LIDSKÝ GENOM

Struktura genomu člověka

Sekvenování lidského genomuNational Human Genome Research Institute (NHGRI), NIHHuman Genome Project (HGP)1990-2003, pětileté plány

• Velikost genomu ~ 3 164 700 kb• Počet genů ~ 20-25 000• Velikost průměrného genu ~ 3000bp• Téměř všechny báze jsou stejné (~99.9%) u všech lidí• Funkce u více než 50% genů není známá• Méně než 2% genomu kóduje proteiny• 50% genomu tvoří repetice• Během posledních 50 mil let silný pokles aktivity TE• Genově bohaté oblasti jsou GC-bohaté, repetice AT-bohaté• Náhodná distribuce genově-bohatých oblastí, oddělené repeticemi• Chrom.1 má nejvíce genů (2968) a chrom. Y nejméně (231)

Srovnání lidského genomu s genomy jiných organizmů

•Genové ostrovy u člověka versus homogenní distribuce genů u jiných organizmů•3x více proteinů než D.m. nebo C.e. díky alternativnímu sestřihu (35-60% genů)•Stejné genové rodiny jako u D.m., C.e., rostlin, ale počet členů rodin expandoval•Větší podíl repeticí – C.e. (7%), D.m. (3%), A.t. (11%)

Lidský genom

Lidský jaderný genom (projekt HUGO Human Genome Organization, založen 1990)Publikace 2001, zpřesnění 2004, 2006.

25,2 % geny (1,2% exony, 24% introny); 22 287 genů kódujících proteiny

(odhad z roku 2004, dnes okolo 21 000 genů)

21-22% mezigenová DNA (heterochromatin, regulační sekvence, pseudogeny, genové fragmenty)

50% genomu jsou repetitivní sekvence (tandemové x disperzní; vysoce x středně repetitivní)

Tandemové: centromery – satelitní DNA, telomery, mikrosatelity, minisatelity, rDNA klastry…)Disperzní: většina transponovatelných elementů - 45% genomu.

Mezinárodní Konsorcium, 2001

Celera Genomics (Venter), 2001

Lidský genomLidský mitochondriální genom

16,6 kbp, 37 genů22 genů pro rRNA, 2 pro tRNA, 13 pro proteiny dýchacího řetězce (ty jsou syntetizovány na mitochondriálních ribozomech, zbytek je kódován v jádře, syntetizován na ribozomech v cytosolu a pak exportován do mitochondrií)- Původ mitochondrií z α – proteobakterií (Ricketsia) - endosymbióza 

Lidský genom Dnes podle ENSEMBL: http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable?db=core

Databáze sekvencí DNA1)GenBank (USA)– dnes provozována Národním centrem pro biotechnologické informace (NCBI = National Center for Biotechnology Information), která je součástí Národní lékařské knihovny (NLM = National Library of Medicine); www.ncbi.nih.gov 2)EMBL (European Molecular Biology Laboratory)3)DDBJ (DNA DataBank of Japan)

Dnes propojeny dohromady všechny; v databázích se dají hledat sekvence podobné zadaným sekvencím (BLAST = Basic Local Alignment Search Tool)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes/

Další typické vlastnosti lidského genomu

Expanze genových rodin a rozdíly v negenových oblastech

RNA nekódující proteiny:- mnoho transkriptů nekódujících proteiny a s neznámou funkcí- „transfrags“ – transkribované fragmenty genů, role v reorganizaci chromatinu nebo regulace dostupnosti polymeráz či TF, role antisense transkriptů v regulaci genové exprese- přes 1000 miRNAs

Ultrakonzervativní elementy:- 481 UCEs delších 200bp, 100% identita mezi člověkem, myší a potkanem- UCE jsou enhancery genů (někdy homologie s TE)

Genomová struktura:- nepotvrzena opakovaná polyploidizace v historii, 45% repeticí, duplikace

Lidský chromosom Y

Sál plný zrcadelPAR1 PAR2

Palindromy:• 3 000 000 bází dlouhé• 99.9% identita

Homologní oblasti mezi X a Y

Duplikativní přenos z X

Palindromy

Genom člověka a šimpanze

• speciace ~ 6.3 mil• následné křížení• větší podobnost chromosomu X

1.23% rozdíl

• Genové duplikace• Expanze transposonů• Mutace• Posttranskripční a translační modifikace• Odlišné používání genů (alternativní promotory a alternativní sestřih) Chromosom Y člověka a

šimpanzerozdíly v amplikonových oblastech

Genom má mozaikovitou strukturu Některé oblasti bližší šimpanzovi, jiné gorile

38-50 mil let - vznik retrogenů v linii primátů- role ve spermatogenezi

člověk myš

•Od evoluční divergence proběhly četné přestavby, které umístily bloky genů do různých kombinací.

•Konzervativita chromosomu X.

Genom člověka a myši

Gen „Metuzalém“

Mutace jednoho z genů skupiny daf, a to daf-2, 6x delší život u červa C. elegans.

Dystrofinový gen

79 exonů, nejdelší známý gen, 14kb mRNA2.5 Mb dlouhý (0.1% genomu)

Gen mth (methuselah), kromě dlouhověkosti, dává svému nositeli také zvýšenou odolnost vůči různým formám stresu. Gen kóduje G protein vázající receptor a ten se účastní při řízení metabolických pochodů, příjmu potravy, tělesné hmotnosti, výdeje energie, řízení cyklu spánku a bdění,…

FOXP2 – důležitý lidský gen

- důležitý pro rozvoj řeči, mutace v rodinách s poruchou řeči- souvislost s chápáním pojmů, gramatika, kreativita, kultura- existuje i u jiných živočichů - nová lidská forma vznikla před 200 000 let- délka 14 063 bp- divergenece od šimpanze 0.87%, orangutana 2.5%- lidská forma přítomná u Neandertálce

(forkhead box P2)

BUDOUCNOST

VÝZKUMU LIDSKÉHO

GENOMU

Variabilita a mutace- 99.9% identita mezi jedinci- 1.4 milionů polymorfních míst (SNP) – vazba na choroby- 2x více mutací v zárodečné linii muže než ženy

Budoucnost •Transkriptomika – exprese genů, za různých podmínek•Proteomika – exprese a funkce proteinů, dopady pro design léčiv•Komparativní genomika – srovnání s jinými organizmy•Polymorfismus mezi jedinci (genetic variation program)•ELSI – (ethical, legal and social implications) – 10 mil $ /rok•Zdraví, společnost, vzdělávání …

Rozdíly mezi jedinci

Comparative genomic hybridization (CGH)

Farmakogenomika

Studuje, jak varianty v lidském genomu ovlivňují odpověď na léčbu.

Umožní vytvářet léky „na míru“ podle znalosti konkrétního genomu

pacienta. Minimalizují se tak nežádoucí vedlejší účinky.

Farmakogenomikaa personální medicína

Nyní

Design léků na průměrného pacienta, masová výroba. Ale „jeden

klobouk nesedí na každé hlavě“.

Pomalá metabolizace (vedlejší účinky) x rychlá metabolizace

(žádné účinky).

Vedlejší účinky léků (adverse drug reactions, ADR): > 2mil

případů, 100 000 úmrtí v USA (rok 1994).

Farmakogenomikaa personální medicína

Potom

Farmakogenomika, test v dětství, dědičné varianty v genech určují reakci na léky.Single nucleotide polymorphism (SNP, snips) – genetické varianty, katalogizace, anotace, dbSNP, microarray data.DNA čipy – screening 200 000 SNPů/několik hodin (200$) výběr léků.Levnější - klinické testy na menších skupinách, pacient se nevrací k lékaři pro další léky na vyzkoušení kvůli žádnému efektu nebo nežádoucím účinkům.

Etické otázky

Léky na míru (tailor-made drugs) dražší, nezájem farmaceutických

firem (menší objemy výroby).

Neochota pojišťoven platit za lidi s genetickými testy indikující

potřebu drahých léků na míru.

Prohloubení propasti mezi rozvinutým a rozvojovým světem.

Dostupnost všem?

DNA čipy(DNA chips, DNA microarrays)

Pomocí DNA čipů lze určit, které varianty genů/sekvencí DNA člověk obsahuje a podle toho zacílit léčbu.

Genová terapie

Genová terapie je rychle se rozvíjející obor medicíny, kdy jsou

geny zaváděny do těla (genomu) jedince s cílem vyléčit nemoc.

Dědičné nemoci

•jeden gen (srpková anémie, barvoslepost)

•polygenní (většina nemocí – diabetes, epilepsie, astma,

maniodepresivní choroba, schizofrenie)

• škodlivý gen recesivní (cystická fibróza), dominantní

(Huntingtonova chorea), na chromosomu X (hemofilie)

Genová terapie

PODMÍNKY ÚSPĚCHU

- dobré pochopení problému, identifikace genu- metoda vnesení, typ buněk, vektor (viry), stabilní integrace- opravovány jen geny v somatických buňkách, nahrazen špatný gen nebo vnesen nový gen s funkcí vyléčit nemoc.

Možnosti genové terapie

U velkého množství geneticky podmíněných chorob známe

příčinu (tj. mutaci konkrétního genu - genů), ovšem tuto příčinu

nejsme v současné době schopni vyléčit –

neexistence kauzální terapie.

Současná medicína nabízí mnoho možností symptomatické

léčby, kdy se snažíme různými způsoby zlepšit průběh nemoci.

Tato léčba však neléčí samotnou podstatu choroby, pacient je na

této léčbě často závislý po celý život.

Symptomatická léčba zahrnuje

Dodání chybějícího enzymu u enzymopatií.

Dodání jiných chybějících látek (substrátů, proteinů...).

Vyvarování se substrátu, který nelze správně metabolizovat (speciální diety).

Chirurgické zákroky.

Farmakologické ovlivnění narušených fyziologických procesů.

Farmakologické zlepšení kvality života.

Jiné ovlivnění fyziologických procesů nebo kvality života (přístroje,

pomůcky).

Transplantace chorobou poškozeného orgánu.

Během posledních let dochází k prudkému rozvoji molekulární

biologie. Na přečtení lidského genomu navazují pokroky v proteomice

a farmakogenomice. Nové znalosti umožňují nejen zlepšovat stávající

léčebné postupy, ale dávají i naději do budoucna, kdy snad budeme

schopni léčit přímo příčinu dědičných onemocnění.

Genová terapie bude v budoucnosti možná léčit i většinu

nádorových onemocnění.

Genová terapie

vpravení genetické informace do buněk za účelem léčebného

účinku.

U některých pacientů byla již genová terapie úspěšně použita (jako

první určité typy těžkých imunodeficitů), stále jde o experimenty, které

s sebou mohou nést řadu vedlejších efektů.

Experiment (Cavazzana-Calvo, 2000):

léčba imunodeficience způsobené mutací genu na

chromosomu X, děti uzdraveny.

ALE

2 z 10 dětí onemocněly leukémií, virový vektor

aktivoval onkogen!!!

Podmínky pro zahájení genové terapie

1/ Musíme znát přesnou příčinu genetické choroby, tj. znát přesný gen/y,

umístění, povahu produktu.

2/ Mechanizmus patologického účinku. Patologicky totiž může působit jak

deficit normálního genového produktu, tak i pozměněný produkt mutovaného

genu.

3/ Znalost přesné sekvence zdravého genu. Pro současnou experimentální

genovou terapii jsou vybírány choroby, pro které jiná léčba neexistuje a které

mají velmi těžký, často letální průběh.

Správná strategie genové terapie

1/ Pokud je patologický nedostatek genového produktu, stačí dodatečné

zařazení nemutovaného genu kamkoliv do genomu příslušných buněk.

2/ Pokud patologicky působí pozměněný produkt mutovaného genu, je

nutné buď opravit mutovaný gen, tj. pravá kauzální terapie - odstranění

příčiny, nebo zablokovat tento gen (odstranění genu, zamezení

transkripce...). S tím souvisí i zajištění fyziologické aktivity tohoto genu, tj.

posílení nebo utlumení transkripce, je-li potřeba.

3/ Volba vhodného vektoru (nosiče) a vytipování cílových buněk genové

terapie.

S ohledem na jistou kontroverznost této terapie je třeba

provádět genovou terapii pouze pokud je úspěšně

otestována a schválena k použití.

K podstoupení experimentální terapie je vždy potřeba

souhlas pacienta či jeho zákonného zástupce. Pro užití

genové terapie budou v budoucnosti pravděpodobně přijaty

zákonné i podzákonné normy.

Provedení genové terapie zahrnuje

1/ Vytvoření genetické informace metodami rekombinantní DNA,

která je určená pro transport do buněk.

2/ Vytipování buněk, do kterých bude upravená genetická informace

vnesena. Genová terapie se může provádět jak in vivo, kdy jsou cílové

buňky po celou dobu součástí organismu, tak in vitro, kdy jsou cílové

buňky z těla organismu nejprve odebrány a po provedení genové

terapie opět vráceny na své místo v organismu.

Provedení genové terapie zahrnuje

3/ Výběr vhodného vektoru (nosiče), který bude použit pro vpravení genetické

informace do cílových buněk.

Řada možností - mechanické metody (mikrojehly), chemické či fyzikální metody

(specifickým způsobem umožní průnik gen. informace cytoplazmatickou

membránou), samotná DNA či DNA v komplexech s různými molekulami. V

současnosti se však nejvíce využívá virových vektorů, zejména adenovirů a

retrovirů, které mají schopnost inzerce své gen. informace do genomu hostitelské

buňky. Do virových kapsid je zabudována terapeutická gen. informace, virová

gen. inf. je odstraněna a virové vektory jsou aplikovány.

Po provedení genové terapie je třeba pacientův stav pečlivě monitorovat a všímat

si jak zlepšování zdravotního stavu, tak i nástupu případných komplikací.

Schéma provedení genové terapie s adenovirovým vektorem

Problémy (nevýhody) genové terapieVýhody genové terapie jsou nesporné. Existují však i stinné stránky této metody

(současný stav, je snaha tyto negativa zmírnit či eliminovat).

1/ Velmi vysoká finanční náročnost takovéto terapie.

2/ Technická a technologická náročnost.

3/ Nízká úspěšnost terapie, pokud jsou problémy s "uchycením" vnášené

genetické informace.

4/ Při použití virových vektorů je genetická informace do genomu vložena

víceméně náhodně. Vnesený gen tak může narušit sekvenci jiného genu.

Narušení protoonkogenu nebo tumor-supresorového genu může spustit

maligní transformaci buňky!

5/ Genová terapie je eticky problematická.

Budoucnost

Genová terapie by mohla nejen zachraňovat životy pacientům s

těžkými genetickými chorobami či rakovinou.

Mohla by zpříjemnit život mnoha dalším lidem, jejichž choroba

sice není natolik závažná, ale stejně jsou odkázáni na podpůrnou

terapii.

Budoucnost

Bude však potřeba přesně vymezit hranici mezi tím, na co je ještě

etické genovou terapii použít a na co již ne.

Budou v budoucnosti "děti na objednávku"? Budeme si moc určit

barvu očí, vlasů či výšku našich dětí? Pokud budeme umět vytvářet

děti bez genetických chorob - nemohly by tyto děti být také fyzicky

zdatnější?

Dočkáme se éry superlidí?

Odpověď nám dá až budoucnost.

Nesmíme dopustit, aby se z genové terapie stal takový obchod,

jakým je dnes třeba plastická chirurgie.

Vylepšení genomu na objednávku a jen pro majetné by bylo

vyložené pošlapání současných nadějí.

DNA vakcinace

DNA vakcinace je ochrana proti nemocem (viry, bakterie, paraziti)

pomocí geneticky upravených molekul DNA s cílem vyvolat

imunitní odpověď.

Vakcíny

První generace – oslabené formy celých organizmů.

Druhá generace – definované proteinové antigeny (i rekombinantní).

Třetí generace – upravené plasmidové DNA, které produkují

specifické proteiny.

Metody vnášení DNA do organizmu

Injekce do svalů nebo do kůže - trvalá nebo dlouhodobá exprese, rychlé rozšíření po těle, nevýhodou velké množství potřebné DNA (10μg-1mg)

Genové dělo – bombardování buněk částicemi zlata nebo wolframu, stačí malé množství DNA (0.2-20μg), avšak potřeba inertní částice

Tlaková injekce - několik mm pod kůži, větší množství DNA (300μg), bez částic, DNA se rozbíjí, nižší exprese a imunitní odpověď.

Další metoda - nanesení aerosolu na sliznice.

Množství vnášené DNA je 10x menší u myši než u primátů.Metoda má vliv na to, jaký typ buněk se aktivuje – T-buňky (TH1, TH2), T-killer, T-helper, protilátky.

Projekt „osobního genomu“(personal genome project, PGP)

Projekt osobního genomu

• Sekvenace 100 000 dobrovolníků (1% genomu bohatou na geny)• Hledání korelace mezi genetickými a tělesnými vlastnostmi• Cílem cena do 1000 USD během několika let (faktory: čas, technologie, cena)• Axiomy: automatizace práce + otevřenost dat• Předpokladem je vývoj novějších technologií sekvenování: 454 Life Sciences, Solexa (Illumina), SOLiD (Applied Biosystems), aj.

Aspekty osobní genomiky

• Zdravotní hlediska• Rodokmen• Obavy ze zneužití (pojišťovny, zaměstnavatel, soudy, školy, agentury pro adopci, vláda, konkurence, zločinci)

ETICKÉ A PRÁVNÍ

ASPEKTY SEKVENACE

LIDSKÉHO GENOMU

Patentování genů

1790: „first patent act“

1889: rostliny, i uměle pěstované jsou produktem přírody a nelze je tudíž patentovat

(pokus patentovat vlákninu izolovanou z rostlin)

1930: lze patentovat nové odrůdy rostlin (kongres USA)

1948: spojování bakterií není objev, nelze patentovat (Nejvyšší soud USA)

1981: spor Diamond vs. Chakrabarty – umělá bakterie likvidující ropné skvrny -

geneticky modifikovaná (fúze), nepřítomná v přírodě

1996: Bermudská pravidla – sekvence genomů musí být volně dostupné

2005: zamítnut návrh na patent na lidskou chiméru, aby zabránili tvorbě hybridů

Patentovány geny, izolované úseky DNA samostatně neexistující v přírodě.

2005: přes 4 000 genů z ~24 000 je spojeno s patentem, např. firma Incyte vlastní

10% genů

Patentovatelný objev nebo nápad musí být umělý, ne zcela zřejmý, nový a užitečný.

Nelze patentovat zákony přírody.

Čtyři priority1. Poctivost (fairness) – svoboda od diskriminace na bázi genotypu2. Soukromí (privacy) – kontrola jedince nad svým genotypem, volba odhalení3. Poskytování zdravotní péče 4. Vzdělání (education)

PojišťovnyNutnost rovné hry, stejné informace, spravedlivá smlouva.Proč by pojišťovny nemohly znát / měly znát ??? kromě fenotypových i genotypové parametry?Obava pojištěnce že bude pojišťovna chtít jeho testy a zdraží pojistné.Obava pojišťovny že se pojištěnec dozví o budoucí nemoci a vysoce se pojistí.Např. Huntingtonova chorea, znát počet CAG repetic, pojišťovací hra možná, změna s časem.

ZaměstnavateléNapř. povolání s vysokými náklady na vyškolení, letový dispečer, pilot:- argument zaměstnavatele – chci znát riziko jeho infarktu, platím pojištění, bezpečnost- argument žadatele – nyní jsem zcela zdráv, nenesu vinu na predispozici.

Etické otázky související s PGP

Neudržitelnost rasismu

– větší diverzitra uvnitř skupin, než mezi skupinami- jedinečnost individua a universalita lidstva

Genový doping a „designed baby“

Dříve: Výběr vhodného partnera Nyní: Znalost lidského genomu + asistovaná reprodukce/PGD

vliv na vlastnosti dětí

Co je možné

Můžeme vybrat zdravá embrya?

Můžeme vybrat pohlaví.

Můžeme zlepšit vlastnosti dítěte (výšku, paměť)?

Čím se liší plastická chirurgie od genové změny?

Když investujeme do environmetálních faktorů (knihy, vzdělání, výchova), proč

neinvestovat do genetických faktorů?

Vznikne novodobá genetická aristokracie a třída genetických proletářů?

Klasický doping u sportovců je zakázaný, a co genový doping? Jak prokázat?

Budou rodiče odsuzování za narození postiženého dítěte?

Genový doping jen pro nejbohatší? Vznik nového darwinismu?

DNA databáze FBI(Combined DNA Indexing System = CODIS)

CODIS (1994 Kongres USA) - FBI databáze, obsahuje ~6 milionů

vzorků DNA, přibývá až 40 000 každý měsíc, dříve jen u

usvědčených zločinců, nyní širší záběr.

Forenzní laboratoře v USA - genetický fingerprint usvědčených

zločinců

Ministerstvo obrany USA – vzorky tkání vojáků pro pozdější

identifikaci pomocí DNA