reakce.

45

5. Stanovení kalibrační křivky Ze zásobního roztoku 2% maltosy odpipetujeme přesně 1 mL a doplníme destilovanou vodou na 100 mL. Z tohoto roztoku odměříme 1, 2, 3, 4, a 5 mL a doplníme destilovanou vodou do 10 mL. K analýze odebereme po 1 mL ze zkumavek obsahujících různé koncentrace maltosy (20-100 µg), přidáme 0,5 mL Somogyi-Nelsonova činidla I a II. Zkumavky umístníme do vroucí vodní lázně a vaříme. Po 10 minutách ochladíme vodou, přidáme 0,5 mL Somogyi-Nelsonova činidla III a intenzivně promícháme, až se rozpustí vzniklý Cu2O. Po doplnění objemu na 10 mL změříme absorbanci proti slepému vzorku při 720 nm. Slepý vzorek připravíme přidáním Somogyi-Nelsonova činidla I a II (0,5 mL) k 1 mL destilované vody. Po povaření a následném ochlazení přidáme 0,5 mL Somogyi-Nelsonova činidla III. Po doplnění objemu na 10 mL změříme absorbanci proti slepému vzorku při 720 nm. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Nakreslíme kalibrační závislost pro stanovení koncentrace redukujících cukrů. 2. Nakreslíme graf závislosti stanoveného množství redukujících cukrů na pH a odečteme z něho

pH optimum amylasy. 3. Do tabulky uvedeme stupeň rozštěpení škrobu enzymem v závislosti na pH.

3.1.4. TEPLOTNÍ OPTIMUM ENZYMOVÉ REAKCE SACHARASY

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: sacharosa, 0,1 mol.L-1 acetátový pufr pH 4,6, kvasnice, činidlo Somogyi-Nelsonovo I, II, III. Materiál: Erlenmayerova baňka (50 a 100 mL), stojan se zkumavkami, pipety, odměrná baňka (100 mL), váženka, hrnec, miska na led, střička s destilovanou vodou. Přístroje: termostat (30 oC), vařič, spektrofotometr. PRACOVNÍ POSTUP 1. Příprava substrátu a enzymu Substrát připravíme rozpuštěním 10 g sacharosy ve 100 mL acetátového pufru. Enzym sacharasu získáme rozetřením 0,5 g kvasnic v 5 mL acetátového pufru. 0,1 mL této suspenze přidáme do 20 mL acetátového pufru. 2. Stanovení aktivity Měření provádíme v teplotním intervalu 25 - 40 oC vždy ve dvou paralelních zkumavkách. Třetí zkumavka bude sloužit ke kontrole volné glukosy v sacharose, eventuálně k určení neenzymové hydrolýzy sacharosy během pokusu. Zastavení enzymové reakce provedeme odpipetováním 0,5 mL reakční směsi do předem připravené zkumavky se Somogyi-Nelsonovým činidlem I umístěné na vroucí vodní lázni. Z tohoto důvodu si předem připravíme sadu 13 označených zkumavek obsahujících 0,5 mL Somogyi-Nelsonova činidla I, které nám budou sloužit k zastavení reakce a ponecháme je při pokojové teplotě. Do druhé, stejně označené sady zkumavek, napipetujeme roztoky podle tabulky 3. Termostat nastavíme na 25 oC a dáme temperovat zkumavky 1 - 3. Mezitím si připravíme vroucí lázeň, do které ponoříme zkumavky 1 - 3 se Somogyi-Nelsonovým činidlem I. Enzymovou reakci zahájíme přídavkem 1 mL suspenze kvasnic do zkumavek 1 a 2, promícháme a necháme v termostatu. Přesně po 5 minutách odebereme po 0,5 mL reakční směsi ze zkumavek 1 - 3 a přidáme do odpovídajících zkumavek na vodní lázni. Zkumavky na vodní lázni povaříme asi 3 minuty a pak je přemístíme zpět do stojanu a ponecháme při pokojové teplotě.

46

Termostat nastavíme na teplotu 30 oC a dáme temperovat zkumavky 4 - 6. Stejně označené zkumavky s činidlem vložíme do vroucí lázně. Po 5 minutách od zahájení reakce ve zkumavkách 4 a 5 přídavkem 1 mL roztoku sacharasy odebereme z každé zkumavky 0,5 mL a přidáme do zkumavek se Somogyi-Nelsonovým činidlem I, krátce povaříme a dále ponecháme zkumavky při pokojové teplotě. Stejný postup provedeme při 35 oC a 40 oC. Nakonec přidáme 1 mL enzymu do zkumavky č. 13 (slepý vzorek), odebereme 0,5 mL a přidáme do stejně označené zkumavky se Somogyi-Nelsonovým činidlem I. Tabulka 3

roztok teplota slepý vzorek 25 oC 30 oC 35 oC 40 oC zkumavka 1 + 2 3 4 + 5 6 7 + 8 9 10 + 11 12 13

sacharosa (mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 - acetátový pufr (mL) - 1 - 1 - 1 - 1 5

3. Stanovení koncentrace redukujících cukrů Stanovení provedeme ve všech zkumavkách současně. Zkumavky vložíme zpět do vodní lázně, přidáme 0,5 mL Somogyi-Nelsonovým činidlem II, promícháme a ponecháme na vroucí lázni 10 minut. Poté zkumavky ochladíme vodou, přidáme 0,5 mL Somogyi-Nelsonového činidla III. Zkumavky třepeme do rozpuštění vzniklého Cu2O. Nakonec přidáme do každé zkumavky 8 mL vody, promícháme a změříme absorbanci při 720 nm proti zkumavce č. 13 (slepý vzorek). Je-li zbarvení příliš intenzivní, je možné zředit roztoky odpovídajícím množstvím destilované vody. Koncentraci stanovíme z kalibrační křivky (viz úloha - stanovení pH optima enzymové reakce). VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Na základě kalibrační přímky vypočítáme aktivitu sacharasy v nmol.s-1 při různých reakčních

teplotách. 2. Vyneseme závislost rychlosti reakce na teplotě. 3. Nakreslíme graf závislosti log V (maximální rychlost) oproti 1/T. Z Arrheniova grafu určíme

velikost aktivační energie. 4. Vypočítáme teoretickou hodnotu Ea, vzroste-li rychlost reakce při přechodu z 20 na 30 oC

o 100 %. KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Jakou reakci katalyzují amylasy? Čím se liší α−amylasa, β−amylasa a glukoamylasa? 2. Jakou reakci katalyzuje sacharasa? Navrhněte pokus pro detekci sacharasy v roztoku. 3. Vysvětlete na příkladu sacharasy a α−amylasy pojem substrátová specifita. 4. Jak budete postupovat při stanovení pH optima studovaného enzymu? Jaký vliv může mít

extrémní hodnota pH na enzym? 5. Vysvětlete, proč při stanovení substrátové specifity neproběhla reakce ve zkumavkách 2 a 5. 6. Navrhněte způsob ochrany enzymu před tepelnou denaturací. Vysvětlete. LITERATURA Voet D. a Voet J.G. (1995) Biochemie, Victoria Publishing (Praha). Macholán L., Skurský L. a Zbořil P. (1980) Skripta Laboratorní cvičení z biochemie I, vydavatelství UJEP (Brno). Macholán L., Barthová J. a Kučera I. (1994) Skripta Enzymologie, vydavatelství MU (Brno).

47

3.2. AMINOXIDASY

3.2.1. IZOLACE AMINOXIDASY ZE SEMENÁČKŮ HRACHU

TEORETICKÝ ÚVOD Aminoxidasy jsou obecně rozšířené enzymy, které lze dělit dle substrátové specifity do

tří skupin: 1. monoaminoxidasy (obsahující flavin), zkr. MAO, EC 1.4.3.4; amin:O2 oxidoreduktasa (deaminační, obsahující flavin). Jsou obsaženy v krvi, mitochondriích a v celé řadě rostlinných čeledí, ale vždy ve velmi nízké aktivitě. Katalyzují oxidaci primárních aminů, obvykle také sekundárních a terciárních s malými substituenty. 2. aminoxidasy (obsahující měď), zkr. AO, EC 1.4.3.6; amin:O2 oxidoreduktasa (deaminační, obsahující měď). Jsou typické zejména pro placentu, kůru ledvin a bobovité rostliny jako hrách, sója, vojtěška, jetel, čočka a pod.) Typickými substráty jsou diaminy putrescin (butan-1,4-diamin) a kadaverin (pentan-1,5-diamin), a proto jsou také někdy označovány jako diaminoxidasy (zkratka DAO). 3. polyaminoxidasy (obsahující flavin), zkr. PAO, nemají zařazení v EC, jsou typické pro trávy a obilniny, substráty jsou spermin (N,N´-3-aminopropylputrescin) a spermidin (N-3-aminopropylputrescin).

Všechny aminoxidasy spotřebovávají k oxidaci substrátu kyslík a produkují peroxid vodíku, amonný ion a příslušný aldehyd:

R - CH2NH3+ + O2 + H2O → R - CHO + NH4

+ + H2O2 Většina polyaminoxidas jsou flavoproteiny, obsahující jako kofaktor FAD. Organické

kofaktory ostatních aminoxidas se podařilo identifikovat až v posledních letech. Některé mikrobiální aminoxidasy (např. methylaminoxidasa) obsahují kovalentně vázaný pyrrolochinolinochinon (zkratka PQQ), zatímco aminoxidasy (obsahující měď) mají jako kofaktor trihydroxyfenylalaninchinon (TOPA-chinon), který vzniká posttranslační modifikací peptidově vázaného tyrosinu. U aminoxidas jsou většinou známy parciální aminokyselinové sekvence. Trojrozměrná struktura aminoxidas z klíčků hrachu a E. coli byla publikována nedávno.

N

NH

HOOC

COOH

COOH

O

O

pyrrolochinolinochinon (PQQ)

O

O

OH

CO

NH

trihydroxyfenylalaninchinon (TOPA-chinon) Pro potřeby laboratorní práce z enzymologie se jeví jako nejvhodnější aminoxidasa

izolovaná z klíčků hrachu (PSAO). PSAO má dimerní strukturu a obsahuje organický kofaktor TOPA-chinon a měď ve formě Cu(II) v každé z podjednotek. Relativní molekulová hmotnost PSAO v nativním stavu (dimer) je 150 kDa.

Výchozím materiálem pro purifikaci rostlinných Cu-aminoxidas jsou nejčastěji etiolované 7 - 10 denní semenáčky. Purifikační metody zahrnují homogenizaci rostlinného materiálu ve vhodném pufru, hrubé přečištění extraktu, jeho zakoncentrování a řadu chromatografických postupů. Pro hrubé přečištění extraktu lze použít metod srážení balastních bílkovin síranem

48

amonným, MnCl2 či protaminsulfátem nebo řízenou tepelnou denaturaci balastních bílkovin. Pro izolaci aminoxidas se využívá chromatografie na celulosových iontoměničích, na hydroxyapatitu a gelová permeační chromatografie.

Pro stanovení aktivity aminoxidasy je vypracována řada různě specifických a citlivých metod. Metoda, kterou budeme dále využívat je založena na spektrofotometrickém stanovení žlutohnědého zbarvení indikujícího aminoxidasovou reakcí vzniklý peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku je za přítomnosti peroxidasy (EC 1.11.1.6) a bezbarvého guajakolu (o-methoxyfenol) rozkládán na kyslík a vodu. Kyslík oxiduje guajakol za vzniku žlutohnědého tetraguajakolochinonu s absorbčním maximem při 436 nm. Nárust absorbance při 436 nm v čase odpovídá vznikajícímu peroxidu vodíku a tedy aktivitě aminoxidasy. MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: síran amonný, 0,1 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 7 s 1 µmol.L-1 Cu2+, 0,035 mol.L-1 guajakol (Mr 124,1), 87,5 mmol.L-1 putrescin, 0,117 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 7, 20 g 10-denních etiolovaných semenáčků hrachu, 0,01% křenová peroxidasa. Poznámka: peroxidasa je velmi aktivní enzym, proto není třeba používat přečištěných preparátů, stačí hrubě přečištěná o aktivitě 40 jednotek.mg-1 pevné substance. Jedna jednotka peroxidasové aktivity oxiduje 1 µmol ABTS = 2,2,-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina) za minutu při 25 oC a pH 5. Materiál: třecí miska s tloučkem, válec (50 mL, 1 L), nylonová síťka, kádinky (2 x 150 mL, 3 x 50 mL), centrifugační kyvety, lžička, miska na síran amonný, miska na ledovou lázeň, stojan se zkumavkami, míchadlo, kyvety do spektrofotometru , pipety, odměrné baňky (4 x 100 mL), střička s destilovanou vodou. Přístroje: předvážky, spektrofotometr, chlazená centrifuga, elektromagnetická míchačka. PRACOVNÍ POSTUP 1. Izolace aminoxidasy a) 20 g zmrazených desetidenních klíčků hrachu nastřiháme na 1 cm kousky do třecí misky a po

přidání mořského písku rozetřeme na kaši. Postupně přidáváme 40 mL 0,1 mol.L-1 K-fosfátového pufru pH 7. Získaný homogenát přefiltrujeme (vymačkáme) přes nylonovou tkaninu a kapalný podíl centrifugujeme na chlazené centrifuze (15 min, 7 000 g). Před vlastní centrifugací je nutné kyvety pečlivě vyvážit. Supernatant slijeme do 50 mL válečku, zaznamenáme si objem a odebereme vzorek č. 1 (cca 2 mL) na stanovení aktivity aminoxidasy a obsahu proteinů. Vzorky odebírané v průběhu izolace uchováváme v ledové lázni.

b) Přídavkem síranu amonného do 30% nasycení vysrážíme z rostlinného homogenátu část

balastních bílkovin. K supernatantu z předešlého kroku v průběhu 15 min postupně přidáváme odvážené množství síranu amonného (176 g na 1 L roztoku). Roztok po dobu srážení mícháme chladíme. Pět minut po posledním přídavku síranu amonného centrifugací odstraníme vzniklou sraženinu (15 min, 7 000 g). Supernatant slijeme do 50 mL válečku, změříme objem a odebereme vzorek č. 2. (cca 2 mL). Se sraženinou, která obsahuje balastní bílkoviny, dále nebudeme pracovat.

c) Enzym s aminoxidasovou aktivitou vysrážíme ze získaného supernatantu přídavkem síranu

amonného do 70% nasycení (na 70% nasycení roztoku obsahujícího již 30 % síranu amonného je třeba 273 g síranu amonného do 1 L). Postupujeme stejně jako v předchozím kroku. Vzniklou sraženinu centrifugujeme (15 min, 7 000 g), supernatant slijeme do válečku, zaznamenáme si objem a odebereme vzorek č. 3 (cca 2 mL). Sraženinu obsahující aminoxidasu rozpustíme v 5 mL 0,1 mol.L-1 K-fosfátového pufru pH 7. Odebereme vzorek č. 4 (cca 2 mL).

49

2. Stanovení aktivity aminoxidasy a) Příprava reakční směsi pro 20 měření

30 mL 0,1 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 7 0,5 mL 0,035 mol.L-1 guajakol 0,5 mL 0,01% křenová peroxidasa

b) Stanovení aktivity K 1,55 mL reakční směsi v kyvetě přidáme - 0,15 mL vzorku č. 1, 2 nebo 3

- nebo 0,05 mL vzorku č. 4 a 0,1 mL vody Reakci startujeme přídavkem 0,05 mL 87,5 mmol.L-1 putrescinu. Po 1 minutě zaznamenáme změnu absorbance. Každé měření opakujeme 3 x. V případě, že změna absorbance za 1 minutu je nižší než 0,1 nebo vyšší než 1, upravíme, po konzultaci s vedoucím cvičení objem vzorku aplikovaný do reakční směsi případně dobu měření. 3. Stanovení obsahu bílkoviny metodou Bradfordové Pro stanovení obsahu bílkoviny 100 x zředíme vzorek 1, 2 a 3 a 500 x vzorek 4. K 1 mL vhodně zředěného vzorku přidáme 2 mL barevného činidla Bradfordové. Roztok promícháme a po 5 minutách měříme absorbanci při 595 nm. Pokud naměřená hodnota nebude v rozsahu 0,05-0,5, upravíme ředění vzorku. Každé měření provedeme 2 x. Pro odečtení koncentrace bílkoviny ve vzorku použijeme kalibrační křivku z úlohy „Stanovení celkových proteinů“. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Vypočítáme aktivitu enzymu, specifickou aktivitu, výtěžek a stupeň přečištění. Aktivitu

vypočteme ze vztahu A = c.ε.l (A – absorbance, ε = molární absorbční koeficient, který má hodnotu 4500 L.mol-1.cm-1, l = délka optické dráhy v cm, c = koncentrace peroxidu vodíku v mol.L-1). Jednotka katal (zkratka kat) odpovídá množství enzymu, které katalyzuje za optimálních podmínek přeměnu jednoho molu substrátu za sekundu. Jeden nanokatal (nkat) je 10-9 kat. Specifická aktivita je aktivita v daném objemu dělena množstvím proteinu. Stupeň přečištění se vypočte ze specifických aktivit tak, že prvnímu kroku se přidělí hodnota 1. Celková aktivita enzymu v prvním izolačním kroku (příprava rostlinného extraktu) odpovídá 100% výtěžku.

2. Výsledky zaznamenáme do následující tabulky. Izolační krok Celkový

objem (mL)

Celková aktivita (nkat)

Celková bílkovina

(mg)

Specifická aktivita

(nkat.mg-1)

Výtěžek

(%)

Stupeň přečištění

Rostlinný extrakt (supernatant)

100 1

I. precipitace síranem (supernatant)

II. precipitace síranem (supernatant)

II. precipitace síranem (sraženina)

KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Jakou reakci katalyzuje aminoxidasa? 2. Jaké izolační postupy lze použít při purifikaci aminoxidasy? 3. Vysvětlete princip stanovení aktivity aminoxidasy používaný v dané úloze. 4. Jakou další metodu pro stanovení aktivity aminoxidasy je možné použít?

50

LITERATURA Šebela M., Frébort I. a Peč, P. (1998) New knowledge about the cofactors of copper amine oxidases as a contribution to the biochemistry of proteins. Chem. Papers (Chemické listy) 92, 698. Ferenčík M. a Škárka B. (1981) Biochemické laboratorné metódy, VTEL (Bratislava). Anzenbacher P. a Kovář J. (1986) Skripta Metody chemického výzkumu pro biochemiky, vydavatelství MŠ ČSR (Praha).

3.2.2. STANOVENÍ KINETICKÝCH PARAMETRŮ AMINOXIDASY TEORETICKÝ ÚVOD Vhodnými substráty aminoxidasy z klíčků hrachu jsou diaminy putrescin a kadaverin. Kadaverin je dokonce oxidován za přítomnosti aminoxidasy rychleji než putrescin, který je však běžnější a dostupnější. Aminoxidasa je dvousubstrátový enzym - prvním substrátem je diamin a druhým kyslík. Mechanismus aminoxidasové reakce má ping-pongový charakter, jak je naznačeno v Clelandově schématu (Obr. 1). V anaerobní fázi reakce dochází nejdříve k reakci enzymu s aminoskupinou aminu (A), uvolní se odpovídající aldehyd (P) a vzniká redukovaná forma enzymu (Ered). Reakcí redukované aminoxidasy s molekulárním kyslíkem (B) dochází k uvolnění H2O2 (Q) a NH3 (R), což je spojeno s reoxidací enzymu (Eox). Obr. 1 Clelandovo schéma bi-ter ping-pongového mechanismu aminoxidasové reakce.

A P B Q RRCH2NH2 RCHO O2 H2O2 NH3

Eox Eox-A Ered-P Ered Ered-B Eox-QR Eox-R

Enzymovou reakci v aktivním místě aminoxidasy zprostředkovávají chinonový kofaktor a ion Cu2+. Interakce chinonového kofaktoru s primární aminoskupinou substrátu vede k tvorbě kovalentní vazby a vzniku chinoketiminu. Zachycením α-protonu substrátu histidinovým zbytkem vzniká z chinoketiminu karbanion, který se velmi rychle mění na bezbarvý chinoaldimin. Po uvolnění aldehydu se v aktivním centru tvoří redukovaná forma kofaktoru, aminokatechol. Stav Cu(II)-aminokatechol je v rovnováze s radikálovou formou Cu(I)-semichinon, semichinolaminem. Jeho reakcí s molekulárním kyslíkem vzniká opět oxidovaná forma enzymu, uvolní se peroxid vodíku a amoniak.

Při dalších kinetických měřeních budeme uvažovat, že koncentrace kyslíku (vzduchu) je stálá po celou reakční dobu, reakční směs je nasycena vzduchem, a můžeme proto měnit koncentraci putrescinu a studovat Km (Michaelisovu konstantu) stejně jako inhibitory ve vztahu k diaminu. Základní konstanty enzymové kinetiky

Z prvotních studií enzymové kinetiky vyplynulo, že pokud je koncentrace substrátu mnohem vyšší než koncentrace enzymů, stává se reakční rychlost nezávislou na jejich koncentraci a reakce je vzhledem k substrátu nultého řádu.

51

Existuje představa, že celková reakce je složena ze dvou elementárních reakcí, v nichž substrát tvoří s enzymem komplex, který se posléze rozkládá na produkt a enzym (pro enzymy složené z identických podjednotek se E vztahuje spíše k aktivním místům než k molekulám enzymu):

EPESSE21 +→→←+ kk

k-1 (E - enzym, S - substrát, ES - komplex enzym-substrát, P produkt, k1 je rychlostní konstanta druhého řádu, má rozměr mol-1.sec-1 (resp. mol-1.min-1), k2 stejně jako k-1 jsou rychlostní konstanty prvého řádu, mají rozměr sec-1 (resp. min-1). Rovnice pro rychlost reakce je:

[ ]ESd

dP2 ×== k

tv

Rychlost produkce ES je rozdílem mezi rychlostí vzniku ES a jeho rozpadu:

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]ESESSEdESd

211 ×−×−××= − kkkt

Pro tuto rovnici neexistuje explicitní řešení, a proto je nutné použít zjednodušující předpoklad. Za fyziologické situace existuje běžně velký nadbytek substrátu vůči enzymu. S výjimkou počátečních několika milisekund po smíchání enzymu a substrátu zůstává centrální komplex ES přibližně konstantní, dokud není substrát úplně vyčerpán. Rychlost tvorby ES se musí rovnat rychlosti jeho rozpadu během téměř celého průběhu reakce. Je evidentní, že v tomto případě je ES konstantní, tj.:

[ ]0

d

ESd =t

a hovoříme o předpokladu ustáleného stavu. Z výše uvedených předpokladů a pro praktické použití experimentálně měřitelných hodnot byla odvozena rovnice pro rychlost enzymové reakce. Rovnice bývá označována jako rovnice Michaelise a Mentenové. Grafem je pravoúhlá hyperbola.

[ ][ ]SS

m0

+×=

K

VV

Km je tzv. Michaelisova konstanta, neboli konstanta poloviční saturace: 1

21m

k

kkK

+= −, V mezní

neboli limitní rychlost (také bývá označována Vlim), která nastává při vysokých koncentracích substrátu, kdy je enzym nasycen a tedy zcela ve formě ES. Michaelisovu konstantu lze definovat jako koncentraci substrátu, při které je reakční rychlost rovna polovině rychlosti limitní. Hodnota Km kolísá s druhem enzymu a charakterem substrátu, je funkcí teploty a pH. Může být vyjádřena také takto:

1

2S

1

2

1

1m

k

kK

k

k

k

kK +=+= −

Protože KS je disociační konstanta komplexu ES, afinita enzymu k substrátu vzrůstá s klesající KS.

Proto je Michaelisova konstanta měřítkem afinity enzymu k jeho substrátu za předpokladu, že 1

2

k

k

je malé ve srovnání s KS, tj., že k2 >> k-1. Druhým faktorem při posuzování vztahu enzym-substrát je V, tzn. rychlost přeměny

substrátu. Z tohoto hlediska je nejlepším substrátem daného enzymu ten, jehož poměr mK

V je

nejvyšší.

52

Dalším měřítkem katalytické účinnosti enzymů je katalytická konstanta, která je

definována jako [ ]TkatEV

k = , kde [E]T je celkové množství enzymu. Hodnota katalytické konstanty

je známa také jako číslo obratu (nebo přeměny) enzymu. Je to prakticky počet reakčních dějů (obrátek), které každé aktivní místo katalyzuje za jednotku času. Pro model Michaelise a Mentenové je 2kat kk = . Je-li S << Km, tvoří se jen velmi málo ES. Rovnici Michaelise a Mentenové můžeme redukovat na rychlostní rovnici druhého řádu:

[ ] [ ] [ ] [ ]SESEm

katT

m

20 ××=××=

K

k

K

kv

Hodnota m

kat

K

k je zdánlivá rychlostní konstanta druhého řádu enzymové reakce a je měřítkem

katalytické účinnosti enzymu. Zjištění hodnot kinetických konstant z vynesení závislosti počáteční rychlosti na

koncentraci substrátu (hyperbola) je graficky obtížné a nepřesné. Běžné je dnes počítačové zpracování těchto dat, tzv. ”fitting”. Pro běžné a názorné zpracování slouží převod hyperboly na přímku neprocházející počátkem dle Hanse Lineweavera a Deana Burka (dvojitě reciproká závislost):

[ ] VV

K

v

1S11 m

0+×=

Proměnné jsou 0

1

va [ ]S

1. Směrnice přímky je

V

Km, úsek na ose

0

1

vodpovídá

V

1a extrapolovaný

úsek na ose [ ]S

1 je roven

m

1K

− .

Existují další lineární vynesení jako např:

Dle Hanese a Woolfa, [ ]

0

S

v proti [ ]S , dle rovnice

[ ] [ ]V

K

Vv

m

0S

1S +×=

Dle Woolfa, Augustinssona a Hofstee, 0v proti [ ]S

0v, dle rovnice [ ] V

vKv +×−=

S0

m0

Dle Eadie a Scatcharda, [ ]S

0v proti 0v , dle rovnice [ ] m

0m

0 1S

KVv

K

v+×−=

Inhibice a inhibitory

Inhibitory jsou látky snižující rychlost enzymových reakcí. Vlastní jev inhibice může mít charakter ireversibilní nebo reversibilní. Znamená to, že v případě ireversibilní inhibice se inhibitor váže na enzym nebo komplex enzym-substrát pevnou kovalentní vazbou, zatímco v případě reversibilní inhibice je vazba inhibitoru nekovalentní a inhibitor může volně z komplexu oddisociovat. V dalším postupu se budeme věnovat třem nejběžnějším typům reverzibilní inhibice. Kompetitivní inhibice - inhibitor se váže do aktivního místa enzymu nebo v jeho blízkosti a vytváří inaktivní komplex EI. Inhibitorem je obvykle strukturní analog substrátu, ale může to být také substrát enzymu s vyšší hodnotou Km. Kompetitivní inhibici lze potlačit nadbytkem substrátu. Model pro kompetitivní inhibici je dán tímto reakčním schématem:

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]EPESSE +→←→←+

[ ] [ ] [ ]EIIE →←+ nevzniká žádný produkt Vzhledem k tomu, že se jedná o reverzibilní vazbu inhibitoru na enzym, můžeme psát výraz pro inhibiční konstantu:

53

[ ] [ ][ ]EI

IEi

×=K

Při hodnocení charakteru inhibice používáme nejčastěji reciprokou rovnici dle Lineweavera a Burka upravenou pro kompetitivní inhibici:

[ ][ ] VKV

K

v

1S1I

11

i

m

i+×

+×=

Z rovnice je patrné, že při kompetitivní inhibici se nemění limitní rychlost V, ale Km roste (jedná se o tzv. zdánlivou Michaelisovu konstantu, angl. apparent). Prakticky měříme rychlosti enzymové reakce při pěti různých koncentracích substrátu

(kolem hodnoty Km v rozsahu jednoho řádu), které vyneseme do grafu závislosti i

1v

proti [ ]S

1.

Získáme první přímku, která protíná osu i

1v

v bodě V

1 a osu [ ]S

1 v bodě

m

1K

− . Další tři měření

provedeme s určitými (v našem případě třemi) koncentracemi inhibitoru. Pokud se jedná o čistou

kompetici, protnou se všechny čtyři přímky v bodě V

1 (na ose y). Poté sestrojíme sekundární

graf, kde vynášíme směrnice přímek z primárního grafu proti koncentraci inhibitoru (máme celkem čtyři koncentrace inhibitoru, včetně nulové). Získaná přímka se protíná s osou koncentrace inhibitoru v bodě Ki, což je inhibiční konstanta, neboli disociační konstanta komplexu EI. Tato konstanta představuje koncentraci inhibitoru, která zdvojnásobuje směrnici přímky v Lineweaverově - Burkově vynesení (Obr. 2). Nekompetitivní inhibice - inhibitor se váže obvykle mimo aktivní místo, ale nepřímo zabraňuje vazbě substrátu na enzym. Vznikají tři komplexy ES, EI a ternární komplex ESI. Model pro nekompetitivní inhibici lze znázornit následujícím modelem:

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]EPESSE +→←→←+

[ ] [ ] [ ]EIIE →←+ žádný produkt

[ ] [ ] [ ]ESIIES →←+ žádný produkt Oba kroky vazby inhibitoru jsou v rovnováze, ale mají různé disociační konstanty:

[ ] [ ][ ]EI

IE ×=iK a [ ] [ ]

[ ]ESI

IES ×=iK

Nekompetitivní inhibice je zvláštním druhem smíšené inhibice, kdy se inhibitor váže se stejnou disociační konstantou na volný enzym i na komplex ES a obě výše uvedené inhibiční konstanty jsou shodné.

V Lineweaver a Burkově reciproké rovnici jsou změněny oba členy o hodnotu [ ]

+i

I1

K:

[ ][ ]

[ ]

+×+×

+×=ii

m

i

I1

1S1I

11

KVKV

K

v

Při praktickém provedení postupujeme analogicky jako v případě kompetitivní inhibice. Pro různé

koncentrace nekompetitivního inhibitoru získáme svazek přímek, které s protínají na ose ]S[

1.

Inhibiční konstantu získáme ze sekundárních grafů vynesením průsečíků přímek primárního grafu

s osou i

1v

proti koncentraci inhibitoru nebo vynesením sklonů přímek primárního grafu proti

koncentraci inhibitoru (Obr. 3). Při čisté nekompetitivní inhibici by se hodnoty obou takto

54

získaných inhibičních konstant měly shodovat. Ki je zde rovna koncentraci inhibitoru, při níž dochází ke snížení aktivity enzymu na polovinu (50% inhibice enzymu). Akompetitivní inhibice - inhibitor se váže až na vzniklý komplex ES za vzniku ternárního inaktivního komplexu ESI. Reciproká rovnice dle Lineweaver a Burka má tvar:

[ ][ ]

+×+×=i

m

i

I1

1

S

11

KVV

K

v

Grafem je svazek rovnoběžných přímek. Akompetitivní inhibitor snižuje hodnoty Km i V. Inhibiční konstanta akompetitivní inhibice je rovna koncentraci inhibitoru, při níž dochází ke snížení aktivity enzymu na polovinu při plné saturaci enzymu substrátem. Určí se analogickým způsobem jako ve dvou předchozích případech (Obr. 4). Obr. 2 Inhibice aminoxidasy (izolované z pískavice řecké seno) 3-pentanon-1,5-diaminem. a) závislost 1/A436 na 1/c (v legendě jsou uvedeny výsledné koncentrace inhibitoru v nmol.L-1)

b) závislost směrnice přímek grafu (a) na koncentraci inhibitoru a)

0

2

4

6

8

-4 -2 0 2 4 61/c [mmol.L-1]

1/A

0

12,5

25

50

b)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

-25 -15 -5 5 15 25 35 45 55Koncentrace 1,5-diamino-3-pentanonu

[nmol.L -1]

Směrn

ice

55

Obr. 3 Inhibice aminoxidasy (izolované z pískavice řecké seno) triethylentetraminem. a) závislost 1/A436 na 1/c (v legendě jsou uvedeny výsledné koncentrace inhibitoru v µmol.L-1) b) závislost směrnice přímek grafu (a) na koncentraci inhibitoru a)

0

2

4

6

-4 -2 0 2 4 61/c [mmol.L-1]

1/A

0

0,5

1

2

Lineárn

b)

0

0,2

0,4

0,6

-2 -1 0 1 2 3

Koncentrace triethylentetraminu [µµµµmol.L -1]

Směrn

ice

Obr. 4 Inhibice aminoxidasy (izolované z pískavice řecké seno) azidem sodným. a) závislost 1/A436 na 1/c (v legendě jsou uvedeny výsledné koncentrace inhibitoru v mmol.L-1) b) závislost úseků na ose y vytčených přímkovými závislostmi v grafu (a) na koncentraci inhibitoru a)

0

1

2

3

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 61/c [mmol.L-1]

1/A

0

5

10

20

Lineárn

56

b)

0

0,5

1

1,5

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25

Koncentrace azidu sodného [mmol.L-1]

Úse

k

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: 0,035 mol.L-1 guajakol (Mr = 124,1), 0,01% křenová peroxidasa - HRP, 87,5 mmol.L-1

putrescin, 0,1 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 7, 20 mmol.L-1 L-lobelin HCl (Mr = 373,9), 20 mmol.L-1

cinchonin (Mr = 294,4), 5 mmol.L-1 8-hydroxychinolin (Mr = 145,2), 700 µmol.L-1 β-aminopropionitril, částečně přečištěný extrakt AO z klíčků hrachu (5 mL - zmrazený), roztoky putrescinu diHCl připravené dle následujícího postupu a tabulky: Níže uvedený postup ředění roztoků substrátu je zvolen z toho důvodu, že běžné provedení ve smyslu dvojitě reciproké závislosti vykazuje nestejnoměrné úseky na ose 1/[S] komplikující proložení lineárních závislostí. Postup usnadňuje dávkování různých koncentrací substrátu jednotným přídavkem (50 µL). Základní roztok 87,5 mmol.L-1 putrescin diHCl. (Mr putrescin diHCl 161,1; 141 mg putrescinu diHCl do 10 mL vody). Materiál: kádinky, pipety, míchadlo, umělohmotné kyvety se stojanem, centrifugační zkumavky, odměrný válec. Přístroje: spektrofotometr. Tabulka 1 Ředění roztoků pro kinetická měření. Další větší nebo menší objemy ředěných roztoků můžete získat násobením nebo dělením prezentovaných poměrů.

Číslo roztoku

putrescinu

Destilovaná voda

(mL)

Putrescin 87,5 mmol.L-1

(mL)

Putrescin konc. zředěného

zásobního roztoku (mmol.L-1)

Putrescin konc. v kyvetě

[S] (mmol. L-1)

Putrescin konc. v kyvetě

1/[S] (L.mmol-1)

1 3,0 2,0 35 1 1,0 2 4,0 1,0 17,5 0,500 2,0 3 2,6 0,4 11,66 0,333 3,0 4 3,6 0,4 8,75 0,250 4,0 5 4,6 0,4 7,00 0,200 5,0 6 5,6 0,4 5,83 0,166 6,0

PRACOVNÍ POSTUP Pro pohodlnější měření si nejdříve připravíme reakční směs např. na 60 měření:

90 mL 0,117 mol.L-1 K-fosfátový pufr pH 7 1,5 mL 0, 035 mol.L-1 guajakol 1,5 mL 0,01% křenová peroxidasa

57

Stanovení aktivity provádíme nejméně ve třech paralelách.

• Do kyvety napipetujeme dle rozpisu v tabulce 2 reakční směs, enzym s aminoxidasovou aktivitou (přečištěný extrakt hrachu) (Tab. 1), vodu a případně inhibitor.

• Reakci startujeme přídavkem putrescinu o známé koncentraci • Po 1 minutě zaznamenáme změnu absorbance. V případě, že změna absorbance za 1 minutu je

nižší než 0,1 nebo vyšší než 1, upravíme po konzultaci s vyučujícím objem vzorku enzymu aplikovaný do reakční směsi, případně dobu měření.

Tabulka 2

Kyveta Reakční směs (mL)

Aminoxidasa (mL)

Inhibitor (mL)

Voda (mL)

Startovat přídavkem putrescinu (mL)

První sada 1 1,55 0,05 0 0,1 0,05(1) 2 1,55 0,05 0 0,1 0,05(2) 3 1,55 0,05 0 0,1 0,05(3) 4 1,55 0,05 0 0,1 0,05(4) 5 1,55 0,05 0 0,1 0,05(5) 6 1,55 0,05 0 0,1 0,05(6)

Druhá sada 7 1,55 0,05 0,05 0,05 0,05(1) 8 1,55 0,05 0,05 0,05 0,05(2) 9 1,55 0,05 0,05 0,05 0,05(3) 10 1,55 0,05 0,05 0,05 0,05(4) 11 1,55 0,05 0,05 0,05 0,05(5) 12 1,55 0,05 0,05 0,05 0,05(6)

Třetí sada 13 1,55 0,05 0,1 0 0,05(1) 14 1,55 0,05 0,1 0 0,05(2) 15 1,55 0,05 0,1 0 0,05(3) 16 1,55 0,05 0,1 0 0,05(4) 17 1,55 0,05 0,1 0 0,05(5) 18 1,55 0,05 0,1 0 0,05(6)

VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Výsledky měření vyneseme do dvojnásobně reciprokého grafu. 2. Určíme Km, charakter inhibice a Ki použitých inhibitorů. Namísto přepočtu absorbance na rychlost enzymové reakce vyneseme v grafu naměřenou absorbanci (resp. její reciprokou hodnotu). V sekundárním grafu pro zjištění Ki vynášíme na osu y sklony přímek z primárního grafu (resp. také průsečíky přímek s osou 1/vi) proti koncentraci inhibitoru (osa x). KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Jak rozeznáte ireverzibilní inhibici od reverzibilní? 2. K čemu slouží inhibiční studie enzymů? LITERATURA Macholán L., Barthová J. a Kučera I. (1994) Skripta Enzymologie, vydavatelství MU (Brno).

58

3.3. PROTEOLYTICKÉ ENZYMY

TEORETICKÝ ÚVOD Jako proteolytické enzymy, zkráceně proteasy (EC 3.4.), označujeme všechny enzymy, které katalyzují exergonickou hydrolýzu peptidových vazeb v proteinech a peptidech. Patří proto do enzymové třídy hydrolas. Na rozdíl od většiny ostatních enzymů nejsou proteasy přísně specifické vůči určitému substrátu (tedy vůči určité bílkovině), ale jsou specifické vůči určitým strukturním znakům peptidového řetězce. Podle místa jejich působení na polypeptidový řetězec je dělíme do dvou skupin: 1. Endopeptidasy (proteinasy) katalyzují hydrolýzu vazeb uvnitř peptidového řetězce, přičemž vznikají štěpné peptidy rozmanité velikosti. Mohou být dále děleny na kyselé, neutrální a bazické endopeptidasy. Mezi enzymy typu neutrálního a bazického jsou rozlišovány serinové proteinasy a thiolové proteinasy. Příklady živočišných proteinas jsou pepsin, rennin (chymosin), trypsin, chymotrypsin, elastasa, thrombin a plasmin. Z rostlinných a bakteriálních proteas můžeme zmínit papain, ficin, bromelain, subtilisin a thermolysin. Existují také proteasy z kvasinek, plísní a hub. 2. Exopeptidasy (peptidasy) katalyzují hydrolytické odštěpení samotné koncové (terminální) aminokyseliny z polypeptidového řetězce. Mohou být proto klasifikovány jako N-terminální exopeptidasy (aminopeptidasy, např. leucin aminopeptidasa, aminopeptidasa M) nebo C-terminální exopeptidasy (karboxypeptidasy A, B, P, Y atd.). Di- a tripeptidasy se považují rovněž za exopeptidasy.

Serinové proteinasy (EC 3.4.21) jsou skupinou živočišných a bakteriálních proteas, které mají podobný mechanismus působení a obsahují přitom katalyticky aktivní zbytek serinu (hydroxylovou skupinu) v aktivním místě. Katalytický mechanismus u všech serinových proteinas zahrnuje tvorbu esterové vazby mezi hydroxylovou skupinou katalyticky aktivního serinu a karboxylovou skupinou štěpené peptidové vazby (derivát acyl-enzym) (Obr. 1). Intermediát je hydrolyzován v deacylační fázi reakce, přičemž se regeneruje hydroxyskupina serinu a dojde k uvolnění štěpného peptidu. Součástí aktivního místa je také zbytek kyselé či bazické aminokyseliny (His, Asp) fungující jako donor či akceptor protonů. Katalytický serinový zbytek je selektivně a ireverzibilně zablokován acylací vlivem organických esterů kyseliny fosforečné - tzv. organofosfátů (diisopropylfluorofosfát, DFP), nebo působením fenylmethan-sulfonylfluoridu (PMSF). Tyto látky jsou proto silnými inhibitory serinových proteinas. Typickými zástupci této skupiny proteolytických enzymů jsou trypsin, chymotrypsin a elastasa z pankreatu, thrombin, plasmin a kallikrein z krevní plasmy, z bakteriálních enzymů např. subtilisin z Bacillus subtilis, trypsinu podobná proteasa ze Streptomyces griseus a další. Thiolové proteinasy (EC 3.4.22) nesou v aktivním místě katalytický zbytek cysteinu (volná thiolová - sulfhydrylová skupina). Jsou proto inaktivovány blokujícími sulfhydrylovými reagenty jako jsou např. jodacetát, N-ethylmaleinimid či p-chlormerkuribenzoát. Naproti tomu 2-merkaptoethanol či dithiothreitol (DTT) jsou významnými aktivátory těchto enzymů. Katalytický mechanismus zahrnuje v první fázi vytvoření thioesterové vazby mezi thioskupinou katalyticky aktivního cysteinu a karboxylovou skupinou štěpené peptidové vazby. Po hydrolýze intermediátu se regeneruje volná SH-skupina analogicky jako u serinových proteinas. Příklady zmíněných enzymů jsou rostlinné proteasy papain, ficin a bromelain. U "kyselých" proteinas (EC 3.4.23) se katalýzy účastní zbytek kyselé aminokyseliny např. kyseliny asparagové (pepsinu). Aspartyl vstupuje do transpeptidační reakce s NH- skupinou té peptidové vazby, která má být štěpena. Jako první štěpný produkt se tak uvolní karboxyl a teprve ve druhé fázi reakce (regenerace enzymu) se uvolňuje aminoskupina. Jde tedy o obrácený průběh působení trypsinu.

59

Obr. 1 Mechanismus štěpení peptidu chymotrypsinem

R CH

NH2

C NH CH COOH

O R1

chymotrypsin

O H

CH2

+_

N N

Ser 197 His 57

+_NO

CH2

H

R CH

NH2

C NH CH COOH

O R1

chymotrypsin

chymotrypsin

1. produkt

acylchymotrypsin

N N

CH2

R CH

NH2 CH COOH

O

R1

H2N

C O

+

CH COOH

R1

H2NH2O+

2. produkt

N

Metalloproteasy obsahují dvojmocné kovové ionty nebo vyžadují jejich přidání, mají-li být plně aktivní. Mezi metalloproteinasy (EC 3.4.24) patří thermolysin (Zn2+, Ca2+) a kolagenasa z bakterie Clostridium histolyticum (Ca2+). Karboxypeptidasy A a B (EC 3.4.17) obsahují zinečnatý ion. Vzhledem k ústřední funkci při biodegradaci proteinů, která vede k opětovnému využívání či odbourávání aminokyselin, jsou proteasy u živých organismů široce zastoupeny. Vysoké koncentrace těchto enzymů byly nalezeny v trávicím traktu živočichů (extracelulární proteasy) a v lysozomech buněk eukaryotických organismů (intracelulární proteasy), kde katalyzují úplné odbourání proteinů přijatých potravou, respektive buněčných proteinů, na aminokyseliny. Bakteriální proteasy jsou často vylučovány jako extracelulární do média. Nejznámější proteasy přísluší k metaloenzymům. Obsahují nebo vyžadují kovový ion (např. Zn2+) jako aktivátor nebo stabilizátor. Sebedegradaci (autolýze) je bráněno syntézou proteolytických enzymů ve formě inaktivních prekurzorů (zymogenů), přítomností specifických přirozených inhibitorů proteas a v případě intracelulárních enzymů díky kompartmentaci buňky oddělením od cytoplasmy ve speciálních buněčných organelách - lysozomech. Přehled významných proteas • pepsin; nachází se v žaludku všech obratlovců s vyjímkou ryb, které žaludek postrádají (např.

kapr). Pepsin vykazuje maximální aktivitu při pH 1 - 2, pH optimum v žaludku se nachází v rozmezí 2 - 4. Pepsin štěpí peptidovou vazbu mezi dvěma hydrofobními aminokyselinami (Phe-Leu, Phe-Phe, Phe-Tyr). S vyjímkou bazických protaminů a proteinů s bohatou cukernou složkou působí na většinu proteinů. Produkty působení pepsinu jsou tzv. peptony - směsi peptidů s Mr

60

300 - 3000. Pepsin je vytvářen v inaktivní formě pepsinogenu, který se v aktivní pepsin přeměňuje autokatalyticky v přítomnosti HCl. Největší ze štěpných peptidů přitom působí jako inhibitor pepsinu. U člověka jsou známy čtyři isoenzymy pepsinu označované A, B, C a D.

• trypsin; serinová proteinasa, vytvářená v podobě zymogenu (trypsinogenu) v pankreatu všech obratlovců. Uvolňován je do dvanáctníku. Konverze trypsinogenu na trypsin je iniciována v tenkém střevě působením enterokinasy (enteropeptidasy), urychlována je autokatalyticky vznikajícím trypsinem a vápenatými ionty. Podstatou aktivace je odštěpení N-koncového hexapeptidu z trypsinogenu. Molekula trypsinu obsahuje 6 disulfidových vazeb. Trypsin specificky katalyzuje hydrolýzu vazeb vycházejících z bazických aminokyselin Lys a Arg, pH optimum enzymu je 7 - 9. Působí také na umělé N-acylované arginyl- a lysylestery nebo N-acylované arginyl- a lysylarylamidy, čehož se využívá při stanovení aktivity. Vyskytuje se celá řada přirozených inhibitorů trypsinu, např. trypsinový inhibitor ze soji. Tyto látky se spojují s trypsinem, ale neštěpí se a blokují tak enzym vzhledem k jiným substrátům.

• chymotrypsin; ve skutečnosti jde o řadu strukturně a katalyticky podobných homologních serinových proteinas tvořených a deponovaných v pankreatu ve formě inkativního zymogenu - chymotrypsinogenu (známy jsou chymotrypsinogeny A, B a C). Aktivaci zprostředkovává v tenkém střevě trypsin. Na rozdíl od výše uvedené aktivace trypsinu jde o vícekrokový proces vedoucí k několika aktivním formám chymotrypsinu. Ve struktuře α-chymotrypsinu vznikajícího z chymotrypsinogenu A je 5 disulfidových vazeb. Všechny chymotrypsiny při hydrolýze preferují vazby aromatických aminokyselin Phe, Tyr a Trp. Optimální pH pro reakci se nachází v rozmezí 8 - 8,5. Působí také na phenylalanylové, tyrosylové a tryptofanylové esterové vazby.

• rennin (chymosin, syřidlo); kyselá proteinasa podobná pepsinu, která se vyskytuje v žaludku telat. Tvoří se však pravděpodobně i v žaludku jiných savců. Vzniká v podobě inaktivního prorenninu, který je aktivován působením pepsinu či autokatalyticky. Hlavním substrátem enzymu je kaseinogen (kasein) v mléce, který se jeho účinkem mění na nerozpustný kasein (parakasein). Tím je odstraněna protektivní koloidační funkce kaseinu a je umožněno využití živin v mléce.

• papain; thiolová proteinasa z latexu a nezralých plodů tropického melounového stromu (papáji, Carica papaya). Vyznačuje se neobvyklou stabilitou vůči působení zvýšené teploty a některým denaturačním činidlům. Obsahuje 4 disulfidové vazby a katalyticky aktivní zbytky cysteinu a histidinu. Hodnota pH optima je v rozmezí pH 5 - 5,5. Ve specifitě zásahu se blíží trypsinu a chymotrypsinu. Má širokou substrátovou specifitu (endopeptidasa, esterasa, amidasa). Podobnou, avšak ne identickou specificitu má chymopapain.

• bromelain; thiolová proteasa ze stonku a plodů bromélie (ananasovníku). Enzym ze stonku je bazický glykoprotein, strukturně a katalyticky podobný papainu.

• ficin; thiolová proteasa z latexu rostlin Ficus spp. Působí podobně jako papain, preferuje štěpení vazeb Lys, Ala, Tyr, Gly, Asn, Leu a Val.

• subtilisin; extracelulární proteinasa z Bacillus subtilis a příbuzných druhů. V aktivním místě obsahuje reaktivní serinový zbytek, katalýzy se dále účastní zbytky His a Asp. Struktura enzymu se však podstatně liší od jiných serinových proteinas (trypsin, chymotrypsin). Neobsahuje žádný disulfidový můstek. Má široké spektrum účinnosti vůči různým aminokyselinovým zbytkům, přednostně ale působí na Asp, Glu, Ala, Leu a Val. Enzym je aktivován ionty Ca2+.

• thermolysin; teplotně odolná metalloproteinasa z Bacillus thermoproteolyticus se substrátovou specifitou podobnou subtilisinu. Štěpí zvláště vazby, kde NH- skupina přísluší aminokyselině s hydrofobním postranním zbytkem (Ile, Leu, Val, Phe). Vysoká teplotní stabilita (po zahřívání 1 h při 80 oC zůstává 50 % aktivity) se přičítá rozsáhlým hydrofobním doménám v molekule a přítomnosti vápenatých iontů, které udržují kompaktní tvar molekuly. Neobsahuje žádný disulfidový můstek.

61

• proteinasa K; serinová proteinasa z Tritiachirum album. Hydrolyzuje proteiny s místem účinku při karboxylu aromatických nebo hydrofobních aminokyselinových zbytků.

• thrombin, plasmin a faktor Xa jsou serinové proteinasy krevní plasmy, účastní se procesů spojených s krevní koagulací.

• kathepsiny; intracelulární endopeptidasy lokalizované v lysozomech. Dělí se na kathepsiny A, B, C, D a E. Kathepsiny B a C jsou thiolové proteasy, kathepsin D obsahuje katalytický aspartyl.

• pronasa; směs několika nespecifických endo- a exopeptidas ze Streptomyces griseus. Odbourání proteinů působením pronasy vede k volným aminokyselinám.

• karboxypeptidasy A a B se vyskytují také v ledvinách a slezině, ve velkém množství jsou ale obsaženy v trávicím sekretu. Karboxypeptidasa A odštěpuje zvláště ty koncové skupiny, které se uvolňují chymotrypsinem. Naproti tomu štěpí karboxypeptidasa B přednostně bazické aminokyseliny na karboxylovém konci a odbourává tak peptidy vzniklé působením trypsinu. Oba tyto enzymy patří k metalloproteasám, obsahují zinečnaté ionty.

• aminopeptidasa M; metalloproteasa (Zn2+) kompletně hydrolyzující peptidy a proteiny s volnými α-aminoskupinami. Nepůsobí na Asp, Glu nebo β-Ala.

Stanovení aktivity proteolytických enzymů

Aktivitu proteolytických enzymů je možné stanovit měřením koncentrace tyrosinu uvolněného do roztoku Lowryho metodou po odstranění zbytkového proteinového substrátu (hemoglobinu) precipitací s kyselinou trichlorooctovou a následnou centrifugací (Ansonův test). Pro některé proteasy se využívá umělých substrátů na bázi peptidů, esterů, amidů a nitroanilidů. Enzymovou aktivitu trypsinu je takto možné určit s použitím BAEE (N-α-benzoyl-L-argininethylester), N-α-benzoyl-L-arginin-4-nitroanilidu nebo N-α-benzoyl-L-arginin-7-amido-4-methylkumarinu. Pro chymotrypsin se využívá BTEE (N-α-benzoyl-L-tyrosinethylester) nebo ATEE (N-acetyl-L-tyrosinethylester). Tyto substráty jsou však poměrně drahé. Velmi jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná je metoda využívající cytochromu c jako substrátu proteas. Obr. 2 Struktura aktivního místa cytochromu c

62

Cytochrom c katalyzuje v přítomnosti peroxidu vodíku oxidaci rozmanitých látek, jež mohou vystupovat jako donory elektronů - různé fenoly, luminol, 4-aminoantipyrin, kyselina 2,2´-azino-bis(3-ethylbenzenthiazolin)-6-sulfonová (ABTS). Podobně katalyzuje oxidace vhodných substrátů (např. aromatických aminů, benzidinu a jeho derivátů) peroxidem vodíku také hemoglobin. Nejedná se přitom o enzymovou aktivitu - hemoglobin ji neztrácí ani po tepelné denaturaci. Působení proteas trypsinu, chymotrypsinu či subtilisinu na cytochrom c vzniká degradační produkt o relativně nízké molekulové hmotnosti - jde o oktapeptid (viz Obr. 2) H2N-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-COOH s kovalentně vázaným hemem, původní prostetickou skupinou cytochromu c. Tato látka se nazývá mikroperoxidasa-8 (MP-8). Digesce cytochromu c vlivem pepsinu analogicky vede k hemovému undekapeptidu. Mikroperoxidasa MP-8 vykazuje zajímavé enzymové vlastnosti. Při pH 4,9 má MP-8 až 20 x vyšší peroxidasovou aktivitu než samotný cytochrom c. Oxiduje elektrondonory jako ABTS a různé fenoly, např. guajakol (o-methoxyfenol). Současně také působením peroxidu vodíku dochází k degradaci MP-8 v kompetující reakci. Trypsin, patřící mezi serinové proteasy, hydrolyzuje nejenom peptidové vazby v proteinech, které vycházejí z karboxylového konce bazických aminokyselin argininu a lysinu, ale stejně dobře působí na esterové nebo amidové vazby v umělých nízkomolekulárních substrátech. Amidasovou aktivitu trypsinu měříme například s použitím syntetické látky Nα-benzoyl-DL-arginin-4-nitroanilidu (BAPNA) (Obr. 3). Hydrolytickým působením trypsinu na substrát se tvoří volný 4-nitroanilin. Látka absorbuje ve viditelné oblasti spektra s maximem 405 nm. Měřením časové změny absorbance při uvedené vlnové délce lze takto pohodlně měřit rychlost tvorby 4-nitroanilinu a tím i aktivitu trypsinu. Číselnou hodnotu aktivity trypsinu vypočteme pomocí daného molárního absorpčního koeficientu 4-nitroanilinu (ε = 8270 L.mol-1.cm-1). Aktivitu trypsinu pak vyjádříme v jednotkách nkat nebo IU. Obr. 3. Umělé substráty BAPNA a BAEE

Pro stanovení esterasové aktivity trypsinu použijeme obdobný substrát ethylester Nα−benzoyl-L-argininu (BAEE) (Obr. 3). Hydrolýza v tomto případě nevede k tvorbě barevného produktu, jejím vlivem však dochází k nárůstu absorbance při 253 nm. Pro vyjádření aktivity s použitím substrátu BAEE se v literatuře objevují např. BAEE jednotky nebo USP jednotky. Přepočet na IU je pak následující: 1 IU = 270 BAEE j. = 90 USP j. Pro kalkulaci číselné hodnoty aktivity vycházíme z diferenčního molárního absorpčního koeficientu BAEE a Nα-benzoyl-DL-argininu, který činí ∆ε = 808 L.mol-1.cm-1.

NH

NO2NH

O

NH

NH2

NH

O

NH

O

NH

NH2

NH

O CH3

O

63

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: hemoglobinový substrát podle Ansona (připravuje laborantka): 2 g hemoglobinu z hovězích erytrocytů a 36 g močoviny se rozpustí v destilované vodě a přidá se 8 mL 1 mol.L-1 NaOH. Objem se pak doplní destilovanou vodou na 100 mL a roztok se ponechá stát 1 h při laboratorní teplotě. Poté se přidá 10 mL 1 mol.L-1 KH2PO4 a 4 g močoviny. Roztok se zfiltruje přes filtrační papír. Hodnota pH hemoglobinového substrátu má být 7,8 a obsah proteinů stanovený Lowryho metodou s BSA jako substrátem 6,15 mg.mL-1; 40 mmol.L-1 Britton-Robinsonův pufr pH 8,0: 100 mL roztoku, který obsahuje 40 mmol.L-1 H3PO4, 40 mmol.L-1 CH3COOH a 40 mmol.L-1 H3BO3 (2,7 mL 85% H3PO4, 2,3 mL ledové CH3COOH a 2,74 g H3BO3 na litr roztoku se smísí s 60 mL 0,2 mol.L-1 NaOH), pro vytvoření konstantní iontové síly I=0,15 se může přidat 1,17 g pevného NaClO4.H2O; činidla A a B pro stanovení celkových proteinů Lowryho metodou, fyziologický roztok (0,9% NaCl), roztok cytochromu c z vepřového srdce (0,4 mg.mL-1 fyziologického roztoku), roztok chymotrypsinu z hovězího pankreatu (0,8 mg.mL-1 fyziologického roztoku); roztok trypsinu z hovězího pankreatu (0,8 mg.mL-1 fyziologického roztoku), roztok subtilisinu (Bacillus subtilis carlsbergensis, 0,2 mg.mL-1 fyziol. roztoku a dále 10 krát zředit), 25% kyselina trichloroctová, 0,03% peroxid vodíku, 25 mmol.L-1 guajakol, standardní roztok tyrosinu (10 mg tyrosinu ve 100 mL fyziologického roztoku), 50 mM Nα-benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) a Nα-benzoyl-L-arginin (BAEE) v DMSO, Tris, kyselina chlorovodíková, dimethylsulfoxid (DMSO), 50 mM Tris-HCl, pH 8.5; trypsin (2 mg.mL-1 v 1 mM HCl nebo 5% kyselině octové). Materiál: stojany s malými (10 cm) a velkými (15 cm) zkumavkami, centrifugační mikrozkumavky, pipety, kádinky, odměrné baňky se zátkami (2 x 10 mL), střední plastová miska na ledovou lázeň. Přístroje: termostaty (nastavené na teplotu 37 a 60 oC), laboratorní mikrocentrifuga, spektrofotometr UV-Vis, vibrační třepačka (vortex). PRACOVNÍ POSTUP 1. Kalibrační křivka pro stanovení koncentrace tyrosinu Nejprve naředíme standardní roztok tyrosinu. Pipetujeme 1 a 2 mL standardu do dvou 10 mL odměrných baněk a doplníme fyziologickým roztokem. Do malých zkumavek pipetujeme námi zředěný roztok tyrosinu po dávkách 1, 0,8, 0,6, 0,4 a 0,2 mL, doplníme do 1 mL fyziologickým roztokem. Jako slepý vzorek poslouží 1 mL fyziologického roztoku. K napipetovaným roztokům přidáme 1 mL činidla A, zamícháme a necháme stát při laboratorní teplotě 10 minut. Poté přidáme 0,5 ml činidla B a rychle promícháme. Po 30 minutách měříme absorbanci při 750 nm proti slepému vzorku. Nejsou-li vzorky čiré, je třeba tyto před měřením zcentrifugovat na laboratorní mikrocentrifuze. Dostaneme tak kalibrační přímku pro 2 - 20 µg tyrosinu, absorbance se pohybují v rozmezí 0,1 - 0,7. 2. Ansonův test Zkoumaný roztok proteasy rozpipetujeme do zkumavek v množství 1, 0,8, 0,6, 0,4 a 0,2 mL. Doplníme fyziologickým roztokem do 1 mL. Slepým vzorkem je 1 mL fyziologického roztoku. K 0,5 mL připravených vzorků proteasy přidáváme 2 mL hemoglobinového substrátu a roztoky inkubujeme 15 min ve vodní lázni termostatu (trypsin či chymotrypsin při 37 oC, subtilisin při 60 oC). Čas sledujeme na stopkách. Po uplynutí časového intervalu reakci zastavíme 1 mL 25% kyseliny trichloroctové a vzniklý precipitát odcentrifugujeme (10 min při 6 000 g). Vzorek (1 mL) supernatantu pak použijeme pro stanovení volného tyrosinu Lowryho metodou. Proteasa má aktivitu rovnou 1 Ansonově jednotce, štěpí-li hemoglobin rychlostí 1 mmol tyrosinu za minutu při standardních podmínkách.

64

3. Stanovení proteolytické aktivity s použitím cytochromu c Zkoumaný roztok proteasy rozpipetujeme do zkumavek v množství 1, 0,8, 0,6, 0,4 a 0,2 mL. Doplníme fyziologickým roztokem do 1 mL. Slepým vzorkem je 1 mL fyziologického roztoku. Reakční směs obsahující 2 mL Britton-Robinsonova pufru pH 8,0, 0,3 mL roztoku cytochromu c a 0,15 mL zkoumaného roztoku proteasy inkubujeme 15 min (trypsin či chymotrypsin při 37 oC, subtilisin při 60 oC) v termostatu. Reakci zastavíme ochlazením zkumavek v ledové lázni. Po 5 minutách přidáme 50 µL roztoku guajakolu a 1 mL 0,03% peroxidu vodíku. Obsah zkumavek protřepeme a necháme 10 min stát při pokojové teplotě. Poté změříme absorbanci při 476 nm. 4. Stanovení aktivity trypsinu s použitím umělých substrátů Před zahájením pokusu si připravíme reakční směs pro 10 měření. Do 19 mL Tris pufru pipetujeme 0,5 mL roztoků BAPNA nebo BAEE v DMSO a 0,4 mL vody. Promícháme. Po vynulování spektrofotometru na reakční směs v kyvetě (2 mL) při příslušné vlnové délce přidáme 20 µl roztoku enzymu a zahájíme měření. Výsledná koncentrace substrátu v kyvetě je 1,25 mM. Měříme změnu absorbance po dobů tří časových intervalů v délce 1 minuty. Měření provedeme minimálně třikrát. 5. Stanovení kinetických konstant trypsinu s použitím umělých substrátů Před zahájením pokusu si připravíme 5 reakčních směsí s rozdílnou koncentrací substrátu, každou pro 5 měření. Do očíslovaných zkumavek pipetujeme roztoky následujícím způsobem: 1. 9,5 mL pufru, 50 µL roztoku BAPNA nebo BAEE, 400 µl vody; 2. 9,5 mL pufru, 100 µL roztoku BAPNA nebo BAEE, 350 µl vody; 3. 9,5 mL pufru, 150 µL roztoku BAPNA nebo BAEE, 300 µl vody; 4. 9,5 mL pufru, 200 µL roztoku BAPNA nebo BAEE, 250 µl vody; 5. 9,5 mL pufru, 250 µL roztoku BAPNA nebo BAEE, 200 µl vody. Po vynulování spektrofotometru na reakční směs v kyvetě (2 mL, odebírame ze zkumavek) při příslušné vlnové délce přidáme 20 µl roztoku enzymu a zahájíme měření. Měříme po dobů tří časových intervalů v délce 1 minuty. Výsledná koncentrace substrátu v kyvetě se pohybuje v rozmezí 0,25 – 1,25 mM. Provedeme minimálně tři měření s každou z pěti reakčních směsí. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Vypočítáme specifickou aktivitu zkoumaného vzorku proteasy (v Ansonových jednotkách na

gram lyofilizovaného proteinu). 2. Nakreslíme závislost absorbance při 476 nm na proteolytické aktivitě uvedené v Ansonových

jednotkách. 3. Hledáme vztah pro výpočet aktivity v Ansonových jednotkách z absorbance při 476 nm po

provedení testu s cytochromem c. 4. Vypočítáme specifickou aktivitu trypsinu v nkat.mg-1, případně v IU.mg-1. Měříme-li se

substrátem BAEE, přepočítáme specifickou aktivitu v uvedených jednotkách také na BAEE jednotky.mg-1.

5. Z vynesení dle Lineweavera-Burka sestrojeného na základě experimentálních hodnot určíme hodnoty Km a V pro trypsin a příslušný substrát. Součástí protokolu bude tabulka s hodnotami aktivity a kinetických konstant, dále pak graf.

6. Porovnáním specifické aktivity stanovené Ansonovým testem a s použitím umělého substrátu určíme přepočítávací koeficient.

65

KONTROLNÍ OTÁZKY A ÚKOLY 1. Proč se endopeptidasy označují jako proteasy a exopeptidasy jako peptidasy? 2. Jak ovlivníte či zastavíte proces proteolytického štěpení? 3. Vyjmenujte některé z inhibitorů proteas. 4. Popište postupný průběh odbourání proteinů přijatých s potravou u živočichů. LITERATURA Scott T. a Eagleson M., ed. (1988) Concise Encyclopedia Biochemistry, Walter de Gruyter (Berlin - New York). Berg J.M., Tymoczko J.L. a Stryer L. (2002) Biochemistry (5. vydání), W.H. Freeman (New York). Svendsen I. (1976) Chemical modifications of the subtilisins with special reference to the binding of large substrates. A review. Carlsberg Res. Commun. 41, 238-291. Frébort I. a Peč P. (1993) Proteolytic activity assay based on enhanced peroxidase effect of hydrolyzed cytochrome c. Biochem. Mol. Biol. Int. 30, 219-223. Kézdy F.J., Lorand, L., Miller, K.D. (1965) Titration of active centers in thrombin solutions. Standardization of the enzyme. Biochemistry 4, 2302-2308. Simon M.L., László K., Kotormán M., Szajáni B. (2001) A comparative study of the conformational stabilities of trypsin and α-chymotrypsin. Acta Biol. Szegediensis 45, 43-49. Havliš J., Thomas H., Šebela M., Shevchenko, A. (2003) Fast response proteomics by accelerated in-gel digestion of proteins. Anal. Chem. 75, 1300-1306.

66

4. LIPIDY

4.1. CHEMICKÉ VLASTNOSTI LIPIDŮ TEORETICKÝ ÚVOD

Lipidy jsou heterogenní skupinou biologických látek. Jsou velmi málo rozpustné ve vodě, ochotně se však rozpouští v nepolárních rozpouštědlech. Z rostlinných a živočišných tkání mohou být proto extrahovány použitím organických solventů jako je benzen, ether, chloroform či trichlorethylen. Zahrnují chemicky tak odlišné sloučeniny, jako jsou triacylglyceroly (tuky), vosky, terpeny. Komplexní sloučeniny glykolipidy a fosfolipidy bývaly dříve také označovány jako lipoidy. Do skupiny terpenických látek přísluší rovněž karotenoidy a steroidy.

Neutrální tuky jsou složené sloučeniny, chemickým charakterem patří k esterům. Z kyselin obsahují nerozvětvené monokarboxylové alifatické kyseliny, tzv. mastné kyseliny. Alkoholickou složkou je glycerol, který má tři hydroxylové skupiny. Glycerol jako trojsytný alkohol může tvořit mono-, di- a triglyceridy. Podle nové nomenklatury se nazývají monoacyl-, diacyl- a triacylglyceroly. Triacylglyceroly většinou obsahují dvě nebo tři různé kyseliny. Hydrolýzou se esterová vazba štěpí a uvolní se jednotlivé složky. Hydrolýzu lze provést velmi snadno hydroxidy alkalických kovů. Přitom nevzniknou volné mastné kyseliny, nýbrž jejich alkalické soli, mýdla. Kyseliny v přírodních tucích mají vždy sudý počet atomů uhlíku, což vyplývá z procesu jejich biosyntézy. Nejčastěji jsou zastoupeny kyseliny se šestnácti a osmnácti uhlíky, palmitová a stearová. Vedle nasycených mastných kyselin se často vyskytují i kyseliny nenasycené, které mají téměř bez vyjímky konfiguraci cis (např. olejová 18:1, linolová 18:2, linolenová 18:3 a arachidonová 20:4). Biologický význam tuků spočívá v tom, že jsou rezervními látkami. Enzymová hydrolýza triacylglycerolů v tukové tkáni probíhá postupně. Prvým krokem je štěpení pomocí triacylglycerollipasy a poté účinkem diacyl- a monoacylglycerollipasy. Hydrolýza tuků přijatých potravou probíhá především v tenkém střevě pomocí pankreatické lipasy. Vzniká 2-monoacylglycerol, který se z poloviny takto resorbuje, nebo je dále štěpen enzymem 2-monoacylglycerollipasou.

Přirozené vosky (vosk včelí, vorvaní, vosky rostlinné) jsou směsi nejrůznějších látek. Hlavními složkami jsou estery jednosytných vyšších alkoholů obecného vzorce CH2(CH2)nCH2OH, často se vyskytují karnaubylalkohol C24 a cerylalkohol C26. Ze včelího vosku byl izolován myricin, ester palmitové kyseliny s myricylalkoholem C30H61OH a z vorvaňoviny cetylpalmitát CH3(CH2)14COOC16H33. Vedle těchto esterů jsou ve voscích přítomny rovněž vyšší nevětvené uhlovodíky (vznikající dekarboxylací mastných kyselin), estery sterolů, volné mastné kyseliny zvané voskové (laurová C12, myristová C14, palmitová C16, karnaubová C24, cerová C26, montanová C28, melissová C30) a hydroxyderiváty mastných kyselin.

Terpeny jsou sloučeniny obsahující isoprenové stavební jednotky. Isopren je nenasycený uhlovodík s pěti atomy uhlíku a jedním methylovým rozvětvením (2-methyl-1,3-butadien). Počet pětiuhlíkových jednotek ve struktuře je podkladem pro rozdělení na (1) hemi-, (2) mono-, (3) seskvi-, (4) di-, (5) sester-, (6) tri-, (8) tetra- a polyterpeny. Karotenoidy představují rozsáhlou třídu žlutých a červených pigmentů. Jedná se o vysoce nenasycené alifatické a alicyklické uhlovodíky a jejich oxidační produkty. Dělí se na karoteny (lykopen, karoten, neurosporen, fytofluen a fytoen) a oxypigmenty - xanthofyly (lutein, violaxanthin, kryptoxanthin, kapsanthin, kapsorubin a zeaxanthin). Většina karotenoidů obsahuje 40 uhlíkových atomů a přísluší tak ke skupině tetraterpenů. Steroidy jsou biologicky významné látky. Patří sem steroly, steroidní hormony, žlučové kyseliny, srdeční glykosidy, steroidní alkaloidy a steroidní saponiny. Jejich biosyntéza začíná u acetylkoenzymu A a vede přes hydroxymethylglutarát a isopentenyldifosfát k isoprenoidu skvalenu C30H50. Konečným produktem cyklizace skvalenu je cholesterol, který je

67

nejdůležitějším živočišným sterolem. Dalšími steroly jsou např. lanosterol z ovčí vlny, zymosterol a ergosterol z kvasnic, sitosterol a stigmasterol rostlinného původu. Obr. 1 Tuky a vosky.

C

O cetylpalmitát (vorvaňovina)CH2(CH2)14CH2

O

H2C

H2C

OH

OHCO HC

O

2-monoacylglycerol

CH2(CH2)28CH2 C

Omyricin (včelí vosk)

O

OH2C

H2C

O

OCO H

CC

C

O

O

triacylglycerol (neutrální tuk)

Obr. 2 Glycerolfosfatidy I.

HO

OH2C

H2C

O

O

C H

C

O

P O CH2 CH2 N

CH3

CH3

CH3

O -

+

fosfatidylethanolamin (kefalin)O

H2C

H2C O

CO HC

O

P O CH2 CH2

O

CO

NH2

-+

H2C

H2C

O

O

CO

H

C

C

O

O

P O CH2 CH2

O

C

H

H

plasmalogen

(1-alken-1´-yl-2-acylglycerol-3-fosforyl)-ethanolamin

NH3

+

fosfatidylcholin (lecithin) CH3O

H2C

H2C O

CO HC

O

P O CH2 CH2 N

CH3

CH3

O

CO-

+

O

lysolecithin

O

68

Obr. 3 Glycerolfosfatidy II.

fosfatidylinositolOH2C

H2C

O

CO HC

O

P

O

O

C

O

O

HOOHOH

OH

OH

-

O

H2C

H2C

O

O

CO HC

C

O

O

P O CH2

O

O

O

O

C OH C

C

O

O

PO

O

CHO H

CH2

CH2H2C

-

-

fosfatidylserin O

H2C

H2C O

CO HC

O

P O CH2

O

CO

O

CH

COO

NH3

-+

bisfosfatidylglycerol (kardiolipin)

bisfosfatidylglycerol (kardiolipin)

O

H2C

H2C

O

O

CO HC

C

O

O

P O CH2

O

O

O

O

C OH C

C

O

O

PO

O

CHO H

CH2

CH2H2C

-

-

69

Obr. 4 Sfingolipidy.

C

O

HN

CHHO

ceramid

HOCH2 CH

O

HN C

CH2

CHHO

H3C CH2

CH3

P

O

O

O

ON

CH3

_

+

sfingomyelin

CHOCH2

HOCH2

H2N

OH

sfingosin

O

OH

OH

HO

CH2OH

O

HN C

O

CH

CHHO

CH2

cerebrosid

70

Obr. 5 Steroidy a karotenoidy.

cholesterol

HO

H3C

H3CH3C

CH3

CH3

O O

xyl - gal - gal - glc - glc - O

HO

CH3

CH3

H

OH

digitonin

H3C

CH3

O

OH

testosteron

CH3

CH3

CH3CH3CH3CH3

CH3H3C

H3CH3C CH3

β-karoten

CH3

CH3CH3CH3CH3

CH3H3C

H3CH3C CH3

HO OHzeaxanthin

CH3

HO

CH3

HOH

COOHH3CHO

kyselina cholová

CH3

Fosfolipidy zvané též fosfatidy jsou chemicky diestery kyseliny fosforečné. Fosforečná

kyselina je esterifikována jednak derivátem aminodialkoholu sfingosinu nebo glycerolu (většinou diacylglycerolem), jednak cholinem, ethanolaminem, serinem, inositolem nebo glycerolem. Prvé tři jmenované stavební složky obsahují bazický dusík, který má za fyziologického pH kladný náboj: protože fosforečná kyselina nese náboj záporný, fungují fosfolipidy jako obojetné ionty. Glycerolfosfatidy mají význam především jako složky biomembrán. Fosfatidylcholin se nazývá lecithin, fosfatidylethanolamin kefalin, bisfosfatidylglycerol je kardiolipin. Plasmalogeny jsou

CH3

OH

CH3

O

71

fosfatidy, které mají v poloze C-1 glycerolu enoletherovou skupinou. Přirozené sfingolipidy mají na aminoskupině sfingosinu vázán zbytek mastné kyseliny. Tyto amidy kyselin se vyskytují v malé míře volné a nazývají se ceramidy. Sfingosinfosfatidy, přítomné v myelinové pochvě nervů, dostaly název podle místa výskytu sfingomyelinů. Sfingosin má na dusík vázán amidickou vazbou zbytek mastné kyseliny a na koncovém hydroxylu fosforylcholin.

Fosfatidy obsahují estericky vázané mastné kyseliny, kyselinu fosforečnou a dusíkatou bázi. Fosfolipasy, tj. enzymy katalyzující hydrolýzu těchto esterových vazeb, jsou zčásti specifické. Fosfolipasa A1 štěpí esterovou vazbu na C-1 uhlíku glycerolu, fosfolipasa A2 na C-2 uhlíku, fosfolipasa B na obou těchto uhlících současně, fosfolipasa C štěpí esterovou vazbu kyseliny fosforečné na uhlíku C-3 glycerolu a konečně fosfolipasa D odděluje od zbytku kyseliny fosforečné dusíkatou bázi. Působení fosfolipasy A2 na lecithiny a kefaliny vede k tvorbě lysolecithinů a lysokefalinů, kde OH-skupina na C-2 uhlíku glycerolu není esterifikovaná.

Glykolipidy obsahují místo fosfátu monosacharidový nebo oligosacharidový zbytek, vázaný nejčastěji na sfingosin. Glycerolglykolipidy mají relativně jednoduchou strukturu. Základem je 1,2-diacylglycerol, který má v poloze C-3 glycerolu glykosidicky vázaný mono- nebo oligosacharid. Glykosfingolipidy jsou vystavěny na bázi ceramidu. Podle druhu sacharidu vázaného na ceramid rozlišujeme neutrální glykosfingolipidy, sulfatidy a gangliosidy.

4.1.1. PREPARACE LIPIDOVÝCH FRAKCÍ Z VAJEČNÉHO ŽLOUTKU TEORETICKÝ ÚVOD Zdrojem lecithinu - nejznámějšího fosfolipidu, který se dnes běžně používá v potravinářském průmyslu, je vaječný žloutek. Žloutek slepičího vejce váží asi polovinu váhy bílku. Obsahuje značné množství tuků (asi 23 %), dále jsou v něm obsaženy fosfatidy (lecithiny, kefaliny, plasmalogeny), sfingolipidy (sfingomyeliny, cerebrosidy), látky terpenoidního charakteru (steroidy a karotenoidy), ale i bílkoviny. Lecithin (asi 11 %) je ve žloutku přítomen ve formě aduktu s bílkovinou vitelinem jako tzv. lecithalbumin. Žluté zbarvení žloutku je způsobeno zejména přítomnosti zeaxanthinu. Procentové složení frakcí žloutku se mění v závislosti na přijaté potravě. Některé z uvedených látek se dají ze směsí snadno oddělit na základě rozdílných vlastností. Fosfatidy jsou nerozpustné ve studeném acetonu, ve kterém se naopak snadno rozpouštějí neutrální tuky a steroidy. S vyjímkou neesterifikovaných sterolů se lipidy hydrolyzují alkáliemi za vzniku solí mastných kyselin (mýdel), jež jsou nerozpustné v etheru. Neutrální tuky a vodu odstraníme ze žloutku extrakcí acetonem a z nerozpustného zbytku představujícího denaturované bílkoviny a fosfolipidy extrahujeme druhé jmenované 95% ethanolem. Obsah jednotlivých složek v extraktu záleží na použitém rozpouštědle. Ethanolový extrakt obsahuje převážně lecithin, kefalin a další minoritní složky. Lecithiny lze ze směsi fosfolipidů vysrážet alkoholickým roztokem chloridu kademnatého. Vaječný lecithin je směsí obsahující různé estericky vázané kyseliny (palmitovou, olejovou, linolovou, atd.). MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: bezvodý aceton, 95% ethanol, ether, chloroform, 10% alkoholický roztok NaOH. Materiál: slepičí vejce, 2 stojany s filtračními kruhy, kádinky (5 x 100 mL), odpařovací misky (4 x 10 cm), 3 tyčinky, nálevky (3 x 8 cm), odměrné válce (2 x 100 mL), filtrační papír. Přístroje: elektrická vodní lázeň.

72

PRACOVNÍ POSTUP 1. Extrakce neutrálních lipidů Žloutek slepičího vejce oddělíme pečlivě od bílku a důkladně promícháme v kádince s 25 mL bezvodého acetonu. Necháme stát za občasného míchání asi 10 minut. Potom extrakt zfiltrujeme přes řídký filtr navlhčený acetonem. Zbytek na filtru (denaturované bílkoviny a fosfolipidy) vpravíme zpět do kádinky a opět promícháme s 25 mL acetonu. Směs znovu zfiltrujeme a filtrát obsahující převážně neutrální tuky a cholesterol odpaříme na vodní lázni. 2. Izolace fosfolipidů Zbytek na filtru po dvojnásobné extrakci acetonem dáme zpět do kádinky a rozmícháme s 15 mL 95% ethanolu. Směs zfiltrujeme přes řídký filtr navlhčený ethanolem. Zbytek na filtru (denaturované bílkoviny) ještě jednou promyjeme 15 mL 95% ethanolu. Filtrát obsahující fosfolipidy odpaříme do sucha na vodní lázni. Získáme mazlavou sraženinu fosfatidů, která sestává převážně z lecithinu. 3. Odstranění tuku ve formě mýdla Acetonový filtrát po zahuštění (viz bod 1) smícháme s 15 mL alkoholického roztoku NaOH (nikoli vodného!) a zahříváme 30 minut na vroucí lázni, čímž zmýdelníme tuky. Zbytek ochladíme a dobře rozetřeme s 50 mL etheru. Sraženinu sodného mýdla odfiltrujeme a uschováme pro další práci. 4. Izolace cholesterolu Etherický filtrát (viz bod 3) obsahující cholesterol odpaříme do sucha na vodní lázni a ze zbytku vyextrahujeme cholesterol 5 mL chloroformu. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Do protokolu zapíšeme schéma izolace. 2. Zjistíme výtěžek lecithinu.

4.1.2. IDENTIFIKACE LIPIDŮ TEORETICKÝ ÚVOD Molekula lecithinu složená z objemné hydrofobní části řetězců mastných kyselin a malé hydrofilní části fosfátu a amoniové skupiny tvoří snadno ve vodě micely - krystalické shluky koloidních rozměrů. Tyto amfifilní látky přidané k soustavě dvou vzájemně nemísitelných kapalin snižují povrchové napětí mezi polární a nepolární kapalinou a pomáhají vytvořit emulze. Hydrofilní část emulgátoru se přitom orientuje do vodné fáze, hydrofobní část do nepolární olejové fáze. V praxi nejčastěji užívanými emulgátory jsou mýdla a saponáty, v potravinářství je to lecithin. Lecithin lze rozštěpit hydrolýzou na vyšší mastné kyseliny, glycerol, kyselinu fosforečnou a dusíkatou organickou bázi. Tyto složky lze v hydrolyzátu dokázat. Mastné kyseliny jako mýdla, glycerol reakcí nitrochromovou a kyselinu fosforečnou jako žlutý fosfomolybdenan amonný, který po redukci poskytne modré zbarvení fosfomolybdenové modře (princip kvantitativního stanovení fosfátů podle Fiske-Subbarowa). Cholin dává s přebytkem jodu málo rozpustnou adiční sloučeninu (Florenceovy krystalky). Je to enneajodid cholinu (C5H14NOI.I8). Této sloučeniny se užívalo pro kvantitavní jodometrické stanovení cholinu. Také s roztokem komplexní soli reineckátu amonného (jedná se o sloučeninu tetrarhodanidoammochromitan - NH4[Cr(SCN)4(NH3)2].H2O) dává cholin málo rozpustnou sůl. Cholesterol se nedá zmýdelnit, protože není ester. Podobně jako další β-hydroxysteroidy tvoří s digitoninem (saponin ze semen náprstníku) málo rozpustnou sloučeninu, které se užívalo při

73

gravimetrickém stanovení cholesterolu. V chloroformovém prostředí dává cholesterol barevnou reakci s acetanhydridem, které se používá ke kolorimetrickému stanovení. Hydrolýzou tuků v alkalickém prostředí vznikají soli vyšších mastných kyselin (mýdla) a glycerol. Draselná, sodná a amonná mýdla jsou rozpustná ve vodě, dají se však přidáním vhodného elektrolytu vysolit. Mýdla vápenná a hořečnatá jsou nerozpustná. Nenasycené mastné kyseliny lze dokázat adicí bromu na dvojné vazby. MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: 10% vodný roztok NaOH, ledová kyselina octová, acetanhydrid, koncentrovaná kyselina sírová, koncentrovaná kyselina dusičná, 2,5% roztok molybdenanu amonného v 2,5 mol.L-1 H2SO4, chlorid cínatý, 2% roztok reineckátu amonného (1x týdně čerstvý), 5% Lugolův roztok, 5% roztok digitoninu v 80% ethanolu, 5% roztok chromanu draselného, 10% roztok chloridu vápenatého, bromová voda, chloroformový roztok komerčního cholesterolu, rostlinný olej, pevný NaCl, nastrouhané mýdlo. Materiál: stojan se zkumavkami, držák na zkumavky, 2 kapátka, pipety (2 x 2 mL), 2 gumové zátky, indikátorový papírek, filtrační stojan, kruh, krycí a podložní sklíčka. Přístroje: mikroskop. PRACOVNÍ POSTUP 1. Hydrolýza lecithinu Poloviční množství připraveného surového lecitinu vpravíme na dno zkumavky a zahříváme nejméně 15 minut na vroucí vodní lázni s 5 mL 10% vodného roztoku NaOH, který si připravíme smícháním 25 mL zásobního 40% NaOH a 75 mL vody. Hydrolyzát ochladíme, okyselíme kyselinou octovou na pH 6,0 (univerzální indikátorový papírek) a odfiltrujeme vyloučené mastné kyseliny. • Důkaz cholinu

Kapku hydrolyzátu smícháme na podložním sklíčku se 1 kapkou Lugolova roztoku. Pod mikroskopem pozorujeme růst hnědých krystalků, které zakreslíme do protokolu. K 0,1 ml filtrátu přidáme 1 kapku 2% reineckátu amonného. Vytvoří se růžově zbarvené krystalky reineckátu cholinu, které si rovněž prohlédneme pod mikroskopem.

• Důkaz kyseliny fosforečné K 1 mL odfiltrovaného hydrolyzátu lecithinu přidáme několik kapek roztoku molybdenanu amonného. Vytvoří se žlutý fosfomolybdenan amonný, který po přidání chloridu cínatého zmodrá (fosfomolybdenová modř) (chlorid cínatý v množství na špičku špachtle se přidává opatrně na stěnu nakloněné zkumavky).

2. Lecithin jako přirozený emulgátor Do dvou zkumavek přidáme po 2 mL vody a 1 mL rostlinného oleje. Do jedné ze zkumavek pak přidáme tyčinkou malé množství lecithinu. Za mírného míchání zahřejeme na vodní lázni, zazátkujeme a intenzivně třepeme asi 2 minuty. Po 10 minutách srovnáme stabilitu bez emulgátoru a s emulgátorem. 3. Důkaz cholesterolu

Obě reakce pro srovnání proveďte s chloroformovým roztokem komerčního cholesterolu. • Liebermann-Buchardova reakce: asi 1 mL chloroformového roztoku cholesterolu dáme do suché

zkumavky, přidáme 10 kapek acetanhydridu a 2 kapky konc. kyseliny sírové. Protřepeme a necháme několik minut stát. Pozorujeme zbarvení směsi.

74

4. Vlastnosti mýdla Získané mýdlo rozpustíme asi v 50 mL teplé vody a je-li potřeba, roztok zfiltrujeme. Do čtyř zkumavek odměříme asi po 5 mL roztoku (pro srovnání použijeme i nastrouhané mýdlo) a provedeme tyto reakce: • v první zkumavce pozorujeme, že třepáním se tvoří pěna (snížení povrchového napětí vody) • do druhé zkumavky přidáváme 10% roztok chloridu vápenatého do vzniku sraženiny • do třetí zkumavky přidáme několik kapek kyseliny octové až se objeví bílý zákal, který se po

delším stání přemění v olejovou vrstvu • ve čtvrté zkumavce rozpustíme tolik pevného NaCl, až se objeví sraženina vysoleného mýdla 5. Adice bromu na nenasycené mastné kyseliny Ze zbylého roztoku mýdla uvolníme přidáním ledové kyseliny octové mastné kyseliny. Potom přidáme stejný objem bromové vody a roztok protřepeme. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Napíšeme rovnici hydrolýzy lecithinu v alkalickém prostředí. 2. Zaznamenáme výsledky provedených kvalitativních reakcí. KONTROLNÍ OTÁZKY A ÚKOLY 1. Která látka je intermediátem při metabolické přeměně sacharidů na rezervní tuk? 2. Fosfolipidy jsou důležitými složkami biomembrán, kterým udělují kladné nebo záporné náboje.

Jaký bude celkový náboj uvedených fosfolipidů, bude-li pH prostředí 5 a 8 (pKa fosfátové skupiny je v oblasti 6 - 7)? a) Kyselina dipalmitoylfosfatidová, b) 1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin, c) dipalmitoylfosfatidylethanolamin, d) dioleylfosfatidylserin, e) 1-stearyl-2-palmitoylfosfatidylglycerol.

3. Jak vypadá prostorové uspořádání fosfolipidů v biomembránách? 4. Jaký je princip tvorby barevného produktu při Liebermann-Buchardově reakci prokazující

přítomnost cholesterolu? LITERATURA Stryer L. (1981) Biochemistry, 2. vydání, W. H. Freeman and Company (New York). Scott T. a Eagleson M., ed. (1988) Concise Encyclopedia Biochemistry, Walter de Gruyter (Berlin - New York). Berg J.M., Tymoczko J.L. a Stryer L. (2002) Biochemistry (5. vydání), W.H. Freeman (New York). Mikeš V. (1985) Skripta Základní biochemické praktikum, vydavatelství UJEP (Brno). Macholán L., Skurský L. a Zbořil P. (1980) Skripta Laboratorní cvičení z biochemie I, vydavatelství UJEP (Brno).

75

4.2. STANOVENÍ LIPOFILNÍCH LISTOVÝCH BARVIV A JEJICH ROZDĚLENÍ ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIÍ

TEORETICKÝ ÚVOD Adsorpční chromatografie patří k nejstarším a nejrozšířenějším chromatografickým metodám. Pevný adsorbent je obtékán vhodným rozpouštědlem, které unáší analyzovanou směs, a na povrchu tohoto adsorbentu dochází k dělení. Veličinou určující adsorpci látky na povrch pevné fáze je adsorpční izoterma. Nejčastěji užívanými adsorbenty jsou látky pórovité struktury. Podle své povahy se dělí na polární (silikagel, oxid hlinitý, hydroxyapatit, křemičitan hořečnatý) a nepolární (aktivní uhlí). Při adsorpci na polárních sorbentech hrají největší úlohu interakce typu ion - dipól a dipól - dipól, zatímco u sorbentů druhého typu jsou to převážně van der Waalsovy síly. Podle způsobu provedení rozlišujeme sloupcovou chromatografii (column chromatography) a tenkovrstevnou chromatografii (thin layer chromatography, zkr. TLC). V listech zelených rostlin se vyskytuje větší počet lipofilních barviv, jejichž charakteristickou vlastností je rozpustnost v tucích a tukových rozpouštědlech. Pro fotosyntézu mají rozhodující význam chlorofyly a a b a karotenoidy (vzorce viz učebnice biochemie). Jsou značně citlivé vůči vzdušnému kyslíku a na světlo. Rozkladnými produkty chlorofylu jsou feofytiny; karotenoidy přecházejí přes epoxidy na bezbarvé sloučeniny. Rychlého rozdělení listových barviv lze dosáhnout chromatografií na vrstvě silikagelu. Po rozdělení extraktu lze jednotlivé složky eluovat organickými rozpouštědly a spektrofotometricky stanovit.

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: uhličitan vápenatý, mořský písek, aceton, petrolether, směs benzín : isopropanol : voda (100 : 10 : 0,25), nasycený roztok SbCl3 v chloroformu. Materiál: zmrazené listy špenátu, odměrné baňky (10 a 25 mL), malá třecí miska s tloučkem, nálevka, nůžky, filtrační papír, stojan se sadou zkumavek, dělené pipety (2 x 5 mL), skleněný váleček (100 mL), silufol. Přístroje: spektrofotometr. PRACOVNÍ POSTUP 1. Extrakce barviv Odvážíme 2 g listů špenátu, které rozetřeme v třecí misce s malým množstvím mořského písku a uhličitanu vápenatého (na špičku nože) a několika mL acetonu. Směs zfiltrujeme přes malý

76

filtr smočený acetonem do 25 mL odměrné baňky. Dalšími dávkami acetonu převedeme barviva kvantitativně do filtrátu a objem doplníme acetonem po značku. 2. Fotometrické stanovení chlorofylů Odměřené množství surového extraktu listových barviv zředíme acetonem v poměru 1:4 a v 1 cm kyvetě změříme absorbanci při 645 a 663 nm oproti čistému acetonu. Koncentraci v mg.L-1 rozpouštědla pro chlorofyl a (Ca) a chlorofyl b (Cb) vypočítáme podle vztahů:

645663a A2,69-A12,7C ××= (mg.L-1) 663645b A4,68-A22,9C ××= (mg.L-1)

Celková koncentrace obou barviv je dána vztahem:

645663ba A20,2A8,02CC ×+×=+ (mg.L-1) 3. Chromatografie barviv Asi 10 mL extraktu odpaříme do sucha na vodní lázni a po ochlazení rozpustíme v několika kapkách acetonu. Takto zahuštěný extrakt naneseme na startovní čáru asi 2 cm od okraje silufolové desky. Desku vložíme do vyvíjecí nádobky s vyvíjecí soustavou benzín : isopropanol : voda (100 : 10 : 0,25). Jakmile čelo soustavy dosáhne horního okraje desky, desku vyjmeme a obyčejnou tužkou rychle obtáhneme zóny barviv. Chromatogram zakreslíme do protokolu (některé skvrny na světle rychle blednou). Obr. 1 Lokalizace listových barviv po rozdělení na desce silufolu. Vyvíjecí směs benzin : isopropanol : voda (100 : 10 : 0,25). Legenda k obrázku: 1 - β-karoten, 2 - feofytin, 3 - chlorofyl a, 4 - chlorofyl b, 5 - lutein, 6 - lutein-5,6-epoxid, 7 - violaxanthin, 8 - neoxanthin.

Feofytiny (a a b) se v přírodě nevyskytují. Narozdíl od chlorofylů neobsahují Mg2+ a pokládají se tudíž za artefakty, vznikající při extrakci. Lutein (3,3´-dihydroxy-α-karoten) je isomerní se zeaxanthinem (3,3´-dihydroxy-β-karoten). Violaxanthin je chemicky 5,6,5´,6´-diepoxyzeaxanthin, neoxanthin má sumární vzorec C40H56O4. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Vyjádříme množství chlorofylu a a b v mg.g-1 váhy biologického materiálu. 2. Chromatogram zakreslíme do protokolu. 3. Vypočítáme Rf listových barviv. KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Proč absorbuje β-karoten ve viditelné oblasti spektra? 2. Jaká je funkce listových barviv (zejména chlorofylů a karotenů) v rostlinách? 3. Co je nasycená chromatografická komora a proč se používá?

77

LITERATURA Stryer L. (1981) Biochemistry, 2. vyd., W. H. Freeman and Company (New York). Scott T. a Eagleson M., ed. (1988) Concise Encyclopedia Biochemistry, Walter de Gruyter (Berlin - New York). Berg J.M., Tymoczko J.L. a Stryer L. (2002) Biochemistry (5. vydání), W.H. Freeman (New York). Mikeš V. (1985) Skripta Základní biochemické praktikum, vydavatelství UJEP (Brno). Macholán L., Skurský L. a Zbořil P. (1980) Skripta Laboratorní cvičení z biochemie I, vydavatelství UJEP (Brno).

78

5. SACHARIDY

5.1. CHEMICKÉ VLASTNOSTI SACHARIDŮ - KVALITATIVNÍ REAKCE

TEORETICKÝ ÚVOD Sacharidy jsou rozsáhlou skupinou přírodních látek. Vzhledem k chemické struktuře se

jedná o polyhydroxykarbonylové sloučeniny a jejich deriváty. Většinou lze sacharidy popsat sumárním vzorcem Cx(H2O)n; obsahují tedy uhlík a prvky vody v poměru 1 : 1. Původně byl tomuto vzorci připisován význam hydrátu uhlíku - v roce 1844 byl proto K. Schmidtem zaveden název karbohydráty, česky též uhlovodany. Současná definice je nezávislá na sumárním vzorci, používání staršího názvu je proto nesprávné. Řada látek příslušejících do skupiny sacharidů má navíc odlišné elementární složení: aldonové či uronové kyseliny, deoxycukry, aminocukry, mukopolysacharidy. Označení cukry se přitom vztahuje pouze k určité podskupině sacharidů.

Sacharidy jsou přítomné v každé rostlinné nebo živočišné buňce. Tvoří většinu organických sloučenin vyskytujících se na Zemi. Jsou převážně rostlinného původu (biosyntetické asimilační procesy), představují však také hlavní součást potravy mnohých zvířat i člověka. Mezi živinami (bílkoviny, tuky, sacharidy) jsou nejdůležitějším zdrojem energie. Sacharidy se dále dělí na základě molekulové hmotnosti. Monosacharidy (jednoduché cukry) - nejjednodušší typ. Pohlížíme na ně jako na primární oxidační produkty alifatických polyalkoholů, obvykle s nerozvětveným uhlíkovým řetězcem. Oxidace na primárním uhlíku vede k polyhydroxyaldehydům (aldosám), oxidací na uhlíku sekundárním, obvykle na C-2, vznikají polyhydroxyketony (ketosy). V přírodě se vyskytující monosacharidy mají až na několik vyjímek (např. streptosa) nerozvětvený uhlíkový řetězec. Obvykle obsahují několik center asymetrie, počet stereoizomerů je dán vzorcem 2n, kde n je počet asymetrických uhlíkových atomů. Konfigurace molekul monosacharidů je označována prefixy D nebo L, s ní nesouvisející optická rotace symboly (+) nebo (-). Cukry řady D jsou odvozeny od referenční látky D-glyceraldehydu. Asymetrický uhlík, který je nejvíce vzdálen od karbonylové skupiny, má hydroxylovou skupinu ve Fischerově vzorci umístěnu vpravo. U řady L je tomu naopak. Náhrada hydroxylové skupiny vodíkem vede k deoxycukrům, je-li tato nahrazena aminoskupinou jde o aminocukry. Podle počtu uhlíkových atomů v základním řetězci rozlišujeme triosy, tetrosy, pentosy, hexosy, heptosy.

Ve Fischerově projekci jsou vzorce monosacharidů psány vertikálně (uhlíkový řetězec) s karbonylovou skupinou nahoře a skupinou hydroxymethylovou dole. Jedná se však o značné zjednodušení, které nevystihuje prostorovou strukturu a navíc neodpovídá všem chemickým vlastnostem. Karbonylová skupina totiž vytváří vazbu s jedním z uhlíků nesoucích hydroxyl. Jednoduché cukry se proto vyskytují v cyklických poloacetalových formách s kyslíkem jako heteroatomem. Pětičlenný kruh označujeme na základě analogie jako furanosový, šestičlenný pak jako pyranosový. Většina monosacharidů existuje volně v podobě pyranos, pouze některé známe i ve formě furanosy, zvláště jako složky oligo- či polysacharidů. Cyklické poloacetalové formy mohou být znázorňovány Tollensovými nebo lépe Haworthovými perspektivními vzorci. Furanosový kruh je téměř planární zatímco pyranosový je prostorově zohýbán. Možná je židličková (energeticky výhodnější) nebo vaničková konformace, podobně jako u molekuly cyklohexanu. Konformační vzorce jsou nejblíže realitě, protože nejlépe vyjadřují prostorové uspořádání substituentů a umožňují lépe chápat fyzikální a chemické vlastnosti jednoduchých cukrů.

79

Obr. 1 Konvence pro psaní strukturních vzorců sacharidů podle Fischera (a), Tollense (b) a Hawortha (c).

C

C

C

C

CH2OH

C

OH

OH

HO

OH

O

H

H

H

H

H

C

C

C

C

CH2OH

C

OH

HO

OH

O

H

H

H

H

OHH

C

C

C

C

CH2OH

C

OH

HO

OH

O

H

H

H

H

HHO

CH2OH

O

OH

OH

OH

HO

α-D-glukosa

O OH

OH

OH

HO

β-D-glukosa

CH2OH

D-glukosa

a) b) c)

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

123

45

6

123

45

6

Obr. 2. Látky vznikající oxidačně-redukční přeměnou aldos.

uronová kyselina

CHO

CH2OH

(CHOH)n

(CHOH)n

COOH

COOH

CH2OH

(CHOH)n

CH2OH

CH2OH

(CHOH)n

COOH

COOH

CHO

(CHOH)n

aldosa

aldonová kyselinaaldarová kyselina

alditol (cukerný alkohol)

ox.

red. ox.

ox.

Tvorbou cyklického uspořádání vzniká nové centrum asymetrie na uhlíkovém atomu původní

karbonylové skupiny (C-1 u aldos a C-2 u ketos). Vznikají izomery označované jako α a β formy.

80

Liší se fyzikálními vlastnostmi jako jsou rozpustnost, bod tání nebo optická rotace. U D-cukrů je izomer s vyšší pozitivní rotací označován jako α, u L-cukrů je tomu naopak. V Tollensových vzorcích je hydroxylová skupina na příslušném uhlíkovém atomu pro α izomer u D-řady vpravo, v Haworthově projekci tato hydroxylová skupina směřuje dolů. U L-řady je uspořádání opačné. V roztocích jsou α a β izomery v rovnováze prostřednictvím formy s otevřeným kruhem. Tento jev se nazývá mutarotace. Jestliže se dva diastereomery odlišují pouze v konfiguraci na atomu C-1, nazývají se anomery, např. α- a β-glukosa. Diastereomerní monosacharidy, které mají opačnou konfiguraci hydroxylové skupiny v jediné pozici, se označují jako epimery, příklady jsou D-glukosa a D-mannosa (C-2) a D-glukosa a D-galaktosa (C-4). Chemické vlastnosti monosacharidů pocházejí od přítomnosti reaktivních aldehydových či ketoskupin a alkoholických hydroxylových skupin. Aldosy a ketosy reagují s nadbytkem fenylhydrazinu nebo hydroxylaminu za vzniku osazonů respektive oximů. Opatrná oxidace vede k aldonovým kyselinám, energičtější oxidace ke kyselinám aldarovým. Redukcí karbonylové skupiny se tvoří odpovídající vícesytné alkoholy. Poloacetalová hydroxylová skupina je velmi reaktivní. Reakcí s OH-, NH- nebo SH- skupinou se tvoří glykosidy. Oxidací glykosidů (je v nich chráněna karbonylová funkční skupina) na koncové hydroxymethylové skupině vznikají uronové kyseliny. Ostatní hydroxylové skupiny mohou být esterifikovány, mohou rovněž tvořit ethery. V současné době je známo více než 100 v přírodě se vyskytujících monosacharidů, a to ve jednoduché formě nebo jako složky oligo- a polysacharidů. Z biochemického hlediska jsou významné zejména hexosy a pentosy, kam patří například glukosa, fruktosa, galaktosa, mannosa a ribosa. Obr. 3 Haworthovy vzorce vybraných monosacharidů.

HOCH2

O

OH

OH

OH

HO

α-D-glukosa

OHOCH2

OH

HO

OH

CH2OH

α-D-fruktosa

O

OH

OH

OH

HOCH2

HO

α-D-galaktosa

OHOCH2

OH

OH

HO

α-D-arabinosa

OHOCH2

OH

OH

OH

α-D-ribosa

α-D-mannosa

O

OH

OHOH

HOCH2

HO

81

Obr. 4 Haworthovy vzorce vybraných disacharidů.

HOCH2

O

OH

OH

HO

OHOCH2

OH

HO

CH2OHO

sacharosa

HOCH2

O

OH

OH

HOO

HOCH2

O

OH

OH

OH

α-maltosa

HOCH2

O

OH

OH

HO

HOCH2

O

OH

OH

OH

α-laktosa

O

Oligosacharidy. Jsou tvořeny dvěma až deseti monosacharidy, které jsou spojeny α- nebo β-glykosidovou vazbou. Jsou klasifikovány jako di-, tri-, tetrasacharidy atd. v závislosti na počtu monosacharidových podjednotek, na které mohou být rozloženy kyselou nebo enzymovou hydrolýzou. Oligosacharidy jsou značně rozšířeny jak v rostlinné, tak i v živočišné říši. Vyskytují se přitom ve volné i vázané formě.

Významné jsou zejména disacharidy, které jsou tvořeny glykosidově spojenými shodnými nebo lišícími se monosacharidovými jednotkami. Vzhledem k povaze glykosidové vazby je dělíme na disacharidy typu trehalosového nebo maltosového, tedy do dvou skupin nazvaných podle svých charakteristických zástupců. V případě trehalosy je glykosidová vazba tvořena reakcí poloacetalových hydroxylových skupin obou monosacharidových podjednotek (vazba 1,1). Takto vzniklý disacharid nemá volnou poloacetalovou hydroxylovou skupinu a ztrácí tak schopnost poskytovat typické reakce jednoduchých cukrů jako jsou redukce, tvorba osazonů a oximů, mutarotace. K disacharidům trehalosového typu patří již zmíněná trehalosa, dále také sacharosa. U disacharidů maltosového typu jsou monosacharidové podjednotky spojeny vazbami 1,4 nebo 1,6. Poloacetalový hydroxyl jednoho monosacharidu tedy reaguje s alkoholickým hydroxylem druhého. Vzniklý disacharid má tedy jednu volnou reaktivní hydroxylovou skupinu s redukčními vlastnostmi a schopností mutarotace. Tvoří rovněž osazony a oximy. Zástupci této druhé skupiny jsou maltosa, laktosa, cellobiosa, gentiobiosa nebo melibiosa.

V principu mohou být vyšší oligosacharidy nebo i polysacharidy tvořeny tak jako trehalosa nebo maltosa. Zástupci trisacharidů jsou například rafinosa, gentianosa a melecitosa, tetrasacharidem je stachyosa, pentasacharidem verbaskosa. Polysacharidy. Jde o kvantitativně rozsáhlou skupinu sacharidů, sestávajících z 10 a více monosacharidových podjednotek. Vytvářejí nerozvětvené či rozvětvené řetězce, kde jsou

82

podjednotky navzájem spojeny α- nebo β-glykosidovými vazbami. Tyto řetězce mohou být uspořádány lineárně, spirálovitě nebo sféricky. V přírodě je nalézáme u rostlin i živočichů jako rezervní či podpůrné substance. Nejčastěji se vyskytujícími komponentami polysacharidů jsou hexosy D-glukosa, D-fruktosa, D-galaktosa a D-mannosa, pentosy D-arabinosa a D-xylosa a aminocukr D-glukosamin. Struktura mnoha polysacharidů dosud nebyla detailně vyřešena. Pokud je polysacharid tvořen pouze jediným typem monosacharidové komponenty, nazývá se homoglykan. V opačném případě jde o heteroglykan. Polyuronidy jsou tvořeny uronovými kyselinami. Přírodní polysacharidy všeobecně obsahují stovky nebo tisíce monosacharidových podjednotek a mají velkou molekulovou hmotnost. Charakteristická je tvorba mikrokrystalické struktury. Kromě vlastního složení a přítomných glykosidových vazeb se jednotlivé typy polysacharidů liší i ve stupni polymerace a větvení. Ve srovnání s mono- či oligosacharidy vykazují zcela odlišné fyzikální a chemické vlastnosti. S rostoucím stupněm polymerace klesá rozpustnost ve vodě, mizí redukční vlastnosti a projev sladké chuti. Skeletální polysacharidy jako např. celulosa a chitin jsou ve vodě zcela nerozpustné a jsou velmi odolné vůči enzymové hydrolýze. Naproti tomu polysacharidy rezervní (škrob, lichenin nebo glykogen) vytvářejí koloidní vodní roztoky a jsou snadno hydrolyzovatelné. Kyselá hydrolýza polysacharidů, stejně jako působení trávicích enzymů (amylasy), vede nejdříve k oligosacharidům a teprve nakonec jsou uvolňovány monosacharidy. Rezervní polysacharidy jsou in vivo odbourávány fosforolyticky. Obr. 5 Haworthovy vzorce stavebních jednotek vybraných polysacharidů.

HOCH2

O

OH

OHO

HOCH2

O

OH

OHOO

n

amylosa (složka škrobu), n = 120 -150

OHOCH2

OH

HO

OHOCH2

OH

HO

CH2

O

O

CH2

O

polyfruktosan inulin, n = 10 - 15

n

83

Chemické reakce sacharidů jsou založeny na reaktivitě hydroxylových a karbonylových skupin a na schopnosti tvořit dehydratací minerálními kyselinami heterocyklický aldehyd furfural nebo jeho derivát. V některých případech je možné odlišit ketosy od aldos, pentosy od hexos apod. Vhodnou kombinací kvalitativních reakcí lze určit složení neznámé směsi cukrů. Pro chemickou charakterizaci jsou vhodné fenylosazony mono- a disacharidů. Velkou pomocí při identifikaci sacharidů je chromatografie. Řada reakcí uvedených níže je podkladem metod spektrofotometrického stanovení cukrů. a) Reakce založené na tvorbě furfuralu a jeho derivátů Jednou z nejběžnějších reakcí je dehydratace sacharidů minerálními kyselinami na furfural (pentosy) a 5-hydroxymethylfurfural (hexosy). Tento aldehyd snadno kondenzuje s fenoly a aromatickými aminy (thymol, resorcin, orcin, floroglucin, 1-naftol, anthron, difenylamin atd.) za vzniku zbarvení, které je obdobou trifenylmethanových barviv. Ke kolorimetrickému stanovení se užívá kondenzačních produktů s fenolem, orcinem nebo resorcinem. Reakci mohou poskytovat i glykosidy a polysacharidy, pokud při podmínkách jejich důkazu dochází k jejich částečné hydrolýze. Obr. 6 Reakce založené na tvorbě furfuralu a jeho derivátů

- 3 H2O

HCl

O

C

O

H

ribosa furfural

O

OH

OH

OH

HOCH2

glukosa

- 3 H2O HCl

2 1-naftol

- H2O, - 2 HOHOH2C CHO OHOH2C

C

O

5-hydroxymethylfurfural

barevný kondenzační produkt

O

OH

OH

OH

HOCH2

HO

b) Reakce oxidoredukční Tyto reakce jsou založeny na redukujícím účinku karbonylové skupiny. Aldehydová skupina aldos se přitom oxiduje na karboxyl, u ketos dochází k hlubší oxidaci. Jednou z nejpoužívanějších reakcí je redukce solí měďnatých na Cu2O (reakce Fehlingova, Benediktova, Trommerova),

84

redukce solí antimonitých či bismutitých (reakce Nylanderova) a stříbrných (reakce Tollensova) na kov, nebo redukce kyseliny pikrové na pikraminovou. Všechny tyto reakce probíhají v alkalickém prostředí a dávají je také aldehydy. Na redukci měďnatých solí je založeno stanovení cukrů. Vyloučený Cu2O se stanovuje gravimetricky, titračně nebo kolorimetricky (Nelsonovo stanovení redukujících cukrů). Všechny sacharidy kromě látek vysokomolekulárních redukují chroman v kyselém prostředí. Reakcí lze dokázat i glycerol po hydrolýze tuků a složených lipidů. Z polysacharidů jen ty, které za podmínek reakce hydrolyzují (např. inulin). c) Reakce s jodem Amylosa - jedna z frakcí škrobu - poskytuje s jodem intenzivní modré zbarvení. Podstata reakce spočívá v tom, že molekuly jodu pronikají do dutin vytvořených šroubovicí polysacharidu a ve formě klathrátu jeví změněné fyzikální vlastnosti. d) Tvorba fenylosazonů Fenylosazony jsou kondenzační produkty mono- a disacharidů s přebytkem fenylhydrazinu (podobně reagují p-nitrofenylhydrazin i 2,4-dinitrofenylhydrazin). Tyto látky jsou ve vodě málo rozpustné, dobře krystalují a mají charakteristický tvar krystalků s ostrým bodem tání. Reakční mechanismus zahrnuje primární kondenzaci karbonylové skupiny sacharidu s fenylhydrazinem na fenylhydrazon. Ten při nadbytku činidla postupně reaguje s dalšími dvěma molekulami fenylhydrazinu. Mechanismem zahrnujícím Amadoriho přesmyk konečně vzniká osazon. Z reakčního mechanismu je patrné, že totožný osazon poskytne trojice cukrů, která se liší pouze konfigurací OH- skupin na uhlících C-1 a C-2. Je to vždy ketosa a dvě epimerní aldosy (např. fruktosa, glukosa a mannosa). Jako vodítko při identifikaci může sloužit i rychlost tvorby osazonů a jejich rozpustnost, která se podstatně liší. Například osazony glukosy a fruktosy se vylučují krátce po zahřátí reakčního roztoku, kdežto sacharosa vyžaduje 20 až 30 minutové zahřívání. Osazony laktosy a maltosy se vylučují až po ochlazení. Kromě toho se fenylosazony D-glukosy, D-fruktosy a D-mannosy (identické) nerozpouštějí v chladném acetonu, na rozdíl od fenylosazonů xylosy nebo arabinosy. Obr. 7 Tvorba fenylosazonů

C

O

H

H

C OH

C

OH

H

H C

N NHH2N NH

H2N NH

C

H

C

N NH

N NHH

2

85

MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: 1% roztoky škrobu, glukosy, fruktosy, arabinosy, sacharosy, inulinu, 2% roztok laktosy, galaktosy, maltosy (konzervovat chloroformem), koncentrované kyseliny chlorovodíková, sírová a dusičná, koncentrovaný amoniak, 3% thymol v ethanolu, 10% 1-naftol v ethanolu, Lugolův roztok, neznámý vzorek sacharidu. Činidlo Selivanovo: 0,05% roztok resorcinu v 20% HCl. Činidlo Rothenfusserovo: 20 mL 10% roztoku difenylaminu v 96% ethanolu se smísí s 80 mL ledové kyseliny octové a 100 mL konc. HCl. Činidlo Bialovo: 25 mg FeCl3 se rozpustí v 2,5 mL vody a přidá se k 3 g orcinu v 1 L koncentrované HCl. Činidlo Fehlingovo: roztok I: 40 g CuSO4.5H2O se rozpustí v destilované vodě, roztok se doplní na 1 L a je-li třeba, zfiltruje se, roztok II: 200 g Seignettovy soli (tetrahydrát vínanu sodno-draselného) a 150 g NaOH se rozpustí v destilované vodě a doplní vodou na 1 L. Činidlo Tollensovo: roztok I: 10% roztok dusičnanu stříbrného, roztok II: 20 g pevného NaOH rozpustit ve vodě a doplnit na 250 mL. Před provedením reakce se smísí stejné objemy roztoků I a II a přidává se po kapkách amoniak, dokud se vyloučený oxid stříbrný právě rozpustí. Pozor, přebytek amoniaku snižuje citlivost činidla. 15 g bezvodého octanu sodného a 10 g hydrochloridu fenylhydrazinu se rozpustí ve 100 mL vody. Uchovává se v lednici v tmavé láhvi. Materiál: stojany se zkumavkami, kruhový stojan pro zahřívání zkumavek na vodní lázni, držáky na zkumavky, hrnec, podložní a krycí skla, kapátka (Pasteurovy pipety), Petriho misky, odměrné válečky (2 x 10 mL), kádinka na oplachování kapátek (400 mL), fix. Přístroje: elektrický vařič, mikroskop s lampou. PRACOVNÍ POSTUP Všechny reakce provedeme se standardními roztoky sacharidů a neznámým vzorkem. Roztoky činidel zásadně odměřujeme pomocí Pasteurových pipet, které vždy po použití propláchneme destilovanou vodou. 1. Skupinová reakce na sacharidy Thymolová reakce. K 0,5 mL roztoku sacharidu se přidají 3 kapky 3% alkoholického roztoku thymolu a 3 mL koncentrované HCl. Opatrným 1-5 min. vařením vzniká karmínové zbarvení. Reakci provedem se škrobem, sacharosou a neznámým vzorkem. Molischova reakce. K 0,5 mL roztoku sacharidu přidáme kapku 10% roztoku 1-naftolu a po promíchání opatrně podvrstvíme stejným objemem koncentrované kyseliny sírové (kyselina musí stékat po stěně zkumavky). Na rozhraní se vytvoří červenofialové zbarvení. Reakci provedeme s laktosou, glukosou a neznámým vzorkem. 2. Skupinová reakce na mono- a oligosacharidy Nitrochromová reakce. K 0,5 mL roztoku sacharidu opatrně přidáme asi 1,5 mL koncentrované kyseliny dusičné a po stěně zkumavky 3 kapky 5% chromanu draselného. Po dobrém promíchání vzniká po chvíli stání modré zbarvení. Provedeme se škrobem, inulinem, sacharosou a neznámým vzorkem.

86

3. Reakce na polysacharidy Reakce s jodem. K 0,5 mL roztoku sacharidu přidáme kapku Lugolova roztoku. V pozitivním případě vzniká modré zbarvení, je-li přítomen škrob. Červené zbarvení svědčí o částečném štěpení polysacharidového řetězce nebo o přítomnosti glykogenu. Reakci provedeme se škrobem a neznámým vzorkem. 4. Reakce na redukující cukry Fehlingova reakce. Ve zkumavce smícháme 0,5 mL roztoku sacharidu s 0,5 mL Fehlingova činidla I a 0,5 mL Fehlingova činidla II. Opatrným povařením vzniká v pozitivním případě červená sraženina Cu2O. Provedeme se sacharosou, maltosou a neznámým vzorkem. Tollensova reakce. Ve zkumavce smícháme 0,5 mL roztoku cukru s 0,5 mL čerstvě připraveného Tollensova činidla. Opatrným povařením vzniká u redukujících cukrů na stěnách zkumavky stříbrné zrcátko. Obsah zkumavky po provedení reakce okamžitě vylijeme do odpadu, neboť delším stáním může dojít ke vzniku Bertholetova třaskavého stříbra, jež může být příčinou samovolných explozí. Stříbrné zrcátko odstraníme kyselinou dusičnou. Reakci provedeme s neznámým vzorkem. 5. Reakce na ketosy Selivanova reakce. Na vroucí vodní lázni zahříváme současně 0,5 mL níže uvedených cukrů s 2 mL Selivanova činidla. Přítomnost ketos se projeví červeným zbarvením asi po 1 minutě, aldosy reagují slabě až po delší době. Sacharosa se za podmínek reakce snadno hydrolyzuje, a proto reaguje rychleji než glukosa. Reakci dává též polysacharid inulin (tj. polyfruktosan). Provedeme se sacharosou, fruktosou, glukosou, inulinem a neznámým vzorkem. Rothenfusserova reakce. K 0,5 mL roztoku cukru přidáme 1 mL činidla. Po 10 minutách zahřívání na vroucí vodní lázni vzniká modré zbarvení zejména u ketos. Provedeme s fruktosou, galaktosou a neznámým vzorkem. 6. Reakce na pentosy Bialova reakce. K 0,5 mL roztoku sacharidu přidáme 1 mL činidla. Po zahřátí a ochlazení se roztok pentosy zbarví modrozeleně. Reakci provedeme s arabinosou, glukosou a neznámým vzorkem. 7. Tvorba fenylosazonů 0,5 mL roztoku sacharidu zahříváme se 1,5 mL fenylhydrazinového činidla na vroucí vodní lázni asi 30 min. Roztok pozvolna žloutne a po ochlazení se vylučují žluté krystaly osazonu. Roztoky ponecháme pozvolna chladnout při teplotě místnosti, aby se krystaly dobře vyvinuly. Osazon arabinosy se vylučuje zpočátku v olejovité formě. Laktosa a maltosa dávají sraženinu až po ochlazení. Osazon arabinosy je snadno rozpustný ve studeném acetonu na rozdíl od osazonů glukosy a fruktosy. Reakci provedeme se všemi připravenými standardními roztoky mono- a disacharidů a s neznámým vzorkem. Krystaly si prohlédneme pod mikroskopem VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Všechny provedené kvalitativní reakce shrneme v přehledné tabulce; v záhlaví uvedeme

vodorovně název použitého sacharidu a svisle název reakce. Výsledky reakcí označíme takto: (+) pozitivní (pozorováno příslušné zbarvení), (-) negativní. Tabulku doplníme nákresem pozorovaných krystalků osazonů.

2. Určíme složení neznámého vzorku.

87

5.2. PAPÍROVÁ CHROMATOGRAFIE SACHARIDŮ TEORETICKÝ ÚVOD Chromatografické metody jsou dnes zcela nepostradatelné, máme-li od sebe vzájemně odlišit či oddělit látky blízké struktury. Chromatografie na papíře je druhem rozdělovací chromatografie. Její princip spočívá v rozdělení směsi látek podle jejich rozdělovacích koeficientů mezi dvě omezeně mísitelná rozpouštědla. Jedno z rozpouštědel je zakotveno v porézním nosiči (stacionární fáze), rozpouštědlo protékající přes nosič představuje fázi mobilní. Ta rozpouští látky nanesené na startu a rozpuštěné v zakotvené fázi. Látka nejlépe rozpustná v mobilní fázi se proto bude po papíře pohybovat nejrychleji. Chromatografický papír používaný jako nosič musí být velmi kvalitní, přiměřeně hustý a zcela homogenní. Sacharidový skelet celulosových vláken má daleko větší afinitu k vodě než k organickým a méně polárním rozpouštědlům. Proto na papíře je vždy zakotvenou fází voda, resp. voda nasycená pohyblivou fází. Jednou z variant papírové chromatografie je její kruhové uspořádání, kdy mobilní fáze vzlíná použitím knotu od středu kruhové plochy papíru. Jednou z nejužívanějších rozpouštědlových směsí pro dělení sacharidů je dvoufázová směs n-butanolu, kyseliny octové a vody (4 : 1 : 5) Směs se připravuje tak, že se uvedené látky v daném poměru smísí v dělicí nálevce a důkladně protřepou. Po ustálení se vytvoří dvě vrstvy. Horní (organická) obsahuje především butanol, dolní (vodná) obsahuje hlavně vodu. Obě fáze se použijí. Chromatografuje se organickou fází, vodná fáze se používá k sycení atmosféry chromatografické komory. Největší vliv na hodnotu Rf faktoru u sacharidů má velikost molekuly (počet monosacharidových podjednotek) a počet uhlíků v molekule. Druhotně se uplatňuje prostorové uspořádání hydroxylových skupin, jejich počet a charakter cyklu. Furanosy mají větší retenční faktor než pyranosy. U složitějších sacharidů má vliv i charakter glykosidové vazby: 1,4-disacharidy putují rychleji než 1,6-disacharidy. Vcelku jsou však hodnoty Rf malé, protože sacharidy jsou velmi rozpustné v organických rozpouštědlech. Chromatogram se proto při vyvíjení nechává přetéci (vyvíjení běží přes noc), aby došlo k výraznějšímu rozdělení směsi. Poloha skvrn se pak hodnotí podle autentických srovnávacích vzorků, neboť nelze určit Rf. Obr. 8 Princip detekce sacharidů v chromatogramu reakcí s 2,3,5-trifenyl-1,2,3,4-tetrazolium v alakalickém prostředí.

glukosa kys. glukonová+ ++

N N

N N

HN N

N N

+OH-

formazan

H2O

2,3,5-trifenyl-1,2,3,4-tetrazolium

88

K detekci sacharidů v chromatogramu použijeme roztok trifenyltetrazolia, čerstvě připravený smísením 2% roztoku chloridu trifenyltetrazolia s roztokem NaOH (1 mol.L-1) v poměru 1 : 1. Po vysušení za zvýšené teploty (v sušárně) lze sacharidy obsahující redukující poloacetalový hydroxyl identifikovat jako sytě červené skvrny na světlém pozadí - redukcí trifenyltetrazolia se tvoří formazan. Sacharosa jako neredukující cukr toto zbarvení nevytváří. Po aplikaci detekční směsi rozprašovačem na vyvinutý chromatogram se však objeví jako negativní skvrna (světlejší než pozadí). Za účelem detekce je rovněž možné převedení sacharidu na derivát furfuralu a jeho následující kondenzace s hydrogenftalátem anilinu. Aldopentosy dávají červenohnědé zbarvení, aldohexosy hnědé zbarvení s nádechem do žluta. Ketosy ale poskytují nepatrné zbarvení a je proto nutné detekovat je jinými činidly, např. resorcinem v přítomnosti kyseliny. MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: 10% standardní roztoky sacharidů (arabinosa, ribosa, fruktosa, glukosa, mannosa, galaktosa, laktosa, maltosa, sacharosa), směs n-butanol : kys. octová : voda v poměru 4 : 1 : 5 (oddělené fáze), 2% roztok chlorid trifenyltetrazolia, 1 mol.L-1 roztok NaOH, neznámý vzorek (směs). Materiál: chromatografický papír Whatman (20 x 20 cm), tampony z buničité vaty, chromatografická komora - Petriho misky (2 x 20 cm, 1 x 10 cm), odměrný válec (25 mL), mechanický rozprašovač, kapátka ke standardním roztokům sacharidů a neznámému vzorku, skleněná zátka jako šablona. Přístroje: elektrický vysoušeč ("fén"). PRACOVNÍ POSTUP

Používaný chromatografický papír má tvar čtverce rozměrů 20 x 20 cm. Vzorky, tj. standardní roztoky sacharidů a neznámou směs, nanášíme na start ve formě obloučků po kružnici (vždy 2 - 3 kapky na sebe) nakreslené podle šablony kolem středu papíru. Po nanesení každé kapky důkladně vysušíme fénem. Chromatogram vyvíjíme v komoře zhotovené ze dvou vík velkých Petriho misek o průměru 20 cm. Organická fáze vyvíjecí směsi je v malé Petriho misce umístěné uprostřed spodní velké misky, kolem ní se nachází vodná fáze k nasycení atmosféry uvnitř chromatografické komory. Zásobování papíru vyvíjecí soustavou se děje knotem připraveným stočením tamponu a jeho zasunutím do otvoru ve středu papíru. Doba vyvíjení chromatogramu je pětinásobkem času, za který rozpouštědlo dovzlíná k okraji misky nebo přes noc. Detekci provedeme v příštím cvičení čerstvou směsí připravenou smísením 5 mL roztoku chloridu trifenyltetrazolia (TTC) a 5 mL roztoku NaOH. Suchý chromatogram postříkáme detekční směsí pomocí mechanického rozprašovače a 2-5 minut sušíme v sušárně. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Na základě výsledků chromatografie určíme složení neznámé směsi sacharidů. KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Napište Fischerův a Tollensův vzorec D-ribosy. Napište také Haworthův vzorec furanosové

i pyranosové formy tohoto monosacharidu. Jak budou vypadat vzorce 2-deoxyribosy a ribitolu, kyselin galaktonové, galakturonové a galaktarové?

2. Na základě prováděných kvalitativních reakcí nakreslete postupné schéma identifikace neznámého vzorku sacharidu.

89

Obr. 9 Schéma kruhové chromatografie sacharidů na papíře. I) 1 - víka Petriho misek, 2 - mobilní fáze, 3 - stacionární fáze, 4 - filtrační papír Whatman, 5 - knot pro přívod mobilní fáze; II) a - víko Petriho misky, b - start, nanášení vzorků

LITERATURA Večeřa M. a Gasparič J. (1973) Důkaz a identifikace organických látek, SNTL (Praha). Scott T. a Eagleson M., ed. (1988) Concise Encyclopedia Biochemistry, Walter de Gruyter (Berlin - New York). Berg J.M., Tymoczko J.L. a Stryer L. (2002) Biochemistry (5. vydání), W.H. Freeman (New York). Mikeš V. (1985) Skripta Základní biochemické praktikum, vydavatelství UJEP (Brno).

90

6. NUKLEOVÉ KYSELINY 6.1.IZOLACE DNA A RNA, IDENTIFIKACE SLOŽEK NUKLEOVÝCH

KYSELIN

TEORETICKÝ ÚVOD Nukleové kyseliny byly objeveny roku 1869 jako složky buněčného jádra. Jsou to složité

vysokomolekulární sloučeniny, úplnou hydrolýzou se štěpí na heterocyklické organické báze, sacharid (pentosu) a kyselinu fosforečnou. Podle druhu sacharidu rozeznáváme kyselinu deoxyribonukleovou (DNA), která obsahuje 2-deoxyribosu a kyselinu ribonukleovou (RNA), která obsahuje ribosu. Stavebními jednotkami nukleových kyselin jsou pyrimidinové a purinové báze. Mezi nejčastěji se vyskytující pyrimidinové báze patří cytosin (C), thymin (T) a uracil (U), které N-glykosidickou vazbou s ribosou (resp. 2-deoxyribosou) vytvářejí nukleosidy cytidin, thymidin a uridin. Podobně purinové báze adenin (A), guanin (G) a hypoxanthin vytvářejí nukleosidy adenosin, guanosin a inosin. Všechny nukleosidy vytvářejí esterovou vazbou s fosfátem nukleotidy. Obr. 1 Pyrimidinové a purinové báze.

NHN

NN

NH2

NHN

NNH

O

NH2NH

NH

O

O

CH3

NH

NH

O

ONH2

NH

O

N

Cytosin Thymin Uracil Adenin Guanin

N

NH

O

O

N

N

O

NH2

P

O

O

-O O

O

O

OH

P

O

O

-O O O

OH

P

O

O

-O O O

OH

OO

OH

P

O

O

-O

N N

NN

NH2

N

NNH

O

NH2N

úsek RNA, zkráceně ACGU

Nukleové kyseliny jsou makromolekulární polynukleotidy, jsou tvořeny mnoha nukleosidy navzájem spojenými fosfátem (diesterová vazba). Molekulární strukturu DNA určili roku 1953 Watson a Crick (Nobelova cena). Molekulu DNA tvoří dva polynukleotidové řetězce složené z nukleotidů ACGT, které jsou antiparalelně spletené do dvojšroubovice na základě párování A=T a C≡G prostřednictvím vodíkových vazeb. Molekulová hmotnost DNA se pohybuje od 107 - 109.

91

Experimentálně bylo prokázáno, že DNA je nositelem genetické informace, tedy základem dědičnosti. V DNA je uložena základní genetická informace sloužící k biosyntéze proteinů. Tato informace je kódována pořadím jednotlivých nukleotidů. Informace se může přenášet na další generaci znovu ve formě DNA - tzv. replikací nebo nastává přepis z DNA na mediátorovou RNA - transkripce na základě komplementárního párovaní bazí. Mediátorová RNA se bezprostředně účastní biosyntézy proteinů - translace. V molekulách RNA je báze T nahrazena U, která je také komplementární s A. Celkově rozeznáváme tři základní typy RNA, které se liší především funkcí a molekulovou hmotností:

1. Ribosomální - rRNA, Mr 0,5 - 1,0.106, je hlavní součástí ribosomů 2. Mediátorová - mRNA, Mr řádově 105, struktura je podobná jednomu vláknu DNA, přenáší

genetickou informaci k biosyntéze proteinů 3. Přenosová - tRNA, Mr 25 - 30.103, struktura je podobná jetelovému listu, slouží k přenosu

aminokyselin při proteosyntéze.

Cílem této úlohy je izolace RNA z kvasnic, DNA z vepřové sleziny, stanovení a důkazy jejich komponent. MATERIÁL A CHEMIKÁLIE Chemikálie: 5 a 50% kyselina octová, 5% kyselina sírová, 0,5% NaOH, diethylether, ethanol, 1% CuSO4, 1 mol.L-1 NaCl, Na2CO3, koncentrovaná HCl, difenylaminové činidlo (do 100 mL 1% roztoku difenylaminu v ledové kyselině octové se přidá 2 x 75 mL koncentrované kyseliny sírové), amoniakální roztok dusičnanu stříbrného (k 5% AgNO3 se přidává koncentrovaný amoniak až se rozpustí vzniklá sraženina - roztok se používá čerstvý), ledem vychlazená destilovaná voda, Folinovo činidlo. Materiál: kvasnice, vepřová slezina, mořský písek, křemenná kyveta, centrifugační kyvety, odměrný válec (100 mL), kádinky (500 a 1000 mL), 2 varné baňky, zpětný chladič, zkumavky, třecí miska, dřevěná tyčinka, pipety, varné kamínky. Přístroje: UV spektrofotometr, vodní lázeň, centrifuga. PRACOVNÍ POSTUP 1. Izolace RNA z kvasnic Směs 40 g kvasnic, 3 mL destilované vody a 3 mL diethyletheru rozetřeme pomocí mořského písku v třecí misce. Do homogenátu přidáme postupně 50 mL 0,5% NaOH a pokračujeme v roztírání asi ještě 15 min. Pak upravíme pH preparátu na pH 6 pomocí 5% kyseliny octové. Směs centrifugujeme při 3000 g po dobu 10 min. Supernatant odlejeme do kádinky a upravíme na pH 3,5 s 50% kyselinou octovou (odměříme si její objem), přidáme vychlazený ethanol (stejný objem jako byl přídavek 50% kyseliny octové). Vyloučená sraženina představuje ribonukleoprotein, který po centrifugaci 10 min, 2000 g použijeme k dalšímu pokusu. 2. Izolace DNA ze sleziny Asi 10 g nakrájené sleziny rozetřeme na jemnou kaši s trochou mořského písku v třecí misce. Za intenzívního roztírání po malých dávkách přidáváme 100 mL 1 mol.L-1 NaCl a homogenizujeme 15 min. Homogenát centrifugujeme 10 min při 5000 g, supernatant slijeme a pomalu naléváme do cca 600 ml vychlazené mírně rozmíchané destilované vody. DNA se sráží ve formě vláken, která se navíjí na dřevěnou tyčinku. Tato vlákna přeneseme do varné baňky, do malé a velké zkumavky a následně použijeme k dalšímu pokusu.

92

3. Důkaz RNA a DNA reakcí s difenylaminem DNA a RNA lze rozlišit na základě barevných reakcí, které poskytují ribosa a 2-deoxyribosa s difenylaminem. Difenylamin poskytuje s RNA zelené zbarvení a s DNA modré zbarvení. Izolovanou DNA a RNA rozdělíme na tři části. Do zkumavek přeneseme první část izolované DNA a RNA, přidáme 1 mL 0,5% NaOH a po promíchání a rozpuštění přidáme 1 mL difenylaminového činidla a zahříváme 10-20 min na vroucí vodní lázni. Pozorujeme vývoj zbarvení. 4. Hydrolýza DNA a RNA RNA a DNA se liší stabilitou fosfodiesterové vazby. Kyselou hydrolýzou se štěpí obě nukleové kyseliny, ale rozdílným způsobem, v alkalickém prostředí se RNA štěpí až na nukleotidy, ale DNA se jen denaturuje. Druhé podíly DNA a RNA získané izolací povaříme v baňkách pod zpětným chladičem 30 min s 30 mL 5% kyseliny sírové. Získané hydrolyzáty použijeme pro důkazy purinových bazí. 5. Důkaz purinových bazí nukleových kyselin Purinové báze tvoří nerozpustné soli stříbrné a měďné. Guanin redukuje Folinovo činidlo za vzniku modrého zbarvení.

• K 1 mL hydrolyzátu z předchozího pokusu po kapkách přidáváme amoniak až do alkalické reakce (pH papírek) a 0,5 mL amoniakálního roztoku AgNO3. Vzniká jemná bílá vločkovitá sraženina.

• 1 mL hydrolyzátu ve zkumavce zahřejeme k varu a přidáme 1 mL 10% CuSO4. Do směsi postupně přidáváme pevný Na2SO3, až vznikne tmavě žlutohnědá sraženina.

• 1 mL hydrolyzátu smícháme s 1 mL Folinova činidla a po špetkách přidáváme na nakloněnou stěnu zkumavky pevný Na2CO3. Vzniká intenzivně modré zbarvení.

6. Spektrální stanovení nukleových kyselin Nukleové kyseliny absorbují záření v ultrafialové oblasti, maximum absorpce je při 260-265 nm (Obr. 1). Při stanovení je nutné dbát na čistotu preparátu, protože ruší přítomnost proteinů a aromatických látek. Pro stanovení se využívá vlnové délky 260 nm a metody kalibrační křivky. Ke třetímu podílu vyizolované DNA a RNA přidáme 0,5 ml 0,5% NaOH. Do 1 cm křemené kyvety napipetujeme 2 mL 0,5% NaOH a přidáme 20 µL DNA nebo RNA v roztoku NaOH. Měříme absorpční spektra v UV oblasti v rozsahu 200 - 290 nm. 0,5% NaOH slouží jako blank.

Protože preparáty izolované v tomto experimentu obsahují mimo nukleových kyselin i značný podíl proteinů které absorbují při 280 nm, použijeme pro stanovení obsahu nukleových kyselin poměr absorbancí A280/A260 podle metody Warburga a Christiana na základě následující tabulky 1 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Zhodnotíme výsledky důkazů sacharidů a purinových bazí v nukleových kyselinách. 2. Zjistíme metodou Warburga a Christiana podíl nukleových kyselin v izolovaných preparátech

a obsah proteinů v izolovaných preparátech. KONTROLNÍ OTÁZKY 1. Zjistěte z literatury, jaký je rozdíl mezi strukturami A-DNA a B-DNA a za jakých podmínek

DNA tyto struktury zaujímá. 2. Jaké další báze kromě ACGT(U) lze nalézt v DNA (RNA)?

93

Obr. 2 UV spektrum DNA a RNA.

200 225 250 275 300

Vlnová délka (nm)

35

30

25

20

15

10

5

0

ε (L.mmol-1.cm-1)

DNA

RNA

Obsah kontaminujících proteinů se vypočítá podle vztahu (F je faktor zjištěný z tabulky 1 a d je šířka kyvety v cm).

d

AF

280=proteiny (mg.mL-1)

Tabulka 1 A280/A260 % nukleových

kyselin F

1,75 0,00 1,116 1,63 0,25 1,081 1,52 0,50 1,054 1,40 0,75 1,023 1,36 1,00 0,994 1,30 1,25 0,970 1,25 1,50 0,944 1,16 2,00 0,899 1,09 2,50 0,852 1,03 3,00 0,814 0,979 3,50 0,776 0,939 4,00 0,743 0,874 5,00 0,682 0,846 5,50 0,656 0,822 6,00 0,632 0,804 6,50 0,607 0,784 7,00 0,585 0,767 7,50 0,565 0,753 8,00 0,545 0,730 9,00 0,508 0,705 10,00 0,478 0,671 12,00 0,422 0,644 14,00 0,377 0,615 17,00 0,322 0,595 20,00 0,278

LITERATURA Macholán L., Skurský L. a Zbořil P. (1980) Skripta Laboratorní cvičení z biochemie I, vydavatelství UJEP (Brno). Zelinka J. a kol. (1982) Skripta Základné cvičenia z biochémie,vydavatelství UK (Bratislava).

94

PŘÍPRAVA ČINIDEL A ROZTOKŮ ANTHRONOVÉ ČINIDLO 150 mg anthronu se smísí za studena se 100 mL zředěné H2SO4 (760 mL koncentrované kyseliny o hustotě 1,84 se vleje za chlazení do 300 mL vody); nutno připravovat denně čerstvé. BICINCHONINOVÉ (BCA) ČINIDLO roztok A: 1 g 4,4'-dikarboxy-2,2'-bichinolin, dvojsodná sůl (Na2BCA, 26 mmol.L-1 konečná koncentrace), 2 g Na2CO3.H2O (0,16 mol.L-1 konečná koncentrace), 160 mg vinan sodný (7 mmol.L-1 konečná koncentrace), 0,4 g NaOH (0,1 mol.L-1 konečná koncentrace), 0,95 g NaHCO3 (0,11 mol.L-1 konečná koncentrace), 100 mL H2O, Pouze dvojsodná sůl kyseliny bicinchoninové Na2BCA je rozpustná v neutrálním pH; volná kyselina není dostatečně rozpustná, dokonce ani v alkalickém roztoku. roztok B: 4 g CuSO4.5H2O (16 mmol.L-1 konečná koncentrace), 100 mL H2O, BCA činidlo (roztok A + roztok B): smícháme 50 objemů roztoku A s 1 objemem roztoku B. Připravíme pouze nutné množství na několik dní, protože směs není stálá, BCA činidlo má lehce nazelenalou barvu, po smíchání a rozpuštění složek upravíme pH na 11, 3 +/- 0, 2 přídavkem pevného NaOH pro zvýšení pH, nebo NaHCO3 ke snížení pH. BIALOVO ČINIDLO 25 mg FeCl3 se rozpustí v 2,5 mL vody a přidá se k 3 g orcinu v 1 L koncentrované HCl. BIURETOVÉ ČINIDLO 1,5 g CuSO4.5H2O (6 mmol.L-1 konečná koncentrace), 6 g vinan sodno-draselný tetrahydrát - C4H4KNaO6.4H2O (21 mmol.L-1 konečná koncentrace), 300 mL 10% (w/v) NaOH (0,75 mol.L-1 konečná koncentrace), převařená destilovaná voda do 1 litru. ČINIDLO BRADFORDOVÉ 100 mg Coomassie brilliant blue G250 (0,01% w/v), 50 mL 95% ethanol (5% konečná koncentrace), 100 mL 85% kyselina fosforečná, doplnit vodou do 1 L. BRITTON-ROBINSONŮV PUFR 40 mmol.L-1, pH 8: 100 mL roztoku, který obsahuje 40 mmol.L-1 H3PO4, 40 mmol.L-1 CH3COOH a 40 mmol.L-1 H3BO3 (2,7 mL 85% H3PO4, 2,3 mL ledové CH3COOH a 2,74 g H3BO3 na litr roztoku) se smísí s 60 mL 0,2 mol.L-1 NaOH. FEHLINGOVO ČINIDLO roztok I: 40 g CuSO4.5H2O rozpustíme v 500 mL vody a doplníme do 1 L, roztok II: 200 g Seignettovy soli (vinan sodnodraselný - C4H4O6KNa.2H2O) a 150 g NaOH se rozpustí v menším množství vody a doplní na 1 L. FENYLHYDRAZINOVÉ ČINIDLO 15 g bezvodého octanu sodného a 10 g hydrochloridu fenylhydrazinu se rozpustí ve 100 mL vody. Uchovává se v lednici v tmavé láhvi. HARTREE-LOWRY ČINIDLO roztok A: 2 g vinan sodno-draselný.4H2O (7 mmol.L-1 konečná koncentrace), 100 g Na2CO3 (0,81 mol.L-1 konečná koncentrace), 500 mL 1 mol.L-1 NaOH (0.5 mol.L-1 konečná koncentrace), voda do 1 litru,

95

roztok B: 2 g vinan sodno-draselný.4H2O (0,07 mol.L-1 konečná koncentrace), 1 g CuSO4.5H2O (0,04 mol.L-1 konečná koncentrace), 90 mL H2O, 10 mL 1 mol.L-1 NaOH, roztok C: zředíme 1 objem Folin-Ciocalteau činidla 15 objemy vody. Připravujeme denně v 16 mL množství nebo jeho násobcích, neupravujeme pH. HEMOGLOBINOVÝ SUBSTRÁT PODLE ANSONA 2 g hemoglobinu z hovězích erytrocytů a 36 g močoviny se rozpustí v destilované vodě a přidá se 8 mL 1 mol.L-1 NaOH. Objem se pak doplní destilovanou vodou na 100 mL a roztok se ponechá stát 1 h při laboratorní teplotě. Poté se přidá 10 mL 1 mol.L-1 KH2PO4 a 4 g močoviny. Roztok se zfiltruje přes filtrační papír. Hodnota pH hemoglobinového substrátu má být 7,8 a obsah proteinů stanovený Lowryho metodou s BSA jako substrátem 6,15 mg.mL-1. LOWRYHO ČINIDLO CTC roztok: 0,1% CuSO4.5H2O, 0,2% vinan draselný, 10% Na2CO3. Uhličitan se rozpustí v jedné polovině konečného objemu a přidá se pomalu k druhé polovině konečného objemu obsahujícího roztok vinanu draselného a síranu měďnatého, Folin-Ciocalteuovo činidlo: 100 g wolframanu sodného Na2WO4 . 2H2O a 25 g molybdenanu sodného Na2MoO4.2H2O se smísí v 1,5 L baňce se 700 mL vody, přidá se 50 mL 85% kyseliny fosforečné a 100 mL konc. HCl, roztok se přivede k varu pod zpětným chladičem a vaří se 10 hod, ke konci doby varu se přidá 150 g síranu lithného, 50 mL vody a několik kapek bromu, směs se poté vaří v digestoři bez chladiče 15 min, po ochlazení se doplní do 1 L a zfiltruje, roztok A: směs 1 dílu CTC roztoku se 2 díly vody a 1 dílem 0,8 mol.L-1 NaOH, roztok B: směs 1 dílu Folin-Ciocalteuova činidla s 5 díly vody. LUGOLŮV ROZTOK 10 g jodidu draselného a 5 g jodu se rozpustí ve 100 mL vody. NESSLEROVO ČINIDLO Ve 20 mL vody se postupně rozpustí 30 g KI a 25 g jodu. Po rozpuštění se přidá 30 g redestilované kovové rtuti a směs se dobře protřepe (zahřívá-li se směs příliš, chladí se vodou) tak dlouho, až se všechen jod spotřebuje a roztok se odbarví. Pak se roztok oddekantuje, rtuť a sediment se promyjí malým množstvím destilované vody, která se pak přidá k hlavnímu podílu. Roztok má dávat se škrobem pozitivní reakci na jod. Není-li tomu tak, přidá se po kapkách roztok jodu v KI, až je možné dokázat jeho slabý nadbytek. Pak se roztok zředí na 200 mL, promíchá a přilije k 975 mL 10% NaOH. NINHYDRINOVÉ ČINIDLO roztok 1: 0,2 M citrátový pufr pH 5, 21 g kyselina citronová monohydrát (0,22 mol.L-1 konečná), 200 mL 1 mol.L-1 NaOH (0,4 mol.L-1 konečná koncentrace), H2O do 500 mL, roztok 2: 0,8 g SnCl2 . 2H2O (7 mmol.L-1 konečná koncentrace), 500 mL 0,2 mol.L-1 citrátový pufr pH 5 ( 0,1 mol.L-1 konečná koncentrace), roztok 3: 20 g krystalický ninhydrin (4% w/v, konečná koncentrace), 500 mL 2-methoxyethanol (methyl cellosolve), pracovní roztok: smícháme 500 mL roztoku 2 a 500 mL roztoku 3, probubláme dusíkem a skladujeme v tmavé láhvi při 4 °C). Upozornění: Methyl cellosolve má teplotu varu 124 °C a je silně toxický, ačkoliv není příliš těkavý. S většími kvanty je nutné pracovat v digestoři. Ninhydrinové roztoky barví vše intenzívní purpurovou barvou. Je nutné pracovat v plášti a rukavicích. Pokud si zabarvíte kůži, musíte se několikrát umýt mýdlem a opláchnout vodou. Zbarvení obvykle přetrvává několik dní.

96

PAULYHO ČINIDLO roztok I: 5% roztok dusitanu sodného ve vodě, roztok II: 900 mg kyseliny sulfanilové rozpustíme v 9 mL koncentrované kyseliny chlorovodíkové a doplníme destilovanou vodou do 100 mL. ROTHENFUSSEROVO ČINIDLO 20 mL 10% roztoku difenylaminu v 96% ethanolu se smísí s 80 mL ledové kyseliny octové a 100 mL konc. HCl. SELIVANOVO ČINIDLO 0,05% roztok resorcinu v 20% HCl. SOMOGYI-NELSONOVO ČINIDLO roztok I: 24 g bezvodého Na2CO3, 16 g NaHCO3,, 144 g bezvodého Na2SO4 a 12 g vinanu sodnodraselného (Seignettova sůl) v 800 mL destilované vody, roztok II: 4 g CuSO4.5H2O a 24 g bezvodého Na2SO4 v 200 mL destilované vody, roztok III: 25 g molybdenanu amonného v 450 mL vody a 21 mL konc. H2SO4 a poté přidat 3 g Na2HAsO4.7H2O v 25 mL vody. TOLLENSOVO ČINIDLO roztok I: 10% roztok dusičnanu stříbrného, roztok II: 20 g pevného NaOH rozpustit ve vodě a doplnit na 250 mL. Před provedením reakce se smísí stejné objemy roztoků I a II a přidává se po kapkách amoniak, dokud se vyloučený oxid stříbrný právě rozpustí. Pozor, přebytek amoniaku snižuje citlivost činidla.

97

POUŽITÁ LITERATURA Anzenbacher P. a Kovář J. (1986) Skripta Metody chemického výzkumu pro biochemiky, vydavatelství MŠ ČSR (Praha). Berg J.M., Tymoczko J.L. a Stryer L. (2002) Biochemistry (5. vydání), W.H. Freeman (New York). Boyer R. F. (1986) Modern Experimental Biochemistry,. 413-424, Addison-Wesley Publishing Company, Reading Massachusetts, USA. Cayot P., Tainturier G. (1997) The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal. Biochem. 249, 184-200. Ferenčík M. a Škárka B. (1981) Biochemické laboratorné metódy, VTEL (Bratislava). Ferenčík M. (1989) Imunochémia. Alfa, Vydavateľstvo technickej a ekonomickej literatúry (Bratislava). Fields R. (1971) The measurement of amino groups in proteins and peptides. Biochem. J. 124, 581-590. Frébort I., Haviger A. a Peč P. (1992) Skripta Experimentální metody biochemie, vydavatelství UP (Olomouc). Frébort I. a Peč P. (1993) Proteolytic activity assay based on enhanced peroxidase effect of hydrolyzed cytochrome c. Biochem. Mol. Biol. Int. 30, 219-223. Habeeb A.F.S.A. (1966) Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 14, 328-336. Harwood A. J. (1996) Basic DNA and RNA Protocols. Methods in Molecular Biology, 58, Humana Press Totowa, NJ, USA. Haviger A., Peč P. a Lasovský J. (1988) Acta Univ. Pal. Fac. Rer. Nat. 91 (Chemica XXVII), 159-173 a 183-190. Havliš J., Thomas H., Šebela M., Shevchenko, A. (2003) Fast response proteomics by accelerated in-gel digestion of proteins. Anal. Chem. 75, 1300-1306. Jacobs E. E.a Sanadi D. R. (1960) J. Biol. Chem. 235, 531. Kézdy F.J., Lorand, L., Miller, K.D. (1965) Titration of active centers in thrombin solutions. Standardization of the enzyme. Biochemistry 4, 2302-2308. Kidway S.A., Ansari A.A., Salahuddin A. (1976) Effect of succinylation (3-carboxypropionylation) on the conformation and immunological activity of ovalbumin. Biochem. J. 155, 171-180. Krajhanzl A., Hladík J. a kol.(1991) Skripta Biochemické metody, Návody k pokročilým praktickým cvičením, Karolinum (Praha).

98

Lambeth D. O. (1979) The purification of cytochrome c from bakers yeast. J. Chem. Educ., 56, 270. Laurell C. B. (1966) Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarose gel containing antibodies. Anal. Biochem. 15, 45-52. Lundblad R. L. a Noyes C. M.(1985) Chemical Reagents for Protein Modification, Vol. I, 3rd ed.,

CRC Press Inc (Boca Raton). Macholán L., Skurský L. a Zbořil P. (1980) Skripta Laboratorní cvičení z biochemie I, vydavatelství UJEP (Brno). Macholán L., Barthová J. a Kučera I. (1994) Skripta Enzymologie, vydavatelství MU (Brno). Margoliash E. and Frohwirt N. (1959) Biochem. J. 71, 570. Mikeš V. (1985) Skripta Základní biochemické praktikum, vydavatelství UJEP (Brno). Ouchterlony O. (1959) Diffusion in agar methods for immunologie analysis, Prog. Allergy. 5, 1-78. Peterson G. L. (1983) Methods in Enzymology, 91, 95-119, Academia Press (New York). Ruml T. (1997) Skripta Laboratoře z genového inženýrství, vydavatelství VŠCHT (Praha). Scott T. a Eagleson M., ed. (1988) Concise Encyclopedia Biochemistry, Walter de Gruyter, (Berlin - New York). Simon M.L., László K., Kotormán M., Szajáni B. (2001) A comparative study of the conformational stabilities of trypsin and α-chymotrypsin. Acta Biol. Szegediensis 45, 43-49. Stryer L. (1981) Biochemistry, 2. vydání, W. H. Freeman and Company (New York). Sundaram P.V. (1979) Immobilized-Enzyme Pipette Biochem. J. 179, 445-447. Svendsen I. (1976) Chemical modifications of the subtilisins with special reference to the binding of large substrates. A review. Carlsberg Res. Commun. 41, 238-291. Šebela M., Frébort I. a Peč P. (1998) New knowledge about the cofactors of copper amine oxidases as a contribution to the biochemistry of proteins. Chem. Papers (Chemické listy) 92, 698. Večeřa M. a Gasparič J. (1973) Důkaz a identifikace organických látek, SNTL (Praha). Voet D. a Voet J. G. (1995) Biochemie, Victoria Publishing (Praha). Westermeier R. (1993) Electrophoresis in Practice, VCH, (Weinheim). Wiley J. a Sons (1998) Current Protocols in Protein Science, Unit 3. 4. Assay of Total Proteins (New York).

99

Zbořil P., Macholán L., Dadák V., Skurský L. a Kovář J. (1978) Skripta Pokročilá cvičení z biochemie, vydavatelství UJEP (Brno). Zelinka J. a kol. (1982) Skripta Základné cvičenia z biochémie,vydavatelství UK (Bratislava). Laboratory Handbook of the Department of Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Yamaguchi University, Japan.

Date post:	05-Oct-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	2 times
Download:	0 times

Kompletn skripta 2008 - Přírodovědecká fakulta UP...V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a...

Documents