konfokální mikroskopie

(CLSM)

Confocal

Laser

Scanning

Microscopy

fluorescenční zobrazení jednoho bodu

vzorek

objektivová čočka

excitační světlo zobrazovací čočka

emitované světlo

problém je fluorescence emitovaná z nezaostřěné roviny na vzorku

kamera

konfokální mikroskop

vzorek

objektivová čočka

excitační světlo zobrazovací čočka

emitované světlo

pinhole

detektor

systém se pohybuje po vzorku a excituje bod po bodu, z toho následně

vytváří celkový obraz

CONFOCAL Laser Scanning Microscopy

CONFOCAL = conjugated focal plane

CONFOCAL Laser Scanning Microscopy

principy fluorescenčního snímání

široké „widefield“ osvětlení bodové „point“ osvětlení

The Point Spread Function (PSF)

Z=0

Z=+2µm

Z=-2µm

2D PSF for different defocus

image bodového objektu

x

y

Measured

x

z Calculated

The Point Spread Function (PSF)

Z=0

Z=+2µm

Z=-2µm

2D PSF for different defocus

image bodového objektu

x

y

3D PSF

„out of focus“ signál rozostřuje výsledný obraz „out of focus“ signál je blokován

porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie

fluorescenční konfokální

porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie

porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie

Confocal LASER Scanning Microscopy

Confocal LASER Scanning Microscopy

Confocal LASER Scanning Microscopy

Confocal LASER Scanning Microscopy

Confocal LASER Scanning Microscopy

Confocal Laser SCANNING Microscopy

galvano-skenovací zrcátko

Confocal Laser SCANNING Microscopy

optické řezy a 3D rekonstrukce

x y

z

x y

z

optické řezy a 3D rekonstrukce

x y

z

=

optické řezy a 3D rekonstrukce

Confocal Laser SCANNING Microscopy

Confocal Laser SCANNING Microscopy

Confocal Laser SCANNING Microscopy

spektrální detekce fluorescenčního signálu

spektrální detekce fluorescenčního signálu

velice nízká úroveň šumu a dramatická amplifikace signálu (~1x10)

detekce a amplifikace fluorescenčního signálu

multifunkční systém

Confocal Laser Scanning Microscopy

multifunkční systém

Confocal Laser Scanning Microscopy

„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi

porovnání fluorescenční a konfokální mikroskopie

„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi

„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi

„bleed‐through“ (prosvítání) při emisi

spektrální detekce při emisi

Detekce celého spektra prostřednictvím 32

kanálů na vzorku značeného DAPI a Alexa 488

spektrální detekce a separace signálů

spektrální detekce a separace signálů

spektrální detekce a separace signálů

3-D projekce dat – rekonstrukce objektu z optických řezů v

jednoduchém 2-D obraze

volume rendering – zobrazení 3-D dat z různých uhlů

pohledu

time-lapse data – zobrazení dat jako sekvence jednotlivých

optických řezů, nebo 2-D projekce

několika optických řezů v čase

základní funkce konfokální mikroskopie

Optické řezy

3D-rekonstrukce

3D-rekonstrukce

Pokročilé analýzy

Pokročilé analýzy

Pokročilé analýzy

Pokročilé analýzy