ISBN 978-80-861-8852-2

Vyu

žití

end

ofyt

ních

mik

roor

gani

smů

pro

podp

oru

růst

u oz

dobn

ice

L. M

rnka

a k

ol.

Využití endofytních mikroorganismů pro podporu růstu ozdobnice Certifikovaná metodika

Autoři: Ing. RNDr. Libor Mrnka, Ph.D.RNDr. Tomáš Frantík, CSc.Dr. Christoph S. Schmidt, Ph.D. doc. Ing. Petra Lovecká, Ph.D.

Oponenti: RNDr. David Novotný, Ph.D. (VÚRV v.v.i.)Ing. Michaela Budňáková (MZe, oddělení polních plodin)

DedikaceMetodika vznikla za finanční podpory Technologické agentury ČR (projekt „Zvýšení fytoremediační a produkční kapacity energetických rostlin na marginálních a kontaminovaných půdách prostřednictvím endofytních a mykorhizních symbiontů“ č. TA03011184) a výzkumného záměru RVO67985939. Metodika byla vytvořena v Botanickém ústavu AVČR, v.v.i. ve spolupráci s RABBIT Trhový Štěpánov a.s., Ecofuel Laboratories s.r.o. a VŠCHT Praha.

Vydavatel© Botanický ústav AV ČR, v.v.i.,Zámek 1, Průhonice 25243ISBN: 978-80-86188-52-2

Spoluvydavatel© Vysoká škola chemicko-technologická v Praze,Technická 5, 166 28 Praha 6 - DejviceISBN: 978-80-7080-978-5

vydání první, leden 2017

© Botanický ústav AV ČR, v.v.i., Zámek 1, Průhonice 25243© akvarely na přebalu Mgr. Dušan Kunc© cover & typo Bc. Jaroslav Petříček, DiS.

Tato publikace nesmí být přetiskována vcelku ani po částech, uchovávána v médiích, přenášena nebo uváděna do oběhu pomocí elektronických, mechanických, fotografických či jiných prostředků bez uvedení osoby, která má k publikaci práva podle autorského zákona nebo bez jejího výslovného souhlasu. S případnými náměty na jakékoliv změny nebo úpravy se obracejtepísemně na autory.

Obsah metodikyÚvod ......................................................................................................................... 5 Endofytní mikroorganismy a jejich biotechnologický potenciál ...................................... 6 Efekty endofytů na hostitelské rostliny .................................................................... 6 Příklady komerčního využití endofytních mikroorganismů ....................................... 9 Rizika spojená s biotechnologií využívající endofyty .............................................. 10 Endofyty u ozdobnice ........................................................................................... 11 Ozdobnice jako energetická plodina ........................................................................... 15 Potenciál a obecné nároky ................................................................................... 16 Agrotechnologický cyklus ..................................................................................... 19 Příprava pozemku ............................................................................................ 19 Výsadba .......................................................................................................... 19 Odplevelení ..................................................................................................... 22 Hnojení ........................................................................................................... 23 Kultivary .......................................................................................................... 24 Sklizeň ............................................................................................................. 25 Výnosové modely ................................................................................................. 28Cíl metodiky .................................................................................................................30Popis metodiky ............................................................................................................30 Využití vybraných endofytních mikroorganismů pro podporu růstu ozdobnice ..................30 Příprava bakteriálního inokula .............................................................................. 31 Příprava houbového inokula.................................................................................34 Inokulace ............................................................................................................ 36 Předpěstování inokulovaných rostlin .................................................................... 37 Výsadba a následná péče ....................................................................................38 Výsledky dosažené na modelových plochách ....................................................... 39 Přežívání vysazených rostlin ......................................................................................... 39 Růstové parametry ...................................................................................................... 41Shrnutí a závěr ...........................................................................................................46Srovnání novosti postupů ..........................................................................................46Uplatnění metodiky ...................................................................................................48Ekonomické aspekty ..................................................................................................48Anotace metodiky v AJ ............................................................................................. 52Použitá literatura a seznam publikací přecházejících metodice .......................53Příloha ....................................................................................................................... 67

4

5

Úvod Biomasa má nezastupitelnou roli při produkci obnovitelné energie, která by po-dle cíle EU měla v r. 2020 tvořit přibližně 20 % primární energie vyrobené v tomto regionu. V současnosti se biomasa podílí z jedné pětiny na produkci elektřiny z ob-novitelných zdrojů a z devíti desetin na produkci tepla z obnovitelných zdrojů (AE-BIOM 2016). Vedle odpadní biomasy roste význam cíleně pěstované biomasy, což jsou v podmínkách Evropy zejména plantáže rychle rostoucích dřevin a travin. Kom-petice o půdu s potravinářskými plodinami vytlačuje energetické plodiny na mar-ginální a kontaminované plochy. Ekonomické i ekologické důvody pak stimulují vývoj biotechnologií, které snižují aplikace minerálních hnojiv a pesticidů a zvyšují výnosy a odolnost porostů energetických plodin na těchto stanovištích. Část těchto biotechnologií je založena na symbiotických mikroorganismech. V rámci projektu „Zvýšení fytoremediační a produkční kapacity energetických rostlin na marginál-ních a kontaminovaných půdách prostřednictvím endofytních a mykorhizních sym-biontů“ (projekt Technologické agentury ČR č. TA03011184) jsme vyvinuli dva ino-kulační preparáty na bázi endofytních mikroorganismů podporující přežívání a růst ozdobnice, vytrvalé oddenkaté trávy, která je perspektivní energetickou plodinou. V této metodice popisujeme uplatnění těchto preparátů při zakládání porostů oz-dobnice z explantátových rostlin. S ohledem na nízké povědomí laické i odborné veřejnosti o endofytních mikroorganismech a možnostech jejich využití, jsme kon-cipovali tento úvod obšírněji a popisujeme v něm biotechnologický potenciál en-dofytů (s důrazem na traviny a zejména ozdobnici) včetně obecných mechanismů působení endofytů na hostitelské rostliny. Uvádíme také komerčně využívané en-dofytní mikroorganismy a potenciální rizika spojená s touto biotechnologií. Dále předkládáme přehled současných poznatků o zakládání, managementu a sklízení plantáží ozdobnice, aby potenciální pěstitel nemusel studovat rozsáhlou a roztříště-nou literaturu, resp. věděl kam se v případě zájmu o podrobnější informace obrátit. Zmiňujeme specifika explantátových rostlin, kterých se týká naše metodika. Násle-duje vlastní popis metodiky zakládání porostů ozdobnice s využitím inokulace ex-plantátových sazenic endofyty a ekonomické aspekty této technologie.

6

Endofytní mikroorganismy a jejich biotechnologický potenciál Endofyty jsou mikroorganismy (bakterie a houby) přítomné v pletivech rostlin, které alespoň část svého životního cyklu nemají negativní vliv na hostitelskou rostli-nu a nezpůsobují u ní patogenní symptomy. Vyskytují se u většiny rostlinných druhů, přičemž tvoří překvapivě bohatá a dynamicky se měnící společenstva (Porras-Alfaro & Bayman 2011, Rodriguez a kol. 2009, Ryan a kol. 2008). Složení společenstva en-dofytů závisí na identitě (genotypu) hostitelské rostliny, podmínkách prostředí a in-terakci s dalšími mikroorganismy. Z podmínek prostředí jde především o půdně-kli-matické podmínky, hustotu a stáří porostu, živinové poměry v rostlině a sekundární metabolity rostlinami produkované, ale i roční období (Rosenblueth & Martínez-Ro-mero 2006, Porras-Alfaro & Bayman 2011). Listy, stonky a kořeny rostlin jsou kolonizovány z velké části odlišnými houbo-vými endofyty (Sieber 2007, Porras-Alfaro & Bayman 2011), u bakterií jsou tyto rozdíly méně výrazné. Pokud jde o endofyty v kořenech a mikroorganismy žijící v přiléhající půdě (tzv. rhizosféře), existuje mezi těmito komunitami překryv, ne-jsou však zcela totožné (Bulgarelli a kol. 2013). V případě rhizosféry endofyté většinou kolonizují pletiva v místech klíčících kořenů a růstu postranních kořenů, kde dochází k narušení kořenového pletiva. U nadzemních částí pak vnikají přes průduchy a listová poškození (Zinniel a kol. 2002). Endofyty nalézají komerční využití mimo jiné v mikrobiálních inokulačních preparátech. Ty tvoří jednu ze základních skupin biostimulantů, prostředků pod-porujících růst rostlin. Biostimulanty se staly důležitou součástí udržitelného ze-mědělství a trh s těmito preparáty roste v současnosti přibližně 10 % tempem ročně (Saha 2015). Podle predikcí dosáhne v r. 2021 celkového obratu 2,8 mili-ard dolarů (John 2016).

Efekty endofytů na hostitelské rostliny Endofyty poskytují svým hostitelům řadu výhod. Zlepšují odolnost hostitelů vůči patogenům, zvyšují klíčivost semen, usnadňují uchycování rostlin za zhorše-ných podmínek, podporují růst rostlin, usnadňují dekompozici odumřelých pletiv,

7

modifikují kořenový systém a poskytují ochranu před stresem způsobeným su-chem, polutanty, herbivory aj. (Kannadan a Rudgers 2008, Porras-Alfaro & Bay-man 2011, Ryan a kol. 2008). Mezi nejprostudovanější patří efekty houbových endofytů typu „C“ na trá-vy mírného pásu. Tito systémoví endofyté z čeledi Clavicipitaceae zvyšují rezis-tenci svých hostitelů vůči biotickým a abiotickým stresům a podporují jejich růst (An-Zhi a kol. 2009). Některé jejich efekty jsou vázány na produkci alkaloidů či jiných sekundárních metabolitů, jimiž endofyty odpuzují herbivory a inhibují patogeny (Johnston-Monje & Raizada 2011, O’Hanlon a kol. 2012). Jiné efek-ty souvisejí s komplexním působením endofytů na obranný systém rostlin nebo s produkcí metabolitů podporujících růst rostlin (Porras-Alfaro & Bayman 2011). Velký význam zejména v oblastech s nízkou dostupností dusíku mají endofy-ticky žijící diazotrofní bakterie schopné fixovat vzdušný dusík (Doty 2011). Bakte-riální endofyty dokáží navíc prostřednictvím ACC deaminázy modulovat hladinu rostlinného stresového hormonu etylénu, což jednak zvyšuje jejich schopnost ko-lonizovat rostlinu a také pomáhá rostlině vyrovnat se s environmentálním stre-sem (Hardoim a kol. 2008). Některé endofyty jsou také schopny produkovat fy-tohormony a zvyšovat antioxidační kapacitu svých hostitelů (Waller a kol. 2005) nebo pomáhat hostitelským rostlinám získávat fosfor a mikroživiny (Koulman a kol. 2012, Malinowski a Belesky 1999). Přestože existují rody a druhy endofytů, jejichž zástupci vykazují prospěšné efekty vůči hostiteli s vyšší frekvencí než jiné, tyto efekty a jejich rozsah jsou vždy odvislé od daného genotypu (izolátu). Na-příklad hojní endofyté z rodů Neotyphodium/Epichloë prokazují travinám různou míru ochrany v závislosti na daném genotypu (An-Zhi a kol. 2009). Meta-analýza mapující efekty kořenových vřeckovýtrusých endofytů typu „NC“ na hostitelské rostliny ukázala neutrální nebo mírně negativní vliv těchto

8

symbiontů na biomasu rostlin a výživu dusíkem (Mayerhofer a kol. 2013). Nicmé-ně statisticky významný vliv měl genotyp hostitele, původ endofyta (vliv na hos-titele byl obvykle pozitivní, pokud z něho byl endofyt izolován) a experimentální podmínky (pozitivní efekt byl častěji zaznamenán, pokud byl v experimentu po-užit organický dusík namísto minerálního dusíku). Negativní odpovědi byly pří-tomné spíše u dřevin a to zvláště u jehličnanů. U travin (např. z čeledi Poaceae) byly odpovědi většinou pozitivní. Slibný je potenciál endofytů zvyšovat účinnost fytoremediace (tj. biotechnolo-gie využívající rostliny a na ně vázané mikroorganismy k čištění kontaminovaných půd). Některé bakteriální endofyty jsou schopné degradovat xenobiotika, jako jsou nitro-aromatické sloučeniny, BTEX látky, organochlorinové herbicidy, PCB, me-tan, ropné uhlovodíky aj. (Johnston-Monje & Raizada 2011, Newman & Reynolds 2005). Jiné endofyty dokáží zvyšovat akumulaci rizikových prvků v hostiteli a mo-hou být využitelné na půdách znečištěných těžkými kovy (Kuffner a kol. 2010). Pro inokulaci hostitelských rostlin vybranými endofyty je teoreticky možné po-užít několik způsobů, např. prostřednictvím inokulace semen nebo sprejováním vzrostlých rostlin na list. U trav se v případě endofytických hub jako úspěšnější ukázaly inokulace klíčících rostlin mycéliem ve srovnání s dospělými rostlinami, které byly méně susceptibilní (Latchs & Christensen 1985). Úspěšné inokulační preparáty na bázi sprejů využívají surfaktanty zvyšující smáčivost listů, adheziva zvyšující přilnavost preparátu, zvlhčovací substance, fotoprotektivní látky aj. (Ja-kobs-Schönwandt a kol. 2013).

9

Příklady komerčního využití endofytních mikroorganismů Na trhu je k dispozici řada komerčně významných travin v podobě osiva ob-sahujícího „C“ endofytické houby. Jedním z nejrozšířenějších v USA je kultivar kostřavy rákosovité Kentucky 31, který byl získán z vitálního travního porostu v r. 1931 a byl široce využíván při protierozních výsadbách a jako krmivářská plodi-na. Později se ukázalo, že způsobuje problémy dobytku kvůli obsahu ergotových (námelových) alkaloidů produkovaných C endofyty, které zodpovídají za velkou část odolnosti tohoto kultivaru vůči různým stresům. Pro krmivářské účely byl tento kultivar nahrazen kultivarem Jesup obsahujícím MaxQ™ endofyty (kmeny Neotyphodium coenophialum AR502 a AR542), které neprodukují ergotové alka-loidy, ale podporují růst rostlin. Protože řada trav se využívá pro jiné než krmivář-ské účely (turfové druhy, okrasné druhy aj.), zůstává prostor i pro využití endofytů produkujících alkaloidy (Johnston-Monje & Raizada 2011). Komerčně dostupné jsou inokulační preparáty na bázi „NC“ endofytických hub jako je Trichoderma spp., Beauveria bassiana, Pythium oligandrum, Coniothy-rium minitans a další (Brimner a Boland 2003, Döring 2013, Feng a kol. 1994). Většinou jde o mykoparazitické nebo entomofágní houby, jejichž prorůstový úči-nek je dán inhibicí rozvoje patogenních hub a hmyzích škůdců. Jde o nespecific-ké preparáty s širokou působností. Bakteriální inokula využívají nejčastěji endofytní (a rhizosférní) bakterie rodů Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces nebo Actinomyces (Döring 2013). Mezi další komerčně využívané endofytní bakterie patří druhy r. Azospirillum, které jsou schopny fixovat vzdušný dusík, produkovat fytohormony a zlepšovat mi-nerální výživu rostlin. Příklady komerčně dostupných inokul na bázi Azospiri-llum zahrnují Biopromoter™ (Manidharma Biotech), Nitrofix™ (Ruchi Biochemi-cals) a Bio N™ (FNCA). Azospirillum je také součástí směsí dalších mikrobů jako např. P-solubilizujících bakterií v preparátu EMAS™ (FNCA), který je využíván pro inokulaci čaje, kávovníku, olejové palmy, cukrové třtiny, kukuřice a bram-bor. Několik příkladů bakteriálních endofytních inokul pochází z tropů, kde jsou biohnojiva používána jako alternativa chemických hnojiv. Endofyt Pseudo-monas fluorescens podporující růst kořenů je dostupný v Indii, zatímco kmen

10

P. fluorescens prodávaný pod obchodním názvem FOSFORINA™ je distribu-ován na Kubě zejména s cílem zlepšit výživu fosforem. BioGro™ je směsné biohnojivo obsahující kmen P. fluorescens, dva kmeny bacilů a půdní kvasinky izolované z rhizosféry rýže ve Vietnamu. Byly vybrány pro schopnost fixovat du-sík, solubilizovat minerální sloučeniny fosforu a sekretovat antibiotika (Johnston--Monje & Raizada 2011). Všechny výše uvedené příklady ukazují na širokou využitelnost endofytických mikroorganismů pro podporu růstu potravinových i energetických plodin. Pokud je nám však známo, dosud nebyl vyvinut žádný inokulační preparát na bázi en-dofytů specifický pro ozdobnici.

Rizika spojená s biotechnologií využívající endofyty Biotechnologické využití endofytů s sebou nese některá rizika. Jednak riziko nízké účinnosti endofytních preparátů, které může být důsledkem nekompatibility inokula a hostitele a vlivu variabilních podmínek prostředí. Dále riziko malé trvan-livosti efektu u těch endofytů, které nejsou vázány na celý životní cyklus hostite-le. Zaznívá také obava z ohrožení nativních komunit endofytů nebo prospěšných hub (např. mykorhizních) vnášenými endofyty, pokud se tito začnou chovat inva-zivně nebo působí mykoparaziticky. A v neposlední řadě se s ohledem na mož-nou patogenicitu některých rostlinných endofytů pro člověka ukazuje do budouc-na jako nezbytné posoudit rizika aplikací endofytů tam, kde hrozí vstup endofytů nebo jejich produktů do potravinového řetězce nebo přímý kontakt s člověkem (An-Zhi a kol. 2009, Brimner a Boland 2003, Rosenblueth a Martínez-Romero 2006, Spyreas a kol. 2001). Pokud jde o otázku kompatibility inokula a hostitele, efekt endofytů je v řadě případů závislý na genotypu hostitele a stejný endofyt může mít na různé hostitele pozitivní i negativní účinky (Mandyam a kol. 2012, Rodriguez a kol. 2009). Již zmi-ňovaná meta-analýza efektů houbových kořenových endofytů ukázala, že pozitivní efekty jsou přítomné zejména u hostitelských rostlin totožných se zdrojovými rostli-nami endofyta (Mayerhofer a kol. 2013). Ačkoli z tohoto pravidla existují výjimky, optimální se jeví používat cílená (specifická) inokula pro daný hostitelský druh.

11

Podobně jako genotypová kombinace hostitel × endofyt ovlivňuje výsledek interakce hostitele s endofytem také okolní prostředí. Např. teplota prostředí je dominantním faktorem ovlivňujícím růst endofyta Neotyphodium coenophialum v kostřavě rákosovité, což následně ovlivňuje rezistenci této trávy proti herbivo-rům (Ju a kol. 2006). Protože faktory prostředí lze kontrolovat v polních podmín-kách pouze do malé míry, je výhodné použití směsných preparátů sestávajících z vícero endofytů, které mohou i za měnících se podmínek prostředí poskytnout požadovanému efektu dostatečnou robustnost. Směsné inokulum také dává vět-ší naději, že alespoň některý z vnášených endofytů se bude v rostlinách realizo-vat navzdory tlaku okolní komunity endofytů. Na druhou stranu směsná inokulace více mikroorganismy nemusí vždy znamenat úspěšné uchycení všech vnášených kmenů (Wille a kol. 2002). S ohledem na uvedené skutečnosti jsme oba inokulační preparáty popisované dále v této metodice navrhli jako směsná inokula z mikroorganismů izolovaných z ozdobnice obrovské, aby byla zaručena jak genotypová kompatibilita inokulo-vaných mikroorganismů a hostitele tak robustnost účinku na různých lokalitách.

Endofyty u ozdobnice Komunity houbových endofytů jsou obvykle dominovány několika druhy, za kterými následuje řada dalších druhů vyskytujících se s nízkou četností (Knapp

12

a kol. 2012, Unterseher a Schnittler 2009). Podobné rozložení vykazovala i námi studovaná komunita endofytních hub u ozdobnice obrovské (viz obr. 1). Endofytní mikroorganismy z ozdobnice jsme izolovali se záměrem získat izoláty podporující růst ozdobnice. Proto jsme vybrali porost ozdobnice na ži-vinově chudém stanovišti v Bezděkově, kde byl větší předpoklad přirozené selekce endofytních kmenů zlepšujících růst rostlin. Pro izolaci jsme využili modifikovanou metodu „dilution-to-extinction“ podle Unterseher a Schnit-tler (2009). Celkem jsme získali 118 houbových izolátů, z toho většinu (93 %) z kořenů. Izolovaným houbám dominovaly vřeckovýtrusé houby (Ascomyco-ta) z nichž největší podíl zaujímaly tvrdohouby (Sordariomycetes) s řádem Hypocreales a rodem srpovnička (Fusarium). Srpovničky jsou původcem tzv. fusariového vadnutí a hnilob a jejich vysoká frekvence svědčí o stresových podmínkách v porostu ozdobnice. S relativně vysokou frekvencí byly izolo-vány také rody Microdochium (Xylariales, Sordiaromycetes), což je rod obsa-hující několik rostlinných patogenů a pak rody Periconia (Microascales, Sor-diaromycetes), Leptodontidium (Helotiales, Leotiomycetes) a houby příbuzné r. Exophiala (Chaetothyriales, Chaetothyriomycetes). Poslední tři jmenova-né rody spadají pod tzv. „dark septate endophytes“ (DSE), vláknité houby s tmavě pigmentovaným přehrádkovaným myceliem, jejichž celková frek-vence mezi našimi izoláty přesáhla 30 %. U trav tvoří DSE houby početně významnou skupinu. Vyskytující se zejména na stanovištích se zvýšenou mí-rou abiotického stresu jako je sucho, polutanty apod. (Knapp a kol. 2012). Četněji se vyskytující rody byly doprovázeny méně četnými houbami rodů Aure-obasidium, Alternaria, Ceratocystis, Cladosporium, Leptospora, Mollisia a Tricho-derma, ale také patogeny Botrytis, Leptosphaerulina a Peltaster. Všechny námi vyizolované endofytní houby patří mezi endofyty „NC“ typu, endofyty z čeledi Clavicipitaceae se u ozdobnice nevyskytly. Vybrané rody hub (např. Fusarium a Cladosporium) byly u ozdobnice nalezeny i dalšími autory (Chiang a kol. 2001). U zástupců některých izolovaných rodů (např. Exophiala, Periconia, Microdochi-um) byla prokázána podpora růstu rostlin nebo zvýšení jejich odolnosti vůči stre-su (Li a kol. 2011, Mandyam a kol. 2012).

13

Pokud jde o ozdobnicové bakteriální endofyty, Dunne a kol. (2012) izolovali bakterie z listů, stonků a rhizomů ozdobnice obrovské (M. × giganteus). Většina izolátů patřila do skupiny gama-proteobakterií. Nejčastějšími rody byly Pseudo-monas a Acinetobacter, doprovázené rody Enterobacter, Pantoea, Rahnella a dal-šími. V komunitě bylo velmi málo zástupců kmene Firmicutes kam patří např. r. Bacillus. Mnoho z izolátů vykazovalo rezistenci k těžkým kovům a schopnost degradovat organické xenobiotika. Autoři uvádějí, že tyto izoláty by mohly být využity jako inokulační preparáty pro zvýšení rostlinné biomasy a fytoremediace.

Obr. 1. Taxonomický přehled kultivovatelných endofytních hub izolovaných z kořenů a listů ozdobnice obrovské pěstované na živinově chudém stanovišti v Bezděkově. Koláčový graf ukazuje procentuální zastoupení oddělení, tříd, řádů a rodů směrem od centrálního k vnějšímu prstenci. Čísla udávají relativní četnost dané taxonomické skupiny hub v procentech. N., blíže neidentifikováno.

14

Podobnou strukturu vykázala námi studovaná bakteriální komunita ozdobnice, kde také dominovaly gama-proteobakterie (zejména r. Pseudomonas) a gram-pozitivní bakterie byly zastoupeny slabě (obr. 2). Přibližně 60 % izolátů pocházelo z kořenů.

Obr. 2. Taxonomický přehled kultivovatelných endofytních bakterií izolovaných z kořenů a listů ozdobnice obrovské pěstované na živinově chudém stanovišti v Bezděkově. Koláčový graf ukazuje procentuální zastoupení kmenů, tříd, řádů a rodů směrem od centrálního k vnějšímu prstenci. Čísla udávají relativní četnost dané taxonomické skupiny bakterií v procentech. N., blíže neidentifikováno.

15

Rothballer a kol. (2008) vyizolovali z kořenů ozdobnice bakterii Herbaspiri-llum frisingense, která mezi námi identifikovanými endofyty nefigurovala. Straub a kol. (2013) pozorovali pozitivní vliv této beta-proteobakterie na růst jemných kořenů ozdobnice. Kmeny Herbaspirillum spp. jsou diazotrofní (tj. schopné fixo-vat dusík) a také syntetizují rostlinný hormon auxin, který je zodpovědný za dlou-živý růst rostlin. Eckert a kol. (2001) identifikovali v kořenech ozdobnice jinou diazotrofní bakterii r. Azospirillium. Diazotrofní bakterie rodů Azospirillum a Her-baspirillum vyizolovali u dvou druhů ozdobnice (Miscanthus sinensis, M. saccha-riflorus) také Kirchhof a kol. (1997). N-fixující bakterie zlepšují u ozdobnice výži-vu dusíkem a také díky nim patrně nepotřebuje ozdobnice vysoké dávky hnojiv (Davis a kol. 2010). Ye a kol. (2005) sledovali vliv inokulace ozdobnice konsor-ciem „ANFICO“ (anaerobi nitrogen-fixing consortium) obsahující Clostridium sp. Kas201-1 a Enterobacter sp. B901-2 a to v podmínkách zasolených půd. Přítom-nost inokula průkazně zvýšila toleranci rostlin k těmto půdám a současně sníži-la stres rostlin. Tyto příklady demonstrují potenciál ozdobnicových endofytů pro podporu růstu této plodiny v normálních i stresových podmínkách.

Ozdobnice jako energetická plodina

Ozdobnice je vytrvalá lipnicovitá tráva fotosyntetického typu C4. Mezi rostli-nami C4 typu je unikátní tím, že si uchovává vysokou fotosyntetickou aktivitu při nižších teplotách a je vysoce produktivní i v chladných oblastech. Díky tomu do-sahuje v podmínkách středozápadu USA roční účinnosti konverze energie do-padajícího slunečního záření kolem 1 % na rozdíl od většiny rostlin, které jsou schopné konvertovat do biomasy přibližně 0,1 % slunečního záření (Heaton a kol. 2008). Při zahrnutí biomasy kořenů a rhizomů dosahuje účinnost využití sluneč-ního záření u ozdobnice v letním období dokonce 4,4 % (Dohleman a kol. 2012). S ostatními C4 rostlinami sdílí ozdobnice vysokou účinnost využití dusíku a vody (Anderson a kol. 2011). Kromě energetického potenciálu má pěstování ozdobnice také příznivý vliv na půdu, protože zvyšuje množství organické hmoty, živin a podporuje mikrobiální komunitu (Kahle a kol. 2001). V podmínkách střední

16

Evropy se nejčastěji pěstuje diploidní ozdobnice čínská (Miscanthus sinensis An-dersson (1855)) nebo její triploidní sterilní hybrid s tetraploidní ozdobnicí cuk-rovou (Miscanthus sacchariflorus (Maxim.) Franch.), ozdobnice obrovská (Misca-nthus × giganteus Greef & Deuter ex Hodkinson & Renvoize).

Potenciál a obecné nároky V rámci energetických plodin zaujímá ozdobnice význačné místo a řadí se k perspektivním zdrojům biopaliv druhé generace. Odhadovaná výměra ozdob-nice v EU činila k r. 2008 přes 38 tisíc ha (Elbersen a kol. 2010) a současné od-hady se pohybují kolem 60 tisíc ha (AEBIOM, osobní korespondence). Pokud jde o výnosy ozdobnice, podle údajů DEFRA (2007) se pohybovala průměrná roč-ní produkce biomasy ozdobnice v Anglii mezi 12–16 t sušiny/ha a Larsen a kol. (2014) zmiňuje pro 20-leté dánské plochy výnosy 12–13 t sušiny/ha.rok. Ve stře-dozemní oblasti dosahují dlouhodobé výnosy ozdobnice podobných hodnot –13,3 t sušiny/ha.rok (Alexopoulou a kol. 2015). Strašil (2009) uvádí pro ně-mecké podmínky průměrné výnosy za šestileté období 15–19 t sušiny/ha.rok a pro ČR na základě krátkodobějších pokusů 9–20 t sušiny/ha.rok dle lokality. Výnosy publikované z experimentů v USA jsou často vyšší než na Evropském kon-tinentu. Ve státě Illinois (USA) naměřili Arundale a kol. (2014) produkci bioma-sy ozdobnice mezi 23-29 t sušiny/ha.rok v závislosti na dávce hnojení a Heaton a kol. (2008) uvádí průměrné výnosy za tříleté období v témže státě dokonce 30 t sušiny/ha.rok. Zájemce o podrobnější informace o výnosech odkazujeme na rozsáhlý přehled publikovaných výnosů ozdobnice v Evropě a USA v práci Brosse a kol. (2012).

17

Za srovnatelných podmínek předčí ozdobnice výnosově kukuřici (také C4 plodina), i většinu ostatních energetických plodin včetně rychle rostoucích dře-vin (Allen a kol. 2014, Dohleman a Long 2009, Heaton a kol. 2004). Ander-son a kol (2011) uvádí, že pro produkci 35 miliard galonů bioetanolu ročně (cca 132 miliard L), což je plánovaný cíl USA v oblasti obnovitelných paliv v r. 2022 (Schnepf a Yacobucci 2013), by bylo potřeba osázet 33,7 milionů ha prosem prutnatým (Panicum virgatum L.), 18,7 milionů ha kukuřicí, ale pouze 11,8 milio-nů ha ozdobnicí. Vedle prosa prutnatého jsou dalšími alternativními druhy rychle rostoucích trav, které je možné alespoň okrajově využít v podmínkách ČR, chrastice rákosovitá (Phalaris arundinacea L.) a trsť rákosovitá (Arundo donax L.). Chrastice je odolná i vůči tvrdším klimatickým podmínkám, což ji favorizuje do vyšších poloh, mrazo-vých kotlin nebo lokalit s jarními pozdními mrazíky (Andert a kol. 2014). Trsť rá-kosovitá patří mezi velmi produktivní plodiny (Alexopoulou a kol. 2015), ale také významné invazivní rostliny (viz Global invasive species database) a proto ji ne-lze pro pěstování v ČR doporučit. Další energeticky využitelné trávy (např. psine-ček velký, ovsík vyvýšený, kostřavu rákosovitou, sveřep bezbranný aj.) uvádí Stra-šil a kol. (2011) a Andert a kol. (2014). Tyto druhy trav jsou však spíše vhodné do specifických oblastí (suché, s krátkodobým zaplavením, velké teplotní výkyvy, zasolené půdy apod.), případně jako podsev do krycích plodin. Z cizokrajnějších a méně rozšířených travin produkuje významné množství biomasy čirok (r. Sor-ghum), který je teplomilný, snáší sucho a podobně jako ozdobnice patří mezi rost-liny s C4 typem fotosyntézy. Experimenty srovnávajících různé energetické trávy v ČR ukazují, že ozdobnice patří k perspektivním energetickým plodinám i u nás (Strašil a Moudrý 2011). Její výhodou je také skutečnost, že je odolná vůči choro-bám a škůdcům (Strašil 2009, DEFRA 2007). Možnosti využití ozdobnice jsou široké. Při přímém spalování neupravené ře-zanky lze získat výhřevnost přes 17 MJ/kg. Další možností je spalování briket/pelet. Z ozdobnice je možné získat také bioetanol nebo bioplyn (viz sekce skli-zeň). Díky vysokému obsahu celulózy (kolem 40 %) je alternativou výroba buni-činy. Biomasu ozdobnice lze využít i pro výrobu stavebních materiálů, především

18

dřevovláknitých desek, došků, rohoží a izolačních desek. Perspektivní je také výroba snadno rozložitelných obalových materiálů (Fowler a kol. 2003). Celko-vá energetická bilance (poměr energetických vstupů a výstupů) ozdobnicových plantáží může být i < 0,2 ve srovnání s ≥ 0,8 u kukuřičného etanolu nebo řepko-vé bionafty (Heaton a kol. 2004). Ozdobnice vyžaduje lehčí strukturní půdy s vysokou hladinou podzemní vody (do 60 cm), teplejší oblasti (s průměrnou roční teplotou nad 7,5°C) a úhrny srá-žek nad 500 mm (Andert a kol. 2014, Lewandowski a kol. 2000, Strašil 2009). Doporučují se humózní písčité půdy s pokud možno s malým zaplevelením vy-trvalými plevely (pýr, šťovíky). Ačkoli je ozdobnice fotosynteticky aktivní i při niž-ších teplotách, mezi 8-12°C u ní dochází k redukci rychlosti fotosyntézy (Stra-šil 2009) a pod 6°C se růst zastavuje (DEFRA 2007). Letální teplota, při níž je poškozeno 50 % jednoletých podzemních oddenků leží pro M. × gigateus ko-lem -3,5°C (Clifton-Brown a Lewandowski 2000), pro M. sinensis kolem -6,5°C. Mrazuvzdornost je jedním z klíčových parametrů sledovaných během nových šlechtění (Peixoto a kol. 2015). Ozdobnice toleruje široké rozpětí pH, i když její pH optimum leží mezi 5,5-7,5 (DEFRA 2007). Její kořenový systém dosahuje až do hloubky kolem 2 m. Ozdobnice patří mezi plodiny s vysokou účinností vy-užití vody, avšak nedostatečná vláha zapřičiňuje snížení výnosu (podle kalku-lací se výnos snižuje o 90 kg/ha s každým milimetrem půdního deficitu vláhy). Kvůli hustému zápoji je navíc 20-30 % srážek zachyceno a odpařeno na listech a nikdy neinfiltruje do půdy (DEFRA 2007). Krátkodobé zaplavení snáší ozdob-nice dobře a životaschopnost rhizomů jím není ohrožena (Mann a kol. 2013). Z publikovaných výsledků je zřejmé, že pěstování ozdobnice je limitováno přede-vším minimálními zimními teplotami a úhrnem srážek během vegetačního obdo-bí (Hastings a kol. 2009b).

19

Agrotechnologický cyklus Agrotechnologie pěstování ozdobnice je poměrně rozvinutá a existuje řada dostupných pěstebních materiálů včetně certifikované metodiky publikované Ing. Strašilem z Výzkumného ústavu rostlinné výroby v.v.i. (2009). V této sekci chceme doporučené pěstební postupy zrekapitulovat, obohatit o poznatky po-sledních let a zmínit specifika sadby z explantátových kultur.

Příprava pozemku Metodiky a pěstitelské příručky se shodují, že klíčové je pozemek pro pěsto-vání ozdobnice řádně odplevelit a využít vhodné předplodiny. Těmi jsou obilni-ny, okopaniny, luskoviny, ale i řepka, tritikale nebo čirok (Strašil 2009). Příprava pozemku by měla začít již na podzim roku předcházejícího výsadbě. Pokud je porost ozdobnice zakládán na ploše trvalého travního porostu, jsou na poze-mek v ideálním případě aplikovány v září širokospektrální herbicidy (např. gly-fosát), počátkem zimy je zorán, znovu herbicidován v raném jaře a následně při-praveno sadební lůžko mělkou podmítkou v krátkém předstihu před výsadbou. Výsadba probíhá v březnu/dubnu jedná-li se o porost zakládaný z podzemních oddenků (tzv. rhizomů) nebo v dubnu/květnu, jde-li o porost zakládaný z ex-plantátových rostlin. V druhém případě se doporučuje vysazovat až po odeznění jarních mrazíků, které mohou mladé rostliny poškodit.

Výsadba V současnosti je standardní a převažující metodou založení plantáží z frag-mentů rhizomů, které slouží ozdobnici k přežívání (Strašil 2009). Tyto jsou vět-šinou na matečnicových plantážích vyzvedávány v předjaří a později vysazeny na připravených plochách. Pro výsadbu se používají rhizomy o délce 10-15 cm a hmotnosti do 60 g. Při použití rhizomů o hmotnosti 20-25 g a 40 g byly dosa-ženy podobné výnosy (Anderson a kol. 2011). Pro produkci rhizomů jsou vhodné rostliny o stáří několika let, rhizomy jednoletých matečných rostlin nebo starých rostlin mají snížené procento ujímavosti výsadeb. Je důležité nenechat rhizomy vy-schnout a není dobré je vystavovat přímému slunečnímu svitu (Terravesta 2013).

20

Některé studie uvádí, že rhizomy mohou být skladovány při 4°C až po dobu 4 měsíců, jiné ukazují na sníženou životaschopnost skladovaných rhizomů (An-derson a kol. 2011, Davies a kol. 2011). Rhizomy by měly mít alespoň 2-3 pupe-ny. Při vlastní produkci rhizomů zhruba platí, že 1 ha čtyřleté mateřské plantáže ozdobnice vyprodukuje množství rhizomů postačující k osázení 8-10 ha nových plantáží (Williams a Douglas 2011). Vysazuje se přibližně 10-15 tisíc rhizomů/ha (Terravesta 2013, DEFRA 2007, Strašil 2009). Běžné spony se pohybují od 75 do 100 cm (jde o vzdálenost mezi řádky i rozteč rostlin v řádku). Rhizomy se sází do hloubky 10 cm. Ujímavost se pohybuje dle různých údajů mezi 50-95 %. Jedním z nejrizikovějších fakto-rů ovlivňujících etablování porostu je promrzání povrchové vrstvy půdy během první zimy. Strašil (2009) uvádí jako hraniční teplotu půdy pro vymrzání rhizomů ozdobnice v prvním roce -5°C, což platí zejména pro klony ozdobnice čínské, oz-dobnice obrovská je citlivější (Clifton-Brown a Lewandowski 2000). Pokles teplo-ty vrchní vrstvy půdy pod -3°C v prvním roce po výsadbě vedl k mortalitě porostu M. × giganteus kolem 50 %. Starší porosty dokáží snést pokles zimních teplot až k -29°C (Anderson a kol. 2011). Šanci na úspěšné přezimování zvyšuje výsadba větších rhizomů, větší hloubka výsadby, nebo přikrývání slámou či krycí plodinou (např. hořčice). Pro výsadbu lze využít např. sazeče brambor, který umožňuje do-sáhnout rychlosti výsadby cca 0,3 ha/hod. V Dánsku vyvinuli specializovaný stroj na výsadbu rhizomů (Hvidsted planter), který má vyšší efektivitu, cca 1,3 ha/hod (Heaton a kol. 2004, DEFRA). Minimální teplota půdy, která indukuje vzcházení ozdobnice, činí u M. × gi-ganteus 9°C, u diploidního M. sinensis stačí 6°C (Farrell a kol. 2006). Stárnutí nadzemní části je indukováno u ozdobnice minimálními denními teplotami a vy-soké denní teploty je nedokáží zvrátit. Za těchto podmínek je tok fotosyntetických asimilátů nasměrován do rhizomů a růst je redukován (Purdy a kol. 2015). Dél-ka vegetační sezóny odpovídá přibližně období mezi pozdními jarními mrazíky a prvními podzimními mrazy (Heaton a kol. 2004). Porosty ozdobnice je možné zakládat nejen z rhizomů, ale také z explantá-tových rostlin vypěstovaných in vitro. Mikropropagace ozdobnice je slibnou

21

technologií díky možnosti produkovat velké množství rostlin v relativně krátkém čase. Ačkoli rostliny mikropropagované z různých pletiv vykazují určité rozdí-ly v růstové dynamice, počtu tvořených odnoží atd., zásadnější je rozdíl mezi in vitro množenými rostlinami a rostlinami pocházejícími z rhizomů. Explantátové rostliny jsou rizikovější z hlediska vymrzání, hůře snášejí suboptimální podmín-ky (např. letní sucho) a produkují menší množství biomasy v prvním roce (Scur-lock 1999, Strašil 2009). V pozdějších letech se však rozdíly mezi různě založe-nými porosty stírají a průměrné výnosy jsou podobné, někdy dokonce u porostů z explantátů vyšší (Anderson a kol. 2011, Clifton-Brown 2007). Mikropropaga-ce ozdobnice dosahuje multiplikačního faktoru až 2000x ve srovnání s propa-gací pomocí rhizomů, kde se multiplikační faktor pohybuje v závislosti na po-užité technice mezi 50-100x, někdy i méně (Scurlock 1999). Pro velkovýrobní zakládání porostu ozdobnice z explantátů lze pro sázení použít upravené stroje na výsadbu zeleniny, např. zelí (Strašil 2009). Protože explantátové rostliny bývají předpěstovány ve skleníkových podmínkách, je potřeba je před výsadbou na cí-lové plochy několik dní otužit přesunem do venkovních prostor. Srovnání pořizo-vacích nákladů rhizomů a explantátových sazenic je uvedeno v sekci „Ekonomic-ké aspekty“. Nejnověji se jako alternativa k výsadbám rhizomů a explantátových rostlin na-bízí výsevy ze semen nově vyšlechtěných hybridů ozdobnice. V rámci tohoto sys-tému lze docílit přes 1500 propagulí na m2 mateřského porostu (Clifton-Brown a kol. 2016). Ačkoli správná secí technologie a zajištění rovnoměrného vzcháze-ní je dosud předmětem vývoje, firma New Energy Farms uvedla v r. 2013 na trh novou technologii CEEDS™ založenou na enkapsulaci semen vhodnou i pro oz-dobnici. Tato technologie představuje jedno z možných řešení problematického zakládání semenných porostů ozdobnice.

22

Pokud je k dipozici závlaha, je výhodné ji využít zejména ve fázi ujímání vy-sazeného porostu. Dostupná závlaha také umožňuje posunout termín výsadby do pozdějšího jara, což však s ohledem na zkrácení vegetační sezóny a nutnost tvorby rhizomů pro přezimování není příliš žádoucí. Kromě ujímavosti zvyšuje závlaha také výnos biomasy a to zejména v sušších oblastech jižní Evropy a při kombinaci s přihnojením dusíkem (Ercoli a kol. 1999, Lewandowski a kol. 2000).

Odplevelení Ozdobnice není konkurenčně zdatná a tak vyžaduje v roce výsadby pečlivé odplevelení, pro které je možné použít mechanické (např. prutové brány) i che-mické (herbicidy) prostředky. Druhým, většinou však až třetím rokem, již není třeba používat prostředky na ochranu rostlin, protože opadávající listová hmo-ta vytváří vrstvu mulče, která potlačuje růst plevelů. V druhém roce se používá plečkování pouze při pozdním termínu sázení v předešlém roce nebo při silném výskytu plevelů (Strašil 2009). Obecně lze říci, že herbicidy používané do kukuřice či obilnin mohou být aplikovány i do ozdobnice (Anderson a kol. 2011, DEFRA 2007). Pre-emergent-ní herbicidy atrazin, isoxaflutol, pendimethalin a S-metolachlor a post-emer-gentní herbicidy bromoxynil, dicamba a mesotrion s atrazinem, byly v minu-losti použity na M. × giganteus v polních podmínkách aniž způsobily problémy. Li a kol. (2013) testovali rozsáhlou kolekci 27 herbicidů na ozdobnici a zjistili,

23

že herbicidy thifensulfuron, metsulfuron, tribenuron, chlorimuron, halosulfuron, rimsulfuron, cloransulam, pinoxaden, bentazon, a metribuzin neměly na ozdob-nici negativní dopad na rozdíl od herbicidů nicosulfuron, trifloxysulfuron, sul-fometuron, clodinafop, fluazifop, and pyrithiobac, které způsobily viditelné po-škození ozdobnice nebo snížení jejího růstu/výnosu. V USA byly také úspěšně použity prodiamin a aminopyralid v prvním a druhém roce (Anderson a kol. 2011). Přehled použitelných herbicidů včetně hektarových dávek uvádí Příloha 1.

Hnojení Energetické traviny odpovídají na přihnojení poměrně spolehlivě zvýšenou produkcí biomasy (Andert a kol. 2014). Výsledky studií hnojení ozdobnice mine-rálním dusíkem (N) v Evropě však ukazují, že pokud to stav půdy vyloženě ne-vyžaduje, nemá hnojení N na výnos ozdobnice valný vliv (Anderson a kol. 2011, DEFRA 2007, Himken a kol. 1997, Christian a kol. 2008, Strašil 2009). Ani orga-nické hnojení nezvýšilo výnos ozdobnicové biomasy v polních podmínkách, ač-koli vysoké dávky zvýšily produkci biomasy v květináčovém experimentu (Smith a Slater 2010). Je pravděpodobné, že část potřebného N získává ozdobnice pro-střednictvím N-fixujících bakterií (Davis a kol. 2010). Na druhou stranu v USA pozorovali Arundale a kol. (2014) a další autoři (Wang a kol. 2012) nárůst výno-sů ozdobnice po přihnojení N. Autoři vysvětlují rozdíl obecně nižšími depozice-mi N v USA ve srovnání s Evropou a vyššími průměrnými výnosy (a tudíž nároky na N). V souhrnném článku věnovaném potřebám hnojení ozdobnice uzavírá Ca-doux a kol. (2012), že kromě chudých půd by se během prvních dvou let porosty ozdobnice hnojit neměly. Od třetího roku by se měly aplikovat dávky živin odpo-vídající 4.9 kg N, 0.45 kg P a 7.0 kg K na každou tunu sklizené sušiny. Na pů-dách s menší zásobou živin se doporučuje hnojit prvním rokem do poloviny červ-na jednorázově do 50 kg/ha N. V dalších letech se velikost dávky má přizpůsobit zásobám živin v půdě a dosahovaným výnosům. Strašil (2009) doporučuje hno-jit druhým rokem a další léta cca 70 kg/ha N, 40 kg/ha P a 50-100 kg/ha K, přičemž P a K je optimální aplikovat na jaře a N od jara do poloviny července.

24

Christian a kol. (2008) posouvá termín hnojení N až do pokročilejší části sezóny, protože v brzkém jaře je N mobilizován z rhizomů a rostliny jsou schopny absor-bovat jen malé množství aplikovaného minerálního N hnojiva. Nadměrné hno-jení N (120 kg/ha) nedokáže ozdobnice využít a N se ztrácí vyplavováním nebo se uvolňuje z půdy jako N2O s negativními environmentálními dopady (Behnke a kol. 2012). Zvážit na základě stavu půd je potřeba i hnojení mikroelementy Cu, Zn, B a Mn.

Kultivary Ze zahraničí jsou k dispozici vysoce výnosné kultivary M. sinensis Goliath, Si-rene, Grosse Fontane, Silberfeder, Pünktchen, Poseidon a řada kultivarů M. × gi-ganteus jako Illinois, Hornum, Bock a Piccoplant. Mezi těmito staršími kultivary M. × giganteus nejsou z produkčního a dalších hledisek velké rozdíly a to pa-trně kvůli totožnému genetickému původu. Šlechtění nových kultivarů je cíleno na zvýšenou mrazuvzdornost, odolnost vůči letním přísuškům, nízké živinové požadavky apod. Nově vyšlechtěnými kultivary M. × giganteus jsou např. Free-domTM, Amuri či Nagara. U posledních dvou jmenovaných je uváděna vyšší mra-zuvzdornost než u kultivaru Illinois (Williams a Douglas 2011). Slabinou sterilních kultivarů M. × giganteus je nemožnost generativního množení prostřednictvím semen, naopak výhoda spočívá ve výrazně nižším riziku invazivního chování. V brzké době budou komerčně dostupné nově vyšlechtěné hybridy r. Miscanthus vhodné i pro zakládání porostů ze semen (Clifton-Brown a kol. 2016). S ohle-dem na nesnadné odlišení kříženců od ozdobnice čínské na základě morfologic-kých znaků (Anderson a kol. 2011) je nezbytný dobrý systém evidence a značení sadebního materiálu. Friesen a kol. (2014) testovali chladovou odolnost několika klonů ozdobni-ce (diploidní hybridy M147 a M115, triplodiní M. × giganteus M161 a M116 a te-traploidní M118) a zjistili, že nejvyšší odolnost vykázaly triploidní hybridy M161 a M116 (Nagara). Podobně pozoroval vyšší toleranci triploidní ozdobnice M. × gi-ganteus ke krátkodobému poklesu teplot Purdy a kol. (2013). Farrell a kol. (2006) měřili mrazovou odolnost listů a z testovaných 4 kultivarů (M. sacchariflorus

25

Sac-5, M. × giganteus Gig-2, M. sinensis Sin-H6 a Sin-H9) byl nejodolnější Sin--H9 a nejméně odolný Sac-5. Je však třeba rozlišovat mezi chladovou odolností a odolností vůči vymrzání neboť za ně odpovídají různé mechanismy. Vyšší odol-nost vůči vymrzání vykazují rhizomy kultivarů M. sinensis (Clifton-Brown a Lewan-dowski 2000) a dlouhodobá pozorování v Dánsku ukazují, že porosty M. sinen-sis přežívají první zimu lépe než ozdobnice obrovská (Jørgensen a Muhs 2001). V podmínkách ČR se jeví jako vhodné klony M. × giganteus, které předčí M. si-nensis ve výnosu a nejsou rizikové z hlediska invazivity (Weger a kol. 2011).

Sklizeň Ozdobnice se v roce výsadby obvykle nesklízí, v druhém roce dává výnos su-šiny cca třetinu až polovinu produkčního maxima, ve třetím roce (v severských ze-mích EU však až v pátém roce) dosahuje produkce fytomasy maxima, tato vysoká produkce několik let osciluje, pak mírně klesne a drží se na setrvalých hodnotách až do úpadku porostu, který nastává přibližně po 20 letech (Heaton a kol. 2004, Larsen a kol. 2014). Dospělý porost dosahuje výšky 3-4 m (Anderson a kol. 2011). Vhodnou mechanizací pro sklizeň ozdobnice jsou řezačky kukuřice, případně žací stroje s balíkovači (Heaton a kol. 2004). Ze sklizené slámy je možno lisovat pelety (hustota cca 500 kg/m3), balíky (hustota 120-150 kg/m3) nebo ji lze sklízet celou (pro stavební materiál). Při dlouhodobém skladování by vlhkost neměla být vyšší než 15 %, jinak hrozí rozvoj hub (Lewandowski a kol. 2000). Pokud není k dispo-zici hala a je nutné skladovat balíky venku, je vhodné je rovnat způsobem, který umožní přirozenou ventilaci a použít pod balíky i navrch nepromokavou plachtu (Terravesta 2013).

26

Termín sklizně se odvíjí od následujícího zpracování. Při přímém spalování se nabízí podzimní nebo pozdně zimní/jarní termín sklizně. Maximální množ-ství nadzemní biomasy dosahuje porost ozdobnice v září, později biomasy ubý-vá (Himken a kol. 1997). K plné senescenci rostlin dochází s nástupem mrazů. Většinou převažuje sklizeň koncem zimy/počátkem jara, neboť odpadají starosti s dosoušením biomasy. Při sklizni po zimě je však třeba počítat se ztrátami suši-ny i přes 30 % (Larsen a kol. 2014). Sklizeň v tomto období je výhodnější nejen s ohledem na nižší vlhkost biomasy (pod 20 % oproti raně podzimním 50 %), ale také kvůli nižšímu obsahu popelovin v důsledku translokace prvků do podzem-ních zásobních orgánů a jejich vymývání z odumřelé biomasy v průběhu zimy (Andert a kol. 2014, Williams a Douglas 2011). Odumřelá biomasa ozdobni-ce se vyznačuje nízkými koncentracemi K, Cl a N (Brosse a kol. 2012). Obsah popelovin činí přibližně 5 % (Weger a kol. 2011), při jarní sklizni i méně (Le-wandowski a kol. 2000). Nižší obsah popelovin znamená méně potenciálních problémů se spékáním popele na roštech a nižší emise SOx a NOx. Minimál-ních hodnot N dosahuje stojící biomasa v únoru (Heaton a kol. 2009). Množ-ství popelovin ovlivňuje i půdní typ, např. těžší jílovité půdy vedou ke zvýšeným obsahům popelovin v biomase (Anderson a kol. 2011).

27

Ozdobnici lze konvertovat biologickou cestou na bioplyn (směs s převažují-cím metanem), ačkoli vlastnosti její biomasy (nízký obsah cukrů a vyšší obsah ligninu) ji spíše předurčují pro termochemickou konverzi (Brosse a kol. 2012). Za účelem biologické fermentace (výroba bioplynu) by bylo ideální sklízet bioma-su ozdobnice ve více sečích, případně v raném období, kdy má vyšší obsah ne-strukturních cukrů. Obsah rozpustných cukrů ve stoncích dosahuje maxima (60–80 mg/g sušiny) v květnu/červnu, poté hodnoty klesají (v září činí cca 40 mg/g sušiny) a v období vegetačního klidu (od listopadu) činí pouze 5 mg/g sušiny. Ob-sah škrobu nemá tak zřetelný sezónní průběh, ale maxima (cca 120 mg/g sušiny stonků) dosahuje v listopadu. Stávající kultivary ozdobnice však opakované nebo rané (červencové a srpnové) sklizně netolerují (Kiesel a Lewandowski 2016). Pří-liš časná a/nebo častá sklizeň totiž neumožňuje vytvoření dostatečné energetic-ké rezervy v rhizomech. Zejména v teplých zimách dochází k výraznějšímu pro-dýchání cukerných rezerv rhizomů (Purdy a kol. 2015). Realistické objemy metanu produkovaného při fermentaci ozdobnice se pohybují mezi 100-330 Nm3/t suši-ny v závislosti na genotypu, termínu sklizně a podmínkách fermentace. Množství vyprodukovaného metanu z hektaru ozdobnice a kukuřice pěstovaných pro ener-getické účely je srovnatelné (Kiesel a Lewandowski 2016). Koncovým produktem fermentace nemusí být nutně metan. De Vrije a kol. (2009) použili pro fermenta-ci ozdobnice extrémní termofilní bakterie a pozorovali efektivní produkci vodíku dosahující cca 3 mol H2 na mol uvolněné hexózy, což odpovídalo 74–85 % teore-tické produkce. Biomasu ozdobnice lze konvertovat i na etanol. Kvůli provázanosti strukturních komponent buněčných stěn je nezbytné nejprve fyzikálně-chemické rozvolnění biomasy, po kterém následuje enzymatické štěpení polysacharidů (celulózy a he-micelulóz) a následně mikrobiální konverze uvolněných monosacharidů na eta-nol. Výčet různých technik používaných pro první přípravný krok je nad rámec této metodiky, podrobně je rozebírá např. Brosse a kol. (2012). Vlastnosti bioma-sy pocházející z podzimní a zimní sklizně se co do štěpitelnosti na jednoduché cukry příliš neliší, pokud jde o surovou biomasu, avšak při zahrnutí přípravné-ho kroku byl vyšší výtěžek cukrů u biomasy z ranější podzimní sklizně (Le Ngoc

28

Huyen a kol. 2010). Při použití alternativní metody bylo z chemicky předpřipra-vené biomasy ozdobnice (20 % výsledný roztok) dosaženo výtěžku etanolu 59 g/l (Han a kol. 2011). Při konverzi biomasy ozdobnice na etanol lze získat 250-380 l etanolu z tuny sušiny (tj. konverzní poměr činí 0,2-0,3 t etanolu/t sušiny). Při udá-vaných evropských výnosech kolem 13 t/ha lze z hektaru ozdobnice získat cca 4000 l etanolu (Bansal a kol. 2013). Existují i další způsoby energetického využití biomasy ozdobnice jako je pyrolýza či zplynění, avšak ty jsou teprve ve fázi laboratorních testů (Hodgson a kol. 2010).

Výnosové modely Pro predikci a simulaci růstu a výnosů ozdobnice bylo vytvořeno několik mate-matických modelů. Jedním z nejpropracovanějších je MISCANFOR, který je posled-ní verzí v sérii modelů Clifton-Brown z r. 2000 a MISCANMOD, který následoval po něm. MISCANFOR predikuje výnos ozdobnicových plantáží a zahrnuje různé environmentální podmínky včetně sucha nebo mrazů (Hastings a kol. 2009a). Vý-stup starší verze výnosového modelu Miscanfor zpracovaný Dr. A. Hastingsem pro Českou republiku v rozlišení 10 úhlových sekund je na obr. 3. Autoři modelu na vy-žádání poskytnou predikci výnosu i pro konkrétní pěstební plochy. Jiný model vyvinuli badatelé v Anglii (Richter a kol. 2008). Tento model zo-hledňuje zejména dostupnou půdní vláhu v průběhu vegetační sezóny. Publi-kován byl i semi-mechanistický model, který bere v potaz důležité fyziologické procesy v kombinaci s klimatickými daty (Miguea a kol. 2009). Tyto modely po-skytují užitečné odhady výnosů ozdobnice jak v makroměřítku pro státní správu tak v mikroměřítku pro potenciální pěstitele.

2929

Obr. 3. Odhad výnosů ozdobnice v tunách suché biomasy/ha.rok na území ČR provedený na základě modelu Miscanfor (verze 11). Černě jsou vyznačeny oblasti nad 500m nadmořské výšky, lesní porosty, skalnaté oblasti, vodní plochy a zastavěné oblasti, kde není pěstování ozdobnice možné nebo vhodné.

vysoký výnos - 15 t sušiny/ha.rok

nízký výnos - 0 t sušiny/ha.rok

30

Cíl metodiky Cílem této metodiky je popsat způsob využití vybraných endofytních mikroor-ganismů pro zvýšení produkce biomasy ozdobnice obrovské zakládané z in vitro množených explantátových rostlin. Metodika uvádí podrobně přípravu bakteriál-ního a houbového inokula, inokulaci explantátových rostlin, předpěstování ino-kulovaných sazenic i jejich následnou výsadbu. Dokládá příznivý účinek na pře-žívání a produkci biomasy takto založených porostů ozdobnice.

Popis metodikyVyužití vybraných endofytních mikroorganismů pro podporu růstu ozdobnice

Podmínkou úspěšné inokulace je použití in vitro explantátových rostlin. Tyto rost-liny dodává několik firem, na evropském trhu např. VitroGen (Bygdosz, Polsko) nebo Vitroform (Nørre Søby, Dánsko). Polská firma mikropropaguje Miscanthus × gigan-teus cv. Illinois. Rhizomy cv. Illinois jsou podle Peixoto a kol. (2015) schopny přežít i teploty kolem -6°C, avšak při -8°C klesá přežívání na pouhých 10 %. Dánská fir-ma dodává kultivar Foulum /Hornum/, pro který analogické údaje chybí, avšak lze předpokládat, že budou podobné. Mezi stávajícími (nikoli nově šlechtěnými) kulti-vary M. × giganteus jsou totiž pouze malé genetické rozdíly a je pravděpodobné, že pochází z totožného genetického zdrojového materiálu (Głowacka a kol. 2014). Ačkoli explantátové rostliny nejsou při dodání zcela bez endofytních mikro-organismů, inherentně přítomná endofytní komunita je chudá (testováno na ex-plantátových rostlinách firmy VitroGen) a rostliny mají volnou niku pro inokulací vnášené mikroorganismy. Sazenice je třeba objednat s předstihem tak, aby je farmář obdržel na přelo-mu březen/duben. Po obdržení sazenic a jejich inokulaci (která je popsána níže),

31

jsou rostliny cca 6 týdnů předpěstovány před vlastní výsadbou na cílovou plan-táž. Výsadba se provádí optimálně v době, kdy nehrozí přízemní mrazíky.

Příprava bakteriálního inokula Bakteriální inokulum je směsné a obsahuje 4 kmeny endofytních bakterií izo-lovaných z ozdobnice: Pseudomonas sp. (50OK6), Pseudomonas sp. (50OK3), Pseudomonas sp. (5OK7A) a Variovorax paradoxus (50OK5). Alternativně mo-hou být kmeny Pseudomonas sp. (50OK3) a Pseudomonas sp. (5OK7A) na-hrazeny kmenem Bacillus mojavensis (50K7C2). V tomto případě pak výsledná směs sestává ze tří kmenů (50OK6, 50K7C2 a 50OK5). Druhou variantu upřed-nostňujeme, jde o optimalizovanou směs, která byla použita v experimentech z r. 2016 (viz sekce Příklady dokládající příznivý účinek inokulace na přežívání i produkci biomasy takto založeného porostu). Jednotlivé kmeny bakterií jsou napěstovány samostatně ve standardním ste-rilizovaném LB (Luria-Bertani broth) médiu do hustoty odpovídající OD600 ≥ 1 (24-48 hod při 28°C). Sterilizace růstového média před zaočkováním bakté-rií ze zamražených kultur se provádí nejlépe autoklávováním (121°C, 25 minut,

32

tlak 101,5 kPa). Poté jsou bakteriální kultury centrifugovány (10 min při 5000 g), naředěny v sterilním roztoku MgSO4 o koncentraci 0,01-0,1 M (peleta se ředí do podobného objemu MgSO4 jako byl výchozí objem růstového média) a ulo-ženy v chladu (4-8°C). Následně jsou ověřeny reálné počty životaschopných bakterií s pomocí KTJ (tzv. kolonie tvořící jednotky) u každého napěstovaného kmene zvlášť. Nejprve je z dané bakteriální suspenze připravena ředící řada (ob-vykle v rozmezí 10-5-10-8), 100 µl každého ředění je naneseno na Petriho misky s 1-2 % LB agarem a po nárůstu kolonií tyto spočteny a vypočtena koncentrace živých bakterií daného kmene. Do finálního bakteriálního inokula jsou namíchá-ny jednotlivé složky (tj. v MgSO4 připravené kultury napěstovaných bakteriálních kmenů) na základě hodnot KTJ/ml tak, aby výsledná směs obsahovala stejné počty živých buněk jednotlivých složek. Při přípravě finální inokulační směsi tedy smícháme složky v patřičných objemových poměrech a na požadovanou kon-centraci doplníme roztokem 0,01-0,1 M MgSO4 připraveným z destilované či deionizované vody krátce před použitím (to je důležité, při delším skladování by se v MgSO4 mohly namnožit jiné mikroorganismy). Výsledná minimální koncen-trace živých bakterií ve finálním směsném inokulu by měla činit 5.107 buněk/ml.

33

Množství kapalného inokula potřebného na inokulaci 1 tisíce explantátových rostlin činí cca 4 L. Připravenou bakteriální směs před ředěním pro finální inoku-lum udržujeme v temnu a chladu (4-8°C) a ředíme až krátce před aplikací. Přípravu inokula si můžeme demonstrovat na následujícím příkladu. Pokud dosáhne koncentrace čtyř napěstovaných bakteriálních kmenů hodnot 3.109, 6.109, 6.109 a 1.1010 KTJ/ml, do výsledné směsi je přidáno na 1 objemový díl kmene 1 pouze 0,5 objemového dílu kmenů 2 a 3 a 0,3 objemového dílu kmene 4. Na každý 1 ha ozdobnice o hustotě výsadby 12 tisíc rostlin/ha, potřebuje pěs-titel připravit 48 litrů inokula o minimální koncentraci 5.107 KTJ/ml. 48 litrů ino-kula získá 60-násobným naředěním 0,8 l bakteriální směsi o koncentraci 3.109

KTJ/ml, kterou připraví smícháním 350 ml, 175 ml, 175 ml a 105 ml kmenů 1-4. Pro přípravu inokula na 1 ha tedy postačí 500 ml výchozí kultury každého kme-nu napěstované v LB médiu. Mezi napěstováním bakterií a aplikací inokula nesmí být delší časová pro-dleva než několik dní (max. týden), jinak může dojít k znehodnocení inokula. Pro dlouhodobější skladování inokula je možné imobilizovat bakterie na gama zá-řením (25 kGy)-sterilizovanou práškovou neutralizovanou rašelinu v zatavených silnostěnných plastových vacích. Počet živých buněk u imobilizovaného inoku-la by měl dosahovat 5.108 KTJ/ml rašeliny a výsledná vlhkost být v rozmezí 35-50 %, tomu je třeba přizpůsobit přidávaný objem roztoku. Pokud je inokulum připravováno několik měsíců předem a je potřeba po tuto dobu udržet bakte-rie naživu bez výrazného poklesu jejich počtu, přidejte ke sterilní rašelině kro-mě suspenze živých buněk i živinový roztok. Jako levný živinový roztok poslouží dobře 1,5 % sterilizovaná suspenze bramborového těsta. Na takto připravené matrici přežívají bakterie bez výrazného poklesu počtu min. 6 měsíců. Protože vybavení potřebné k napěstování bakteriálního inokula není dostupné běžnému pěstiteli, předpokládáme, že si zájemce nechá bakterie napěstovat a ino-kulum připravit subdodavatelsky. Kultury bakterií jsou uloženy ve sbírce VŠCHT Praha. Přípravu inokula je schopná zvládnout každá běžně vybavená mikrobiolo-gická laboratoř. Tuto službu nabízí např. firma Ecofuel Laboratories s.r.o., která za-hájila registraci bakteriálního preparátu pod názvem ENDOSTIM B u ÚKZUZ.

34

Příprava houbového inokula Houbové inokulum sestává ze tří kmenů hub: MR67 (Verticillium leptobac-trum), MR72 (houba příbuzná k r. Exophiala) a MR75 (Zalerion/Halenospora sp.). Kmen MR72 může být případně nahrazen jinou DSE houbou, a sice kme-nem MR52 (Leptodontidium orchidicola). Tato optimalizovaná alternativa byla použita v experimentech z r. 2016 (viz sekce Příklady dokládající příznivý účinek inokulace na přežívání i produkci biomasy takto založeného porostu). Uvedené kmeny hub byly vybrány na základě screeningových testů provedených in vitro, v květináčích a v polních podmínkách. Jednotlivé kmeny jsou napěstovány samostatně a to v tekuté submerzní kul-tuře na standardním 2 % ME („malt extrakt“) médiu, které je složeno ze sladové-ho extraktu a mykologického peptonu. Na trhu je řada dodavatelů hotového ME přípravku, který se pouze vhodně naředí (rozpuštěním 20 g přípravku v 1 litru vody) a plní do sterilizovatelných nádob o vhodném objemu (např. Erlenmaye-rovy baňky se zátkami z buničité vaty). Následně je nutné médium sterilizovat a to nejlépe autoklávováním (121°C, 25 minut, tlak 101,5 kPa). Poté je prove-deno ve sterilních podmínkách (např. v laminárním boxu) zaočkování růstové-ho média zdrojovým houbovým materiálem (lyofilizovanými sporami, zamra-ženou kulturou nebo terčíkem mycelia narostlého na agarové misce). Houbové kultury se ponechají růst při pokojové teplotě za mírného míchání na horizon-tální třepačce po dobu 2 týdnů. Poté je mycélium ve sterilních či semisterilních podmínkách přefiltrováno přes vhodné síto, zváženo a převedeno do sterilního roztoku MgSO4 o koncentraci 0,01-0,1 M. K myceliární suspenzi jsou přidány samostatné skalpelové čepelky (počet ks přizpůsobit velikosti nádoby) a mag-netické míchadlo vhodné velikosti (čepelky i míchadlo musí být sterilní). Poměr hmotnosti mycelia k objemu roztoku síranu hořečnatého je 1:4, tj. koncentrace resuspendovaného mycelia činí cca 200 g/l. Následně je mycelium dezintegro-váno na magnetické míchačce (cca 0,5 hod), aby se vytvořila homogenní my-celiální suspenze. Vzniklé tři suspenze se smísí ve stejném objemovém poměru a naředí ve vhodné nádobě na požadovaný objem sterilním roztokem MgSO4 o výše uvedené koncentraci. Konečná hustota myceliální suspenze v inokulu by

35

měla činit 15 g/l. Množství kapalného inokula potřebného na inokulaci 1 tisíce explantátových rostlin činí cca 4 l. Přípravu inokula si můžeme demonstrovat na následujícím příkladu. Předpo-kládejme, že se pěstitel rozhodl založit 1 ha ozdobnice o hustotě 12 tisíc rostlin/ha. Pro inokulaci potřebuje 48 l inokula o koncentraci 15 g/l. Předpokládejme dále, že po dvoutýdenní kultivaci narostou kultury výše uvedených tří kmenů do hustoty 80 g mycelia/l, 128 g mycelia/l a 160 g mycelia/l. Mycelium jednotli-vých hub je přefiltrováno a převedeno do roztoku MgSO4 (v poměru 1:4, jak bylo uvedeno výše) a poté desintegrováno. Koncentrace homogenizovaných suspen-zí jednotlivých kmenů teď činí shodných 200 g/l. Do výsledné inokulační směsi přidáme 1,2 l homogenizované suspenze každého kmenu. Následně inokulum doředíme na 48 l roztokem MgSO4. Pro přípravu 48 l inokula tedy potřebuje-me následující množství primárních (v ME napěstovaných) houbových kultur: 3 l kmenu A, 1,9 l kmenu B a 1,5 l kmenu C.

Protože vybavení potřebné k napěstování a přípravě houbového inokula není dostupné běžnému pěstiteli, předpokládáme, že si zájemce nechá houbové ino-kulum napěstovat a připravit subdodavatelsky. Kultury hub jsou uloženy v CCM sbírce a v Botanickém ústavu AVČR v.v.i. Přípravu inokula je schopná zvládnout každá běžně vybavená mikrobiologická laboratoř. Tuto službu nabízí např. firma Ecofuel Laboratories s.r.o.

36

Inokulace

Obr. 4 Kořeny ozdobnice po inokulaci endofytními houbami

Inokulace se provádí vzápětí po dodání sazenic ozdobnice (cca 8-15 cm vysoké rostliny) s pomocí vybraných směsí bakterií a hub připravených na vhodných růsto-vých médiích v in vitro kulturách. Sazenice se dodávají zavlhčené a lze je uskladnit v lednici/chladném místě, pokud není inokulum bezprostředně po obdržení sadby k dispozici. Doba uskladnění by však neměla překročit několik dní. V případě bakteriálního tekutého inokula spočívá inokulace v máčení kořenů rostlin po dobu 1-2 hod v bakteriální suspenzi. Poté jsou rostliny vysazeny a zbytek bakteriální suspenze je aplikován na substrát v blízkosti vysazených rostlin. Prová-dí-li se inokulace imobilizovaným (práškovým) bakteriálním inokulem, pak se vlhký kořenový systém sazenic přitiskne na inokulum, lehce oklepne a sazenice s uchyce-ným inokulem se vysadí. V případě houbové-ho inokula je ve vhodně naředěné myceliální sus-penzi kořenový systém sazenic ozdobnice namo-čen stejně jako u bakteri-álního inokula po dobu 1-2 hod. Inokulované sa-zenice jsou založeny v řa-dách do pěstebních van s odhaleným kořenovým systémem (obr 4). Poté je zbytek myceliální suspen-ze aplikován na substrát v blízkosti kořenů vysazo-vaných sazenic a kořeny přehrnuty substrátem.

37

Předpěstování inokulovaných rostlin

Sazenice jsou předpěstovány ve vanových (viz obr. 5) nebo jiných vhodných sadbovačích, které zajistí dostatečný prostor pro rozvoj kořenového systému rostlin po dobu 6-8 týdnů. Preferované jsou sadbovače s hlubším profilem (min 10 cm), aby se vytvořil dostatečný kořenový systém a snížilo riziko poškození su-chem po transplantaci rostlin na pole. Inokulované sazenice jsou sázeny do živino-vě chudšího substrátové-ho mixu na bázi neutra-lizované rašeliny (např. směs rašelina:písek:zeolit v objemových poměrech 6:3:1). Rostliny jsou pěsto-vány po dobu cca 6 týdnů před vlastní výsadbou na pole v krytých prostorách (skleník apod.), kde ne-klesá teplota pod 8-12°C. Během této fáze je možné rostliny přihnojit lignohu-mátovým listovým hnoji-vem (cca 6 %) v dávce dle doporučení výrobce. Vý-sadbu inokulovaných sa-zenic do živinově boha-tého substrátu nebo hno-jení minerálními hnojivy v této fázi nedoporučuje-me, aby nebyla naruše-na kolonizace rostlin en-dofyty. Obr. 5 Inokulované rostliny ozdobnice v sadební vaně

38

Výsadba a následná péče Výsadba sazenic na cílovou plochu probíhá u malých výměr ručně (např. s pomocí vodících šňůr, na kterých je vyznačen spon rostlin), na velkých plantá-žích s pomocí mechanizace (např. sazeče zeleniny). Doporučené hustotě 10-15 tisíc rostlin/ha odpovídá spon 0,75 x 0,75 m až 1 x 1 m. Je-li dostupná závlaha, doporučujeme po výsadbě založený porost adekvát-ně zavlažit (např. v dávce odpovídající 5-10 mm srážek). S ohledem na nízkou konkurenční schopnost ozdobnice v první etapě po výsadbě jsou zásahy proti plevelu nutné a pečlivé odplevelení má velký vliv na úspěšné uchycení založe-ného porostu. Odplevelení je možné provádět prutovými branami, rotavátorem, případně vyžínáním a to obvykle 2-4x za sezónu dle použité techniky. Lze vyu-žít i chemické ochrany v podobě preemergentních herbicidů. Pro výběr a dávko-vání vhodných herbicidů odkazujeme na přílohu 1. V oblastech s vyšší hrozbou

Obr. 6 Rostliny hořčice v meziřadí ozdobnice

39

vymrzání ozdobnice lze koncem léta (začátek září) provést do meziřadí ozdobni-ce výsev hořčice rolní (obr. 6), jejíž biomasa vytváří v zimě přirozený mulč chrá-nící mladé rostliny ozdobnice.

Výsledky dosažené na modelových plochách Níže uvádíme příklady realizovaných výsadeb ozdobnice s inokulacemi na bázi bakteriálních a houbových endofytů, které dokládají výrazný stimulační účinek těchto preparátů na růst ozdobnice. V r. 2015 jsme založili porost na ži-vinově chudší lokalitě ve Stříteži (GPS N 49.662487, E 15.156862, 422 m n.m.) a na ploše v Novém Podlesí kontaminované těžkými kovy (GPS N 49.707479 E 13.976164, 502 m n.m.). V r. 2016 jsme založili nový experiment s optimalizo-vanými inokulačními směsmi na nekontaminovaných plochách ve Stříteži (stejná lokalita jako v r. 2015) a v Čáslavi (GPS N 49.9138933, E 15.4013158, 240 m n.m.). Všechny experimentální plochy byly před založením experimentů v režimu trvalého travního porostu.

Přežívání vysazených rostlin

Přežívání rostlin ozdobnice vysazených na jaře r. 2015 bylo posouzeno na konci I. (říjen 2015) a II. (říjen 2016) vegetační sezóny a je vyneseno na obr. 7. U ozdobnice na nekontaminované (Střítež) i kontaminované (Nové Podlesí) plo-še přežívalo na konci první sezóny přibližně 80 % rostlin, přičemž pětina rostlin uhynula během fáze ujímání a v bezprostředně následujícím období, v druhé polovině vegetační sezóny již byla mortalita zanedbatelná. Přezimování se uká-zalo jako kritický faktor a navzdory poměrně mírné zimě došlo k výraznému úhynu ozdobnice, zejména na nekontaminované ploše. Je třeba podotknout, že lokalita Střítež spadá podle rámcové typologie Strašila (2009) pod méně vhodné a rizikové oblasti pro pěstování ozdobnice a tlak stresových faktorů zde je vyšší. V dalším průběhu sezóny se již mortalita prakticky nezměnila. Mezi přežíváním inokulovaných a neinokulovaných rostlin nebyl pozorován statisticky význam-ný rozdíl s výjimkou bakteriální varianty na nekontaminované ploše (Střítež),

40

jejíž přežívání bylo statisticky významně vyšší než u kontrolních neinokulovaných rostlin (obr. 7).

Obr.7 Přežívání ozdobnice vysazené v Novém Podlesí (plocha kontaminovaná těžkými kovy) a ve Stříteži (nekontaminovaná plocha). C, neinokulovaná kontrolní varianta; B, varianta inokulovaná směsným bakteriálním inokulem (viz oddíl Příprava bakteriálního inokula); F, varianta inokulovaná směsným houbovým inokulem (viz oddíl Příprava houbového inokula); BF, varianta inokulovaná kombinovaným bakteriálním a houbovým inokulem. Data představují průměry ± SEM. * značí statisticky významný rozdíl na hladině p<0,05 proti kontrole.

41

Růstové parametry

Růst a produkce biomasy ozdobnice vysazené v r. 2015 byly výrazně ovlivněny lokalitou a experimentální variantou. Na kontaminované ploše v Novém Podlesí rostliny přirůstaly velice pomalu a vyprodukovaly malé množství biomasy. Oz-dobnice zde velmi málo odnožovaly a většinou se jednalo o jednotlivé rostliny, které nevytvořily trsy. Protože jsme zjistili signifikantně významný efekt randomi-zovaných bloků, v nichž byly rostliny vysazeny a které se lišily mortalitou i výno-sem, uvádíme výsledky vyjádřené relativně, tj. po vztažení hodnot inokulovaných rostlin na nejbližší kontroly. Bakteriální i houbová varianta statisticky význam-ně zvýšily nadzemní biomasu v první sezóně (obr. 8). Podobný trend zvýšení nadzemní biomasy, byť statisticky nevýznamný, byl pozorován i ve druhé sezóně. Výška porostů inokulací zvýšena nebyla. Na nekontaminované ploše ve Stříteži rostla ozdobnice lépe a vyprodukova-la výrazně větší množství biomasy (obr. 9). Houbové inokulum po první sezóně signifikantně zvýšilo množství biomasy ve srovnání s kontrolou. Žel kvůli výraz-né mortalitě po první sezóně nebylo možné vyhodnotit růst a produkci biomasy i v následující sezóně (2016).

42

Obr. 8 Růstové parametry ozdobnice vysazené v Novém Podlesí (plocha kontaminovaná těžkými kovy) v r. 2015. C, neinokulovaná kontrolní varianta; B, varianta inokulovaná směsným bakteriálním inokulem (viz oddíl Příprava bakteriálního inokula); F, varianta inokulovaná směsným houbovým inokulem (viz oddíl Příprava houbového inokula); BF, varianta inokulovaná kombinovaným bakteriálním a houbovým inokulem. Data představují průměry ± SEM a jsou vyjádřena v % (vztaženo k hodnotám nejbližšího bloku kontrolních rostlin; kontrolní hodnoty zdůrazněny červenou přerušovanou linií). * značí statisticky významný rozdíl na hladině p<0,05 proti kontrole.

0

20

40

60

80

100

120

140

na konci I. vegetační sezóny (2015)

na konci II. vegetační sezóny (2016)

Výšk

a [%

C]

0

50

100

150

200

250

na konci I. vegetační sezóny (2015)

na konci II. vegetační sezóny (2016)

Nad

zem

ní b

iom

asa

[% C

]

C

B

F

BF

* *

100

100

43

Obr. 9 Růstové parametry ozdobnice vysazené ve Stříteži (nekontaminovaná plocha) v r. 2015 po jedné vegetační sezóně. C, neinokulovaná kontrolní varianta; B, varianta inokulovaná směsným bakteriálním inokulem (viz oddíl Příprava bakteriálního inokula); F, varianta inokulovaná směsným houbovým inokulem (viz oddíl Příprava houbového inokula); BF, varianta inokulovaná kombinovaným bakteriálním a houbovým inokulem. Data představují průměry ± SEM. * značí statisticky významný rozdíl na hladině p<0,05 proti kontrole.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1

Výšk

a [c

m]

0

10

20

30

40

50

60

70

1

Nad

zem

ní b

iom

asa

[g su

šiny]

C

B

F

BF

*

44

V novém polním experimentu zrealizovaném v r. 2016 s optimalizovanými variantami směsí hub a bakterií se mortalita vyvíjela podobně jako v předcho-zím roce, tj. rostliny, které přežily fázi ujímání, rostly až do závěru sezóny. S ohle-dem na malou produkci biomasy na kontaminované ploše v předešlém roce jsme tentokrát testovali efekt inokulace pouze na nekontaminovaných plochách, a sice ve Stříteži a v Čáslavi. Celková mortalita byla mírně nižší (cca o 5-10 %) než v předešlém roce a na konci sezóny jsme nezaznamenali statisticky významný rozdíl v přežívání mezi experimentálními variantami. Růstové a výnosové para-metry experimentu jsou na obr. 10 (Střítež) a 11 (Čáslav). Ve Stříteži obě inokula (bakteriální i houbové) signifikantně zvýšila výšku porostu a zejména produk-ci nadzemní biomasy. Podobný, i když pouze u houbové varianty signifikantní trend vykázala biomasa rhizomů. Produkce rhizomů je v první sezóně důležitější než produkce nadzemní biomasy kvůli přezimování založených ozdobnicových porostů.

V Čáslavi měla inokulace bakteriálním inokulem významný pozitivní efekt na nadzemní biomasu ozdobnice, trendy zvýšení výšky a produkce rhizomů ne-byly signifikantní.

Obr. 10 Růstové parametry ozdobnice vysazené ve Stříteži (nekontaminovaná plocha) na jaře r. 2016 po jedné vegetační sezóně. C, neinokulovaná kontrolní varianta; B, varianta inokulovaná směsným bakteriálním inokulem (viz oddíl Příprava bakteriálního inokula); F, varianta inokulovaná směsným houbovým inokulem (viz oddíl Příprava houbového inokula). Data představují průměry ± SEM a jsou vyjádřena v % (vztaženo k hodnotám nejbližšího bloku kontrolních rostlin; kontrolní hodnoty zdůrazněny červenou přerušovanou linií). * značí statisticky významný rozdíl na hladině p<0,05 proti kontrole.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C B

rela

tivně

vůči

kont

role

[%]

přežívání výška nadzemní biomasa rhizomy

100

*

Obr. 11. Růstové parametry ozdobnice vysazené v Čáslavi (nekontaminovaná plocha) na jaře r. 2016 po jedné vegetační sezóně. C, neinokulovaná kontrolní varianta; B, varianta inokulovaná směsným bakteriálním inokulem (viz oddíl Příprava bakteriálního inokula). Data představují průměry ± SEM a jsou vyjádřena v % (vztaženo k hodnotám nejbližšího bloku kontrolních rostlin; kontrolní hodnoty zdůrazněny červenou přerušovanou linií). * značí statisticky významný rozdíl na hladině p<0,05 proti kontrole.

46

Shrnutí a závěr Metodika přehledně shrnuje současné poznatky týkající se agrotechno-

logie pěstování, sklizně a využití energetické lipnicovité trávy ozdobnice. Ved-le toho ukazuje výrazný potenciál vybraných symbiotických endofytních mik-roorganismů zvýšit přežívání a růst ozdobnice a to zejména na marginálních a kontaminovaných stanovištích. Detailně popsána je příprava dvou inokulač-ních preparátů na bázi bakteriálních a houbových endofytů, jejich aplikace i mo-delové příklady výsledků v realizovaných polních experimentech. Zvýšení výnosů nadzemní biomasy se na různých stanovištích pohybovalo mezi 20-90 %. S ohle-dem na klíčovou roli rhizomů pro přezimování ozdobnice považujeme za vý-znamné, že houbové inokulum vedle nadzemní biomasy signifikantně zvýšilo produkci rhizomů a stejný, byť nesignifikantní trend vykázalo bakteriální ino-kulum. To také výrazně zvýšilo procento přežívajících rostlin na jedné z experi-mentálních ploch. Protože cena produkce obou inokul je ekonomicky přijatelná a nezvyšuje výrazně náklady na zakládání porostu, předkládáme tuto metodiku potenciálním pěstitelům a producentům in vitro sazenic s nadějí, že najde brzy své uplatnění.

Srovnání novosti postupůInovativnost předkládané metodiky spočívá v použití unikátních kmenů en-

dofytních mikroorganismů izolovaných z ozdobnice k podpoře přežívání a růstu této energetické plodiny. Metodika popisuje způsob přípravy bakteriálního a houbového inokula a jejich aplikace na in vitro množené ozdobnicové sazeni-ce. Ačkoli českým pěstitelům energetických plodin je již k dispozici certifikova-ná metodika popisující agrotechnologii a další aspekty související s pěstováním ozdobnice (Strašil 2009), netýká se endofytních mikroorganismů ozdobnice ani nezmiňuje jejich potenciální využití. Nakolik je nám známo, naše metodika je

47

první českou metodikou, která popisuje využití endofytů pro podporu růstu rost-lin. Vzdáleně související certifikovaná metodika popisující využití endofytní hou-by Clonostachys sp. k ochraně rostlin včetně obilnin a trav (Ondráčková a kol. 2014) je založena na jiném mikroorganismu s odlišným efektem a cílí primárně na biologickou kontrolu patogenů. Díky tomu, že použité endofyty byly izolovány z ozdobnice a jsou na ni zpětně inokulovány, je zaručena kompatibilita inokul s cílovou plodinou. Důležitý aspekt metodiky je skutečnost, že vyvinutá inokula zlepšují růst ozdobnice na stresovaných a marginálních plochách, kam energe-tické plodiny vytlačuje kompetice s potravinovými komoditami. Zahraniční práce zmiňují (a naše polní experimenty potvrzují) jako jedno z vážných rizik souvise-jících s pěstováním ozdobnice přezimování nově vysazených plantáží v prvním roce. V tomto ohledu považujeme za zvláště významný efekt bakteriálního ino-kula, které během prvního přezimování výrazně snížilo mortalitu rostlin.

48

Uplatnění metodikyMetodika je určena pěstitelům plantáží ozdobnice a producentům in vitro

množených sazenic ozdobnice, případně zemědělským poradcům.

Ekonomické aspekty Ozdobnice je vytrvalá plodina s vysokými náklady na založení porostu. Už jen z toho důvodu by se porost měl zakládat minimálně na 10 let. V nákladech na založení hraje významnou úlohu sadební materiál, kterým mohou být výji-mečně semena (pouze u nesterilních kultivarů), většinou však rhizomy nebo in vitro propagované rostliny. Huisman a kol. (1997) uvádí pro podmínky Holandska v polovině devade-sátých let cenu explantátových rostlin cca 0,4 ECU/ks a cenu produkce vlastních rhizomů z mateřské plantáže na 0,04 ECU/ks (ECU byla evropská měnová jed-notka, na kterou navázalo v r. 1999 EUR ve směnném kurzu 1:1). Caslin a kol. (2010) odhaduje cenu za produkci vlastních rhizomů v Irsku na 0,052 EUR/ks.

49

Podle osobního sdělení Larse Sommera z firmy Vitroform (Dánsko) se v součas-nosti cena rhizomů na tamějším trhu pohybuje kolem 0,11 EUR/ks a cena ex-plantátových rostlin kolem 0,52 EUR/ks. V polovině devadesátých let přitom či-nila cena explantátových rostlin cca 0,66 EUR/ks a nová efektivní technologie mikropropagace umožní v brzké době snížení ceny pod 0,26 EUR/ks. Polská fir-ma VitroGen již v současnosti prodává explantátové sazenice kolem 0,20 EUR/ks. V Kanadě a USA se v r. 2013 ceny rhizomů pohybovaly mezi 0,05-0,08 USD/ks (dle New Energy Farms, Leamington, Kanada). Ekonomická analýza vycházející z dánských podmínek ukázala, že produkč-ní náklady ozdobnice jsou srovnatelné s ostatními jednoletými i vytrvalými ener-getickými plodinami (cca 70 ECU/t nebo 4,1 ECU/GJ), což činí tuto plodinu při zahrnutí dotací mírně výdělečnou (Scurlock 1999). V době studie se tržní ceny slámy v Dánsku pohybovaly kolem 80 ECU/t (ve stejné době se ovšem dřevní štěpka ve Švédsku obchodovala za pouhých 32 ECU/t). V Británii ukázala eko-nomická analýza organizace ADAS, že ozdobnice je ekonomicky životaschopná pro specializovanou produkci papíru v chemických celulózkách a že energetické zpracování by bylo ekonomicky výdělečné bez dotace za současných Evropských podmínek při výnosech nad 18 t/ha.rok. S tržní pobídkou i kolem 15 t/ha.rok (Walsh and McCarthy 1998). V USA činí náklady na založení a údržbu porostu ozdobnice v prvních dvou letech cca 4600 USD/ha (odpovídá přibližně 4200 EUR/ha), přičemž nákla-dy jsou rozloženy v tomto období následovně: 1100 USD přípravná fáze v roce předcházejícím výsadbu (včetně pronájmu pozemku), 2800 USD v roce výsad-by a 700 USD v následujícím roce. V dalších letech už náklady zahrnují pouze pronájem pozemku a sklizeň a pohybují se lehce pod 1000 USD/ha. Průměr-né roční náklady na založení porostu se při předpokladu 20 let trvání porostu a 8 % úrokové míry pohybují lehce pod 400 USD/ha (Hoque a kol. 2014). Hea-ton a kol. (2016) odhadují čistý zisk z hektaru ozdobnice na cca 2900 USD, nic-méně počítají se založením porostu ze semen, nikoli rhizomů. Hranici rentabili-ty pro výrobu elektřiny z biomasy ozdobnice ve státě Illinois určili Khanna a kol. (2008) na 44-80 USD/t sušiny (v závislosti na výnosech, cenách pronájmu půdy

50

a dalších parametrech), což je podstatně více než hranice rentability pro výro-bu elektřiny z uhlí (20 USD/t). Autoři konstatovali, že při současných cenách uhlí a nákladech/výnosech ozdobnice jsou dotace pro stimulaci pěstování ozdobnice nezbytné. K podobnému závěru dospěli v podmínkách ČR Andert a kol. (2014), kteří zdůraznili možnost využití dostupných dotací SAPS a PVP. Strašil (2009) odhadl pro ČR celkové variabilní náklady (včetně sadby) při 10-letém období existence plantáže na 19,5 tisíc Kč/ha.rok. V novější práci uvádí Veselý (2014), že technologické náklady (tj. variabilní náklady včetně fixních nákladů na stroje) související se založením a sklizní ozdobnicového porostu činí přibližně 18 tisíc Kč/ha.rok (odpovídá přibližně 670 EUR/ha.rok při současném směnném kurzu). Odhad čistého finančního zisku z hektaru udává u ozdobni-ce 2617 Kč se započtením dotace SAPS a TOP-UP, bez ní by hospodaření bylo ve ztrátě 3944 Kč/ha. Práce vychází z Normativů pro zemědělskou a potravinář-skou výrobu na r. 2012, které předpokládají dobu trvání porostu 10 let, cenu sa-zenic mezi 5-10 Kč a výkupní ceny fytomasy kolem 1000 Kč/t. Četné zahraniční zkušenosti však ukazují, že porost je životaschopný přibližně dvojnásobnou dobu, cena sazenic v průběhu let klesá (rhizomy lze zakoupit již od 3 Kč/ks a explantá-tové rostliny od 6 Kč/ks) a výkupní ceny biomasy naopak rostou (v současnosti cca 1700 Kč/t při vlhkosti 20 % dle údajů BIOM). Pro variantu 20-letého trvání porostu vyčíslil Strašil (2009) náklady na založení ozdobnicové plantáže na 13,6 tisíc Kč/ha.rok (cca 500 EUR/ha.rok) a je zřejmé, že při zohlednění výše uvedených fak-torů jsou současné reálné náklady související se založením ozdobnicové plantáže výrazně nižší (pod 10 tisíc Kč/ha.rok) a pěstování tudíž rentabilnější. S ohledem na to, že v této metodice navrhujeme použití endofytních bak-teriálních a houbových inokul, uvádíme níže odhad nákladů na jejich produkci. Při výrobě inokulačního preparátu v průmyslovém či poloprůmyslovém měřítku, která zahrnuje kroky rozpěstování mikrobiálních kmenů z agarových ploten po-stupně do 250 ml a 5 l Erlenmayerových lahví na orbitální třepačce, následo-vané vsádkovou fermentací v 100 l a 1500 l fermentoru, je možno odhadnout (dle interní kalkulace spol. EcoFuel Laboratories s.r.o.) náklady na produkci 1 li-tru kapalné mikrobiální kultury 1 kmene o obsahu mikroorganismů cca 1.109 až

51

1.1010 KTJ/ml na částku 250 Kč (včetně marže). Vyjdeme-li z předpokladu uve-deného v kapitole „Příprava bakteriálního inokula“, že na ošetření 1 ha plan-táže potřebujeme směsný preparát vzniklý smísením 0,5 litru čtyř individuálně připravených kultur mikrobiálních kmenů, potřebujeme tedy celkem 2 l směsné mikrobiální kapalné směsi a náklady na produkci bakteriálního preparátu nut-ného k ošetření sadby budou kolem 500 Kč/ha. U hub činí odhadované výrobní náklady (se započtením marže) cca 300 Kč/L, což při nárůstu kultur do hustoty ≥ 100 g mycélia/l představuje celkové náklady na produkci houbového inokula nutného k ošetření sadby kolem 1800 Kč/ha. S větším množstvím sazenic a po-třebného inokula jednotkové náklady ještě o 10-20 % klesnou. Tyto náklady jsou vynakládany pouze při založení plantáže a činí méně než 1 procento celkových variabilních nákladů spojených s pěstováním ozdobnice. S ohledem na to, že obě inokula mají výrazný prorůstový efekt (u bakteriálního inokula doprováze-ný také zvýšením procenta přežívání a u houbového inokula zvýšenou produkcí rhizomů), snižují teoreticky náklady na odplevelování a dosadbu uhynulých rost-lin v další sezóně a urychlují nástup plné produkce. Proto považujeme investici do endofytních inokul za vysoce rentabilní.

52

Anotace metodiky v AJ This certified methodology describes the utilisation of two preparations based on consortia of endophytic microorganisms for enhancement and growth pro-motion of the energy crop Miscanthus. It comprises a detailed description of two combined inocula (one consisting of endophytic bacteria, and one consisting of endophytic fungi), their preparation and application on in vitro propagated Mis-canthus explants, the pre-growth of inoculated plants and their field transplan-tation. Several examples of successful use of the inocula are presented. While Czech growers already have an in-depth handbook describing Miscanthus hus-bandry and utilisation, biostimulants applicable on this crop were lacking. Our methodology fills this gap. Due to the fact that all endophytic microbes used in the inocula were isolated from Miscanthus × giganteus, they are fully compatible with this crop. Their use for other plants (namely closely related crops of the Po-aceae family, e.g. other energy grasses or cereals) must be tested before large-scale application. Another important aspect of the methodology is the potential of the endophytic inocula to support growth of Miscanthus on marginal and con-taminated land. This falls in line with the effort to reduce competition of energy and food crops for prime arable land. Our results confirm the observations of foreign studies that the first overwintering is a particular critical period for Mis-canthus establishment. The combined bacterial inoculum described here might provide a substantial protection during this precarious stage and improve crop establishment in frost-prone regions, as it significantly decreased mortality of the plants during the first winter. Crop establishment should also be improved and accelerated by the fungal inoculum that significantly increased production of rhi-zomes. Moreover we expect a yield increase by application of either inoculum, since both inocula significantly increased production of the aboveground bio-mass at three tested locations. We hope for fast and extensive implementation of the methodology in the Czech Republic and beyond.

53

Použitá literatura a seznam publikací, předcházejících metodice

AEBIOM (2016) Statistical report of the European Biomass Association (AEBIOM). European Bioenergy outlook. Brusel. 300 pp.

Allen B., Kretschmer B., Baldock D., Menadue H., Nanni S., Tucker G. (2014) Spa-ce for energy crops – assessing the potential contribution to Europe’s energy fu-ture. Report produced for BirdLife Europe, European Environmental Bureau and Transport & Environment. IEEP, London

Anderson E., Arundale R., Maughan M., Oladeinde A., Wycislo A., Voigt T. (2011) Growth and agronomy of Miscanthus × giganteus for biomass production. Biofu-els 2: 71-87

Andert D., Fendrych D., Abrham Z., Gerndtová I., Herout M. (2014) Energetické využití trav. Certifikovaná metodika. Výzkumný ústav zemědělské techniky, v.v.i., ISBN 978-80-86884-86-8

An-Zhi R, Yin-Hua W., Yu-Bao G. (2009) Difference in antifungal activity of mor-photypes of clavicipitaceous endophytes within and between species. Acta Ecolo-gica Sinica 29: 227-231

Arundale R.A., Dohleman F.G., Voight T.B., Long S.P. (2014) Nitrogen fertilization does significantly increase yields of stands of Miscanthus × giganteus and Panicum virgatum in multiyear trials in Illinois. BioEnergy Research 7:408–416

54

Bansal A., Illukpitiya P., Singh S.P., Tegegne F. (2013) Economic competitiveness of ethanol production from cellulosic feedstock in Tennessee. Renewable Energy 59: 53-57

Behnke G.D., David M.B., Voigt T.B. (2012) Greenhouse gas emissions, nitrate le-aching, and biomass yields from production of Miscanthus × giganteus in Illinois, USA. BioEnergy Research 5: 801–813

Berg G., Smalla K. (2009) Plant species and soil type cooperatively shape the structure and function of microbial communities in the rhizosphere. FEMS Micro-biology and Ecology 68: 1–13.

Brimner T.A., Boland G.J. (2003) A review of the non-target effects of fungi used to biologically control plant diseases. Agriculture, Ecosystems & Environment 100: 3-16.

Brosse N., Dufour A., Meng X., Sun Q., Ragauskas A. (2012) Miscanthus: a fast- growing crop for biofuels and chemicals production. Biofuels, Bioproducts and Bi-orefining 6: 580–598

Bulgarelli D., Schlaeppi K., Spaepen S., Ver Loren van Themaat E., Schulze-Lefert P. (2013) Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Re-view of Plant Biology 64: 807-838

Cadoux S., Riche A.B., Yates N.E., Machet J.-M. (2012) Nutrient requirements of Miscanthus × giganteus: Conclusions from a review of published studies. Biomass and Bioenergy 38: 14–22

Caslin B., Finnan J., Easson L. (2010) Miscanthus best practice guidelines. ISBN 1-84170-574-8, Teagasc & AFBI, Severní Irsko

55

Chiang Y.C., CHou C.H., Lee P.R., Chiang T.Y. (2001): Detection of leaf-associa-ted fungi based on PCR and nucleotide sequence of the ribosomal internal tran-scribed spacer (ITS) in Miscanthus. Botanical Bulletin of Academia Sinica 42:39-44

Clay K., Holah J. (1999) Fungal endophyte symbiosis and plant diversity in suc-cessional fields. Science 285: 1742-1744

Clifton-Brown J.C., Lewandowski I. (2000) Overwintering problems of newly es-tablished Miscanthus plantations can be overcome by identifying genotypes with improved rhizome cold tolerance. New Phytologist 148: 287-294

Clifton-Brown J.C., Breuer J., Jones M.B. (2007) Carbon mitigation by the energy crop, Miscanthus. Global Change Biology 13: 2296–2307

Clifton-Brown J.C. (2014) v on-line článku dostupném zde: https://www.aber.ac.uk/en/news/archive/2014/11/title-159025-en.html

Clifton-Brown J., Hastings A., Mos M., a kol. (2016) Progress in upscaling Misca-nthus biomass production for the European bio-economy with seed-based hyb-rids. GCB Bioenergy. doi:10.1111/gcbb.12357

Davis S.C., Parton W.J., Dohleman F.G., Smith C.M., Del Grosso S., Kent A.D., DeLucia E.H. (2010). Comparative biogeochemical cycles of bioenergy crops re-veal nitrogen-fixation and low greenhouse gas emissions in a Miscanthus × gigan-teus agro-ecosystem. Ecosystems 13: 144–156

Davies S.C., Longbottom H., Atkinson C.J. (2011) Changes in duration of rhizo-me cold storage and manipulation of the growing environment to promote field establishment of Miscanthus giganteus. Biomass and Bioenergy 35: 4268–4279

DEFRA (2007) Planting and Growing Miscanthus. Best Practice Guidelines. pp 1-19

56

De Vrije T., Bakker R.R., Budde M.AW., Lai M.H., Mars A.E., Claasen P.AM. (2009) Efficient hydrogen production from the lignocellulosic energy crop Miscanthus by the extreme thermophilic bacteria Caldicellulosiruptor saccharolyticus and Thermo-toga neapolitana. Biotechnology for Biofuels 2:12

Dohleman F.G., Long S.P. (2009) More productive than maize in the Midwest: How does Miscanthus do it? Plant Physiology 150: 2104–2115

Dohleman F.G., Heaton E.A., Arundale R.A., Long S.P. (2012) Seasonal dyna-mics of above- and below-ground biomass and nitrogen partitioning in Misca-nthus × giganteus and Panicum virgatum across three growing seasons. GCB Bio-energy 4: 534–544

Doty S.L. (2011) Nitrogen-fixing endophytic bacteria for improved plant growth. Chapter in Bacteria in agrobiology: Plant growth responses, pp 183-199, Ed. Ma-heshwari D.K., ISBN: 978-3-642-20331-2

Döring M. (2013) Overview about the research of endophytes as biocontrol agents againts phytopathogens. In: Schneider C, Leifert C, Feldmann F (eds.) Endophytes for plant protection: the state of the art, pp. 181-182

Dunne G.G.C., Keogh E., Menton C., Brazil D., Ryan D., Germaine K.J., Bowling D.N. (2012) Improving the phytoremediation potential of plants using endophyt-ic bacteria: Cultivable bacterial communities associated with two monocotyleno-donous plants used for waste treatment. 5th international symposium on biosorp-tion and bioremediation, 51 – 55

Eckert B., Weber O.B., Gudrun K., Andras H., Marion S., Anton H. (2001) Azospi-rillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bakterium associated with the C4- grass Miscanthus. International Journal of Systematics and Evolutionary Microbio-logy 51: 17–26

57

Elbersen B., Startisky I., Naeff H., Hengeveld G., Schelhaas M.J. (2010) Spatially detailed and quantified overview of EU biomass potential taking into account the main criteria determining biomass availability from different sources. Deliverable 3.3. Biomass role in achieving the Climate Change & Renewables EU policy tar-gets. Demand and Supply dynamics under the perspective of stakeholders. IEE 08 653 SI2. 529 241

Ercoli L., Mariotti M., Masoni A., Bonari E. (1999) Effect of irrigation and nitrogen fertilization on biomass yield and efficiency of energy use in crop production of Miscanthus. Field Crops Research 63: 3–11

Everman W.J., Lindsey A.J., Henry G.M., Glaspie C.P., Phillips K., McKenney C. (2011) Response of Miscanthus × giganteus and Miscanthus sinensis to Postemer-gence Herbicides. Weed Technology 25: 398-403.

Farrell A.D., Clifton-Brown J.C., Lewandowski I., Jones M.B. (2006) Genotypic va-riation in cold tolerance influences the yield of Miscanthus. Annals of Applied Bio-logy 149: 337–345

Feng M. G., Poprawski T. J., Khachatourians G. G. (1994) Production, formulati-on and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control: current status. Biocontrol Science and Technology 4: 3-34

Fowler P.A., McLauchlin A.R., Hall L.M. (2003) The potential industrial uses of fo-rage grasses including Miscanthus. BioComposites Centre, University of Wales, Bangor, UK, pp 1-37

Han M., Choi G.W., Kim Y., Koo B.C. (2011) Bioethanol production by Misca-nthus as lignocellulosic biomass: focus on high efficiency conversion to glucose and ethanol. BioResources 6:1939-1953

58

Hastings A., Clifton-Brown J., Wattenbach M., Mitchell C.P., Smith P. (2009a) The development of MISCANFOR, a new Miscanthus crop growth model: towards more robust yield predictions under different climatic and soil conditions. GCB Bioenergy 1: 154–170

Hastings A., Clifton-Brown J., Wattenbach M., Mitchell C.P., Stampfl P., Smith P. (2009b) Future energy potential of Miscanthus in Europe. GCB Bioenergy 1, 180–196

Heaton E.A., Clifton-Brown J., Voigt T.B., Jones M.B., Long S.P. (2004) Miscanthus for renewable energy generation: European Union experience and projections for Illinois. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change 9: 433–451

Heaton E.A., Dohleman F.C., Long S.P. (2008) Meeting US biofuel goals with less land: the potential of Miscanthus. Global Change Biology 14: 2000–2014

Heaton E.A., Dohleman F.C., Long S.P. (2009) Seasonal nitrogen dynamics of Miscanthus giganteus and Panicum virgatum. GCB Bioenergy 1: 297–307

Himken M., Lammel J., Neukirchen D., Czypionka-Krause U., Olfs H.-W. (1997) Cultivation of Miscanthus under West European conditions: Seasonal changes in dry matter production, nutrient uptake and remobilization. Plant and Soil 189: 117–126

Hodgson E.M., Fahmi R., Yates N., Barraclough T., Shield I., Allison G., Bridgwater A.V., Donnison I.S. (2010) Miscanthus as a feedstock for fast-pyrolysis: Does agro-nomic treatment affect quality? Bioresource Technology 101: 6185-619

Hoque M., Artz G., Hart Ch. (2014) Estimated cost of establishment and producti-on of Miscanthus in Iowa. Iowa State University, FM 1886, file A1-28

59

Huisman W., Venturi P., Molenaar J. (1997) Costs of supply chains of Miscanthus giganteus. Industrial Crops and Products 6: 353–366

Christian D.G., Riche A.B., Yates N.E. (2008) Growth, yield and mineral content of Miscanthus giganteus grown as a biofuel for 14 successive harvests. Industrial Crops and Products 28: 320–327

Jakobs-Schönwandt D., Lohse R., Patel A.V. (2013) Development of spray formula-tions for an endophytic Beauveria bassiana strain. In: Endophytes for plant protec-tion: the state of the art 156. Proceedings of the 5th International Symposium on Plant Protection and Plant Health in Europe, Held at the Faculty of Agriculture and Horticulture (LGF), Humboldt University Berlin, Berlin-Dahlem, Germany, 26-29

Jezowski S., Glowacka K., Kaczmarek Z. (2011) Variation on biomass yield and morphological traits of energy grasses from the genus Miscanthus during the first years of crop establishment. Biomass & Bioenergy 35: 814–821

John J. (2016) Global Biostimulants Market will reach USD 2.81 Billion in 2021: By Active Ingredient, Application, Products and Region. Dostupné online: https://globenewswire.com/news-release/2016/10/24/882054/0/en/Global-Biostimu-lants-Market-will-reach-USD-2-81-Billion-in-2021-By-Active-Ingredient-Applicati-on-Products-and-Region.html

Johnston-Monje D., Raizada M.N. (2011) Plant and endophyte relationships: Nutrient management. In: Murray Moo-Young (ed.), Comprehensive Biotechnology, Second Edition, 4: 713–727

Jørgensen U., Muhs H.J. (2001) Miscanthus Breeding and improvement. In Misca-nthus: For Energy and Fibre (eds.) Jones M.B. & Walsh M., Earthscan, London, ISBN: 978-1-84971-097-8

60

Ju H.-J., Hill N.S., Abbott T., Ingram K.T. (2006) Temperature Influences on Endo-phyte Growth in Tall Fescue. Crop Science 46: 404-412

Kahle P., Beuch S., Boelcke B., Leinweber P., Schulten H.R. (2001) Cropping of Miscanthus in Central Europe: biomass production and influence on nutrients and soil organic matter. European Journal of Agronomy 15: 171–184

Kannadan S., Rudgers J.A. (2008) Endophyte symbiosis benefits a rare grass under low water availability. Functional Ecology 22: 1365-2435

Keoleian G.A., Volk T.A. (2005) Renewable energy from willow biomass crops: Life cycle energy, environmental and economic performance. Critical Reviews in Plant Sciences 24: 385-406

Khanna M., Dhungana B., Clifton-Brown J. (2008) Costs of producing miscanthus and switchgrass for bioenergy in Illinois. Biomass and Bioenergy 32: 482–493

Kiesel A., Lewandowski I. (2016) Miscanthus as biogas substrate – cutting to-lerance and potential for anaerobic digestion. GCB Bioenergy, doi: 10.1111/gcbb.12330

Kirchhof G., Reis W.M., Baldani J.I., Eckert B., Dobereiner J., Hartmann A. (1997) Occurrence, physiological and molecular analysis of endophytic diazotrophic bac-teria in gramineous energy plants. Plant and Soil 194: 45–55

Koulman A., Lee T.V., Fraser K., Johnson L., Arcus V., Lott J.S., Rasmussen S., Lane G. (2012). Identification of extracellular siderophores and a related peptide from the endophytic fungus Epichloë festucae in culture and endophyte-infected Lolium perenne. Phytochemistry 75: 128–139

61

Knapp D.G., Pintye A., Kovács G.M. (2012) The dark side is not fastidious – dark septate endophytic fungi of native and invasive plants of semiarid sandy areas. PLoS ONE 7(2): e32570. doi:10.1371/journal.pone.0032570

Kuffner M., De Maria S., Puschenreiter M. a kol. (2010) Culturable bacteria from Zn- and Cd-accumulating Salix caprea with differential effects on plant growth and heavy metal availability. Journal of Applied Microbiology 108: 1471-1484

Larsen S.U., Jørgensen U., Kjeldsen J.B., Lærke P.E. (2014) Long-term Miscanthus yields influenced by location, genotype, row distance, fertilization and harvest sea-son. BioEnergy Research 7:620–635

Latchs G.C.M., Christensen M.J. (1985) Artificial infection of grasses with endo-phytes. Annals of Applied Biology 107: 17-24

Le Ngoc Huyen T., Rémond C., Dheilly R.M., Chabbert B. (2010) Effect of harves-ting date on the composition and saccharification of Miscanthus giganteus. Biore-source Technology 101: 8224–8231

Lewandowski I., Clifton-Brown J.C., Scurlock J.M.O., Huisman W. (2000) Misca-nthus: European experience with a novel energy crop. Biomass and Bioenergy 19:209–227

Li T., Liu M.J., Zhang X.T., Zhang H.B., Sha T., Zhao Z.W. (2011) Improved toleran-ce of maize (Zea mays L.) to heavy metals by colonization of a dark septate endo-phyte (DSE) Exophiala pisciphila. Science of the Total Environment 409: 1069–107

Li X., Grey T.L., Blanchett B.H., Lee R.D., Webster T.M., Vencill W.K. (2013) Tole-rance Evaluation of Vegetatively Established Miscanthus × giganteus to Herbicides. Weed Technology 27: 735-740

62

Malinowski D.P., Belesky D.P. (1999) Neotyphodium coenophialum endophyte in-fection affects the ability of tall fescue to use sparingly available phosphorus. Jour-nal of Plant Nutrition 22: 835-853

Mandyam K., Fox C., Jumpponen A. (2012) Septate endophyte colonization and host responses of grasses and forbs native to a tallgrass prairie. Mycorrhiza 22: 109-119

Mann J.J., Barney J.N., Kyser G.B., Di Tomaso J.M. (2013) Miscanthus × giganteus and Arundo donax shoot and rhizome tolerance of extreme moisture stress. GCB Bioenergy 5: 693–700

Mayerhofer M., Kernaghan G., Harper K. (2013) The effects of fungal root endo-phytes on plant growth: a meta-analysis. Mycorrhiza 23: 119-128

Miguez F.E., Zhu X., Humphries S., Bollero G.A., Long S.P. (2009) A semimecha-nistic model predicting the growth and production of the bioenergy crop Misca-nthus x giganteus: description, parameterization and validation. GCB Bioenergy 1: 282–296

O’Hanlon K.A., Knorr K., Jørgensen L.N., Nicolaisen M., Boelt B. (2012) Exploring the potential of symbiotic fungal endophytes in cereal disease suppression. Biolo-gical Control 63: 69-78

Ondráčková E., Michal O., Both Z., Nestrsta M., Prokinová E. (2014) Metodika biologické ochrany rostlin s využitím hub rodu Clonostachys. AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby, s. r. o.; Šumperk; ISBN 978-80-87360-32-3

Peixoto M. de Melo, Friesen P.C., Sage R.F. (2015) Winter cold-tolerance thre-sholds in field-grown Miscanthus hybrid rhizomes. Journal of Experimental Botany (first on-line) doi: 10.1093/jxb/erv093

63

Porras-Alfaro A., Bayman P. (2011) Hidden Fungi, Emergent Properties: Endo-phytes and Microbiomes. Annual Review of Phytopathology 49: 291-315

Purdy S.J., Maddison A.L., Jones L.E., Webster R.J., Andralojc J., Donnison I., Cli-fton-Brown J. (2013). Characterization of chilling-shock responses in four genoty-pes of Miscanthus reveals the superior tolerance of M. × giganteus compared with M. sinensis and M. sacchariflorus. Annals of Botany 111: 999–1013

Purdy S.J., Cunniff J., Maddison A.L., Jones L.E., Barraclough T., Castle M., Da-vey C.L., Jones C.M., Shield I., Gallagher J., Donnison I., Clifton-Brown J. (2015) Seasonal Carbohydrate Dynamics and Climatic Regulation of Senescence in the Perennial Grass, Miscanthus. BioEnergy Research 8: 28-41 doi:10.1007/s12155-014-9500-2

Richter G.M., Riche A.B., Dailey A.G., Gezan S.A., Powlson DS. (2008) Is UK bio-fuel supply from Miscanthus water-limited? Soil Use and Management 24: 235–245

Rodriguez R.J., White J.F. Jr., Arnold A.E., Redman R.S. (2009) Fungal endophytes: diversity and functional roles. New Phytologist 182: 314-330

Rothballer M., Eckert B., Schmid M., Fekete A., Schloter M., Lehner A., Pollmann S., Hartmann A. (2008): Endophytic root colonization of gramineous plants by Her-baspirillum frisingense. FEMS Microbiology and Ecology 66: 85–95

Rosenblueth M., Martínez-Romero E. (2006) Bacterial Endophytes and Their Inte-ractions with Hosts. MPMI 19: 827-837

Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N. (2008) Bacterial en-dophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiology Letters 278: 1-9

64

Saha S. (2015) Biostimulants Market to Expand at 10.9% CAGR between 2015 and 2025: Report. Dostupné on-line: https://globenewswire.com/news-relea-se/2015/10/05/773428/10151648/en/Biostimulants-Market-to-Expand-at-10-9-CAGR-between-2015-and-2025-Report.html

Scurlock J.M.O. (1999) Miscanthus: A review of European experience with a novel energy crop. Environmental Sciences Division Publication No. 4845, Prepared for the U.S. Department of Energy, pp 1-18

Schnepf R., Yacobucci B.D. (2013) Renewable Fuel Standard (RFS): Overview and Issues. CRS Report for Congress. 1-35. Dostupné on-line: http://www.ifdaonline.org/IFDA/media/IFDA/GR/CRS-RFS-Overview-Issues.pdf

Sieber T.N. (2007) Endophytic fungi in forest trees: are they mutualists? Fungal Biology Reviews 21: 75-89

Smith R., Slater F.M. (2010) The effects of organic and inorganic fertilizer appli-cations to Miscanthus × giganteus, Arundo donax and Phalaris arundinacea, when grown as energy crops in Wales, UK. GCB Bioenergy 2: 169–179

Spyreas G., Gibson D.J., Middleton B.A. (2001) Effects of endophyte infection in tall fescue (Festuca arundinacea: Poaceae) on community diversity. International Journal of Plant Science 162: 1237-1245. DOI: 10.1086/323274

Strašil Z. (2009) Základy pěstování a možnosti využití ozdobnice (Miscanthus) Me-todika pro praxi. Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i., ISBN 978-80-7427-006-2

Strašil Z., Moudrý J. (2011) Porovnání chrastice rákosovité (Phalaris arundinacea L.) a ozdobnice (Miscanthus) z produkčního hlediska. Acta Pruhoniciana 97:5-11

65

Strašil Z., Kohoutek A., Diviš J., Kajan M., Moudrý J., Moudrý J. jr. (2011) Trá-vy jako energetická surovina. Certifikovaná metodika, ISBN: 978-80-7427-078-9

Straub D., Rothballer M., Hartmann A., Ludewig U.(2013): The geonome of the en-dophytic bacterium H. frisingense GSF30T identifies diverse strategies in the Her-baspirillium genus to interact with plants. Frontiers in Microbiology 4 (168): 1-10

Terravesta (2013) The Essential Growers Guide Issue 3. pp 1-14. Dostupné on-li-ne: http://www.terravesta.com/Downloads#part2

Unterseher M., Schnittler M. (2009) Dilution-to-extinction cultivation of leaf-inha-biting endophytic fungi in beech (Fagus sylvatica L.) – Different cultivation tech-niques influence fungal biodiversity assessment. Mycological Research 113: 645-654

Veselý P. (2014) Ekonomické aspekty pěstování energetických rostlin. Bakalářská práce. JČU, České Budějovice, str. 1-54

Waller F., Achatz B, Baltruschat H., Fodor J., Becker K., Fischer M., Heier T., Hüc-kelhoven R., Neumann C., von Wettstein D., Franken P., Kogel K.-H. (2005) The endophytic fungus Piriformospora indica reprograms barley to salt-stress toleran-ce, disease resistance, and higher yield. PNAS 102: 13386–13391

Walsh M., McCarthy S. (1998) Miscanthus handbook, pp. 1071-1074. In Biomass for Energy and Industry, Proceedings of the 10th European Bioenergy Conference, Würzburg, Germany, C.A.R.M.E.N. Publishers, Rimpar, Germany

Weger J., Strašil Z., Hutla P. (2011) Produkční a energetické vlastnosti ozdobni-ce (Miscanthus sp.) pěstované v podmínkách České Republiky. Acta Pruhoniciana 97:13-26

66

Wille P., Boller T., Kaltz O (2002) Mixed inoculation alters infection success of stra-ins of the endophyte Epichloë bromicola on its grass host Bromus erectus. Procee-dings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences 269: 397-402

Williams M.J., Douglas J. (2011) Planting and Managing Giant Miscanthus as a Biomass Energy Crop. USDA NRCS Technical Note No. 4, pp. 1-22

Wang D., Maughan M.W., Sun J., Feng X., Miguez F., Lee D., Dietze M.C. (2012) Impact of nitrogen allocation on growth and photosynthesis of Miscanthus (Misca-nthus × giganteus). GCB Bioenergy 4: 688–697

Wong M. K. M., Hyde K. D. (2001): Diversity of fungi on six species of Grami-neae and one species of Cyperaceae in Hong Kong. – Mycological Research 105(12):1485-1491

Zinniel D.K., Lambrecht P., Harris N.B. a kol. (2002) Isolation and characteriza-tion of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology 68: 2198 – 2208

67

Účinná látka Přípravek Dávka Poznámka

atrazin Gesaprim 2,5 l/hav EU od  r. 2005 zakázán,  jako náhrada doporučen acetochlor, avšak ten byl v r. 2012 také zakázán

bromoxynil/ ioxynil Briotril 2,5 l/ha v ČR registrovány přípravky Bromotril, Bromoterb, Zeagran a další

clopyralid(100 g/l účinné látky) 2,4 l/ha

v ČR registrovány přípravky Clopyralid, BEC Clopyr, Clap, Kobra, Lontrel a další

dicamba 0,56 kg/ha v ČR registrovány přípravky Banvel, Cadence, Oceal a další

dichlorprop(667g/l účinné látky) 5 l/ha

v  ČR  registrován  pouze  ve  směsi  s  MCPA  a  Mekoprop-P  pod názvem Optica Trio

diflufenican/ isoproturon

(100:500 g/l účinné látky) 3 l/ha

v ČR  registrován na bázi  těchto dvou účinných  látek přípravek Legato plus

fluroxypyr Starane 2,0 l/ha v ČR registrovány přípravky Fluxyr, Nestor, Starane a další

halosulfuron 0,035 kg/ha v ČR momentálně neregistrován

isoproturon Tolkan 4,0 l/ha v ČR registrovány přípravky Arelon Flussig, Calipuron a další

MCPA Trifolex-Tra(750 g/l účinné látky) 5,0 l/ha

v ČR registrovány přípravky Agri MCPA, Agritox, Aminex, Dicopur, U 46 M-Fluid a další

MCPA + MCPB 7,7 l/ha MCPB registrován pro ČR v přípravcích Butoxone

mecoprop-P Duplosan 6,0 l/ha v ČR registrovány přípravky CZ-600, Duplosan KV, Optica a další

metsulfuron-methyl Ally  30 g/ha v ČR registrovány přípravky Ally SX, Pike, Savvy a další

metsulfuron-methyl + bromoxynil/ ioxynil (tank-mix)

Ally + Deloxil 30 g/ha + 1,0 l/ha

metsulfuron-methyl + fluroxypyr (tank-mix)

Ally+ Starane 20 g/ha + 0,5 l/ha

Příloha

Příloha 1. Seznam herbicidů, které byly úspěšně použity pro kontrolu plevelů v ozdobnici včetně použitých přípravků a dávek (zkompilováno dle DEFRA, Everman a kol. 2011, Strašil 2009). Aktuální povolené přípravky v ČR na bázi uvedených účinných látek doporučujeme vyhledat v registru přípravků na ochranu rostlin (na webových stránkách ÚKZUZ).