Mgr. Eva FlodrováFN Brno,Oddělení lékařské genetikyLaboratoř molekulární diagnostiky

eflodrova@fnbrno.cz

• enzymy katalyzující oxidativní metabolické reakce xenobiotik• provádějí redukci C-, N-, S-, hydroxylaci, dealkylaci, dehalogenaci a

deaminaci molekul substrátů• jsou zahrnuty v oxidativním metabolismu exogenních i endogenních

molekul • v první fázi je oxidací přeměňují na elektrofilní meziprodukty, které

jsou dále enzymy druhé fáze konjugovány na hydrofilní deriváty vylučované močí

• jsou zapojeny v detoxikačních procesech hlavně v játrech, ale i jiných orgánech

• u člověka se jich náchází více jak 57 druhů

• enzym debrisoquin 4-hydroxyláza• patří mezi nejvíce studované biotransformační enzymy• aktivita enzymu se mezi jednotlivci liší• rozdíly v aktivitě CYP2D6 vedou k individuálním rozdílům

v terapeutické účinnosti léčiv

• zahrnut v metabolismu asi 100 léčiv• antidepresiva, antipsychotika, beta blokátory, antiarytmika

• Betablokátory: Trimepranol, Karvedilol, Timolol..• Antidepresiva: Paroxetin, Citalopram, Amitriptylin, Sertralin..• Antipsychotika: Haloperidol, Zotepin, Risperidon..• Inhibitory protonové pumpy: Omeprazol,Lansoprazol..• Antiepileptika: Fenobarbital, Fenytoin..• Cytostatika: Tamoxifen, Paklitaxel, Vinblastin, Cyklofosfamid..• Antihypertenziva: Chinidin, Propafenon, Kaptopril..• Ostatní: Indometacin, Kodein, Tramadol, Lidokain, Oxykodon..

• 45 kb • u člověka na dlouhém raménku chromozomu 22 (22q13.1)• skládá se ze tří homologních genů - CYP2D8P, CYP2D7P, CYP2D6

– CYP2D8P - pravý pseudogen – delece, inzerce, terminační kodony, nemáotevřený čtecí rámec

– CYP2D7P - sekvenční homologie je 97% s CYP2D6, obsahuje pouze jednu inaktivující mutaci, inzerci T138 v exonu 1 → mění čtecí rámec → předčasnou terminaci translace

• 9 exonů a 8 intronů• 4 378 bp• mRNA 1655 bp

• 4 hlavní skupiny - PM- pomalí metabolizátoři – žádná enzymová aktivita- IM- intermedierní metabolizátoři - snížená enzymová aktivita- EM - efektivní metabolizátoři - normální enzymová aktivita- UM - ultrarychlí metabolizátoři - extrémně zvýšená enzymová

aktivita

• UM 3-5%, EM 70-80%, IM 10-15%, PM 7-10%

Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004

• rozdílná metabolická aktivita enzymu mezi jedinci je dána polymorfismem v genu cyp2d6

• doposud popsáno více jak 100 alel• alely se stejnou klíčovou mutací se označují číslem (např. *6)• písmeny se rozlišují další varianty alel se stejnou klíčovou mutací,

ale různými doplňkovými mutacemi s minoritním funkčním významem (např. *6A, *6B, *6C, *6D)

• nejčastější jsou alely *1, *2, *4, *5, *10, *17 a *41 • CYP2D6*1 je alela se standardní sekvencí genu stejně jako další

alely(*2, *33, *35) kóduje protein s normální enzymatickou funkcí

• gen CYP2D6 má značnou interetnickou variabilitu

• Nulové alely CYP2D6*0- kódují nefunkční protein- v homozygotním stavu způsobují fenotyp pomalého metabolizátora

bodové mutace (alely *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42)velké chromozomové delece (alely *5, *13, *16)mutace vedoucí ke ztrátě f-ce proteinu, ale délka zachována (alely *7, *12, *14,

*18)- alela *4 (12-21%) v kavkazské populaci nejčastější nulová alela -1846G>A- alela *5 (2-7%) dochází ke ztrátě celého genu CYP2D6- alely *13 a *16 - 5´-CYP2D7P/CYP2D6-3´ hybridní geny, vznik delecí

různých částí lokusu CYP2D

• Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí

• Nulové alely

• Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí• kódují enzym s redukovanou aktivitou• v homozygotním stavu nebo spolu s nulovou alelou

v heterozygotním stavu způsobují fenotyp IM• např. CYP2D6*9, *10, *17, *36, *41

*10 (50-70% asiaté, 1-5% kavkazská populace) 100C>T (naruší místo nezbytné pro sbalení proteinu → enzym je velmi nestabilní a másníženou afinitu k substrátu)

• Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí

• Nulové alely CYP2D6*0• Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí

• Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí

- zvýšený počet aktivních genových kopií- alely *1, 2*,35*- frekvence genové duplikace je v kavkazské populaci 1-5%

• in vivo

- metabolické schopnosti jedince se zjišťují po podání testovacílátky (substráty pro CYP2D6 – dextrometorfan, spartein) na základětzv. metabolického poměru (MR)

- v ČR se MR definuje jako poměr koncentrace podaného léku (dextrometorfan) ke koncentraci jeho metabolitů (dextrorfan), kterése objeví v moči během určité doby od podání testovací látky

- koncentrace se stanovuje pomocí chromatografických metod

• molekulárně genetická detekce alel cyp2d6

- metody analýzy délky restrikčních fragmentů (Skoda, 1988)- vyhledávací metody jednovláknového konformačníhopolymorfismu (Broly, 1995)

- alelově specifická polymerázová řetězová reakce (Daly, 1995)- syntéza dlouhých úseků - long-PCR (Sachse, Daly,Løvlie, Panserat )- real-time PCR (Stamer, 2002)- kvantitativní metody s TaqManovými sondami (Bodin, Beaune, Loriot )- přímá sekvenace (James, 2004) - SNaPshot™ (Sistonen, 2005)- AmpliChip CYP450 (Roche, Affymetrix, 2004)

• variabilita v aktivitě CYP2D6 vede k individuálním rozdílům v terapeutické účinnosti léčiv

• PM nejsou schopni metabolizovat substráty CYP2D6 → při běžněpodávané dávce mají ve srovnání s EM vyšší koncentrace léku v plasmě

→ zvýšené riziko předávkování→ výskyt vedlejších efektů.

• UM je koncentrace léku v plasmě mnohem nižší než je terapeuticky účinná koncentrace → nedochází k žádné terapeutické odpovědi

• klinický význam polymorfismu pro konkrétní léky není vždy jasný a závisí na několika faktorech

• Psychiatrie- 50% běžně užívaných antipsychotik- 50% antidepresiv – vedlejší účinky u PM- schizofrenie

• Léčba rakoviny- tamoxifen → N-desmethyltamoxifen → endoxifen (antiestrogenníaktivita)

• Molekulární epidemiologie- PM jsou delší dobu vystaveni toxickým efektům přijatých sloučenin nežEM → náchylnější ke vzniku rakoviny

- naopak při metabolické aktivaci prokarcinogenů jsou většímu rizikuvystaveni EM a UM

• Kardiovaskulární onemocnění

• dlouhodobá mezioborová spolupráce

• optimalizace stávajících metod detekce mutací- zavedení metody Real-Time PCR pro rychlou detekci PM- kvantifikace CYP2D6 genu – detekce delecí a duplikací (Müller, Zöpf, 2003)

• výzkumné účely• vyšetření při neadekvátní odpovědi na léčbu (nedostatečná odpověď

– UM, špatná snášenlivost – PM)

• => individuální dávkování léčiv ??

• Frekvence 7-10% v kavkazské populaci• Žádná nebo velmi nízká aktivita enzymu p450→ zvýšené riziko předávkování→ výskyt vedlejších efektů

• *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *5, *13, *16, *7, *12, *14, *18

• Frekvence 7-10% v kavkazské populaci• Žádná nebo velmi nízká aktivita enzymu p450→ zvýšené riziko předávkování→ výskyt vedlejších efektů

• *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *5, *13, *16, *7, *12, *14, *18

4*1846 A>G6*T1707del8*1758G>T3* A2549del7*2935 A>C

3

4

1846 A>G

T1707del1758G>T

3

4

3

4

*6 *4

*8

6*T1707delTm=65.4°C

4*1846G>ATm=61.2°C

6*wtTm=71.5°C

4*wtTm=52.0°C

Filtr F2

8*1875G>TTm=63.0°C

8*wtTm=55.0°C

Filtr F3