MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ METODY...Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu...

VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO

FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE

Ústav hygieny a technologie mléka

MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ

METODY

MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.

Mgr. Marta Dušková, Ph.D.

MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.

doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

Mgr. Petra Myšková

BRNO 2014

1

Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost:

„Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a

kvalita potravin“

(reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287)

Obsah

2

OBSAH

1. KULTIVAČNÍ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) .............................................. 7

1.1. Vybrané komerční kultivační soupravy ........................................................... 8

1.2. Systém TEMPO .................................................................................................. 8

1.2.1. Základní principy ................................................................................................. 9

1.2.2. Provedení a vyhodnocení testu ............................................................................ 9

1.2.3. Výhody, nevýhody a využití metody TEMPO v praxi ........................................ 10

2. AUTOMATIZOVANÉ SYSTÉMY VYUŽÍVANÉ PŘI IDENTIFIKACI

MIKROORGANISMŮ (Mgr. Marta Dušková, Ph.D.) ..................................................... 11

2.1. Systém VITEK® (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ............................................................... 11


2.1.2. Výhody, nevýhody a využití systému VITEK® v praxi ....................................... 12

2.2. Systém Biolog ...................................................................................................... 12


2.2.2. Výhody, nevýhody a využití systému Biolog v praxi .......................................... 12

2.3. Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF ........................................................ 13 2.3.1. Základní principy ................................................................................................. 13

2.3.1.1. Příprava izolátů .................................................................................................... 14

2.3.2. Výhody a nevýhody metody MALDI-TOF MS .................................................. 15

2.3.3. Využití metody MALDI-TOF MS v praxi ........................................................... 15

2.4. Biosenzory ........................................................................................................... 15 2.4.1. Základní principy ................................................................................................. 15

2.4.1.1. Biorekogniční část ................................................................................................ 16

2.4.1.2. Fyzikálně-chemický převodník ............................................................................ 16

2.4.2. Výhody a nevýhody biosenzorů ........................................................................... 17

2.4.3. Využití biosenzorů v praxi ................................................................................... 17

3. MIKROSKOPICKÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ..................................... 18

3.1. Fluorochromy a sondy používané v mikroskopii ............................................ 18

3.1.1. Fluorochromy ....................................................................................................... 18

3.1.1.1. Využití fluorochromů při vitálním barvení .......................................................... 18

3.1.2. Molekulární sondy ............................................................................................... 19

3.2. Základní druhy mikroskopie ............................................................................ 19

3.2.1. Světelná (optická) mikroskopie ........................................................................... 19

3.2.2. Fluorescenční mikroskopie .................................................................................. 20

3.2.2.1. Epifluorescenční mikroskopie .............................................................................. 20

3.2.3. Elektronová mikroskopie ..................................................................................... 20

3.3. Přímá epifluorescenční filtrační technika – DEFT ......................................... 21


3.3.2. Stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce ........................... 21

3.3.3. Modifikace metody DEFT ................................................................................... 21

3.3.4. Automatizace metody DEFT – systém BactoScan 8000 ..................................... 22

3.3.5. Výhody, nevýhody a využití metody DEFT v praxi ............................................ 22

3.4. Průtoková cytometrie ........................................................................................ 22

3.4.1. Základní principy, složení průtokového cytometru ............................................. 22

3.4.2. Výhody a nevýhody průtokové cytometrie .......................................................... 23

3.4.3. Využití průtokové cytometrie v praxi .................................................................. 24

3.4.3.1. Využití průtokové cytometrie při hodnocení kvality syrového mléka ................. 24

Obsah

3

4. IMUNOLOGICKÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ....................................... 25

4.1. Aglutinační testy ................................................................................................. 25

4.2. Imunochromatografická metoda ...................................................................... 26


4.2.2. Výhody, nevýhody a využití imunochromatografie v praxi ................................ 27

4.3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – ELISA ........................................... 28


4.3.2. Konfigurace ELISA metod používaných v mikrobiologii potravin ..................... 28

4.3.2.1. Sendvičová ELISA ............................................................................................... 28

4.3.2.2. Nepřímá sendvičová ELISA ................................................................................ 29

4.3.2.3. Kompetitivní ELISA ............................................................................................ 29

4.3.3. Komerčně dostupné ELISA soupravy .................................................................. 30

4.3.4. Výhody, nevýhody a využití ELISA metod v praxi ............................................. 31

4.4. Enzyme-Linked Fluorescent Assay – ELFA (MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.) ............... 32


4.4.2. Provedení metody a vyhodnocení výsledků ......................................................... 33

4.4.3. Výhody, nevýhody a využití metody ELFA v praxi ............................................ 34

5. METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE (Mgr. Marta Dušková, Ph.D.) ...................... 35

5.1. Způsoby izolace nukleových kyselin ................................................................. 35

5.1.1. Izolace nukleové kyseliny prokaryot ................................................................... 35

5.1.2. Izolace nukleové kyseliny virů ............................................................................ 35

5.2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) .............................................................. 36


5.2.2. Detekce PCR produktů ......................................................................................... 37

5.2.3. Modifikace PCR ................................................................................................... 37

5.2.3.1. Real-time PCR (qPCR) ........................................................................................ 39

5.2.4. Inhibitory polymerázové řetězové reakce ............................................................ 40

5.2.5. Výhody, nevýhody a využití metody PCR v praxi .............................................. 40

5.3. Hybridizační techniky ........................................................................................ 41


5.3.2. Hybridizace na pevném podkladu ........................................................................ 42

5.3.3. Mikročipy („microarrays“) .................................................................................. 43

5.3.4. Výhody, nevýhody a využití hybridizačních technik v praxi .............................. 43

6. NEPŘÍMÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ...................................................... 44

6.1. Elektrické metody .............................................................................................. 44

6.1.1. Teorie impedance ................................................................................................. 44


6.1.2.1. Přímá metoda měření impedance ......................................................................... 44

6.1.2.2. Nepřímá metoda měření impedance .................................................................... 45

6.1.2.3. Faktory ovlivňující impedanční stanovení ........................................................... 45

6.1.3. Měřicí systémy ..................................................................................................... 46

6.1.4. Výhody a nevýhody elektrických metod ............................................................. 46

6.1.5. Využití elektrických metod v praxi ...................................................................... 47

6.2. Radiometrické stanovení 14CO2 ........................................................................ 47

6.3. Limulus Amebocyte Lysate test – LAL test ..................................................... 48

6.3.1. Detekce pozitivní reakce ...................................................................................... 48

6.3.2. Zkumavkový LAL test ......................................................................................... 48

6.3.3. Využití LAL testu v praxi .................................................................................... 48

Obsah

4

6.4. ATP bioluminiscenční test ................................................................................. 49


6.4.2. Stanovení počtu mikroorganismů v potravinách ................................................. 50

6.4.2.1. Využití v praxi ..................................................................................................... 50

6.4.2.2. Výhody a nevýhody ............................................................................................. 51

6.4.3. Monitoring hygieny a sanitace v potravinářských provozech .............................. 51

6.4.3.1. Výhody a nevýhody ............................................................................................. 52

6.4.4. Využití ATP bioluminiscence při detekci vybraných patogenů .......................... 52

6.4.5. Měřicí přístroje ..................................................................................................... 52

7. STANOVENÍ CITLIVOSTI MIKROORGANISMŮ K AML

(MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ............................................................................................ 53

7.1. Rezistence mikroorganismů k AML ................................................................ 53

7.1.1. Antimikrobiální látky a jejich účinek na mikroorganismy .................................. 53

7.1.2. Rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám ..................................... 53

7.1.2.1. Mechanismy rezistence mikroorganismů k AML ................................................ 54

7.1.2.2. Vznik a šíření rezistence mikroorganismů k AML .............................................. 54

7.2. Semikvantitativní metody .................................................................................. 55

7.2.1. Disková difúzní metoda ....................................................................................... 55

7.3. Kvantitativní – diluční metody ......................................................................... 56

7.3.1. Agarová diluční metoda ....................................................................................... 56

7.3.1.1. Provedení a vyhodnocení testu ............................................................................ 56

7.3.1.2. Výhody a nevýhody agarové diluční metody ...................................................... 57

7.3.2. Diluční mikrometoda (mikrodiluční metoda) ...................................................... 57


7.3.2.2. Výhody a nevýhody diluční mikrometody ........................................................... 58

7.3.3. Etest ...................................................................................................................... 58


7.3.3.2. Výhody, nevýhody a využití Etestu v praxi ......................................................... 59

7.4. Genotypové metody stanovení rezistence ........................................................ 59 7.4.1. Odhalování mutací spojených s rezistencí k AML .............................................. 59

7.4.2. Výhody a nevýhody použití genotypových metod .............................................. 60

8. STANOVENÍ BAKTERIÁLNÍCH TOXINŮ (MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.) ............. 61

8.1. Toxiny Staphylococcus aureus ........................................................................... 61

8.1.1. Stafylokokové enterotoxiny ................................................................................. 61

8.1.2. Přímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů ......................................... 62

8.1.2.1. Imunologické metody .......................................................................................... 62

8.1.2.2. Fyzikálně-chemické metody ................................................................................ 64

8.1.3. Nepřímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů ..................................... 64

8.1.4. Využití v praxi ..................................................................................................... 65

8.2. Toxiny Bacillus cereus ....................................................................................... 66

8.2.1. Emetický toxin a diarhogenní enterotoxiny ......................................................... 66

8.2.2. Přímé metody detekce toxinů B. cereus ............................................................... 67

8.2.2.1. Imunologické metody .......................................................................................... 67

8.2.2.2. Fyzikálně-chemické metody ................................................................................ 67

8.2.2.3. Další přímé metody .............................................................................................. 68

8.2.3. Nepřímé metody detekce toxinů B. cereus .......................................................... 68

8.2.4. Využití v praxi ..................................................................................................... 68

Obsah

5

8.3. Toxiny Clostridium botulinum ........................................................................... 69

8.3.1. Botulotoxiny ......................................................................................................... 69

8.3.2. Metody detekce toxinů C. botulinum ................................................................... 70

8.3.2.1. Průkaz botulotoxinu ............................................................................................. 70

8.3.2.2. Identifikace typu botulotoxinu ............................................................................. 70

8.3.2.3. Další metody ........................................................................................................ 70

8.3.3. Využití v praxi ..................................................................................................... 70

9. TYPIZAČNÍ METODY A JEJICH VYUŽITÍ PŘI

EPIDEMIOLOGICKÉM ŠETŘENÍ ALIMENTÁRNÍCH ONEMOCNĚNÍ

(doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D., Mgr. Petra Myšková) ........................................................... 71

9.1. Alimentární onemocnění ................................................................................... 71

9.2. Typizační metody ............................................................................................... 71

9.2.1. Sérotypizace ......................................................................................................... 72

9.2.1.1. Antigenní struktura .............................................................................................. 72

9.2.2. Fágová typizace .................................................................................................... 73

9.2.3. Rezistence k antimikrobiálním látkám ................................................................. 73

9.2.4. Makrorestrikční analýza a pulsní gelová elektroforéza (PFGE) .......................... 74

9.2.5. Sekvenční metody ................................................................................................ 75

9.3. Případové studie ................................................................................................. 75

9.3.1. Případová studie 1 ................................................................................................ 75




Použitá literatura .............................................................................................................. 77

6

PŘEDMLUVA

Mikrobiologická analýza má při výrobě potravin zcela nezastupitelnou roli. Význam

mikroorganismů nespočívá pouze v otázce bezpečnosti potravin a ochrany konzumentů před

možným vznikem alimentárního onemocnění, významná je také jejich úloha při výrobě a

zpracování potravin, zejména fermentovaných výrobků, či naopak podíl na jejich kažení.

Spolu se zvyšujícím se tlakem na produkci bezpečných a kvalitních potravin, vzrůstá i potřeba

jednoduchých, rychlých a co nejvíce specifických metod detekce mikroorganismů, určených

jako vhodná alternativa ke klasickému kultivačnímu vyšetření.

Učební text je určen studentům navazujícího magisterského studijního programu Bezpečnost

a kvalita potravin realizovaného na Fakultě veterinární hygieny a ekologie Veterinární a

farmaceutické univerzity Brno. Cílem učebního textu bylo komplexním způsobem obsáhnout

problematiku laboratorních metod používaných při mikrobiologickém vyšetření potravin a

potravinových surovin. Jsou zde uvedeny všechny základní skupiny mikrobiologických metod

– kultivační metody, systémy využívané při identifikaci mikroorganismů, mikroskopické

metody, imunologické metody, molekulárně biologické metody a techniky používané při

nepřímém stanovení mikroorganismů. V druhé části skript je zmíněna problematika rezistence

mikroorganismů k antimikrobiálním látkám a metody stanovení jejich citlivosti, dále

významné bakteriální toxiny a možnosti jejich stanovení v potravinách, a v neposlední řadě i

typizační metody a jejich využití při epidemiologickém šetření.

S některými metodami se posluchači již detailně seznámili v rámci předmětu Mikrobiologie

potravin a mikrobiologické laboratorní metody ve 2. ročníku bakalářského studijního

programu Bezpečnost a kvalita potravin. Abychom předešly zbytečnému opakování, jsou tyto

metody ve skriptech zmíněny pouze okrajově s odkazem na příslušné studijní materiály, ve

kterých je tato problematika řešena podrobněji.

Závěrem bychom rády poděkovaly recenzentkám MVDr. Marcele Faldynové, Ph.D. a RNDr.

Danuši Lefnerové, Ph.D. za kritické a konstruktivní připomínky.

Autorky

Kultivační metody

7

1. KULTIVAČNÍ METODY

Zlatým standardem při hodnocení mikrobiologické kvality potravin stále zůstává, i přes velký

rozvoj alternativních metod, kultivační vyšetření. Kultivační metody jsou obvykle metodami

referenčními, umožňují jak kvantitativní tak kvalitativní stanovení.

Cílem kvantitativních metod je stanovení počtu životaschopných buněk cílové skupiny

mikroorganismů. Mezi základní techniky patří metoda zalití, metoda roztěru a metoda

stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů (MPN, Most Probable Number).

Stanovení počtu některých mikroorganismů (zejména patogenů) může být rozšířeno o krok

resuscitace, jehož cílem je zachycení i stresovaných či subletálně poškozených buněk. Jednou

z možností je např. využití membránových filtrů, které se po filtraci nejdříve krátce kultivují

na neselektivním médiu a teprve poté se filtr umístí na selektivní agar (stanovení počtu

Escherichia coli O157 v potravinách). Další možností je homogenizace vzorku v neselektivní

či částečně selektivní tekuté půdě a jeho krátká resuscitace při laboratorní teplotě, jako je

tomu např. při stanovení počtu Listeria monocytogenes.

Kvalitativní stanovení je zaměřeno na průkaz přítomnosti či absence cílového

mikroorganismu v dané navážce vzorku. Tento typ stanovení je časově i materiálově

náročnější a obvykle probíhá v několika na sobě navazujících stupních – primární pomnožení

(předpomnožení), sekundární pomnožení, izolace a konfirmace. Cílem předpomnožení

(neselektivní tekuté médium) či primárního pomnožení (selektivní tekutá půda se sníženou

koncentrací inhibičních složek) je mimo jiné resuscitace stresovaných či subletálně

poškozených cílových buněk. Během sekundárního pomnožení se výrazně zvyšuje počet

cílových mikroorganismů. Při stanovení některých mikroorganismů se využívá pouze jeden

pomnožovací krok (např. stanovení termotolerantních druhů rodu Campylobacter).

Pomnožený vzorek se izoluje na pevných selektivních či selektivně diagnostických agarech.

Růst cílového mikroorganismu se projeví vznikem kolonií s typickou morfologií, příp.

doplněnou o charakteristické změny živného média. Protože jenom velmi málo používaných

diferenciálních živných médií je zcela specifických, je nejen při kvalitativním stanovení

nezbytné provést vhodnými metodami konfirmaci suspektních kolonií cílových

mikroorganismů.

Problematika kultivačních metod a jejich využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci

předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin –

praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie a skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení II. Metody

stanovení mikroorganismů v potravinách).

Konvenční kultivační metody používané pro detekci mikroorganismů v potravinách jsou

dobře zavedené, jednoduché, levné a mohou být použity pro kvantitativní i kvalitativní

analýzu. Mezi jejich nevýhody, zejména při stanovení patogenních mikroorganismů, patří

nezbytnost kultivace v několika různých živných médiích, detekce růstu vizuálně a potřeba

provedení konfirmačních testů (biochemických a serologických). To má za následek

zvýšenou pracnost, subjektivní hodnocení výsledků a zejména dlouhou dobu stanovení.

Zkrácení doby stanovení a snížení požadavků na laboratorní vybavení lze dosáhnout použitím

alternativních neboli rychlých metod. Mezi tzv. rychlé metody lze zařadit celou řadu

technologií založených na mikroskopii, měření ATP (adenosintrifosfátu), monitoringu

metabolické aktivity elektrickým měřením, stanovení nukleových kyselin či imunologii.

Protože v poslední době došlo k výraznému zvýšení kvality, výkonnosti a komerční

dostupnosti těchto metod, jsou rychlé metody v praxi stále více využívány. Na druhou stranu

nemohou rychlé metody kompletně nahradit kultivační vyšetření, a to zejména při stanovení

patogenních mikroorganismů. Je obvyklé, že se kultivační i rychlé metody používají

v kombinaci, kdy např. rychlá metoda nahradí jeden krok kultivačního stanovení.

Kultivační metody

8

1.1. Vybrané komerční kultivační soupravy Jednou z možností zjednodušení klasického kultivačního vyšetření je použití tenkých

rehydrovatelných kultivačních filmů (např. Petrifilm™, výrobce 3M), které jsou tvořeny

dvěma plastickými filmy potaženými vysušeným kultivačním médiem a dehydratovaným

gelovým činidlem rozpustným studenou vodou. Po odkrytí horního filmu (krycí folie) se 1 ml

vzorku přidá do středu spodního filmu. Inokulum se horním filmem opatrně překryje a

následně se roztlačí kruhovým tvořítkem do požadované plochy. Tím dojde k rehydrataci

živného média a vytvoří se podmínky vhodné pro růst mikroorganismů. Kultivační podmínky

se volí s ohledem na stanovované mikroorganismy. Kultivační rehydratovatelné filmy jsou

vhodné pro stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM), různých indikátorových

mikroorganismů i některých patogenů (např. S. aureus, Listeria spp.).

Na trhu jsou dále dostupné různé formy otiskových nosičů či kontaktních Petriho misek.

Otiskové nosiče (tzv. dipslides) nabízí celá řada firem – Orion Diagnostica (Hygicult®),

Merck Millipore (řada Cult Dip), Oxoid Ltd., HiMedia Laboratories (řada HiDip Slide®),

Accepta, atd. Obvykle se jedná o ohebný plastový nosič, který je z obou stran potažen živným

médiem a umístěn ve sterilní šroubovatelné zkumavce. Vzorkování se nejčastěji děje otiskem

živného média na testovaný povrch, možné je i ponoření nosiče do vyšetřované tekutiny,

případně nanesení vzorku sterilním tamponem. Díky uzavření nosiče ve sterilní zkumavce

jsou dipslidy lehce použitelné přímo v potravinářském provozu. Spektrum vyšetření je

obvykle omezeno na indikátorové skupiny mikroorganismů.

Některé sety jsou určeny pro stanovení MPN. Jedná se např. o systém SimPlate® (výrobce

BioControl), což je speciálně tvarovaná kruhová plastová miska s velmi malými jamkami.

Před nalitím do misky se vzorek smíchá s kultivačním médiem. V průběhu inkubace je

chromogenní substrát obsažený v živném médiu hydrolyzován cílovými bakteriemi. Po

ukončení inkubace se hodnotí počet jamek se změnou barvy a odhadne se hodnota MPN.

Systém SimPlate umožňuje stanovení CPM, kvasinek a plísní, Enterobacteriaceae,

koliformních bakterií/E. coli, Campylobacter spp.

Pro stanovení koliformních bakterií, resp. E. coli ve vodě lze využít systém Colilert® (výrobce

IDEXX Laboratories). Systém je tvořen speciálně tvarovanou deskou s komůrkami, do

kterých se nalije směs vzorku a kultivačního média. Kultivační médium obsahuje chromogeny

a fluorogeny. Přítomnost sledovaných mikroorganismů je indikována změnou barvy,

fluorescencí (E. coli) a tvorbou plynu. Po ukončení inkubace je spočítán počet pozitivních

komůrek a odhadnuta hodnota MPN. Ke stanovení enterokoků ve vodách lze využít podobný

systém Quanti-Tray® (výrobce IDEXX Laboratories).

1.2. Systém TEMPO Při vyšetření vzorků potravin a tekutin s očekávanou nízkou úrovní kontaminace

mikroorganismy, se již více než 100 let používá metoda stanovení nejpravděpodobnějšího

počtu mikroorganismů. Metoda MPN patří mezi základní techniky stanovení počtu

mikroorganismů při použití tekutých půd. Je založena na pravděpodobnosti záchytu

mikroorganismů ze vzorku. Hodnota MPN se odečítá v tabulkách, kde jsou statisticky

vypočteny nejpravděpodobnější hodnoty odpovídající počtu záchytů, tj. počtu pozitivních

zkumavek ve třech po sobě jdoucích sériích ředění vzorku, pro daný počet očkovaných

zkumavek v každé sérii. Klasické provedení je tří- či pětizkumavkový test.

V roce 2007 uvedla firma bioMérieux na trh systém TEMPO – miniaturizovaný systém

stanovení MPN. TEMPO je plně automatizovaný test založený na enzymatickém principu. Je

určen pro přímé stanovení počtu vybraných mikroorganismů v potravinách.

Kultivační metody

9

1.2.1. Základní principy Systém TEMPO se skládá ze tří komponent – TEMPO kitu, plničky (tzv. filler) a čtečky (tzv.

reader). TEMPO kit tvoří vialka s kultivačním médiem, do které se v průběhu testu přidává

homogenát vyšetřované potraviny (ředění 10-1), a specifická karta. Vialka obsahuje

lyofilizované kultivační médium, které musí být před inokulací vzorku resuspendováno v

destilované vodě. Kultivační médium je po naočkování testovaným vzorkem v plničce

automaticky přeneseno do specifické karty, která obsahuje 3 sady jamek po 16, vždy s jedním

logaritmem rozdílu v objemu každé sady (první sadu tvoří 16 malých jamek; druhou sadu 16

větších jamek, které mají 10ti násobný objem oproti první sérii; třetí sérii 16 velkých jamek,

které mají 10ti násobný objem oproti druhé sérii).

Vialka i karta jsou opatřeny unikátním čárovým

kódem, který slouží k přesné identifikaci

jednotlivých vzorků a vylučuje jejich záměnu.

Plnička je vlastně vakuová komora, ve které

dochází k naplnění karet směsí ve vialce.

Inkubace vzorků probíhá v běžném termostatu.

K odečtu výsledků se používá čtečka. Součástí

obou přístrojů (plničky i čtečky) jsou počítače

vybaveny specifickým softwarem. Oba přístroje

jsou vzájemně propojeny pomocí bezdrátové sítě

a dochází mezi nimi k automatickému přenosu

dat.

Při inkubaci karet dochází k růstu přítomných mikroorganismů, které metabolizují živiny

z kultivačního média. K detekci přítomnosti mikroorganismů (pozitivní záchyt) v systému

TEMPO může docházet dvojím způsobem. První možností je pokles pH, k němuž dochází při

metabolizaci živin z kultivačního média, a současné vymizení fluorescenčního signálu

vyzařovaného 4-methylumbeliferonem (4MU). Signál je snímačem TEMPO detekován díky

fluorescenčnímu indikátoru pH pouze tehdy, je-li pH neutrální. Tento způsob vyhodnocení se

používá např. při stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM).

Druhá možnost detekce je založena na specifické enzymatické aktivitě stanovovaných

bakterií. Při tomto způsobu dochází k enzymatickému odštěpení látky z vazby na 4MU, jenž

se stává fluorescentní. Pozitivní jsou v tomto případě jamky vyzařující fluorescenční signál.

Tento způsob vyhodnocení se používá např. při stanovení E. coli.

Na základě počtu pozitivních zkumavek v každé řadě získáme stejně jako u klasické metody

MPN trojciferný kód, který je přístrojem automaticky vyhodnocen. Konečný výsledek, včetně

zohlednění stupně ředění vzorku, je uveden přímo v KTJ (kolonie tvořící jednotky, angl.

Colony Forming Unit, CFU) na gram vyšetřované potraviny.

1.2.2. Provedení a vyhodnocení testu Počáteční příprava vzorku zahrnuje jeho homogenizaci v pufrované peptonové vodě (10 g a

90 ml, resp. 25 g a 225 ml, tj. ředění 10-1). Následuje resuspendace živného média ve vialce

sterilní destilovanou vodou, její množství se volí podle požadovaného finálního ředění vzorku

(3 ml – ředění 1:40 nebo 3,9 ml – ředění 1:400). Obsah vialky důkladně promícháme na

vortexu. Homogenizovaný vzorek se asepticky dávkuje do vialky v množství 1 ml (finální

ředění 1:40) nebo 0,1 ml (finální ředění 1:400), obsah vialky se opět důkladně promíchá.

Následuje načtení čárového kódu vialky a načtení prázdné karty pomocí čtečky čárových

kódů, jenž je součástí TEMPO systému. Po zanesení údajů do systému a jejich zobrazení na

počítači, který je součástí plničky, lze doplnit název vzorku a jeho ředění (1:40 nebo 1:400,

Obrázek 1: TEMPO specifická karta.

Kultivační metody

10

příp. i vyšší). Karta i vialka se vloží do speciálního stojánku tak, aby nasávací trubička karty

byla ponořena do vialky. Stojánek se následně umístí do plničky, po jejím spuštění je vzorek

pod tlakem automaticky rozplněn do všech 48 jamek na kartě. Po naplnění karty je nasávací

trubička automaticky odříznuta a zatavena. Před umístěním stojánku do inkubátoru se provádí

vizuální kontrola, zda opravdu došlo k nasátí vzorku do karty. Inkubační podmínky se volí

podle požadavků stanovovaných mikroorganismů.

Po ukončení inkubace se karty přenesou do readeru, který hodnotí v každé jamce vznik (příp.

zánik) fluorescence a automaticky vypočítá hodnotu MPN. Během několika minut je výsledek

získaný na základě zohlednění ředění zobrazen v počítači v přehledné tabulce přímo v KTJ/g

potraviny. Přístroj umožňuje i přímé vytištění výsledků nebo jejich transport do uživatelského

PC.

1.2.3. Výhody, nevýhody a využití metody TEMPO v praxi Metoda TEMPO je plně automatizovaná s minimem nároků na obslužný personál. Její

provedení je velmi jednoduché, výrobce uvádí maximální kapacitu více než 500 vyšetření za

den. Je vhodná pro laboratoře, které pravidelně vyšetřují větší počty vzorků. Stanovené

výsledky mají výbornou korelaci s klasickou metodou MPN. Určitou nevýhodou mohou být

investiční náklady na pořízení nezbytného přístrojového vybavení a následně i cena TEMPO

kitů.

Metodu lze využít pro vyšetření celé řady mikroorganismů zahrnujících jak patogenní, tak

indikátorové a technologicky významné mikroorganismy. V současné době jsou dostupné kity

pro stanovení CPM, koliformních bakterií, E. coli, kvasinek a plísní, bakterií mléčného

kvašení a koagulasa pozitivních stafylokoků.

Systémy identifikace mikroorganismů

11

2. AUTOMATIZOVANÉ SYSTÉMY VYUŽÍVANÉ PŘI IDENTIFIKACI

MIKROORGANISMŮ

Velmi oblíbenými identifikačními nástroji v mikrobiologii jsou automatizované systémy,

které velmi rychle poskytují výsledek. Doplňují ostatní mikrobiologické metody běžně

používané v laboratořích.

2.1. Systém VITEK® Systém VITEK® (výrobce bioMérieux) je rychlý, plně automatizovaný systém umožňující

identifikaci mikroorganismů současně se stanovením jejich citlivosti k antimikrobiálním

látkám. Nachází široké uplatnění v řadě oborů. VITEK byl vyvinut koncem 60-tých let

minulého století pro NASA a byl určen pro přímou detekci a identifikaci patogenů ve

vzorcích moči kosmonautů. Původní systém byl označován jako MLM (Microbial Load

Monitor). Koncem 70-tých let byl firmou MacDonell Douglas uveden na trh automatický

systém označovaný jako Auto Microbic System určený pro klinickou mikrobiologii. Byl

schopen identifikovat devět nejčastějších patogenů močového ústrojů. V roce 1977 se

vytvořila samostatná divize Vitek Systems, po níž získal přístroj své konečné označení.

Postupně se také rozšiřovala použitelnost systému v různých odvětvích průmyslové

mikrobiologie.

Novou generaci představuje modernizovaný systém VITEK® 2, který byl na trh uveden v roce

2007. Opět se jedná o plně automatizovaný systém umožňující současnou identifikaci

mikroorganismů a stanovení jejich citlivosti k antimikrobiálním látkám. Úplnou novinkou je

systém VITEK® MS. Identifikace mikroorganismů je zde založena na principu hmotnostní

spektrometrie (MALDI-TOF), výsledky jsou k dispozici během několika minut.

2.1.1. Základní principy Systém VITEK® je integrální modulární systém skládající se z několika základních

komponent. První z nich je identifikační karta (ID card) – tenká plastová karta obsahující 30

malých jamek naplněných různými dehydrovanými biochemickými substráty. Zastoupení

jednotlivých biochemických testů odpovídá testované skupině mikroorganismů.

K plnění identifikačních karet připravenou suspenzí mikroorganismu dochází v jednotce

označované jako plnička (filler), což je v podstatě vakuová komora, do které se ve speciálním

stojánku umístí identifikační karta a vialka s připravenou suspenzí. Po naplnění karty, je

dávkovací trubička uříznuta a zatavena, čímž dojde k úplnému uzavření identifikační karty.

Další jednotku představuje inkubátor s readerem. Identifikační karty jsou inkubovány

obvykle při teplotě 35 – 37 °C. Každou hodinu je spektrofotomericky hodnocena změna barvy

či tvorba zákalu uvnitř jamek na kartě. Současně je posuzována i produkce plynu. Celková

doba stanovení se pohybuje v rozmezí 4 až 12 hodin. Tyto informace jsou přenášeny do

počítače, kde jsou zpracovány. Výsledky biochemických testů jsou porovnány s databází

známých kultur a následně je provedena identifikace testovaného mikroorganismu. Součástí

vybavení počítače je i tiskárna.

Při identifikaci mikroorganismů jsou využívány následující databáze známých kultur:

gramnegativní mikroorganismy (GNI), grampozitivní mikroorganismy (GPI), bakterie rodu

Bacillus (BAC), anaerobní mikroorganismy (ANI), kvasinky (YBC), nefermentující

mikroorganismy (NFC) a rody Neisseria/Haemophilus (NHI). Při stanovení citlivosti

k antimikrobiálním látkám se používají speciální karty (tzv. AST cards) obsahující více než

40 látek. Výsledky jsou vyjádřeny hodnotou MIC (minimální inhibiční koncentrace).


12

2.1.2. Výhody, nevýhody a využití systému VITEK® v praxi Jednoznačnou výhodou systému VITEK® je jednoduché a velmi rychlé provedení testu,

výsledky identifikace jsou známy během několika hodin. Systém je plně automatizovaný,

umožňuje současné stanovení velkých sérií vzorků. Nevýhodou jsou samozřejmě vyšší

investiční náklady na pořízení nezbytného vybavení a do jisté míry i cena stanovení. Z tohoto

důvodu nelze VITEK® doporučit do laboratoří s velmi malým počtem vyšetřovaných vzorků.

Mimo širokého využití v klinické diagnostice se systém VITEK® používá také k hodnocení

farmaceutických a kosmetických výrobků a potravin, kde nachází uplatnění zejména při

stanovení patogenních mikroorganismů (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, atd.).

Velké využití má také při identifikaci klinicky významných multirezistentních bakterií.

2.2. Systém Biolog Pro identifikaci a charakterizaci mikrobiologických kultur vyvinula firma Biolog, Inc. systém

Biolog – rychlý a levný prostředek pro získání velkého množství informací o analyzovaných

mikroorganismech.

2.2.1. Základní principy Princip tohoto identifikačního systému spočívá ve schopnosti mikroorganismů metabolizovat

sacharidové substráty umístěné v 96-ti jamkové mikrotitrační destičce. Pokud naočkované

mikroorganismy mají enzymy schopné metabolizovat dané substráty, dochází k uvolnění

elektronů ze substrátu a probíhá oxidace. Tyto elektrony přijímá barvivo

trifenyltetrazoliumchlorid (TTC), čímž se redukuje a dochází ke vzniku trifenylformazanu

(TPF), reakce je doprovázena změnou barvy. Dostatečné množství buněk v jamce

mikrodestičky tak zajišťuje pozorovatelnou barevnou změnu. Tímto způsobem každý

mikroorganismus získá specifický kód, díky kterému je identifikován.

Postup analýzy je jednoduchý. Nejdříve se na agaru izoluje čistá kultura, poté se připraví

inokulum o předepsané koncentraci buněk a naočkuje se vhodná mikrotitrační destička.

V průběhu času dochází při inkubaci k vývoji barvy v jednotlivých jamkách podle toho, jak

mikroorganismus využívá jednotlivé substráty. Po inkubaci je mikrodestička umístěna do

mikrostanice pro analýzu, kde reader odečte absorbanci (k odečtům je použito dvou vlnových

délek, 590 nm a 750 nm). Výsledky jsou zaznamenány a srovnány s širokou databází

mikroorganismů, ve které je uloženo přes 2000 druhů. Systémy existují manuální (MicroLog),

poloautomatické (MicroStation) – zahrnující kromě softwaru i identifikační reader, a plně

automatické – systém OmniLog® (software, inkubátor/reader).

2.2.2. Výhody, nevýhody a využití systému Biolog v praxi Výhodou systému Biolog je rychlá a poměrně přesná identifikace mikroorganismů díky

široké škále biochemických reakcí obsažených v mikrodestičce a komplexní databázi

mikroorganismů (bakterie, kvasinky, plísně). Nevýhodou tohoto systému je možnost

identifikace pouze kultivovatelných mikroorganismů, pro vhodný výběr panelu testů se musí

předem nadefinovat, o jakou skupinu mikroorganismu se jedná. Dále je zde potenciální riziko

křížových reakcí, u manuální verze není možné měřit absorbanci (vyhodnocení je vizuální).

Původně měl systém Biolog sloužit pro snadnou identifikaci klinicky významných bakterií.

Nyní jsou mikrodestičky vyvinuty pro různé skupiny mikroorganismů – aerobní bakterie,

anaerobní bakterie, grampozitivní bakterie, gramnegativní bakterie, kvasinky a plísně.

V nejnovější verzi tohoto systému lze identifikovat na stejném panelu jak grampozitivní, tak

gramnegativní bakterie zároveň, a tím odpadá před vlastní analýzou barvení dle Grama a další

testování pro výběr vhodného panelu substrátů.


13

Kromě identifikace mikroorganismů má systém Biolog také možnost sledovat funkční

diverzitu mikrobiálních společenstev se speciálními testovacími panely pro ekologické a

ekotoxikologické studie.

2.3. Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Rychlou a velmi přesnou identifikaci a typizaci mikroorganismů poskytuje hmotnostní

spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem (MALDI-TOF MS, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass

Spectrometry). Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF patří mezi chemotaxonomické

metody. Proces identifikace je založen na analýze ribosomálních a dalších proteinů v buňce.

Ribosomální proteiny představují asi 20 % veškerých buněčných bílkovin a asi 3 % celkové

hmoty. Tyto makromolekuly jsou specifické pro jednotlivé bakteriální druhy a díky tomu

mohou být považovány za vhodné biomarkery. Hmotnostní spektrometrie je vysoce citlivá

analytická technika s detekčními limity řádově až desetiny femtomolů.

Obrázek 2: Schéma přístroje MALDI-TOF MS.

2.3.1. Základní principy Jedná se o šetrnou ionizační metodu, kdy biomolekuly (proteiny buněčných extraktů) nejsou

po ataku laseru štěpeny, ale pouze ionizovány pomocí matrice (obrázek 3). Nejčastěji se

využívají dusíkové UV lasery, v menší míře infračervené (IR) lasery. Ozáření o vlnové délce

337 nm trvá 4 ns. Matrice zajistí kontakt analyzované molekuly s laserem tak, aby

biomolekula nebyla atakována přímo a

štěpena nežádoucím způsobem. Matrice

dále zprostředkovává přenos energie, kdy

excitované molekuly matrice za vysokého

tlaku ionizují molekuly analytu

(biomolekuly) přenosem protonu.

Ionty, které přešly do plynné fáze, postupují

přes silné elektrické pole, ve kterém jsou

urychleny a zaostřeny. Vstoupí do vakuové

trubice hmotnostního analyzátoru doby

letu (TOF, Time of Flight), kde se pohybují

Obrázek 3: Schéma ionizace.


14

rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji (obrázek 2). Měří se doba letu částice, lehčí či

více nabité ionty dorazí k detektoru dříve než těžší nebo méně nabité. Detektor je propojen

s počítačem a pomocí softwaru jsou data zpracována.

Pro každý kmen je

vytvořeno hmotnostní

spektrum, neboli profil jeho

proteomu. Toto hmotnostní

spektrum je zobrazením

četnosti ionizovaných částic

buněčného proteomu.

Profily proteinů jsou pro

daný druh mikroorganismu

vysoce charakteristické.

Vlastní identifikace

mikroorganismů následně

spočívá ve srovnávání

proteinového spektra izolátu

se spektry referenčních

kmenů v databázi MALDI Biotyper. Z matice podobnosti spekter se provádí klastrová

(shluková) analýza. Shluky podobnosti se zobrazují jako dendrogram (obrázek 4). Na základě

získaného dendrogramu je založena klasifikace v rámci rodu, druhu, a v některých případech i

poddruhu či typizace kmene. Míra spolehlivosti identifikace (podobnost izolátu s referenčním

kmenem v databázi) se vyjadřuje jako log(score). Pokud je log(score) vyšší než hodnota 2,3,

jedná se o vysoce pravděpodobnou identifikaci na úrovni druhu. Log(score) v rozmezí 2,3 –

2,0 potvrzuje vysoce pravděpodobnou identifikaci na úrovni rodu a pravděpodobnou

identifikaci na úrovni druhu. Pravděpodobnou identifikaci na úrovni rodu mají kmeny

s log(score) 2,0 – 1,7. Výsledky s hodnotami pod 1,7 nejsou signifikantní. Samotná analýza je

velmi rychlá a výsledky jsou možné získat během několika minut.

2.3.1.1. Příprava izolátů

Příprava izolátů pro analýzu MALDI-TOF MS je velmi jednoduchá. Analyzovat se mohou

celé buňky nebo jejich extrakty. Nejrychlejším způsobem je nanesení mikroorganismů

vykultivovaných na agaru či v bujónu, promytých deionizovanou vodou a s přídavkem

matrice, přímo na MALDI destičku. Buněčné proteiny je doporučeno extrahovat zejména u

grampozitivních bakterií vzhledem ke struktuře jejich buněčné stěny (silná vrstva

peptidoglykanu) např. působením enzymů lysozymu či lysostaphinu, chemických

rozpouštědel (ethanolu, acetonitrilu, směsi chloroform-methanol), ultrazvukové sonikace či

tepelného záhřevu. Čisté 24 hodinové bakteriální

kultury jsou resuspendovány a inaktivovány v 75%

ethanolu. Po centrifugaci a důkladném odstranění

supernatantu je k buňkám přidána matrice v poměru

1:104. Matrice musí absorbovat vlnovou délku

použitého laseru, musí být fotostabilní a tvořit malé

krystaly. Nejčastěji se používají deriváty kyseliny

benzoové či skořicové. Výběr vhodné matrice je

zcela zásadní pro kvalitu analýzy.

Jako rozpouštědlo se používá acetonitril, aceton či

organická kyselina ve směsi s vodou a pro zvýšení

Obrázek 4: Dendrogram vytvořený na základě MALDI-TOF MS

profilů. (autor O. Šedo)

Obrázek 5: MALDI destička. (autor O. Šedo)


15

kvality signálu je přidávána kyselina trifluoroctová (TFA) či mravenčí (FA). Směs je

nanášena na speciální destičku z nerezové oceli či hliníku, která je inertní vůči matrici a

rozpouštědlům. Na této kovové destičce se může analyzovat až 384 izolátů. Po vysušení

vzorků při pokojové teplotě je destička umístěna do hlubokého vakua (10-4 Pa) v iontovém

zdroji hmotnostního spektrometru a proběhne analýza MALDI-TOF MS. Po analýze se

MALDI destička důkladně vyčistí a tím je připravena k dalšímu použití.

2.3.2. Výhody a nevýhody metody MALDI-TOF MS Tato metoda má velké přednosti díky levnému provozu, snadnosti a rychlosti provedení,

vysoké rozlišovací schopnosti, snadné reprodukovatelnosti a možnosti analyzovat velký počet

izolátů najednou. Pro analýzu je potřeba velmi malé množství vzorku. Je aplikovatelná pro

široké spektrum mikroorganismů a obejde se bez předchozí charakteristiky izolátu a jeho

zařazení do určité skupiny.

Limitujícím faktorem této metody je identifikace druhů mikroorganismů, které nejsou

obsaženy v databázi. Avšak hmotnostní spektra nových referenčních kmenů se neustále do

databáze doplňují. Mezi další nevýhody patří vysoké pořizovací náklady přístrojového

vybavení a komplikovaná identifikace některých fylogeneticky příbuzných druhů bakterií či

směsných kultur.

2.3.3. Využití metody MALDI-TOF MS v praxi Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF byla v nedávné době zavedena do rutinní

mikrobiologické diagnostiky. MALDI-TOF MS se začíná úspěšně využívat v různých

oblastech mikrobiologie, nejen v klinické praxi. Metodou lze identifikovat bakterie, kvasinky

a plísně izolované z různých biologických materiálů, potravin i vzorků prostředí. Stává se

klíčovým nástrojem v rámci kontroly bezpečnosti potravin. Mikroorganismy lze identifikovat

nejen do rodu, ale také na druhové úrovni a v některých případech i na úrovni poddruhů.

MALDI-TOF MS lze snadno a rychle identifikovat nejen patogenní bakterie izolované

z potravin, jako jsou E. coli O157:H7, Yersinia spp., Salmonella spp., Campylobacter spp.,

jednotlivé druhy listerií včetně L. monocytogenes, Clostridium spp., Bacillus cereus,

Staphylococcus aureus (včetně rozlišení meticilin rezistentních – MRSA, od meticilin

senzitivních kmenů S. aureus), Enterococcus spp., ale také technologicky významnou avšak

na identifikaci komplikovanou skupinu bakterií mléčného kvašení a další mikroorganismy.

Hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF se mohou analyzovat také rekombinantní proteiny,

proteiny faktorů virulence, proteiny sporových stěn a S-vrstvy, enzymy, metabolity,

bakteriociny, atd.

2.4. Biosenzory Biosenzor je analytický přístroj s velmi širokým využitím. Uplatňuje se v humánní i

veterinární medicíně, farmaceutickém a potravinářském průmyslu, zemědělství, životním

prostředí, atd. Pomocí biosenzorů jsou zkoumány interakce protilátka-antigen, DNA-DNA,

DNA-protein, receptor-ligand, protein-ligand a mnoho dalších interagujících dvojic. Studium

biosenzorů spadá do několika vědních oborů – biochemie, biotechnologie, analytická a

fyzikální chemie, elektronika, informatika, nauky o materiálech a biologie.

2.4.1. Základní principy Biosenzor má dvě hlavní části (obrázek 6). Biorekogniční část – citlivý prvek biologického

původu, který má za úkol styk s testovaným vzorkem (analytem). Biorekogniční část je buď

součástí, nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Ten převádí

biologický nebo biochemický signál na měřitelný a kvantifikovatelný elektrický nebo optický


16

signál vhodný k dalšímu zpracování.

Signál je přímo úměrný koncentraci

stanovovaných látek ve vzorku.

Samotné měření může probíhat buď

v uzavřené nádobce, v průtočném

systému nebo přímo v kontaktu

s analytem. Měření v uzavřené nádobce je velmi jednoduché a nenáročné na vybavení, avšak

je potřeba manuální obsluha. Průtočné systémy měření mohou být automatizovány. Vzorek

může být v průtočné cele měřen neředěný či ředěný. Pokud se biosenzor nachází přímo ve

sledovaném prostředí (tkáň, krevní řečiště, fermentor), neměla by jeho přítomnost ovlivnit

koncentraci analytu a snížit jeho množství v důsledku měření.

2.4.1.1. Biorekogniční část

Biorekogniční část biosenzoru může být buď biokatalytická nebo bioafinitní. Pokud je analyt

přeměněn v průběhu chemické reakce, obvykle vystupuje jako substrát enzymové reakce,

jedná se o biokatalytický typ (biologickým prvkem je např. enzym, organela, buňka, tkáň,

orgán, mikroorganismus). V případě, že je analyt specificky vázán ve vznikajícím afinitním

komplexu, biorekogniční část je bioafinitní (např. lektin, protilátka, nukleová kyselina,

receptor).

Nejčastěji využívanou biorekogniční složkou je enzym. Ten katalyzuje přeměnu substrátu

v produkt, který se může stát zároveň markerem pro elektrochemický převodník.

Další rozšířenou biorekogniční složkou je protilátka, která je pevně imobilizovaná na povrch

převodníku. Tento typ biosenzoru velmi připomíná techniku ELISA s tím rozdílem, že

vzniklý imunokomplex je detekován pomocí převodníku, nikoliv pomocí kolorimetrické

změny. Velké využití se nabízí u kombinace protilátek s křemíkovým typem převodníků –

tzv. Guartz Crystal Microbalance.

Mikroorganismy patří mezi velmi výhodnou biologickou složku biosenzorů. Používají se

buňky bakterií (např. Bacillus subtilis, B. licheniformis), sinic, kvasinek či plísní. Mohou

nahradit antigeny, enzymy, proteiny (pokud jsou exprimovány na povrchu buňky), což

zjednodušuje a zvyšuje efektivitu výroby biosenzoru.

2.4.1.2. Fyzikálně-chemický převodník

Pro sestavení biosenzorů se používá celá škála fyzikálně-chemických převodníků. Mohou být:

- elektrochemické, tyto nejrozšířenější převodníky měří změnu napětí (amperometrie),

odporu (konduktometrie), proudu (voltametrie) či elektromotorického napětí

(potenciometrie); jsou velmi citlivé, levné a jednoduché ke konstrukci,

- optické převodníky jsou založeny na detekci změn ve světelné adsorpci nebo emisi

během reakce biorekogniční složky analytu, uplatňuje se fotometrie, fluorimetrie,

luminometrie a nelineární optika,

- kalorimetrické převodníky využívají změnu teploty v průběhu enzymatických reakcí,

- akustické,

- piezoelektrické převodníky, kde se využívá křemíkový krystal, který kmitá na určité

frekvenci v závislosti na převedeném napětí. Pokud je změněna hmotnost krystalu (např.

navázáním určitých látek), posouvá se i frekvence oscilace krystalu a z této změny lze

určit nárůst hmotnosti na krystalu. Tento typ převodníků se využívá např. při detekci

Salmonella Typhimurium.

Obrázek 6: Schéma složení biosenzoru.


17

2.4.2. Výhody a nevýhody biosenzorů Přednostmi biosenzorů jsou vysoká citlivost a selektivita, měření bez speciálních reagencií,

rychlost analýzy, nízké náklady a snadná obsluha. Analýzy probíhají v reálném čase. Častou

výhodou biosenzorů je jejich malá velikost a přenositelnost, tudíž stačí relativně malé

množství vzorku a potřebných chemikálií pro analýzu.

Velkým problémem je sterilizace biosenzorů. Některé typy pracují jen v úzkém rozsahu

koncentrace analytu, mají pomalou odezvu, jsou citlivé na elektrický šum a jejich

miniaturizace může mít vliv na velikost signálu. Při použití enzymů se obvykle liší optimální

provozní pH enzymu od pH prostředí.

2.4.3. Využití biosenzorů v praxi V dnešní době nacházejí biosenzory uplatnění zejména v medicíně. V klinické diagnostice se

používají pro detekci různých metabolických produktů, složek krve, ale i k identifikaci

patogenních mikroorganismů. Snad úplně nejrozšířenějším biosenzorem je glukosový

biosenzor pro kontrolu hladiny glukosy v krvi diabetiků.

Velký potenciál využití biosenzorů je i v potravinářství při kontrole kvality potravin. Pomocí

biosenzorů lze stanovit např. sacharidy, lipidy, vitaminy, ale také alergeny, rezidua

inhibičních látek, antibiotika, růstové stimulátory, pesticidy či methanol. Mezi důležité

aplikace patří detekce alimentárních patogenů jako Salmonella Enteritidis, Salmonella

Typhimurium, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, S.

aureus, dále bakteriálních toxinů (např. stafylokokové enterotoxiny typ A a B), mykotoxinů

(např. aflatoxin) a biogenních aminů (např. histamin, putrescin).

Navzdory velkému rozvoji biosenzorů, jen málo systémů je komerčně vyráběných právě

pro oblast analýzy potravin. Na trhu jsou k dispozici následující biosenzory určené pro

detekci bakterií: Midas Pro (výrobce Biosensori SpA), Malthus 2000 (výrobce Malthus

Instruments) Unilite (výrobce Biotrace) a BIACORE (výrobce Swedish BIACORE AB).

V oblasti ochrany životního prostředí jsou biosenzory využívány zejména ke sledování

znečištění zdrojů pitné vody a vodních toků (např. polyaromatickými uhlovodíky). Dále

k monitorování půdní mikroflóry a metabolické aktivity těchto mikroorganismů.

V biotechnologiích nacházejí biosenzory uplatnění při řízení procesů a při kontrole jakosti

produktů (např. nežádoucí kontaminace). V neposlední řadě se biosenzory uplatňují také v

armádě.

Pokud má být biosenzor vhodný k použití v praxi, musí splnit následující kritéra: dostatečná

selektivita pro účely dané analýzy, dostatečná stabilita v průběhu analýzy, reakce probíhající

v biosenzoru by měla být nezávislá na fyzikálních parametrech (pH, teplota, atd.) což

umožňuje provádět analýzu bez předchozí úpravy vzorku. Odpověď senzoru by měla být

přesná, reprodukovatelná a lineární v co nejširším rozsahu koncentrací, aby nebylo nutné

vzorek ředit. Biosenzor použitelný v biotechnologiích by měl být sterilizovatený (např. v

autoklávu).

Mikroskopické metody

18

3. MIKROSKOPICKÉ METODY

Mikroskopické hodnocení je jedním ze základních postupů při analýze mikrobiální populace a

hraje důležitou roli i v mikrobiologii potravin. Mimo klasických mikroskopických metod

využívajících světelnou mikroskopii, nachází stále větší uplatnění i metody moderní –

fluorescenční či elektronová mikroskopie. V uvedeném textu se zaměřujeme na metody

nejvíce využívané při mikrobiologickém vyšetření potravin a potravinových surovin – přímou

epifluorescenční filtrační techniku (Direct Epifluorescent Filter Technique, DEFT) a

průtokovou cytometrii (Flow Cytometry, FC).

Obě techniky využívají spojení optické metody v kombinaci se specifickým či nespecifickým

barvením mikroorganismů fluorescenčními barvivy. DEFT se opírá o přímé mikroskopické

pozorování mikroorganismů, oproti tomu průtoková cytometrie kombinuje optické, fluidní a

elektronické technologie při detekci a charakterizaci jednotlivých buněk či dalších malých

částic. Některé průtokové cytometry jsou schopné třídit či fyzicky izolovat buňky či částice

s definovanými vlastnostmi. Komerčně se tato technologie využívá od 70. let minulého

století. Lze však diskutovat o tom, zda je průtoková cytometrie pravou mikroskopickou

technikou, protože při ní nemusí docházet ke zdánlivému zvětšení organismů a jejich

pozorování pouhým okem.

3.1. Fluorochromy a sondy používané v mikroskopii

3.1.1. Fluorochromy Některé mikroskopické techniky využívají pro odlišení vybraných buněk fluorescenční

barviva. Fluorochromy mohou být použity dvojím způsobem: buď díky svým chemickým

vlastnostem přímo reagují s cílovými molekulami (DNA, RNA, bílkoviny, lipidy) nebo se

používají ke značení molekulárních sond, jako jsou protilátky či oligonukleotidy.

Základní vlastností všech fluorochromů je schopnost absorbovat a emitovat světlo o

specifické vlnové délce. Po absorpci světelné energie se fluorochromy dostávají do

nestabilního excitovaného stavu, kdy jsou elektrony posunuty do vyšší energetické hladiny.

Při návratu elektronů do stabilního neexcitovaného stavu dochází k uvolnění energie ve formě

emitovaného světla. Vlnová délka použitá k excitaci fluorochromu je vždy kratší (vyšší

energie) než vlnová délka světla emitovaného (nižší energie). Vlastnosti jednotlivých

fluorochromů jsou určující pro konfiguraci měřicích přístrojů. V případě průtokové

cytometrie se obvykle k excitaci používá laser, ve fluorescenční mikroskopii rtuťové či

xenonové lampy.

3.1.1.1. Využití fluorochromů při vitálním barvení

Vhodné fluorochromy můžeme využít i k hodnocení vitality mikrobiálních buněk. Jedním

z nich je např. akridinová oranž – fluorescenční barvivo s afinitou k nukleovým kyselinám.

Při vazbě na jednořetězcovou RNA vzniká červenooranžová fluorescence (mrtvé buňky), při

vazbě na dvouřetězcovou DNA fluorescence zelená (živé buňky). Vzniklá barva však může

být ovlivněna složením média, ve kterém došlo k resuspendaci buněk, či úrovní zpracování

vzorku.

Další kategorii indikátorů životaschopnosti tvoří redoxní sondy, které jsou založeny na

přítomnosti fungujícího elektronového transportního systému. Redoxní sondy přijímají

elektrony ze složek elektronového transportního systému respirujících buněk a hromadí se

uvnitř buňky jako nerozpustné chromogeny či fluorescenční deriváty.


19

Řada vitálních barviv je založena na integritě buněčné membrány. Vyloučení určitých barviv

intaktní membránou je ukazatelem životaschopnosti, zatímco pronikání barviva je známkou

poškození a omezené vitality buňky. Jedná se např. o fluorescenční barviva propidium jodid

či fluorescein diacetát.

3.1.2. Molekulární sondy Fluorochromy jsou používány ke značení protilátek nebo oligonukleotidů. Umožňují

specifickou identifikaci mikroorganismů při mikroskopování či průtokové cytometrii.

V závislosti na použité sondě lze provádět identifikaci mikroorganismů na různých

taxonomických úrovních (rod, druh, kmen).

Fluorochromem značené protilátky se váží na antigenní determinanty bakteriálních buněk.

Jejich použití je velmi jednoduché, po přidání ke vzorku dojde k vazbě protilátek na cílové

bakterie, následuje promytí a pozorování v mikroskopu. Protože se protilátky váží na

povrchové struktury, není třeba buňky před jejich aplikací nijak ošetřit.

Oligonukleotidy (syntetické polymery) jsou schopné vazby na specifické úseky nukleových

kyselin (na základě komplementarity bazí). Podobně jako protilátky mohou být značené

fluorochromy a mohou fungovat jako fluorescenční sondy pro specifické sekvence

nukleových kyselin. Protože jsou syntetizovány chemicky, je produkce oligonukleotidů

levnější a jednodušší. Využití nachází například v metodě FISH (Fluorescence In Situ

Hybridization) nebo v průtokové cytometrii (detekce patogenů v potravinách). Na rozdíl od

značených protilátek, vyžaduje použití značených oligonukleotidů obvykle určitý typ úpravy

buněk tak, aby sonda mohla projít skrz buněčnou stěnu a interagovat s nukleovou kyselinou

(např. záhřev nebo chemická úprava).

3.2. Základní druhy mikroskopie Již bylo zmíněno, že mikroskopie je základním nástrojem při analýze mikrobiální populace.

Mikroskopie má dvě základní charakteristiky, a to zvětšení a rozlišovací schopnost (tj.

oddělení dvou blízkých objektů tak, aby mohly být hodnoceny individuálně).

Mikroskopie je univerzální technologie umožňující rychlou detekci i stanovení počtu

mikroorganismů v potravinách. Pokud je využita při identifikaci mikroorganismů, zkracuje

dobu analýzy. Řada postupů mikrobiologické analýzy potravin zahrnuje mikroskopii

v různých formách.

3.2.1. Světelná (optická) mikroskopie Světelná mikroskopie je základním a historicky nejstarším druhem mikroskopie. Je přímo

využitelná při testování potravin v laboratořích, při identifikaci mikroorganismů (Gramovo

barvení, barvení endospor, morfologie plísní) či jako kvantitativní metoda stanovení

mikrobiální populace (vyšetření čistých mlékařských kultur, stanovení počtu mikroorganismů

v mléce, stanovení fragmentů plísní). Obvyklé provedení zahrnuje nanesení a fixaci vzorku na

podložní sklíčko a jeho barvení, aby bylo dosaženo dostatečného kontrastu nebo zviditelnění

mikrobiálních buněk proti pozadí.

Problematika světelné mikroskopie a jejího využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci


praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie a skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení II. Metody

stanovení mikroorganismů v potravinách).


20

3.2.2. Fluorescenční mikroskopie Podstatou fluorescenční mikroskopie je excitace fluorochromu po expozici světlem o krátké

vlnové délce a následná emise světla o delší vlnové délce z fluorochromu. Emisní spektrum je

vůči excitačnímu posunuto do vyšších vlnových délek, protože během vzniku fluorescence je

část energie ztracena. Excitační a emisní vlnové délky jsou kontrolovány a odděleny

vhodnými filtry umístěnými v mikroskopu.

Základní součásti fluorescenčního mikroskopu jsou: zdroj světla, systém filtrů a zrcadel,

objektiv a detektor (okulár či CCD kamera). Konstrukce fluorescenčního mikroskopu je

založena na jednom ze dvou typů osvětlení – a) světlo vzorkem prochází, nebo b) světlo na

vzorek dopadá.

3.2.2.1. Epifluorescenční mikroskopie

V mikrobiologii potravin má nepraktičtější

využití epifluorescenční mikroskopie, při

které silný zdroj světla (rtuťová,

halogenová či xenonová lampa) osvicuje

vzorek a výsledná fluorescence je následně

optickou cestou poslána na detektor. Světlo

ze zdroje prochází skrz excitační filtr, který

usměrňuje vybrané vlnové délky na

dichroické zrcadlo. Dichroické zrcadlo

odráží kratší excitační záření a propouští

delší emisní záření. Současně odstraňuje

nežádoucí excitační záření o vysoké

intenzitě, které je škodlivé pro oko. Každé

zrcadlo je vždy kombinováno s vhodným

excitačním a emisním filtrem (obvykle se

jedná o set zrcadla a filtrů pro daný

fluorochrom). Zrcadlo je umístěno pod

úhlem 45° k vertikální ose mikroskopu.

Záření odražené zrcadlem prochází čočkou objektivu a dopadá na vzorek (preparát) shora. Ve

vzorku vyvolá excitaci elektronů a následné vyzáření světla. Emitované záření má větší

vlnovou délku a šíří se všemi směry. Díky imerznímu oleji prochází přes imerzní objektiv jen

část záření, která dopadá na dichroické zrcadlo. Zrcadlem emitované záření prochází na

excitační (bariérový) filtr, který propouští jen záření vlnové délky odpovídající použitému

fluorochromu, záření o kratší vlnové délce filtr zastaví. Vybrané fluorescenční záření můžeme

pozorovat okulárem nebo snímat CCD kamerou.

Epifluorescenční mikroskopie má dvě základní výhody: a) vyšší výkon při velkých zvětšeních

potřebných pro mikrobiální buňky; b) světlo přichází na vzorek shora a osvětluje povrch

vzorku, proto můžeme analyzovat i silné či neprůhledné vzorky.

3.2.3. Elektronová mikroskopie Elektronová mikroskopie není využitelná pro rutinní analýzu potravin. Rozlišujeme dva typy

elektronových mikroskopů – transmisní a skenovací. Transmisní elektronový mikroskop má

obrovské zvětšení a rozlišovací schopnost (detekční limity jsou v rozmezí nanometrů) a

umožňuje podrobné zobrazení jednotlivých vnitrobuněčných struktur mikroorganismů. Při

skenovací elektronové mikroskopii je vzorek potažen tenkým filmem těžkého kovu a je

skenován paprskem elektronů skrz. Technika umožňuje trojdimenzionální zobrazení povrchu

vzorku a může být využitelná při studiu mikroorganismů v jejich přirozeném prostředí.

Obrázek 7: Epifluorescenční mikroskop.


21

3.3. Přímá epifluorescenční filtrační technika – DEFT

3.3.1. Základní principy Oproti běžnému mikroskopickému stanovení kombinuje metoda DEFT membránovou filtraci,

fluorescenční barvení a mikroskopii. Membránová filtrace vzorku umožňuje koncentraci

mikroorganismů a tím výrazně zvyšuje citlivost metody. U homogenizovaných pevných

potravin se někdy zařazuje krok předfiltrace přes hrubý filtr pro usnadnění pasáže vzorku

membránovým filtrem. Při průchodu vzorku skrz membránový filtr jsou mikroorganismy

koncentrovány na jeho povrchu. K hodnocení povrchu filtru je použita epifluorescenční

mikroskopie. K barvení se používá akridinová oranž (afinita k nukleovým kyselinám).

Původně se ke koncentraci vzorků používaly černé membrány, které tvořily kontrastní pozadí

pro fluorescenci. Dnes se používají polykarbonátové membrány s jednotnou velikostí pórů,

které umožňují dobré stanovení počtu mikroorganismů.

Při hodnocení počtu bakterií se používá nefluorescenční imerzní olej a imerzní objektiv 100

(objektiv s nejmenším zorným polem). Při detekci kvasinek nebo protozoí lze použít méně

výkonné objektivy s větším zorným polem. K vyhodnocení se obvykle používá digitální

fotoaparát, napojený na mikroskop, s vazbou na systém analýzy obrazu (semi-automatická

metoda). Detekční limit metody DEFT je běžně řádově 103 buněk v 1 ml.

3.3.2. Stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce Původně byla metoda DEFT používána při stanovení celkového počtu mikroorganismů

(CPM) v syrovém mléce. Nejdříve se pomocí proteolytických enzymů a povrchově aktivních

látek provede lýza somatických buněk a tukových kuliček pro usnadnění filtrace vzorku.

Vzorek (2 ml) je přefiltrován přes polykarbonátový membránový filtr. Bakterie soustředěné

na jeho povrchu jsou obarveny akridinovou oranží, po opláchnutí barviva se filtr nechá osušit

na vzduchu. Poté se umístí na podložní sklíčko, zakápne imerzním olejem a překryje krycím

sklíčkem, hodnocení probíhá v epifluorescenčním mikroskopu. Metabolicky aktivní buňky

fluoreskují oranžovočerveně, neaktivní zeleně. Stanovení trvá 25 minut.

Před vlastním hodnocením se provede hrubý odhad počtu buněk v zorném poli, je-li větší než

100, je nutné provést naředění vzorku. Následně se počítají fluoreskující buňky v náhodně

vybraných zorných polích na membránovém filtru. Počet hodnocených zorných polí je závislý

na množství mikrobiálních buněk. Stanovení počtu buněk v 1 ml mléka se provede výpočtem

z průměrného počtu buněk v zorném poli, faktoru mikroskopu, množství filtrovaného vzorku

a jeho ředění.

3.3.3. Modifikace metody DEFT Pro hodnocení životaschopných buněk se filtr po filtraci vzorku několik hodin inkubuje na

vhodném živném médiu, dojde k vytvoření mikrokolonií, které po obarvení fluoreskují.

Technika mikrokolonií byla dále modifikována použitím fluorescenčně značených protilátek

jako barvicího činidla. Metodu lze využít např. k rychlé detekci životaschopných buněk

salmonel a L. monocytogenes v syrovém mase.

Jako alternativa k barvení akridinovou oranží se dají použít fluorescenční protilátky i bez

tvorby mikrokolonií, a to pro rychlou a především specifickou detekci a počítání

mikroorganismů. Během jedné hodiny lze detekovat např. E. coli O157:H7 v mléce,

ovocných šťávách a hovězím mase nebo L. monocytogenes v zelenině. Ke konfirmaci

pozitivních vzorků lze využít imunomagnetickou separaci.

Další variantou je využití fluorescenčně značených oligonukleotidů (vazba na r-RNA) např.

při detekci E. coli ve vodě, odpadech či zeleninových klíčcích.


22

3.3.4. Automatizace metody DEFT – systém BactoScan 8000 BactoScan 8000 (výrobce Foss Electric) je plně automatizovaný přístroj pro přímé

mikroskopické počítání mikroorganismů v syrovém mléce. Mikroorganismy jsou ze

syrového mléka odstředěny a odděleny, barveny fluorescenčním barvivem a elektronicky

počítány jako světelné impulsy ve fluorescenčním mikroskopu s kontinuálním prouděním.

Somatické buňky, tukové kuličky a kaseinové micely jsou chemicky degradovány a poté

separovány od bakteriálních buněk odstředěním v sacharoso-glycerolovém gradientu.

Současně dochází k rozpuštění bakteriálních shluků, což vede k přesnější kvantifikaci

mikroorganismů. Bakteriální buňky jsou po obarvení akridinovou oranží usměrněny pod

objektiv epifluorescenčního mikroskopu. Při průchodu pod objektivem jsou bakterie ozářeny

filtrovaným modrým světlem, které způsobí červený světelný impuls emitovaný živými

bakteriemi. Fotodetektor připevněný k objektivu zachytí tyto impulsy, které jsou počítány

jako individuální bakteriální buňky (IBC).

Průběžně se provádí kalibrace BactoScanu za použití referenčních standardů IBC, které jsou

převedeny na hodnoty KTJ.ml-1. Krok kalibrace umožňuje srovnání výsledků s dalšími

technikami stanovení celkového počtu mikroorganismů.

Přístroj BactoScan 8000 nachází široké využití v analýze syrového mléka, je vhodnou

alternativou ke klasickému kultivačnímu stanovení CPM v syrovém mléce, a to zejména

pokud CPM je v rozsahu přístroje (tj. 4.104 až 8.104 KTJ.ml-1). Jeho hlavní výhodou je

rychlost stanovení (cca 80 vzorků za hodinu). Novější verzí je BactoScan FC+ pracující na

principu průtokové cytometrie (viz kapitola 3.4.3.1.).

3.3.5. Výhody, nevýhody a využití metody DEFT v praxi Metoda DEFT je velmi náročná a pracná technika, která neumožňuje zpracovat velký počet

vzorků a je aplikovatelná pouze při vyšších počtech mikroorganismů v potravině (103 až 104

KTJ.g-1). Pro vlastní hodnocení výsledků je zapotřebí kvalifikovaný pozorovatel. Na druhou

stranu jen málo automatizovaných metod se může rovnat diskriminační síle cvičeného oka.

Nespornou výhodou je rychlost stanovení.

Technika DEFT je obecně použitelná pouze pro syrové potraviny a obvykle pro stanovení

celkového počtu mikroorganismů. Může však být využita i pro detekci a stanovení počtu

patogenních bakterií (salmonely, E. coli O157:H7, L. monocytogenes), a to např. v kombinaci

s fluorescenčně značenými specifickými protilátkami či imunomagnetickou separací. Rutinní

využití našla automatizovaná metoda DEFT při stanovení celkového počtu mikroorganismů

v syrovém mléce (systém Bactoscan), dále při mikrobiologickém vyšetření masa, drůbeže,

ryb, zeleniny či koření.

3.4. Průtoková cytometrie

3.4.1. Základní principy, složení průtokového cytometru Průtokový cytometr je přístroj, který analyzuje částice (buňky, bakterie, jádra) pohybující se

v proudu kapaliny, který protíná soustředěný, stabilní a vysoce intenzivní paprsek světla,

obvykle tvořený laserem. Přístroj zaznamenává charakteristiky každé buňky unášené proudem

a je schopný analyzovat tisíce buněk ve vzorku během sekundy. Mezi vlastnosti

(charakteristiky) částic lze zařadit velikost, tvar, obsah nukleových kyselin, přítomnost

povrchových antigenů, schopnost odrážet či rozptylovat světlo a fluorescenci.

V nejjednodušším typu průtokového cytometru prochází tekutý vzorek přes průtokovou

štěrbinu a je osvětlen laserem. Částice jsou automaticky detekovány mikroskopem


23

zaostřeným na průtokovou štěrbinu. Moderní průtokový cytometr se skládá ze tří hlavních

částí: fluidiky, optiky a elektroniky.

Pro analýzu je nezbytné, aby se buňky nacházely ve formě suspenze, protože musí přístrojem

procházet jedna za druhou konstantní rychlostí. Suspenze buněk se dávkuje do zkumavky, ze

které vychází na dolním konci kapilára. Zkumavka je uložena v nádobce s tzv. plášťovou

tekutinou, která odtéká laminárním prouděním a strhává s sebou z kapiláry jednotlivé buňky.

To, aby prošla měřícím bodem právě jedna částice, je zajištěno tzv. hydrodynamickou

fokusací. Ideální je, aby rozdíl tlaku mezi vzorkem a unášející tekutinou byl malý, v tomto

případě je proud vzorku úzký a v plošném průřezu projde právě jedna buňka (lepší rozlišení).

Proudění vzorku musí být laminární nikoli turbulentní.

Analyzované buňky nebo detekovaná látka uvnitř buněk se vhodnou metodou označí tak, aby

ji mohl rozpoznat detekční systém přístroje. Nejčastěji se tak děje pomocí specifických

fluorochromů. Je vhodné, aby se absorpční maximum fluorochromu co nejvíce blížilo

vlnovým délkám běžně používaných laserů. Vzorek procházející kapilárou je ozářen

monochromatickým zářením laseru. Průtokové cytometry bývají dvoulaserové nebo

třílaserové. Nejčastěji používaným laserem je vzduchem chlazený argonový laser, který

emituje záření s vlnovou délkou 488 nm (modrá oblast spektra).

Sběrnou optiku tvoří soustava filtrů, zrcadel a čoček. Filtry a zrcadla rozdělují emitované

fotony podle vlnové délky na příslušné detektory. V případě bočního rozptylu (SSC) a

fluorescence je intenzita signálu nízká, a proto je potřeba signál zesilovat fotonásobičem. Při

bočním rozptylu je světlo emitováno v úhlu přibližně 90° k dráze paprsku laseru. U přímého

rozptylu (FSC) je intenzita signálu dostatečná, světlo je emitováno v malém úhlu ke směru

dráhy laserového paprsku. Intenzita paprsků FSC je přímo úměrná velikosti buňky, intenzita

poprsků SSC odráží vnitřní komplexitu buněk a je úměrná granularitě buňky (stav cytosolu,

buněčné inkluze, granula, atd.). Podle intenzity paprsků FSC je možné rozlišit živé a mrtvé

buňky, podle SSC buňky granulózní a agranulózní. Signály z optiky jsou v detektorech

převedeny na elektrické impulsy, které jsou zpracovány počítačovým programem. Pro

jednotlivé buňky jsou generována multiparametrická data, která se ukládají do počítače.

Výsledek je vyjádřen graficky v podobě jednoparametrového histogramu (osa x – intenzita

signálu, osa y – četnost) nebo dvouparametrově pomocí dot plotů. V jednom grafu je tedy

možno pozorovat přímý rozptyl, boční rozptyl a fluorescenci (u částic s navázanou

fluorochromem značenou protilátkou). Z grafu se tzv. gatováním vybere populace buněk,

která bude předmětem další analýzy a vytvoří se pro ni dot plot histogram.

3.4.2. Výhody a nevýhody průtokové cytometrie Průtoková cytometrie umožňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu. Jako automatizovaná

metoda nabízí zejména následující výhody: rychlost analýzy (minuty), jednoduchá příprava a

vyšetření velkého počtu vzorků. V rámci jednoho vzorku analyzuje průtokový cytometr

mnoho tisíc jednotlivých částic, což není manuálně možné. Zřejmou výhodou je také

schopnost shromažďovat data o jednotlivých buňkách. Problémy mohou vzniknout při detekci

zřídka se vyskytujících buněk (např. patogenů) na pozadí velkého množství buněk či částic.

Pokud jsou k dispozici specifická fluorescenční barviva pro selektivní značení vybraných

druhů mikroorganismů, je metoda potenciálně velmi specifická.

Jednoznačnou nevýhodou je finanční náročnost, zejména investiční náklady na pořízení

průtokového cytometru. Vzorky nelze dlouhodobě uchovávat, pevné vzorky musí být nejprve

upraveny tak, aby došlo k separaci buněk od sebe. K obsluze cytometru je zapotřebí školený

personál. Jednou z nevýhod použití v mikrobiologii potravin je nedostatečná diskriminace

mezi živými a mrtvými buňkami a rušení stanovení potravinovou matricí.


24

3.4.3. Využití průtokové cytometrie v praxi Základní principy průtokové cytometrie se dají aplikovat i na mikroorganismy, přesto je její

využití v mikrobiologii potravin poměrně malé. V případě bakterií narážíme na několik

specifických problémů, jedním z nich je relativně malá velikost bakteriálních buněk. Většina

komerčně dostupných průtokových cytometrů je vytvořena pro analýzu částic o velikosti

eukaryotních buněk (např. lymfocytů), které jsou několikanásobně větší než bakterie.

Při stanovení počtu mikroorganismů v potravinách, musí být zařazen krok filtrace, který je

nezbytný pro odstranění částic potraviny (hrozí ucpání cytometru). Ke stanovení počtu

bakterií, kvasinek, plísní a spor lze využít např. technologii CHEMUNEX® (automatizované

přístroje D-Count®, BactiFlow®ASL, semi-automatický přístroj BactiFlow®, výrobce

bioMérieux), která umožňuje mikrobiologickou analýzu potravin (např. syrového mléka,

mléčných výrobků, nápojů), vody, výživových doplňků, léčiv a kosmetických přípravků.

Technologie kombinuje fluorescenční značení životaschopných buněk s digitální průtokovou

cytometrií.

Průtoková cytometrie může být využita i k multiparametrické analýze startovacích kultur a

probiotických produktů, kdy se hodnotí přítomnost a) kultivovatelných (životaschopných), b)

metabolicky aktivních, ale nekultivovatelných a c) neživotaschopných bakterií mléčného

kvašení.

Při stanovení patogenů se průtoková cytometrie kombinuje s imunofluorescencí. Barvení

buněk musí být provedeno před vlastní analýzou na průtokovém cytometru. Po přídavku

optimálního množství fluorescenčně značených protilátek následuje krátká inkubace vzorku a

poté promytí k odstranění nenavázaných protilátek. Pokud je stanovení patogenů

kvantitativní, musí být zjištěn objem vzorku, který prošel detekčním bodem přístroje. K tomu

lze použít např. mikrosyrinky s kontrolovaným průtokem. Tímto způsobem lze detekovat

např. L. monocytogenes, salmonely či E. coli O157:H7.

Asi největší využití nachází průtoková cytometrie v lékařství, konkrétně v klinické

imunologii, hematoonkologii, nádorové biologii a v oblasti molekulární biologie.

3.4.3.1. Využití průtokové cytometrie při hodnocení kvality syrového mléka

Širší využití nachází průtoková cytometrie při rutinní analýze kvality syrového mléka,

konkrétně se jedná o stanovení počtu somatických buněk a celkového počtu mikroorganismů.

Pro stanovení počtu somatických buněk se v naší republice často používají průtokové

cytometry Fossomatic™ FC (výrobce Foss) či přístroje řady Somacount (dodavatel

BentleyCzech). V obou případech je fluorochrom navázán na DNA somatických buněk. Při

průchodu buněk kapilárou a po osvitu laserem dojde k emisi záření, které je přístrojem

detekováno.

Ke stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce lze použít BactoCount IBC

(dodavatel BentleyCzech). Vzorek mléka je natažen do karuselu temperovaného na 50 °C,

kde na něj působí směs pufru, proteolytického enzymu a fluorescenčního barviva. Tento

roztok způsobí rozklad somatických buněk, rozpuštění tukových globulí a bílkovin, současně

podpoří propustnost bakterií k obarvení jejich DNA. Během inkubace je vzorek ošetřen

speciálním ultrazvukovým způsobem. Po inkubační periodě je část vzorku přemístěna do

průtokového cytometru, kde jsou jednotlivé bakterie vystaveny laseru a fluoreskují.

Fluorescenční signál je zaostřen optikou, filtrován, a detekován fotonásobičem. Intenzita a

šířka pulsů je zaznamenána a použita jako vstupní parametr. Po kalibraci jsou vytříděné pulsy

přepočítány na individuální počty bakterií. Výsledky i cytogramy jsou archivovány. Různé

modely zpracují 50 až 150 vzorků za hodinu. Na podobném principu pracuje i BactoScan™

FC+ (výrobce Foss), kterým lze během jedné hodiny vyšetřit až 200 vzorků syrového mléka.

Imunologické metody

25

4. IMUNOLOGICKÉ METODY

Imunologické metody jsou obecně založeny na vysoce specifické reakci mezi protilátkou a

antigenem. Tvoří základ celé řady testů, které mohou být v mikrobiologii potravin použity

k detekci a konfirmaci specifických mikroorganismů, zejména alimentárních patogenů, a

některých toxinů. Antigen je molekula schopná vyvolat v živých organismech produkci

specifických protilátek. Jako antigen mohou sloužit specifické části cílového mikroorganismu

(např. lipopolysacharidy v buněčné stěně gramnegativních bakterií, bičíkové proteiny), nebo

toxin či jiný produkt vznikající při růstu mikroorganismu. Protilátky jsou proteiny

produkované bílými krvinkami (aktivované B-lymfocyty) živočichů po jejich infekci cizí

molekulou nebo mikroorganismem. V mikrobiologii potravin se používají v testech určených

k detekci specifických mikroorganismů, proteinů či toxinů.

Uvádí se, že u některých mikroorganismů může docházet ke zkříženým reakcím jejich

somatických antigenů, a proto, i když jsou imunologické metody relativně specifické, nelze je

k potvrzení přítomnosti určitého mikroorganismu použít samostatně. Z tohoto důvodu jsou

výsledky imunologických testů označovány jako presumptivní a musí být potvrzeny

konvenční kultivací s následnou konfirmací sledovaného mikroorganismu. Některé

imunologické metody, jako aglutinační testy, se staly nedílnou součástí řady konfirmačních

postupů (stanovení Salmonella spp., E. coli O157, atd.).

Pravděpodobně nejrozšířenější metodou detekce specifických mikroorganismů v potravinách

je technika ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Využití nachází také metoda

imunomagnetické separace, která umožňuje oddělení cílových mikroorganismů z homogenátů

potravin či pomnožených vzorků a tím snižuje negativní vliv potravinové matrice a

doprovodné mikroflóry. Běžně se používá při stanovení E. coli O157, kde je nejen součástí

referenční kultivační metody, ale i dalších alternativních metod. Technika imunomagnetické

separace je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody ,

proto není v této kapitole dále uvedena.

Využití imunologických metod při vyšetření potravin má některá úskalí. Jedním z nich je

doprovodná mikroflóra, která může inhibovat růst sledovaného mikroorganismu nebo

zkříženě reagovat s použitými protilátkami (falešně pozitivní výsledky). Řada

technologických postupů při výrobě potravin může způsobit subletální poškození

mikroorganismů, které potom nejsou schopny růstu v selektivních médiích. Z tohoto důvodu

je nezbytné zařazení kroku neselektivního pomnožení vzorku před vlastní imunologickou

detekci. Na trhu je v současné době řada testovacích souprav umožňujících detekci běžně se

vyskytujících alimentárních patogenů a jejich toxinů.

4.1. Aglutinační testy Aglutinační testy se řadí do skupiny serologických metod, asi největší využití nachází při

serologické konfirmaci bakterií. Aglutinace je in vitro reakce antigenu se specifickou

protilátkou, která se makroskopicky projevuje viditelným shlukováním. Reakce je obvykle

rychlá, vykazuje vysokou afinitu, vzniklý aglutinát se nerozpadá.

Již řadu let se aglutinační testy využívají v klinické diagnostice infekcí či při serologické

klasifikaci bakterií (např. identifikace Salmonella spp. – Kauffmann-White Antigenic

Scheme). V potravinářské mikrobiologii je důraz kladen především na rychlou konfirmaci

suspektních izolátů. Standardně je aglutinace součástí stanovení Salmonella spp. a E. coli

O157. Trend při vývoji aglutinačních testů je použití nosičů (např. latexových částic), které

umožňují jednodušší odečítání pozitivních reakcí než klasická antiséra. Při vyšetřování

potravin lze úspěšně používat i testovací soupravy určené pro klinickou diagnostiku.


26

Asi nejběžnějším alimentárním patogenem, při jehož identifikaci se používá aglutinační test,

je Staphylococcus aureus. Komerční aglutinační testy umožňují identifikaci S. aureus detekcí

vázané koagulasy (clumping faktor) a proteinu A, a to samostatně nebo v kombinaci.

K průkazu proteinu A se obvykle používají latexové částice s navázanými specifickými

monoklonálními protilátkami, pro detekci vázané koagulasy potom ovčí erytrocyty

senzitivované fibrinogenem – při pozitivní reakci dochází k hemaglutinaci.

Rutinní využití má aglutinace i při identifikaci Escherichia coli O 157:H7 či bakterií rodu

Salmonella. Při konfirmaci salmonel využívají běžné laboratoře obvykle pouze polyvalentní

antiséra, bližší typizaci jednotlivých izolátů provádí specializované laboratoře. Některé

komerční latex-aglutinační soupravy umožňují nejen screening, ale i presumptivní identifikaci

suspektních izolátů, např. Wellcolex® Colour Salmonella Test (výrobce Oxoid Ltd.).

Při detekci bakteriálních toxinů se využívá metoda pasivní reverzní latexové aglutinace

(RPLA). Test se provádí v mikrotitračních destičkách, výsledky jsou k dispozici za cca 24

hodin. Mezi komerčně dostupné testy patří např. SET-RPLA pro stanovení stafylokokových

enterotoxinů A až D, BCET-RPLA pro stanovení diarhogenních enterotoxinů B. cereus či

VTEC-RPLA pro detekci Shigatoxinů ST1 a ST2 (výrobce Oxoid Ltd.).

Problematika serologických metod a jejich využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci


praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie).

4.2. Imunochromatografická metoda Praktické využití v mikrobiologii potravin nachází také imunochromatografické metody,

označované též jako LFIA (Lateral Flow Immuno Assay).

4.2.1. Základní principy Nejběžnějším formátem je plošná imunochromatografie. Na trhu je celá řada různých

provedení testu, jeho základní formát zůstává však stejný. Typicky se test skládá z porózní

nitrocelulózové membrány, na které jsou imobilizovány vazebné proteiny pro cílovou

detekovanou molekulu. Ve většině případů se jedná o specifické protilátky schopné navázat

antigeny přítomné ve vzorku.

Obrázek 8: Schéma imunochromatografického testu. (McMeekin, 2003 – upraveno)


27

Určené množství pomnoženého vzorku se otvorem v krytu testu napipetuje do tzv. okna pro

vzorek, kde je obvykle papírová vrstva umožňující absorpci vzorku. Pod touto vrstvou je

vrstva skleněných vláken obsahující vysušený konjugát – částice s navázanými specifickými

protilátkami proti cílovému antigenu (mohou to být např. částice zlata nebo barevné latexové

částice). Vrstva s konjugátem je připojena k nitrocelulózové membráně. Po aplikaci vzorku

proniká tekutina kapilární difúzí do vrstvy konjugátu a rehydratuje jej. Současně dochází ke

specifické reakci mezi konjugátem a cílovými antigeny.

Vytvořený komplex antigen-konjugát projde až na membránu a putuje směrem k linii

vazebných proteinů (tzv. vazebná nebo testovací linie). Vazebné proteiny jsou specifické

protilátky proti cílovému antigenu, které migrující komplex zachytí a imobilizují.

V testovacím okně dojde v místě vazebné linie k vytvoření zřetelného pruhu či linky, což

indikuje pozitivní výsledek. V závislosti na rychlosti průniku kapaliny porózní membránou,

trvá tento proces obvykle 15 – 20 minut.

Přebytečný (nenavázaný) konjugát vzlíná dál

membránou a je zachycen na dalším místě

membrány, tzv. kontrolní linii, kde jsou navázány

specifické protilátky proti konjugátu. Jejich

hromadění opět vyvolá vznik barevného proužku.

Tato linie slouží ke kontrole funkčnosti testu.

Pokud nedojde k jejímu zvýraznění, je test

neplatný i když vznikne proužek na testovací linii.

Vyhodnocení testu:

pozitivní výsledek – zřetelný barevný pruh

v místě vazebné i kontrolní linie (2 proužky)

negativní výsledek – pruh je vytvořen pouze

v místě kontrolní linie (1 proužek).

4.2.2. Výhody, nevýhody a využití imunochromatografie v praxi Jedná se o velmi rychlou, jednoduše proveditelnou metodu, která nevyžaduje zvláštní

přístrojové vybavení či školený personál a je proveditelná v provozních podmínkách. Určitým

omezením je požadavek na pomnožení vzorku před vlastním stanovením, což samozřejmě

prodlužuje dobu stanovení. Podobně jako u dalších imunologických technik, je nezbytné

potvrdit pozitivní výsledky konvenční metodou.

V klinické diagnostice jsou imunochromatografické metody rutinně používány. Využívají se

při detekci specifických složek moči, krve a ostatních tělních tekutin, dále hormonů, léčiv,

virů či dalších infekčních agens. V potravinářské mikrobiologii nachází své uplatnění při

detekci reziduí antibiotik, hormonů a alimentárních patogenů. Nečastěji se

imunochromatografická metoda používá k detekci Salmonella spp., E. coli O157 a

Shigatoxinů ST1 a ST2, L. monocytogenes či Campylobacter spp., a to v různých potravinách

či environmentálních vzorcích. Komerční soupravy dodává na trh řada firem, např. Merck

KGaA (řada Singlepath či Duopath), Oxoid Ltd, BioControl Inc. (řada VIP), Neogen Corp

(řada Reveal) či Celsis Ltd (řada Path-Stick). Některé testy byly validovány organizací

AOAC (Association of Official Chemists).

Obrázek 9: Výsledek testu.


28

4.3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – ELISA ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), známá také jako EIA (Enzyme

Immunoassay), je široce používaná imunologická technika nejen pro detekci patogenních

mikroorganismů. Je alternativou ke kroku detekce či izolace mikroorganismů na živném

agaru. Je relativně jednoduchá, může být i semi-automatická, výsledky poskytuje dostatečně

rychle. Podle zaměření umožňuje detekovat konkrétní rod, druh či serotyp. Na druhou stranu

je to stále metoda screeningová, pozitivní výsledky musí být potvrzeny klasickým způsobem.

4.3.1. Základní principy Jako všechny imunologické metody, je i ELISA založena na principu specifické vazebné

reakce mezi antigenem a protilátkou. V ELISA testech se používají monoklonální nebo

polyklonální protilátky. Polyklonální protilátky jsou produkovány při imunitní odpovědi

hostitele na infekci organismu relativně velkou molekulou (protein, mikroorganismus), jsou

produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů, a proto jsou namířeny proti více

epitopům určitého antigenu. Monoklonální protilátky jsou produkované jedním klonem B-

lymfocytů po styku s jedním konkrétním antigenním epitopem, připravují se na tkáňových

kulturách.

Ke značení protilátek se v ELISA metodě používá enzym, obvykle schopný katalyzovat

přeměnu bezbarvého substrátu na barevný produkt (případně může dojít i ke změně barvy

substrátu). Díky tomu je hodnocení testu vizuální nebo spektrofotometrické. Nejčastěji se

využívá enzym alkalická fosfatasa reagující s para-nitrofenyl fosfátem nebo křenová

peroxidasa reagující s tetramethylbenzidinem. V obou případech vzniká barvený produkt.

Reakce probíhající v průběhu ELISA testu vždy vyžadují nějaký pevný nosič, na který jsou

kovalentně vázány či adsorbovány protilátky, příp. antigen. Nejčastěji se jedná o mikrotitrační

destičky či mikrozkumavky, lze použít i papírové membrány nebo polystyrenové tyčinky.

4.3.2. Konfigurace ELISA metod používaných v mikrobiologii potravin V mikrobiologii potravin je detekce obvykle zaměřena na průkaz antigenu (bakterie, toxin)

pomocí známých protilátek. Tomu odpovídají i typy ELISA metod, které se používají.

Prvním krokem je vždy pokrytí pevného nosiče specifickými protilátkami nebo antigeny.

V případě, že test používá statický nosič (např. mikrotitrační destičku),jsou vzorek a další

reagencie v několika fázích postupně přidávány do jamek. Při použití polystyrenových

tyčinek (tzv. dipstick) je pevný nosič navržen tak, aby byl přenosný. Antigeny navázané na

pevném nosiči (tyčince) mohou být přenášeny do různých živných médií (podpora růstu a

namnožení cílových buněk), po přenesení do roztoku substrátu dojde k barevné reakci.

4.3.2.1. Sendvičová ELISA

Nejjednodušším a nejčastěji používaným formátem v komerčních testech používaných při

vyšetření potravin je sendvičová (angl. sandwich) ELISA. „Sendvič“ v tomto případě

znamená, že je cílový antigen obalen dvěma protilátkami. V průběhu testu je antigen nejprve

zachycen a poté detekován. Prvním krokem každého sendvičového ELISA testu je pomnožení

vyšetřované potraviny.

Vazebné (imobilizované) protilátky, specifické pro cílový antigen, jsou navázány na povrch

pevného nosiče, např. jamky mikrotitrační destičky. Po přídavku pomnoženého vzorku

potraviny dojde, v případě přítomnosti cílových antigenů, k jejich vazbě na protilátky. Po

promytí, kterým se odstraní zbytky vzorku, následuje přídavek detekčních, enzymaticky

značených protilátek. Detekční protilátky se váží na cílové antigeny a vytvoří se „sendvič“.

Několikanásobným promytím se odstraní nenavázané protilátky. Po přídavku substrátu


29

katalyzuje enzym jeho přeměnu na barevný produkt. Na závěr lze přidat tzv. stop roztok,

který ukončí enzymovou aktivitu. Vzniklá barevná reakce je hodnocena vizuálně nebo

spektrofotometricky. Celková doba trvání testu je asi 2 až 3 hodiny. Metodu lze využít nejen

ke kvalitativnímu, ale i semikvantitativnímu či kvantitativnímu stanovení (kalibrací

koncentrace antigenu proti intenzitě barvy).

Obrázek 10: Hlavní kroky sandwich-ELISA testu.

4.3.2.2. Nepřímá sendvičová ELISA

V tomto typu ELISA metody nejsou detekční protilátky značené enzymem, ale nesou marker

– molekulu se specifickou vazebnou kapacitou pro jinou molekulu, např. protein. Nejčastěji je

jako marker používán biotin, který má vazebné proteinové místo pro avidin. Po přídavku

komplexu avidinu a enzymu (např. streptavidin-křenová peroxidasa), dojde k jeho navázání

na biotin. Tímto způsobem vznikne enzymaticky značená protilátka. Přítomný enzym opět

katalyzuje přeměnu substrátu na barevný produkt.

Obrázek 11: Nepřímá sendvičová ELISA – schéma.

4.3.2.3. Kompetitivní ELISA

V tomto případě jsou na dno testovací jamky (pevný nosič) navázány antigeny. Vzorek a

enzymaticky značené protilátky jsou do jamky přidány současně. Jsou-li ve vzorku přítomny

cílové antigeny, nastává kompetice (soutěžení) o vazebná místa. Značené protilátky se

přednostně váží na cílové antigeny ve vzorku, část protilátek se může vázat i na antigeny

imobilizované na dně jamky (čím více je cílových antigenů, tím méně protilátek se naváže na

imobilizované antigeny). Během následného promývání je komplex cílový antigen-protilátka

z jamky odstraněn. Už bylo zmíněno, že změna barvy na konci testu je způsobena výhradně

přítomností komplexu protilátka-imobilizovaný antigen na dně jamky. Při pozitivním průkazu

cílových antigenů ve vzorku je tedy výsledné zbarvení velmi slabé nebo zcela bezbarvé. Což

je zcela naopak oproti sendvičové ELISA metodě (pozitivní výsledek – intenzivní barva,

negativní výsledek – bezbarvé nebo velmi slabě zbarvené).


30

Obrázek 12: Kompetitivní ELISA – pozitivní průkaz cílového antigenu.

Naopak nejsou-li ve vzorku přítomny cílové antigeny, značené protilátky se váží na

imobilizovaný antigen na dně jamek. Po přídavku substrátu katalyzuje enzym jeho přeměnu

na barevný produkt. Negativním výsledkem je tedy změna barvy.

Obrázek 13: Kompetitivní ELISA – negativní průkaz cílového antigenu.

Podobně jako sendvičová ELISA, může být kompetitivní ELISA přímá či nepřímá a může

sloužit nejen ke kvalitativnímu, ale i kvantitativnímu stanovení. Tento typ se nejčastěji

používá pro detekci malých molekul.

4.3.3. Komerčně dostupné ELISA soupravy V mikrobiologii potravin se nejčastěji využívají ELISA sety určené pro detekci alimentárních

patogenů či jejich toxinů – zejména se jedná o Salmonella spp., Listeria spp., E. coli

O157:H7, Campylobacter spp., stafylokokové enterotoxiny, diarhogenní enterotoxiny B.

cereus, Shigatoxiny a neurotoxiny C. botulinum. Nejčastěji jsou to soupravy na bázi sandwich

ELISA využívající jako pevný nosič mikrotitrační destičky. Jamky jsou obvykle samostatné,

před testem se vždy potřebný počet zasune do rámu destičky. Typická souprava mimo jamek

s navázanými protilátkami, zahrnuje koncentrovaný promývací roztok, lyofilizované

enzymaticky značené protilátky (konjugát), lyofilizovaný substrát, ředicí roztoky a pozitivní a

negativní kontrolu. K vizuálnímu hodnocení je k dispozici barevná šablona, případně lze

použít reader mikrotitračních destiček. Promývací kroky lze provádět ručně nebo

automaticky. Na trhu jsou dostupné i zcela automatizované systémy vyžadující minimum

ruční práce.

Nově jsou vyvíjeny formáty, do kterých jsou začleněny kroky využívající další imunologické

techniky, např. separace bakterií za použití imunomagnetických částic (IMS). Takto

koncentrované antigeny jsou následně využity jako vzorek pro ELISA test.


31

Produkcí ELISA testů se zabývá řada

výrobců – TECRA (řada TECRA-VIA se

provádí v mikrotitračních destičkách, v řadě

UNIQUE je pevným nosičem přenosná

polystyrenová tyčinka), bioMérieux (řada

TEK, pevnou fází je mikrotitrační destička,

uvedený systém je kombinovatelný také s

imunomagnetickými částicemi), Merck,

BioControl a další. Plně automatizovaným

systémem je EiaFoss (výrobce FossElectric)

se zařazenou fází imunokoncentrace pomocí

magnetických částic. Dostupné jsou

soupravy pro detekci Salmonella spp., Listeria spp., E. coli O157 a Campylobacter spp.

4.3.4. Výhody, nevýhody a využití ELISA metod v praxi Citlivost většiny ELISA testů je přibližně 105 buněk v ml, což je jednou z hlavních nevýhod

této metody. Při stanovení patogenních mikroorganismů v potravinách je obecně požadavkem

detekce 1 buňky ve 25 g (ml) potraviny, z tohoto důvodu je nezbytné před vlastním ELISA

testem provést pomnožení vzorku ve vhodném živném médiu. Současně krok pomnožení

umožňuje resuscitaci subletálně poškozených buněk (účinek tepelného ošetření, mrazení,

nízkého pH či chemických konzervantů). To je významné zejména při stanovení patogenů

s nízkou infekční dávkou, jako je E. coli O157:H7 nebo C. jejuni. Další možností zvýšení

citlivosti metody je již zmíněné využití imunomagnetické separace.

ELISA metody mají dostatečnou specifitu, a to díky používaným protilátkám, které mají

vysokou afinitu k cílovým antigenům a vykazují nízkou úroveň zkřížených reakcí s jinými

mikroorganismy. Více specifické jsou soupravy obsahující monoklonální protilátky. U

některých typů potravin může docházet k nespecifickým reakcím, tomu se lze vyhnout jejich

vhodnou úpravou před vlastním stanovením.

Provedení ELISA metody je jednoduché a rychlé, u většiny testů trvá asi 2 až 3 hodiny.

Největší výhodou je využití ELISA metody při negativním screeningu vzorků, její zařazení

umožní zvýšení počtu vyšetřených vzorků a podstatné zkrácení doby vyšetření (negativní

výsledky jsou k dispozici cca za 24 – 30 hodin). Na druhou stranu se jedná o screeningovou

metodu, takže pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny klasickou metodou.

Náklady na provedení ELISA metody jsou nepochybně vyšší než u ekvivalentního

konvenčního testu, na druhou stranu je ale vyvažují poskytované výhody (např. nižší

požadavky na pracovní sílu či rychlejší uvolňování výrobků s negativním průkazem

sledovaného mikroorganismu či toxinu).

Určité problémy mohou nastat při stanovení stafylokokových enterotoxinů, kdy součástí

soupravy je i pozitivní kontrola – čistý toxin. Stafylokokové enterotoxiny patří mezi vysoce

rizikové toxiny a pro jejich použití platí v České republice přísné legislativní předpisy, které

musí každá laboratoř pracující s touto látkou respektovat (více kapitola 8.1.4.).

Jak již bylo zmíněno výše, hlavní využití ELISA metod v potravinářské mikrobiologii je

detekce vybraných alimentárních patogenů či jejich toxinů. Stanovení může být prováděno

v různých druzích potravin. Příslušné ELISA soupravy jsou na trhu běžně dostupné.

Obrázek 14: ELISA souprava.


32

4.4. Enzyme-Linked Fluorescent Assay – ELFA Plně automatický systém založený na fluorescenční imunologické metodě ELFA (Enzyme-

Linked Immunofluorescent Assay) využívá přístroj VIDAS® (Vitek Immuno Diagnostic Assay

System) vyvinutý francouzskou firmou bioMérieux.

4.4.1. Základní principy ELFA je založena na specifické reakci antigen-protilátka a princip reakce je podobný jako u

ELISA metody. Rozdíl spočívá v použitém substrátu, který je enzymem štěpen na

fluorescenční produkt. Vzniklé chemické změny detekuje fotodiodový fluorimetr.

Obrázek 15: VIDAS souprava (reagenční strip, SPR® a kontroly) a přístroj miniVIDAS®.

Testy využívané přístrojem VIDAS® se skládají ze dvou částí. První částí jsou tzv. „pipety“,

označované jako komůrka s pevnou fází (SPR®), jejichž vnitřní část je potažena protilátkou

specifickou k hledanému antigenu. Druhou částí je reagenční strip složený z deseti jamek.

První z nich je prázdná, do ní se pipetuje upravený vzorek – zpravidla o objemu 500 µl.

Dalších osm jamek obsahuje promývací roztoky nebo reagenční roztoky, konjugát z části

tvořený alkalickou fosfatasou a substrát 4-methyl-umbeliferyl fosfát.

Hledaný antigen (bakterie nebo např. stafylokokový enterotoxin SEA – SEE) se naváže na

protilátku uvnitř SPR® a v průběhu promývacích kroků se odstraní nenavázané složky vzorku.

Fluorogenní substrát 4-methyl-umbeliferyl fosfát, používaný v testu, je enzymem alkalickou

fosfatasou navázanou na komplex antigen-protilátka konvertován na fluorescenční produkt 4-

methyl-umbeliferon. Poslední jamka stripu je optická kyveta, ve které je změřena intenzita

fluorescence při 450 nm pomocí fotodiodového fluorimetru.

Na konci analýzy je pro každý vzorek stanovena relativní fluorescenční hodnota (RFV) a

přístroj tyto výsledky automaticky analyzuje. Stanovená hodnota se porovná s interními

referenčními hodnotami a provede se interpretace jednotlivých výsledků (pozitivní/

negativní), které jsou následně přístrojem vytištěny.

Novinkou a významnou inovační technologií firmy bioMérieux je využití rekombinantních

fágových proteinů v systému VIDAS. V současnosti se tato technologie používá při detekci

salmonel, listerií a E. coli O157:H7 v potravinách. U takto inovovaných testů není vnitřek

SPR komůrky potažen protilátkou proti detekovaným bakteriím, ale specifickými fágovými

proteiny. Rekombinantní fágové proteiny jsou části bakteriofágů (používá se tzv. „tail fiber

protein“), které mají schopnost se specificky navázat na receptory bakterií. Nová technologie

je jedinečná díky své citlivosti. Další postup enzymové metody zůstává zachován jako

v případě použití protilátek.


33

4.4.2. Provedení metody a vyhodnocení výsledků Soupravy se skládají z reagenčních stripů (zpravidla 30 – 60 ks) a příslušného počtu SPR®

komůrek, standardů a pozitivní i negativní kontroly. K dispozici je také ředicí roztok.

Nezbytnou součástí každé soupravy je MLE karta (Master Lot Entry) s čárovými kódy, která

je před vlastním využitím soupravy vkládána do přístroje. Karta umožní načtení dat

potřebných pro kalibraci testu a závěrečné vyhodnocení analýzy a současně dohlíží na to, aby

v testu nebyly použity stripy po uplynutí doby exspirace. Kalibrace přístroje pomocí karty,

standardů, pozitivních a negativních kontrol je nutná u každé nové soupravy.

Vlastní analýze na přístroji VIDAS® předchází vždy zpracování vzorků. V případě průkazu

stafylokokových enterotoxinů se vzorky nejprve homogenizují s destilovanou vodou,

upravuje se pH na hodnotu v rozmezí 3,5 – 4,0 pomocí 5 M HCl, po odstředění se upravuje

pH čirého supernatantu 1M NaOH na hodnotu v rozmezí 7,5 – 8,0 a znovu se vzorek

odstřeďuje. Pro analýzu se použije získaný supernatant. V případě detekce patogenních

bakterií spočívá příprava vzorků v jejich homogenizaci v pufrované peptonové vodě

s přídavkem suplementů a inkubaci. Může následovat pomnožení v dalších pomnožovacích

půdách. Takto zpracované vzorky se pipetují vždy v množství 500 µl do první jamky stripu.

Obrázek 16: Schéma reagenčního stripu s pevnou fází (SPR®). (McMeekin, 2003 – upraveno)

Reagenční stripy s aplikovanými vzorky se vloží do přístroje

VIDAS®. Vložení každého stripu musí být doplněno

zasunutím špičky (SPR® fáze) na příslušnou pozici shodnou s

dráhou proužku (obrázek 15). Každý vyšetřovací set má své

barevné označení. Je nutné, aby si barevné štítky s kódem testu

na SPR® fázi a stripu odpovídaly a bylo zřejmé, že pochází z

jednoho typu testu. Poté se přístroj spustí a na displeji se

označí názvy vzorků v jednotlivých drahách. V průběhu testu

se SPR® postupně zasunuje do jamek s reagenciemi. Ty jsou

vždy nasáty do špičky a po ukončení daného kroku opět

vypuštěny do příslušné jamky stripu (obrázek 16). V závěru

analýzy je SPR®, obsahující v případě pozitivního výsledku

komplex imobilizovaná protilátka-antigen-konjugát, naplněna

fluorogenním substrátem z poslední jamky. Proběhne

enzymatická reakce a obsah je uvolněn zpět do optické kyvety,

kde je změřena hladina fluorescence. Výsledky jsou

k dispozici za 48 – 90 minut, podle typu testu. Výsledky pro

jednotlivé vzorky (pozitivní/negativní) přístroj vytiskne.

Obrázek 17: Vyhodnocení.


34

4.4.3. Výhody, nevýhody a využití metody ELFA v praxi Významnou výhodou této automatizované metody je velká časová úspora v případě detekce

patogenních bakterií, což platí pro všechny vyšetřovací soupravy z oblasti mikrobiologie

potravin. Nejlépe to lze demonstrovat na průkazu salmonel a listerií. Běžná detekce salmonel

nebo L. monocytogenes pomocí časově náročných kultivačních metod trvá zpravidla až 5 dní.

ELFA metoda jejich průkaz zjednodušuje a zrychluje, což uvítají zvláště výrobci potravin, pro

něž je negativní výsledek testů podmínkou pro expedování potravin do tržní sítě. Nejnovější

testy, které využívají rekombinantní fágový protein, umožní obdržet výsledek průkazu

salmonel dokonce do 27 hodin. Výjimku tvoří mléčné výrobky, kde je součástí standardního

postupu vyžadován krok pomnožení vzorku v selektivním bujonu a tím se celá analýza

prodlouží o 6 – 8 hodin. I přesto je však doba získání výsledků zkrácena o polovinu.

Vyhodnocování mikrobiologických analýz při použití kultivačních metod včetně provedení

konfirmačních testů vyžaduje vždy velké zkušenosti pracovníků mikrobiologické laboratoře.

U VIDAS testů pracovníci obdrží jednoznačný výsledek v podobě automaticky vytištěného

zápisu s pozitivním nebo negativním výsledkem. Odpadá tak riziko subjektivního hodnocení

výsledků. Příprava vzorků určených pro analýzy ve VIDAS přístroji je jednoduchá.

I v případě detekce stafylokokových enterotoxinů (SEs) je za výhodu považována rychlost

získání výsledků (do 3 hodin) a jednoduchá příprava vzorků. Nevýhodou je, že SEs (SEA –

SEE) přítomné ve vzorku jsou detekovány jako suma a z výsledků nelze vyvodit, který typ

enterotoxinu je v potravině přítomen. Legislativou požadovaná citlivost pro průkaz SEs ve

vzorcích potravin umožňuje metodu ELFA k těmto analýzám použít (viz kapitola 8.1.4.).

Citlivost metody ELFA se v případě detekce SEs pohybuje od 0,5 ng.g-1 (ml-1) (pro SEA a

SEB) do 1,0 ng.g-1 (ml-1) (pro SEC, SED a SEE). Pro srovnání lze uvést citlivost ELISA testů,

které detekují 0,1 – 1,0 ng enterotoxinu na 1 g (ml) potraviny.

Možnost využití všech výhod, které automatizovaný systém VIDAS nabízí, je spojena

s finanční investicí mikrobiologických laboratoří do nákupu přístroje. Časová úspora oproti

kultivačním metodám bývá taktéž spojena s vyšší cenou vyšetření z důvodu nákupu

vyšetřovacích souprav.

Automatizovaný přístroj VIDAS má široké uplatnění v klinické medicíně při diagnostice

virové hepatitidy, viru EBV (Epstein-Barrová virus známý také jako lidský herpesvirus 4

způsobující infekční mononukleózu) a HIV (původce nemoci AIDS), dále při stanovení

Clostridium difficile, biochemických markerů (onkologická onemocnění, nemoci

kardiovaskulárního systému) a dalších.

V mikrobiologii potravin je přístroj VIDAS využíván při detekci Listeria spp., Listeria

monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Campylobacter spp. a

stafylokokových enterotoxinů typu A – E.

Metody molekulární biologie

35

5. METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Ke konci 20. století se začaly velmi rychle rozvíjet genotypové metody. Ty se zaměřují na

studium polymorfizmu molekul DNA nebo RNA (rozdílností v primární struktuře nukleových

kyselin). Poskytují velmi přesné, objektivní a reprodukovatelné výsledky a umožňují také

identifikovat nekultivovatelné mikroorganismy. Dále eliminují speciální růstové požadavky a

zkracují čas potřebný ke správné identifikaci. Tyto metody významně zvýšily kvalitu

identifikace mikroorganismů. Genotypové metody jsou zaměřeny buď na celkovou DNA, na

určitý úsek DNA či RNA nebo na analýzu plazmidové DNA.

V dnešní době je pro rodovou a druhovou identifikaci bakterií k dispozici celá řada

molekulárně biologických metod. U některých je potřeba velkého množství DNA či RNA ve

vzorku, neboť nedochází k amplifikaci (namnožení) cílových nukleových kyselin. Mezi tyto

klasické metody řadíme např. Southern blot a nothern blot. Oproti tomu amplifikační metody

(založené na polymerázové řetězové reakci) se vyznačují vysokou sensitivitou a specifitou a

jsou dobře funkční i při nízkém množství cílových nukleových kyselin v analyzovaném

vzorku.

5.1. Způsoby izolace nukleových kyselin Prvním krokem v provedení genotypových metod je extrakce nukleové kyseliny a její

oddělení od ostatních složek buňky. Může se izolovat chromosomální DNA, plasmidová

DNA a virová DNA či RNA, a to přímo ze vzorku, pomnožovacího média nebo z kolonií

mikroorganismu na agarové půdě. Existuje celá řada metod extrakce a purifikace nukleových

kyselin. Při výběru izolační techniky se zohledňuje požadavek na kvalitu a množství nukleové

kyseliny, neboť ve velké míře rozhoduje o úspěšnosti navazujících molekulárně biologických

metod. Také je brána v potaz časová náročnost, finanční nákladnost metody a zdroj nukleové

kyseliny (typ vzorku či druh mikroorganismu).

5.1.1. Izolace nukleové kyseliny prokaryot Obecný postup získání nukleových kyselin zahrnuje narušení buněčných membrán a uvolnění

buněčného obsahu, separaci nukleové kyseliny a v případě izolace DNA také odstranění

RNA. K ruptuře buňky se využívají detergenty iontové povahy (např. soli žlučových kyselin

či dodecylsulfát sodný – SDS), neionogenní detergenty (např. Triton X100), nebo fyzikálně-

chemické postupy (např. ultrazvuk). K oddělení nukleové kyseliny z roztoku buněčného

obsahu se používá teplotní denaturace (záhřev), srážení organickými rozpouštědly,

vysolování, fenol-chloroformová extrakce, chelatační iontoměničové pryskyřice, silikátové

kolonky nebo paramagnetické nosiče. Molekuly RNA je možné degradovat enzymem

ribonukleasou (RNasou), proteiny např. enzymem proteinasou.

Problematika izolace nukleové kyseliny prokaryot je podrobně studována v rámci předmětu Mikrobiologie

potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná

mikrobiologie).

5.1.2. Izolace nukleové kyseliny virů Viry představují zvláštní kategorii živých soustav. Vyznačují se nebuněčnou strukturou a

závislostí na hostitelské buňce. V laboratoři se mohou kultivovat na tkáňových kulturách,

avšak u většiny alimentárních virů (např. noroviry, viry hepatitidy A a E) je tato kultivace

velmi obtížná nebo dokonce nemožná. Proto je detekce v potravinách založena na

molekulárně biologických metodách (PCR u DNA virů, reverzně transkripční PCR u RNA

virů). Tyto metody však neumožní jednoznačně rozlišit infekční virové částice od

neinfekčních. Zatím jen velmi málo mikrobiologických laboratoří analyzujících potraviny je


36

vhodně vybaveno pro rutinní práci s viry a také je velmi málo standardizovaných postupů

izolace a detekce virů. Nukleová kyselina se může z potravinové matrice izolovat buď přímo,

nebo až po izolaci a zakoncentrování virových částic. Existuje celá řada postupů, u kterých se

jednotlivé kroky dají kombinovat, avšak ne všechny jsou vhodné pro použití na všechny typy

potravin a všechny viry, které způsobují alimentární onemocnění.

Technika izolace virových částic se vybírá podle typu matrice (liší se pro potraviny

s vysokým obsahem sacharidů, nebo tuků a bílkovin, mořské živočichy s exoskeletem, vzorky

vody, prostředí nebo fekálií). Používá se elučních technik (pomocí pufrů) s následným

zakoncentrováním virových částic (pomocí polyethylenglykolu – PEG, imunomagnetické

separace, ultracentrifugace nebo filtrace elektricky nabitými filtry) a ošetření proteinasou K.

Po zakoncentrování virových částic je potřeba uvolnit nukleovou kyselinu z virových obalů,

odstranit nežádoucí zbytky hrubých lyzátů a nukleové kyseliny zakoncentrovat. Pro narušení

virových obalů lze použít specifické enzymy či detergenty (SDS, laurylsulfát sodný),

sonifikaci ultrazvukem nebo speciální přístroj „bead beater“, který protřepává biologický

materiál se skleněnými či zirkonovými kuličkami, které mechanicky narušují virový obal. Pro

alimentární viry, které nejsou obalené a mají pouze proteinovou kapsidu, stačí působení

fenolu (případně ve směsi s chloroformem). Nežádoucí proteiny z hrubého lyzátu se

odstraňují proteinasami, RNA (v případě izolace DNA) RNasami a DNA (v případě izolace

RNA) DNasami. Manipulaci s RNA je nutno provádět v ledové lázni, používat ochranné

rukavice a pracovat za aseptických podmínek.

Pro přímou extrakci nukleové kyseliny z potravinové matrice lze použít guanidin

isothiokyanát (GITC), který má destruktivní účinek na všechny komponenty vzorku kromě

nukleových kyselin. V potravinách živočišného původu se pro uvolnění nukleové kyseliny

z tkáně dá použít také přístroj „bead beater“. Poté následuje extrakce fenolem nebo

ultracentrifugace v chloridu cesném a precipitace nukleové kyseliny ethanolem či

izopropylalkoholem (u RNA v přítomnosti LiCl).

Existují komerční soupravy (silikátové kolonky, chromatografické systémy, atd.), které mají

výhodu snadného provedení, avšak jsou finančně nákladnější a hlavně nejsou vhodné pro

každou izolaci virové DNA či RNA.

5.2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Základem pro mnohé molekulárně biologické metody je polymerázová řetězová reakce

(Polymerase Chain Reaction). Pomocí této techniky může být za podmínek in vitro rychle a

vysoce selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená v DNA.

Problematika polymerázové řetězové reakce, včetně detekce PCR produktů, je podrobně studována v rámci


praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie).

5.2.1. Základní principy Principem PCR je opakované kopírování (amplifikace) templátové (vzorové) molekuly DNA

pomocí enzymu DNA-polymerasy. Syntéza DNA je řízena dvěma krátkými oligonukleotidy

(primery), které se komplementárně párují s templátovou DNA na počátku a na konci

amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové molekuly DNA.

V průběhu polymerázové řetězové reakce se opakovaně střídají 3 kroky. Prvním krokem je

denaturace, kdy obvykle při 95 °C dojde k uvolnění vodíkových můstků a z dvouřetězcové

DNA (dsDNA) vzniknou dvě jednořetězcové DNA (ssDNA). Následuje annealing – připojení (hybridizace) primerů k templátové ssDNA. Tím dojde k ohraničení cílové


37

sekvence, která bude amplifikována. Tento krok probíhá při teplotě 50 až 65 °C. Ta závisí na

bodu tání primerů (Tm), jejich délce a nukleotidové sekvenci. U tohoto kroku je nutné provést

optimalizaci. Poté následuje poslední krok, syntéza nového vlákna DNA (vznik dsDNA), tzv.

elongace. Probíhá obvykle při teplotě 72 °C a kromě DNA-polymerasy jsou nutné všechny

čtyři 2´-deoxyribonukleosid-5´-trifosfáty (dNTPs – adenin, guanin, cytosin a thymin).

Přesné hodnoty teploty a dobu trvání jednotlivých kroků je třeba optimalizovat. Tyto kroky se

25 až 35 cyklicky opakují. Optimální počet cyklů je závislý na výchozí koncentraci

templátové DNA. Nově vytvořená DNA se v dalším cyklu stává matricí (templátovou DNA).

Celý proces amplifikace probíhá v přístroji termocykler, v němž se teplota mění automaticky

v naprogramovaných časových intervalech.

Aby byl zabezpečen správný průběh PCR, je potřeba připravit reakční směs (master mix)

obsahující templátovou DNA, primery, dNTPs, reakční pufr, hořečnaté kationty, PCR H2O a

DNA-polymerasu (nejčastěji se používá termostabilní Taq polymerasa izolovaná z termofilní

bakterie Thermus aquaticus). Výsledným produktem polymerázové řetězové reakce jsou

amplikony, úseky DNA s definovanou délkou, o velikosti obvykle desítky až tisíce párů bazí

(bp). Koncentrace a množství jednotlivých komponent reakční směsi hraje rozhodující roli při

tvorbě PCR produktu a stanovuje se empiricky.

Správný průběh reakce se sleduje systémem kontrol. Ty nám mohou indikovat např.

kontaminaci PCR komponent (negativní kontrola) nebo funkčnost všech složek reakce

(pozitivní kontrola). Aby nedocházelo ke křížovým kontaminacím, je potřeba mít od sebe

oddělené prostory pro izolaci DNA, přípravu reakční směsi (nejlépe laminární box) a

manipulaci s PCR produkty, včetně samostatných pomůcek pro každou z těchto činností. Tyto

místnosti by se měly pravidelně dekontaminovat UV světlem.

Pro rutinní provádění polymerázové řetězové reakce jsou dostupné komerčně předpřipravené

PCR master mixy (např. od firmy Top-Bio, s.r.o. či Qiagen, GmbH) obsahující DNA-

polymerasu, reakční pufr, MgCl2, barvivo a aditiva potřebná pro detekci amplikonů

agarózovou gelovou elektroforézou.

5.2.2. Detekce PCR produktů K analýze produktů polymerázové řetězové reakce mohou být použity různé metody. Např.

hybridizace, ELISA nebo sekvenční analýza. Avšak snadná, levná a asi nejužívanější je

separace amplikonů pomocí agarózové gelové elektroforézy (ELFO). PCR produkty migrují

agarózovým gelem na základě jejich záporného náboje od katody ke kladně nabité anodě,

rychlost pohybu molekul DNA je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Amplikony jsou

obarveny např. ethidium bromidem (barvivo interkalující se mezi vlákna dsDNA).

V ultrafialovém světle obarvený fragment DNA oranžově fluoreskuje. Bezpečnější

alternativou ke karcinogenní, mutagenní a teratogenní látce ethidium bromid je barvení PCR

produktů pomocí látky Midori Green, která emituje zelenou fluorescenci.

Podle velikosti amplifikovaného fragmentu, určené porovnáním s markerem, tj. velikostním

standardem obsahujícím různě dlouhé fragmenty DNA, usuzujeme na přítomnost

specifického genu ve vzorku.

5.2.3. Modifikace PCR Polymerázová řetězová reakce je používána v široké škále variant, které jsou upraveny podle

účelu analýzy. U mnohonásobné multiplex PCR je možná detekce více genů v jedné reakci

současně. Podle počtu požadovaných amplikonů, obsahuje master mix počet párů primerů.

Primery musí být navrženy tak, aby se výsledné PCR produkty daly odlišit svou velikostí

nebo byly značeny různými fluorofory (u real-time PCR). Tato varianta PCR je výhodnější


38

než provedení samostatných amplifikací, zejména z hlediska časového i ekonomického

(ušetření komponent reakční směsi). Avšak optimalizace metody je náročnější než s jednou

sadou primerů. Obecně platí, že jsou amplifikovány maximálně 4 různé cílové sekvence pro

zajištění adekvátní citlivosti, specifičnosti a snadné interpretace dat. Využívá se často pro

stanovení několika bakteriálních druhů současně (např. Campylobacter jejuni a C. coli) nebo

při detekci genů kódujících stafylokokové enterotoxiny či genů rezistence.

Odstupňovaná PCR (nested PCR) neboli PCR využívající vnějších a vnitřních primerů.

Tento typ PCR probíhá ve dvou krocích a vyznačuje se vysokou citlivostí. V prvním kroku

dochází k amplifikaci za účasti prvního, vnějšího páru primerů, poté se PCR produkt stává

matricí další polymerázové řetězové reakce a amplifikuje s druhým, vnitřním párem primerů.

Zpětná neboli reverzní PCR (RT-PCR) je metoda určená k amplifikaci molekul RNA. RNA

je nejprve přepsána na cDNA (komplementární DNA) enzymem zpětná transkriptasa. Tento

enzym je termolabilní (již nad 40 °C ztrácí svoji funkčnost), stringence (podmínky ovlivňující

sílu a specifitu hybridizace) reakce je poměrně nízká (dochází k nekomplementárnímu

párování bazí a transkripce tak není dokonalá). Proto se nyní využívá enzym Tth DNA-

polymerasa (RNA-dependentní DNA-polymerasa), která umožňuje nejen přepis RNA do

DNA při teplotě 72 °C, ale i vlastní amplifikaci a tvorbu PCR produktu.

Speciálním typem polymerázové řetězové reakce je in situ-PCR. Při této metodě probíhá

amplifikace specifické sekvence nukleové kyseliny přímo v buňce či tkáni. Postup zahrnuje

šetrnou fixaci buněk k podložnímu sklu a nastavení podmínek pro permeabilitu nezbytných

PCR reagencií do buňky. Detekce probíhá pomocí in situ hybridizace nebo imunochemicky.

Jak prokaryotické, tak eukaryotické genomy obsahují

repetitivní (opakující se) sekvence. Mezi těmito dlouhými

repetitivními elementy se v genomu prokaryot nacházejí

také relativně krátké nekódující sekvence. Při

interrepetitivní (repetitivní) PCR (REP-PCR) dochází

právě k amplifikaci těchto sekvencí oddělujících

v genomu různé typy repeticí. Tímto typem PCR se získá

soubor různě dlouhých amplikonů charakteristický pro

daný mikroorganismus (obrázek 18). Profil genomu

konkrétního mikroorganismu zobrazený spektrem PCR

produktů (případně restrikčních fragmentů) se nazývá

fingerprint. Pomocí počítačového softwaru se amplikony

jednotlivých izolátů porovnávají s typovými kmeny,

vytvoří se dendrogram a izoláty se identifikují. Touto

metodou za použití různých primerů (např. (GTG)5) lze

rozlišit některé druhy bakterií mléčného kvašení, např. při

studiu diversity startovacích a doplňkových kultur. Velké

využití má tato metoda jako typizační technika při

genotypizaci izolátů mikroorganismů.

Další fingerprintovou metodou založenou na PCR, pomocí níž lze zobrazit profil DNA

konkrétního organismu, je náhodná PCR (RAPD). Tato rychlá a jednoduchá metoda se

používá k identifikaci a typizaci některých druhů bakterií. U RAPD se krátký

oligonukleotidový primer náhodně váže k templátové DNA a vzniká soubor amplikonů

charakteristický pro daný mikroorganismus (podobně jako u rep-PCR). Pomocí agarózové

gelové elektroforézy jsou detekovány amplifikované fragmenty různé velikosti a tím se

vytvoří specifický fingerprint pro testovaný mikroorganismus.

Obrázek 18: Agarózová gelová

elektroforéza amplikonů vzniklých

pomocí rep-PCR. (U izolátů v běhu

č. 3, 5 a 6 se vytvořily stejné

amplikony, jedná se o stejný

bakteriální druh).


39

5.2.3.1. Real-time PCR (qPCR)

Dnes velmi využívaným typem polymerázové řetězové reakce je real-time PCR (qPCR), která

umožňuje přímou detekci a kvantifikaci PCR produktu „v reálném čase“ (v průběhu celé PCR

reakce), nikoliv až po jeho skončení. Při stanovení PCR produktů se využívá sledování

fluorescenčního signálu. Jeho intenzita je permanentně snímána a analyzována speciálním

přístrojem, ve kterém zároveň probíhá PCR, tudíž se amplikony nemusí detekovat

elektroforeticky. Tím je tato technika zjednodušena a urychlena. Stanovení množství molekul

nukleových kyselin ve vzorku se využívá při studiu detekce patogenních mikroorganismů a

virů a také exprese genů (zejména studium transkripce – zda je a v jaké míře daný gen

přepisován z DNA do mRNA).

Předností metody qPCR je zejména rychlost bez nutnosti detekce PCR produktu (výsledek do

několika hodin), jednoduchost provedení, přesnost a citlivost.

K detekci vznikajícího PCR produktu lze využít fluorescenční barviva, fluorescenčně značené

hybridizační sondy nebo fluorescenčně značené primery. V prvním případě se používají

barviva (např. SYBR® Green I), která fluoreskují po vazbě na dsDNA. Fluorescenční signál

se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR produktu. Nevýhodou fluorescenčního

kyaninového barviva SYBR® Green I je to, že nelze

rozlišit PCR produkt od nespecificky

naamplifikovaných sekvencí a nedá se použít u

multiplex PCR. Druhý způsob detekce amplikonů je

prostřednictvím fluorescenčně značených

hybridizačních sond (krátké oligonukleotidy), které

se komplementárně vážou na vnitřní část

amplifikované sekvence. Existuje celá řada těchto

sond, které mohou obsahovat kromě různých typů

fluoroforů (např. FAM), také zhášeč (např.

TAMRA). U sondy TaqManTM je možné fluorescenci

snímat až po ukončení zhášení, kdy se zhášeč oddálí

od fluoroforu, a to rozložením sondy pomocí enzymu

Taq DNA-polymerasy při elongaci (obrázek 19).

Mezi další typy sond patří tzv. molekulární majáky.

Je možné také využít přenosu energie fluorescenční

rezonance – technologie FRET (Fluorescence

Resonance Energy Transfer). Třetí způsob detekce

amplionů při qPCR je pomocí fluorescenčně

značených primerů, např. technologie AmpliFluorTM

nebo LUX.

U klasické PCR je velmi obtížná kvantifikace. Korelace mezi počátečním množstvím

templátu a konečným množstvím PCR produktu (i přes známý počet cyklů) není spolehlivá.

Spolehlivější je vztah mezi množstvím templátu a počtem amplifikačních cyklů nutných pro

vytvoření detekovatelného PCR produktu (čím více templátu ve vzorku, tím dříve je možné

PCR produkt detekovat). Cyklus, ve kterém je již PCR produkt detekovatelný se nazývá jako

prahový cyklus CT (treshold cycle). A právě tato kvantifikace může být prováděna metodou

qPCR, která zaznamenává vznik amplikonů v průběhu celé reakce. Existují dva způsoby

kvantifikace. Relativní kvantifikace, při které dochází pouze ke srovnání dvou vzorků a

získání informace, ve kterém vzorku a kolikrát je více templátu. Při „absolutní“ kvantifikaci

je množství templátu vztaženo k externímu templátu a kvantifikováno přesné množství.

V tomto případě je nutné ze standardů sestrojit kalibrační křivku vyjadřující závislost CT na

známém množství DNA standardního vzorku, ze které se určuje počet kopií DNA v templátu.

Obrázek 19: Technologie TaqManTM.


40

5.2.4. Inhibitory polymerázové řetězové reakce Teoreticky umožňuje technika PCR detekovat jednu jedinou buňku či molekulu DNA. Avšak

správný průběh reakce může být narušen přítomností celé řady inhibitorů. Zejména

potravinová matrice se vyznačuje jejich velkým množstvím.

Za snížení citlivosti či úplné selhání reakce mohou být zodpovědné bakteriální enzymy

(nukleasy, proteasy), polysacharidy, proteiny, lipidy a další složky potravin (např. ionty Ca2+

u mléčných výrobků, myoglobin u masných výrobků), pudr z laboratorních rukavic, složky

kultivačních médií, detergenty, antibiotika, aj.

Již při izolaci nukleové kyseliny může dojít k selhání buněčné lýzy nebo degradaci

templátové DNA či RNA. Poškozeny mohou být také primery (zejména ty s nižší teplotou

tání), případně může dojít k obsazení jejich cílových míst. Termostabilní DNA-polymerasu

mohou inhibitory inaktivovat. K inhibici dojde snáze, pokud je nízká koncentrace templátové

nukleové kyseliny a pokud se tvoří dlouhý amplikon nebo amplikon s nižším obsahem G+C

bazí. U real-time PCR může být inhibován také fluorescenční signál. Tyto nežádoucí vlivy se

mohou projevit jako falešně negativní výsledek.

5.2.5. Výhody, nevýhody a využití metody PCR v praxi Polymerázová řetězová reakce je nejpoužívanější amplifikační technika. Má však i svá

omezení. Její citlivost je tak vysoká (umožňující detekci jediné buňky), že u

kontaminovaných vzorků se mohou vyskytnout falešně pozitivní reakce. Naopak

v přítomnosti kontaminujících látek, které PCR inhibují, může dojít k falešně negativní

reakci.

V potravinářské mikrobiologii se polymerázová řetězová reakce využívá jednak k rychlé

detekci alimentárních patogenů přímo ze vzorku, jako jsou Salmonella spp., Listeria

monocytogenes, Shigella spp., Campylobacter jejuni/coli, patogenní serotypy E. coli, Vibrio

spp., Yersinia enterocolitica/pseudotuberculosis, Clostridium perfringens, Cronobacter

sakazakii, S. aureus, Bacillus cereus, atd. Využití nachází také při rodové konfirmaci a

druhové identifikaci mnoha bakterií (např. enterokoky a další bakterie mléčného kvašení) a

dále při průkazu genů kódujících faktory virulence, genů rezistence k antimikrobiálním

látkám a genů zodpovědných za tvorbu enterotoxinů, biogenních aminů či bakteriocinů.

Ve vzorcích potravin se obvykle patogenní mikroorganismy vyskytují v nízkých počtech a při

jejich průkazu standardními metodami je nutné je nejprve pomnožit, čímž se prodlužuje doba

identifikace. Využití PCR tedy významně zkracuje potřebnou dobu stanovení. Na druhou

stranu, stejně jako u jiných alternativních metod, musí být pozitivní výsledek (průkaz

patogenního mikroorganismu přímo ve vzorku) potvrzen standardní kultivační metodou.

Metoda PCR se může přímo využít k detekci mikroorganismů, avšak nestanovíme jí

přítomnost toxinů a dalších metabolitů schopných ovlivnit bezpečnost potravin (např.

stafylokokové enterotoxiny). Stanoví se pouze geny kódující tyto látky nebo jejich exprese.

Problémem při detekci alimentárních virů je to, že mohou být detekovány i inaktivované

virové částice, které již nepředstavují žádné riziko. Jejich nukleová kyselina může

v potravinové matrici přetrvat i po narušení funkce kapsidy viru. V takové formě ztrácí viry

schopnost vázat se na hostitelskou buňku.

Molekulárně biologické metody mohou být použity i při identifikaci pomalu rostoucích či

velmi obtížně kultivovatelných mikroorganismů, kde významně zvýšily kvalitu jejich

identifikace. Dále se jimi mohou detekovat alergeny či geneticky modifikované organismy.

Na druhou stranu, některé molekulární techniky jsou poměrně nákladné, časově náročné a

pracné, a proto nejsou vždy vhodné pro rutinní identifikaci.


41

5.3. Hybridizační techniky Hybridizace je proces vytváření dvouřetězcových (ds, angl. double stranded) molekul

z jednořetězcových (ss, angl. single stranded) molekul nukleových kyselin (DNA či RNA).

Hybridizovat mohou jakékoliv ssDNA či ssRNA za předpokladu, že se jejich sekvence

vyznačují úplnou nebo částečnou komplementaritou bazí. Mezi párovými bazemi dochází

k tvorbě vodíkových můstků. Podle typu molekul, které se mohou párovat, existuje

DNA/DNA hybridizace, DNA/RNA hybridizace a RNA/RNA hybridizace.

5.3.1. Základní principy Před hybridizací se musí dvouřetězcové molekuly

nukleových kyselin denaturovat (působením

vysoké teploty, enzymaticky nebo chemicky

např. NaOH). Při vlastní hybridizaci se smíchá

hybridizační sonda s vyšetřovanou nukleovou

kyselinou a zajistí se vhodné podmínky pro

hybridizaci, a to koncentrace iontů a vhodná

teplota, které lze s určitou přesností odvodit od

tzv. teploty tání sondy. Poté se odmyje sonda,

která se nenavázala na vyšetřovanou nukleovou

kyselinu a detekuje se hybridizační produkt.

Nastavení různých hybridizačních podmínek

umožňuje vytvoření hybridizačních produktů

obsahujících i nespárované úseky. Čím jsou tyto

podmínky přísnější, tzv. vyšší stringence (vyšší

teplota, blížící se teplotě tání), tím se docílí

dokonalejší vazby sondy na vyšetřovanou

nukleovou kyselinu a hybridy jsou stabilnější.

Čím je stringence nižší (nižší teplota

hybridizace), tím častěji vznikají nestabilní hybridy s nedokonale spárovanými nukleotidy

(obrázek 20). Kromě teploty ovlivňuje stabilitu hybridů i jejich délka a zastoupení GC a AT

párů, pH a koncentrace solí v roztoku a přítomnost látek destabilizujících vodíkové můstky

mezi řetězci. Záleží také na tom, které molekuly spolu hybridizují – stabilita klesá v pořadí

RNA-RNA, RNA-DNA, DNA-DNA.

Výchozím krokem pro hybridizaci je příprava hybridizační sondy. Sondou se rozumí

jednořetězcová radioaktivně nebo chemicky značená nukleotidová sekvence DNA (RNA),

vázající se komplementárně k cílové sekvenci, která je takto identifikována. Aby měla sonda

požadovanou sekvenci, může být uměle připravena např. polymerázovou řetězovou reakcí.

Původně byly sondy pro hybridizaci značeny radioaktivně. Radioaktivní sondy mají ve své

sekvenci začleněny nukleotidy obsahující radioaktivní izotop (32P, 33P, 35S, 3H). Signálem

sondy je radioaktivní záření, které lze detekovat autoradiograficky na vrstvě fotografického

filmu, papíru nebo emulze.Tento způsob detekce cílové sekvence je velmi citlivý, ale kvůli

bezpečnosti práce dnes převažují sondy značené chemicky. Do sekvence těchto sond jsou

zabudovány chemicky modifikované nukleotidy dUTP (do DNA se začleňují místo dTTP)

nesoucí molekulu digoxigeninu (DIG) nebo biotinu. Tyto molekuly působí jako antigen a jsou

rozpoznávány protilátkami. Sonda s digoxigeninem je detekována protilátkou specifickou pro

digoxigenin (Anti-DIG). U biotinu se mohou použít kromě specifické protilátky také avidin

nebo streptavidin. Na protilátkách je navázán buď enzym (alkalická fosfatasa, peroxidasa,

luciferasa) nebo fluorescenční barvivo (fluorescein, rhodamin). Po přidání substrátu

Obrázek 20: Hybridizace při nastavení různé

stringence – podmínek přísnosti. (Alberts et al., 2005 – upraveno)


42

katalyzuje příslušný enzym reakci, jejímž výsledkem je změna barvy substrátu nebo jeho

rozpustnosti, emise světla, případně fluorescence.

Uspořádání hybridizačních experimentů je velmi variabilní. Provádí se např. hybridizace

v roztoku, gelu, na filtrech, čipech, v elektronovém mikroskopu nebo in situ hybridizace

(obrázek 21).

K nejcitlivějším technikám patří

hybridizace v roztoku. Cílová

molekula i sonda volně plavou

v reakční směsi a dochází k rychlé

tvorbě hybridizačního produktu. Pro

tento typ hybridizace stačí velmi

málo vzorku. Kombinací hybridizace

v roztoku a na pevném podkladu

vznikla hybridizace, kdy jsou

využity kovové kuličky

s imobilizovanými sondami.

Hybridizace in situ umožňuje

detekovat přítomnost specifických

sekvencí nukleových kyselin

v cytologických preparátech

chromosomů, buněk nebo řezech tkání a s vysokou přesností stanovit jejich prostorovou

lokalizaci. Využití má zejména k detekci genů na polytenních chromosomech hmyzu,

metafázních chromosomech savců a rostlin, k detekci specifických molekul RNA uvnitř

buněk a tkání nebo k detekci RNA či DNA virů.

Pokud sondy obsahují fluorescenčně značené nukleotidy, technika se nazývá fluorescenční

hybridizace in situ (FISH, Fluorescent In Situ Hybridisation). Vizualizace navázaných sond

se provádí fluorescenční mikroskopií. Mohou se použít sondy s různou sekvenční

specifičností značené látkami fluoreskujícími různými barvami, což umožňuje identifikaci

polohy několika genů současně. Tuto metodu lze použít při detekci či konfirmaci bakterií.

5.3.2. Hybridizace na pevném podkladu Hybridizace na pevném podkladu je jednou z nejčastěji používaných technik. Denaturovaná

DNA nebo RNA je přenesena na nitrocelulózový filtr nebo nylonovou membránu. Tato

technika je méně citlivá než hybridizace v roztoku, ale její výhodou je možnost testování

většího množství vzorků najednou.

Pokud je potřeba zjistit, která kolonie nese hledané sekvence, provádí se hybridizace

bakteriálních kolonií. Nejprve jsou kolonie přeneseny z agaru v Petriho misce na membránu

(otisk je zrcadlově otočený). Potom jsou buňky lyzovány a uvolněná dsDNA je denaturována

na ssDNA. Jednořetězcová bakteriální DNA je např. pomocí UV přichycena k membráně a po

přidání ssDNA sondy hybridizována. Hybridizační produkt je vizualizován a podle jeho

polohy je detekována kolonie s hledanou cílovou sekvencí (obrázek 22).

U „dot blot“ (tečkové/kapkové) hybridizace je na hybridizační membránu nakápnuta a

přichycena přímo denaturovaná nukleová kyselina.

Pomocí hybridizace se mohou také vyhledávat a lokalizovat geny u restrikčních fragmentů,

které jsou elektroforézou rozděleny na základě velikosti. Po elektroforetické separaci se tyto

fragmenty přenáší z agarózových případně polyakrylamidových gelů na pevný podklad. Podle

typu přenášené molekuly se rozlišuje Southernův přenos DNA (Southern blotting) a

Obrázek 21: Možnosti experimentálního provedení

hybridizace nukleových kyselin. (Šmarda et al., 2010 – upraveno)


43

nothernový přenos RNA (nothern blotting). Přenášet se mohou i proteiny (např.

stafylokokové enterotoxiny), potom hovoříme o tzv. westernovém přenos (western blotting).

Při těchto technikách se na gel položí membrána a na ni vrstva filtračního papíru, která nasává

denaturační pufr prostupující přes gel a hybridizační membránu. Zdenaturované nukleové

kyseliny jsou z gelu unášeny společně se vzlínajícím pufrem a zachyceny na membráně.

Přenos probíhá díky kapilárním silám. Poté se pevně přichytí nukleové kyseliny na membránu

a provede se hybridizace s vizualizací.

Vzorky nukleových kyselin mohou být po odmytí sondy opětovně hybridizovány s jinou

sondou. Tento postup se nazývá rehybridizace.

Obrázek 22: Hybridizace kolonií. (Alberts et al., 2005 – upraveno)

5.3.3. Mikročipy („microarrays“) Hybridizace může probíhat i opačně, kdy jsou na pevném podkladě připevněny neznačené

sondy, ke kterým se přidá fluorescenčně značená testovaná nukleová kyselina. Je to tzv.

zpětná (reverzní) hybridizace. Příkladem tohoto typu hybridizace je mikročip. Nejhustější

mikročipy obsahují desítky až tisíce fragmentů ssDNA na jedné skleněné mikroskopické

destičce. Dochází tedy k několika tisícům hybridizací současně. Detekci fluorescence po

hybridizaci zajišťuje konfokální laserový skener spojený s počítačem provádějícím analýzu.

Intenzita fluorescenčního signálu je závislá na množství nukleové kyseliny, proto je možné

kvalitativní i kvantitativní stanovení specifických úseků cílových molekul v jedné reakci.

5.3.4. Výhody, nevýhody a využití hybridizačních technik v praxi Pomocí oligonukleotidových sond, které při hybridizaci komplementárně nasedají na

specifické úseky bakteriálního genomu, lze identifikovat velké množství druhů bakterií.

Mezi nevýhody hybridizačních metod patří pracnost a časová náročnost, nižší citlivost než u

amplifikačních metod a možnost falešně pozitivních výsledků, kdy za podmínek nízké

stringence dojde k navázání sondy i na sekvenci, která není plně komplementární.

Výroba mikročipů je poměrně nákladná, avšak samotná analýza je levná a rychlá. Mikročipy

se mohou využít při studiu genové exprese (jsou měřeny rozdíly v počtu RNA transkriptů

jednotlivých vzorků), k porovnávání genů blízce příbuzných mikroorganismů, detekci genů

antimikrobiální rezistence a k identifikaci zejména patogenních bakterií, kdy jedna

mikročipová sada může obsahovat hybridizační DNA sondy celé řady bakteriálních druhů.

Dále se mohou DNA/RNA čipy využít při detekci virů.

Nepřímé metody

44

6. NEPŘÍMÉ METODY

Nepřímé metody nám umožňují stanovit určitou složku, enzym, metabolit nebo změnu

prostředí způsobenou růstem mikroorganismů. Zjištěná hodnota sledovaného znaku může být

následně využita k průkazu či odhadu počtu mikroorganismů ve vzorku. Existují různé druhy

nepřímých metod, v této kapitoly jsou zmíněny ty nejčastěji aplikované při mikrobiologickém

vyšetření potravin.

6.1. Elektrické metody Elektrické metody jsou založeny na měření odezvy mikrobiálních kultur na střídavý

elektrický proud v určitých frekvencích. Měřicí elektrody se umisťují přímo do živného média

nebo homogenátu potraviny. Sledují se následující parametry – impedance, vodivost a

kapacitance, a to buď samostatně nebo v kombinaci. Elektrické metody lze využít ke

kvantitativnímu i kvalitativnímu stanovení mikroorganismů.

Elektrické metody patří mezi tzv. růstové testy. U konvenčních růstových testů je výsledkem

nárůst viditelných, dobře ohraničených kolonií na povrchu pevných živných médií, příp.

zakalení tekutých médií někdy doprovázené i změnou barvy. V případě elektrických metod se

jedná o metabolizaci elektricky neutrálních substrátů na vodivé molekuly a následné změny

hodnocených elektrických parametrů.

6.1.1. Teorie impedance Impedanci lze zjednodušeně definovat jako odpor vůči toku střídavého proudu při průchodu

vodivým materiálem. Impedance má vždy dvě složky – kapacitanci a vodivost (konduktanci),

přičemž kapacitance více odráží vlastnosti a změny na elektrodách, zatímco vodivost změny

prostředí (roztoku, gelu) mezi elektrodami. Obě složky jsou závislé na frekvenci střídavého

proudu aplikovaného na elektrodový systém. Při nízkých frekvencích je impedance do značné

míry ovlivněna kapacitancí, zatímco při vysokých frekvencích převážně vodivostí.

Je-li roztok elektrolytu vystaven elektrickému poli, kationty migrují k záporné elektrodě

(katodě) a anionty k elektrodě kladné (anodě). Pohyb iontů vytváří v roztoku proud, přičemž

každý iont nese zlomek proudu, a to v poměru ke své pohyblivosti a koncentraci. Vodivost je

definována jako převrácená hodnota odporu. Každé její zvýšení má za následek snížení

impedance a zvýšení proudu. Impedance je měřena v jednotkách Siemens (S).

6.1.2. Základní principy Každé růstové médium má určitou hodnotu impedance, která závisí na jeho chemickém

složení (obsahu makromolekul) a také na složení inokula. Největší vliv mají soli. Měřicí

přístroje obecně nedostatečně reagují na vysoký obsah soli v živném médiu nebo velmi slané

potraviny, pokud nejsou dostatečně naředěny. Protože má impedance vysoký teplotní

koeficient, je pro správné měření nezbytná velmi přesná kontrola teploty stanovení.

6.1.2.1. Přímá metoda měření impedance

Substráty používané v živných médiích jsou obvykle bez náboje nebo mají jen slabý náboj.

Při jejich metabolizaci mikroorganismy vznikají vysoce vodivé metabolity a dochází ke

zvýšení vodivosti média (např. aminy a amoniak vzniklé štěpením bílkovin či kyselina

mléčná vznikající při štěpení sacharidů). Složení živného média je tedy pro impedanční

mikrobiologii velmi důležité. Musí být pro testovaný mikroorganismus selektivní, podporovat

jeho růst a musí být optimalizováno pro elektrický signál. Po inokulaci vzorku jsou testovací

zkumavky inkubovány při teplotě odpovídající sledovanému mikroorganismu. Impedanční

systém měří v pravidelných intervalech (obvykle 6 minut) změny impedance živného média.

Nepřímé metody

45

Na začátku testu uživatel definuje kriteria testu. Počítač zobrazuje na displeji průběh měření

každého vzorku a také překročení hodnoty zvoleného parametru u pozitivních vzorků či

překročení časového limitu u vzorků negativních. Získaná data mohou být archivována a dále

zpracována. Měřicí systém je obvykle tvořen inkubační a měřicí jednotkou napojenou na

počítač.

Vybraný ukazatel je primárně zobrazen jako závislost změny daného parametru v čase

(růstová křivka). Místo na křivce a tomu odpovídající čas, kdy byla poprvé zaznamenána

odchylka růstové křivky, se označuje jako detekční čas. Detekční čas je funkcí velikosti

počáteční mikrobiální populace, růstové kinetiky testovaného mikroorganismu a vlastností

růstového média. Je nepřímo úměrný počáteční mikrobiální kontaminaci vzorku. V okamžiku

detekce se obvykle předpokládá přibližně 105 až 106 KTJ.ml-1 sledovaných mikroorganismů

v testované kultuře. Vzniklé křivky jsou reprodukovatelné pro jednotlivé druhy i kmeny

mikroorganismů. Doba stanovení je řádově několik hodin, a to v závislosti na stupni

kontaminace vzorku.

Vyjádřením detekčních časů proti počtu mikroorganismů v inokulu vznikne lineární křivka.

Díky tomu může být detekční čas, po provedení příslušných kalibračních testů, využit ke

stanovení počtu mikroorganismů.

Při kvalitativním stanovení, které můžeme provádět bez nebo s předpomnožením vzorku, se

vzorek inokuluje do selektivního média vhodného pro daný mikroorganismus. Detekční čas

v tomto případě indikuje průkaz cílového mikroorganismu. Po ukončení testu můžeme

pozitivní kulturu podrobit konfirmačním testům.

6.1.2.2. Nepřímá metoda měření impedance

Řada selektivních živných médií obsahuje vysokou koncentraci soli, stejně tak jako některé

potraviny. Výsledné vysoké hodnoty impedance těchto médií jsou mimo běžný pracovní

rozsah přímé impedanční metody. Tento problém lze eliminovat použitím nepřímé metody

měření impedance, kdy je mikrobiální metabolismus hodnocen na základě produkce oxidu

uhličitého. Do zkumavky s elektrodami je přidán hydroxid draselný, v této zkumavce dochází

k měření impedance. Zaočkované kultivační médium je v samostatné komoře, bez přímého

kontaktu s elektrodami či KOH. Celý systém je pevně uzavřen tak, aby všechen CO2,

vznikající při metabolické činnosti mikroorganismů, byl absorbován do roztoku KOH, což

způsobuje výsledný pokles impedance.

Metoda nepřímého stanovení impedance má oproti metodě přímé několik výhod. Lze použít i

média určená pro klasické kultivační stanovení, která nemusí být optimalizována pro

stanovení impedance, a to i média s vysokou koncentrací soli, které jsou jinak mimo rozsah

měření přímé metody. Metodou lze detekovat i některé mikroorganismy, jejichž růst vyvolává

pouze malé či nezjistitelné změny impedance (např. kvasinky a plísně). Nepřímou metodu lze

využít také u vzorků, které mohou při přímém kontaktu nepříznivě ovlivňovat elektrody.

Metoda je dobře využitelná při stanovení S. aureus, L. monocytogenes, E. faecalis, B. subtilis,

E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Salmonella spp., kvasinek a plísní.

6.1.2.3. Faktory ovlivňující impedanční stanovení

Detekční čas je nepřímo úměrný počtu mikroorganismů ve vzorku, proto prvním faktorem

ovlivňujícím detekční čas je koncentrace testovaných mikroorganismů. Impedanční signál je

dále ovlivněn koncentrací živného média. Zředěná média mají nízkou iontovou sílu, a proto

změna vodivosti vyvolaná metabolismem mikroorganismů je poměrně velká. Navíc nízká

koncentrace živného média nemusí plně podporovat nutriční potřeby testovaného

mikroorganismu, výsledkem může být pomalejší růst.

Nepřímé metody

46

Dalšími faktory jsou složení živného média. a teplota, která ovlivňuje generační dobu

mikroorganismů a také složky impedančního signálu – kapacitanci a vodivost. Je proto

nezbytné, aby byla teplota v průběhu testu konstantní.

6.1.3. Měřicí systémy V současnosti jsou na trhu k dispozici 4 měřicí systémy – Bactometer® (výrobce bioMérieux),

BacTrac (výrobce Sy-Lab), Malthus (výrobce Malthus Instruments Ltd.) a RABIT (Rapid

Automated Bacterial Impedance Technique; výrobce Don Whitley Scientific Ltd.). Všechny

přístroje umožňují automatizované kvalitativní i kvantitativní stanovení vybraných

mikrobiologických ukazatelů. Vyznačují se jednoduchou obsluhou a možností současného

vyšetření velkých sérií vzorků. Přístroje pracují v poměrně širokém teplotním rozmezí

(stanovení různých skupin či druhů mikroorganismů), teplota stanovení je velmi přesně

kontrolována.

Tabulka 1: Systémy měření impedance – základní charakteristiky.

Typ měření

impedance

Maximální počet

vzorků

Typ

inkubátoru

Teplotní

rozsah

Bactometer® přímé 512 suchý 8 – 55 °C

BacTrac přímé i nepřímé 512 suchý 0 – 55 °C

Malthus přímé i nepřímé 240 vodní 5 – 55 °C

RABIT přímé i nepřímé 512 suchý 3 – 50 °C

6.1.4. Výhody a nevýhody elektrických metod Elektrické metody patří mezi uznávané rychlé automatické metody používané v mikrobiologii

potravin. Mohou být vzájemně propojeny s dalšími mikrobiologickými metodami. Jedná se

např. o separaci a koncentraci cílových mikroorganismů v přípravné fázi testu za použití

specifických imunomagnetických částic či konfirmaci pozitivních výsledků molekulárně

biologickými metodami.

Jednou z hlavních výhod je výrazná úspora času oproti klasickému kultivačnímu stanovení

(zejména v případě více kontaminovaných vzorků). Možnost využití selektivních médií a

optimálních teplot růstu rozšiřuje spektrum stanovovaných mikroorganismů. Díky minimální

manipulaci se vzorkem (např. není potřeba připravit řadu ředění) je validita a

reprodukovatelnost elektrických metod vysoká.

Elektrické metody nevyžadují použití čirých vzorků či médií. Stanovení lze provést i ve

vzorku obsahujícím částečky potraviny. Je pouze nutné vzorek naředit tak, abychom

minimalizovali vliv případných antimikrobiálních látek v potravině (např. u čerstvého mléka).

Provedení testů je velmi jednoduché, po inokulaci vzorku probíhá vlastní stanovení zcela

automaticky. Získaná data jsou automaticky ukládána, vyhodnocována a mohou být dále

zpracována. Další výhodou je možnost vyšetření velkých sérií vzorků.

Po skončení testu lze z testovacích zkumavek odebrat kulturu obsahující velké množství

cílových mikroorganismů pro provedení konfirmačních testů. Současně screening negativních

vzorků umožňuje minimalizaci nákladů na další testy.

Hlavní nevýhodou elektrických metod je vyšší počáteční investice na pořízení přístrojového

vybavení, na druhou stranu vlastní provozní náklady i výsledná cena stanovení jsou poměrně

nízké.

Nepřímé metody

47

6.1.5. Využití elektrických metod v praxi Elektrické metody patří mezi nejpoužívanější automatizované systémy v aplikované

mikrobiologii, jejich použití bylo schváleno řadou akreditačních organizací po celém světě.

Mezi validovaná stanovení patří např. detekce Salmonella spp. (validace AOAC, ISO);

Mezinárodní mlékařská federace (IDF) schválila využití měření impedance při vyšetření

mléka a mléčných výrobků, ve Francii se tato metoda používá při úřední kontrole ústřic na

obsah střevních bakterií.

Využití nachází elektrické metody při hodnocení mikrobiologické kvality potravin a

potravinových surovin (syrové mléko a mléčné výrobky, jatečně upravená drůbež, čerstvé

maso a masné výrobky, mořské plody, nápoje), testování vody, krmiv, environmentálních

vzorků či produktů kosmetického průmyslu.

Mezi nejpoužívanější testy patří stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM), bakterií

čeledi Enterobacteriaceae, koliformních bakterií a Escherichia coli, bakterií rodu Salmonella,

dále stanovení Vibrio spp., Campylobacter spp. či listerií. Přehled možných stanovení na

jednotlivých přístrojích je uveden v tabulce 2.

Tabulka 2: Systémy měření impedance – stanovované mikrobiologické ukazatele.

Bactometer® BacTrac Malthus RABIT

aerobní mezofilní MO (CPM) + + + +

psychrotrofní mikroorganismy +

termofilní mikroorganismy +

anaerobní mikroorganismy +

sporotvorné mikroorganismy + +

gramnegativní bakterie + +

Enterobacteriaceae + + + +

koliformní bakterie + + + +

Escherichia coli +

Salmonella spp. + + +

Campylobacter spp. +

Listeria spp. + +

Bacillus cereus +

Enterococcus spp. +

bakterie mléčného kvašení +

kvasinky a plísně + + + + Pozn.: MO – mikroorganismy

6.2. Radiometrické stanovení 14CO2 Radiometrická metoda detekuje mikrobiální růst měřením metabolitů, vznikajících

z radioaktivních substrátů. Je obecně založena na principu měření množství 14CO2 uvolněného

metabolickou činností bakterií utilizujících živiny s obsahem značeného uhlíku 14C. Pro

mikroorganismy utilizující glukosu se používá značená glukosa, pro ostatní potom značený

glutamát nebo jiný podobný zdroj uhlíku. Doba potřebná k tvorbě plynu (detekční čas) je

nepřímo úměrná počtu mikroorganismů ve vzorku. Citlivost metody je závislá na počtu

mikroorganismů nezbytných pro produkci detekovatelného množství 14CO2, obvykle je to 104

mikroorganismů v g či ml vzorku. Délka stanovení je v hodinách, nejčastěji 4 – 6 hodin.

Radiometrické stanovení je rychlou a jednoduchou alternativou ke klasickému kultivačnímu

vyšetření. Jedná se o screeningovou metodu umožňující výrazné zkrácení doby potřebné

k získání výsledků. Vlastní stanovení je automatizované, nezbytné jsou tedy počáteční

Nepřímé metody

48

náklady pro pořízení potřebného přístrojového vybavení. Na druhou stranu, používání

radioaktivních chemikálií je omezeno přísnými předpisy, což nedovoluje širší využití této

metody.

V potravinářství se tato metoda používá při mikrobiologickém hodnocení mražených

potravin, tepelně ošetřených potravin (např. masných výrobků) či ovocných šťáv. V klinické

mikrobiologii se radiometrické stanovení využívá např. k detekci Mycobacterium tuberculosis

v klinických vzorcích (BACTEC 460TB System, výrobce Becton, Dickinson and Company).

6.3. Limulus Amebocyte Lysate test – LAL test V 50. letech minulého století bylo zjištěno, že lyzát amebocytů z hemolymfy členovce

ostrorepa amerického (Limulus polyphenus) se sráží v přítomnosti endotoxinu

gramnegativních bakterií. Bakteriální endotoxin (lipopolysacharid) je součástí buněčné stěny

gramnegativních bakterií a je uvolňován do okolního prostředí po smrti a lýze bakteriální

buňky. Toto zjištění vedlo následně k vývoji in vitro testu pro detekci pyrogenů

kontaminujících přípravky určené k injekčnímu podávání. Od roku 1972 se v lékařském

prostředí začal LAL test masivně používat. Současné medicínské využití spočívá zejména v

detekci gramnegativních bakterií při meningitidách či infekcích močového traktu.

6.3.1. Detekce pozitivní reakce Klasickým způsobem detekce pozitivní reakce je vizuální posouzení tvorby gelu, jako je tomu

u zkumavkového testu.

Další možností je spektrofotometrické či turbidimetrické vyhodnocení, kdy se hodnotí změny

v optické denzitě. Příkladem tohoto typu testu je modifikace automatizovaného systému MS-2

(výrobce Abbott Laboratories), tzv. MS-2 LAL, který se využívá např. při vyšetření moči.

K vyhodnocení testu lze využít i chromogenní substrát. Vzniklá barevná reakce se odečítá

spektrofotometricky, intenzita barvy je přímo úměrná množství endotoxinu. Test probíhá

v mikrotitračních destičkách, pomocí speciálního readeru je vzniklá barevná změna

hodnocena v pravidelných časových intervalech po celou dobu trvání testu (celkem 241

měření za 60 minut). Koncentrace endotoxinu ve vzorcích jsou vypočteny automaticky na

základě standardní křivky odvozené z naměřených hodnot. Test je vysoce citlivý.

6.3.2. Zkumavkový LAL test K provedení zkumavkového testu se používá standardizovaný lyzát (obvykle 0,1 ml na jeden

test). Citlivost činidla se nejdříve testuje za použití standardizovaného endotoxinu. Poté se

stanoví obsah endotoxinu ve vzorcích. Ty se naředí a 0,1 ml každého ředění se přidá do

zkumavky s LAL činidlem. Zaočkované zkumavky jsou po promíchání inkubovány 1 hodinu

ve vodní lázni při teplotě 37 °C. Pozitivní reakcí je vznik pevného gelu, který zůstává ve

zkumavce i po jejím otočení o 180°. Jako titr se označí nejvyšší ředění s pozitivním

výsledkem. Ke stanovení množství endotoxinu v titru, se titr násobí předem stanovenou

citlivostí LAL činidla zjištěnou při reakci se standardizovaným endotoxinem. Počet

gramnegativních bakterií ve vzorku lze odhadnout na základě výpočtu počtu buněk, který

odpovídá zjištěnému množství endotoxinu.

6.3.3. Využití LAL testu v praxi Mimo široké využití ve farmakologii a klinické mikrobiologii, lze LAL test použít také při

mikrobiologickém hodnocení potravin. Metoda je dobře použitelná při screeningu mikrobiální

kontaminace. Například při vyšetření čerstvého masa indikuje nízký obsah endotoxinu maso

výborné mikrobiální kvality (vztaženo k obsahu gramnegativních bakterií – nejvýznamnější

Nepřímé metody

49

skupině mikroorganismů v čerstvém mase). Na druhou stranu vysoký obsah endotoxinu,

zjištěný metodou LAL, nemusí vždy korespondovat s vysokou hodnotou CPM zjištěnou

plotnovou metodou. A to třeba v případě, kdy došlo k destrukci gramnegativních bakterií

záhřevem či účinkem bakteriofágů, nebo když je přítomný endotoxin reprezentován

gramnegativními bakteriemi, které nerostou za podmínek stanovení CPM.

Protože v čerstvých potravinách zpracovaných za standardních podmínek existuje více méně

konstantní poměr gramnegativních a grampozitivních bakterií, lze výsledky LAL testu využít

nejen k odhadu celkového počtu mikroorganismů, ale i počtu bakterií grampozitivních.

Podobným způsobem lze odhadnout i počet plísní. Na druhou stranu LAL test nelze využít

k odhadnutí „celkového“ počtu mikroorganismů v tepelně ošetřených výrobcích, protože

gramnegativní bakterie jsou mnohem citlivější k záhřevu než bakterie grampozitivní.

LAL test lze využít při hodnocení mikrobiální kvality syrového a pasterovaného mléka,

mléčných výrobků, masa a masných výrobků, ryb, atd. Endotoxiny jsou termostabilní, proto

lze u tepelně opracovaných výrobků zpětně posoudit výchozí kontaminaci suroviny.

Výhodou LAL testu je především rychlost a jednoduchost provedení, dostupnost komerčně

připraveného lyzátu či kompletních testovacích souprav a vysoká citlivost (detekuje ng

endotoxinu, přítomného u gramnegativních bakterií). Na druhou stranu nelze rozlišit

přítomnost živých či mrtvých buněk.

6.4. ATP bioluminiscenční test

6.4.1. Základní principy Každá živá buňka obsahuje ATP (adenosintrifosfát), který je univerzálním donorem energie

pro její metabolické reakce. Množství ATP v buňkách je relativně konstantní, a proto může

intracelulární koncentrace ATP sloužit ke stanovení biomasy nebo počtu životaschopných

buněk. Po smrti buňky obsah ATP v důsledku autolytických procesů prudce klesá, veškeré

ATP je rozloženo během několika minut.

ATP bioluminiscenční metoda je založena na principu enzymové reakce mezi luciferinem

(substrát) a luciferasou (enzym). Enzym luciferasa, přirozeně se vyskytující u světlušek

(Photuris pyralis), katalyzuje za přítomnosti luciferinu, kyslíku a hořečnatých iontů přeměnu

chemické energie ATP ve světlo pomocí oxidačně-redukční reakce (obrázek 23).

Obrázek 23: Schéma ATP bioluminiscenční reakce. (McMeekin, 2003 – upraveno)

Luciferin je přeměňován na oxiluciferin, ATP na AMP (adenosinmonofosfát) za uvolnění

pyrofosfátu (PPi), CO2 a současné emise světla o vlnové délce v rozmezí 470 – 700 nm

(vrchol při 562 nm). Emitované světlo je měřeno pomocí luminometru, jeho množství se

stanovuje v relativních světelných jednotkách (RLU; Relative Light Units). Dostupné

luminometry jsou schopné detekovat méně než 0,1 pg ATP v kyvetě, což odpovídá počtu 102

bakteriálních buněk.

Nepřímé metody

50

Množství produkovaného světla je přímo úměrné koncentraci ATP vstupujícího do reakce a

souvisí s počtem metabolicky aktivních buněk ve vzorku. Metodu lze tedy využít i ke

stanovení celkového počtu mikroorganismů ve vzorku, protože mezi intracelulárním obsahem

ATP a počtem KTJ bakterií či kvasinek je lineární vztah. I když lze teoreticky při použití

vhodné techniky a činidel o vysoké čistotě stanovit množství ATP odpovídající přibližně stu

mikrobiálních buněk, v praxi je to obvykle množství odpovídající asi 103 – 104 KTJ.g-1.

Široké použití má při hodnocení čistoty povrchů přicházejících do kontaktu s potravinami.

6.4.2. Stanovení počtu mikroorganismů v potravinách ATP bioluminiscenční test byl původně vyvinut k odhadu celkového mikrobiálního zatížení

potravin. V potravinách je ATP přítomno v somatických buňkách, jako volné ATP nebo

v mikroorganismech. Při stanovení počtu mikroorganismů musí být mikrobiální ATP nejprve

separováno od ostatních zdrojů.

Původní techniky spoléhaly na selektivní lýzu somatických buněk neionogenním detergentem

(např. Triton X-100) následovanou enzymatickou či chemickou destrukcí uvolněného ATP.

Zbylý mikrobiální ATP byl poté extrahován pomocí kationaktivního detergentu a jeho obsah

stanoven za použití luciferin-luciferázového komplexu. Počet buněk byl vypočítán

z kalibračních přímek koncentrace ATP nebo emitovaného světla (RLU) k počtu buněk

(KTJ.ml-1). Tato metoda byla jednoduchá a rychlá, ale nedostatečně citlivá.

Další možností je využití koncentrace a separace mikroorganismů z potraviny ještě před

provedením ATP bioluminiscenčního testu. Využívá se filtrace nebo centrifugace vzorku

následovaná uvolněním mikrobiálního ATP a jeho kvantifikací. Nutnost dvou-krokové

procedury pro bioluminiscenční detekci mikroorganismů byla dána určitou nestabilitou

luciferasy v lyzačním činidle. Nově bylo vyvinuto činidlo pro jedno-krokovou analýzu. Jedná

se o mutantní formu luciferasy světlušek, která je více odolná k lytickým činidlům. Stabilní

luciferasa je použita v činidle kombinujícím lytické složky s luciferin-luciferázovým

komplexem a umožňuje tak nový zjednodušený formát testu.

Pro filtrovatelné roztoky byl zaveden systém MicroStar™ (výrobce Millipore Corp.)

umožňující stanovení počtu kvasinek (trvání testu několik minut) a bakterií (trvání testu

několik hodin). Nejprve dochází k filtraci vzorku přes speciální membránový filtr schopný

zadržet mikroorganismy. Systém umožňuje detekci jediné buňky kvasinek ihned po filtraci.

Detekce bakterií vyžaduje krátkou inkubaci membránového filtru na povrchu vhodného

živného média. Poté se na filtr nastříká činidlo uvolňující ATP a po krátkém sušení je přidáno

bioluminiscenční činidlo. To vyvolá vznik „světelných spotů“ korespondujících s každou

buňkou kvasinek či bakteriální mikrokolonií. CCD kamerou lze vytvořit obraz

membránového filtru s prostorovou distribucí světelných skvrn. Získané výsledky jsou

srovnatelné se standardní plotnovou metodou. Moderní verzí je automatizovaný systém

Milliflex® Rapid Microbiology Detection and Enumeration System (výrobce Merck

Millipore).

6.4.2.1. Využití v praxi

Při stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce se nejčastěji používá

filtrační technika, která je vhodná pro screening cisternových vzorků mléka ve

zpracovatelských závodech a monitoring kvality během prodlouženého skladování mléka.

Metodu lze využít také k hodnocení kvality pasterovaného mléka, kontrole sterility UHT

výrobků, k detekci antibiotik v mléce nebo při sledování aktivity bakterií mléčného kvašení

při hodnocení čistých mlékařských kultur. Testovací soupravy a potřebné přístrojové

vybavení nabízí v současnosti několik firem. Jedná se například o RapidScreen Dairy

Nepřímé metody

51

(výrobce Celsis Inc.) nebo 3M™ Microbial Luminescence System II (výrobce 3M) určený pro

testování sterility UHT mléka a mléčných výrobků.

Při hodnocení povrchové kontaminace jatečně opracované drůbeže se testuje oplachová voda

nebo se provede stěr sterilním tamponem, v případě prasat a skotu se stěr provádí sterilní

testovací houbičkou zvlhčenou fyziologickým roztokem s přídavkem Tweenu 80. Tekutina

z houbičky je dále zpracována pomocí filtračního zařízení Filtravette™ (výrobce New

Horizont Diag. Corp.). Jedná se o speciální luminometrickou kyvetu jejíž dno slouží jako

membránový filtr pro záchyt bakterií. Další možností je odebrání a zpracování vzorku

svaloviny z povrchu jatečně opracovaného těla. Systém Filtravette™ je využitelný také pro

stanovení mikrobiální kontaminace mletého masa. ATP bioluminiscenční metoda je

využitelná také při hodnocení vařených či vakuově balených masných výrobků.

Při detekci bakterií způsobujících kažení piva (Lactobacillus brevis) byl aplikován systém

MicroStar™ (výrobce Millipore Inc.), k vyšetření sycených nápojů lze použít např. filtrační

systém Haemocell Rapid Microbial Quality Assurance (RMQA) (výrobce GEM Biomedical,

Inc). Reagenční kit Bev-Trace™ (výrobce Biotrace Ltd.) je určený pro rychlou detekci

mikroorganismů kažení ve všech filtrovatelných nápojích, ať už pasterovaných či

sterilizovaných filtrací. Další možností je např. RapidScreen Food & Beverage (výrobce

Celsis Inc.).

6.4.2.2. Výhody a nevýhody

Vzhledem k tomu, že existuje vědeckými studiemi podložená korelace mezi množstvím ATP

a počtem mikroorganismů, je ATP bioluminiscenční test vhodnou alternativou k tradiční

plotnové metodě při rutinním mikrobiologickém hodnocení potravin a nápojů. Výhodou je

relativně jednoduché a rychlé provedení testu, v porovnání s klasickou kultivační metodou je

úspora času značná. Naměřené výsledky jsou archivovány a mohou být dále zpracovávány.

Naopak nevýhodou je nutnost počáteční úpravy vzorku tak, aby bylo mikrobiální ATP

separováno od ATP z jiných zdrojů (např. somatických buněk). Dále je to samozřejmě

počáteční investice do přístrojového vybavení. Test sám o sobě není specifický, v případě

detekce vybrané skupiny mikroorganismů je nezbytné zařazení vhodného specifického

postupu (např. imunomagnetická separace pro zachycení cílových bakterií či lýza buněk

druhově specifickými bakteriofágy).

6.4.3. Monitoring hygieny a sanitace v potravinářských provozech ATP bioluminiscenční techniky nachází široké uplatnění při hodnocení účinnosti sanitace

provozních povrchů a zařízení a monitoringu hygieny v rámci systémů HACCP, a to v celé

řadě potravinářských provozů (mlékárenství, výroba nápojů, masný průmysl, atd.) po celém

světě. Běžné stěrové či otiskové techniky kombinované se stanovením počtu mikroorganismů

plotnovou metodou mohou detekovat pouze povrchovou kontaminaci mikroorganismy, ale

neposkytují informace o tom, zda byl povrch dostatečně očištěn.

Metoda ATP bioluminiscence, provedená po rutinní sanitaci povrchu či zařízení, umožňuje

během několika minut posouzení celkové úrovně organického znečištění povrchu. V tomto

případě je detekován veškerý ATP přítomný na testovaném povrchu (mikrobiální ATP, ATP

ze somatických buněk, příp. volné ATP). Z vyšetřované plochy se provede stěr speciálním

sterilním tamponem, ten je vložen do zkumavky obsahující všechna potřebná činidla pro

vlastní bioluminiscenční reakci. Po vložení do přenosného luminometru je změřeno množství

emitovaného světla v RLU. Získané výsledky jsou následně hodnoceny jako vyhovující či

nevyhovující, a to podle předem nastavených limitních hodnot RLU pro každé kontrolované

místo. Provedení testu je velmi jednoduché, příprava vzorku a měření trvá pouze několik

Nepřímé metody

52

minut. Podobným způsobem lze testovat i oplachovou vodu. V tomto případě se k odběru

vzorku používají speciálně upravené odběrové tyčinky se žlábkem umožňující zachycení

konstantního množství vzorku.

Testovací soupravy a měřicí přístroje dodává na trh celá řada výrobců – např. 3M (3M™

Clean-Trace™ Hygiene Monitoring Systems), Merck Millipore (HY-LiTE® Plus), Charm

Science Inc., Promega.

6.4.3.1. Výhody a nevýhody

Nespornou výhodou je jednoduché a rychlé provedení testu, při použití přenosného

luminometru se stanovení provádí přímo v místě kontroly. Naměřené výsledky lze ihned

porovnat se zadanými hraničními hodnotami, archivovat či dále zpracovávat.

Nezbytná je počáteční investice na pořízení měřicího přístroje, vlastní stanovení již není

finančně náročné. Pro záchyt ATP je důležité správné provedení stěru, vliv má také charakter

stíraného povrchu. Dalším omezením je případná přítomnost detergentů, sanitačních a dalších

čistících prostředků na testovaném povrchu. Tyto látky mohou interferovat s luminiscenční

reakcí a vyvolávat falešně pozitivní či negativní výsledky.

6.4.4. Využití ATP bioluminiscence při detekci vybraných patogenů Metodu ATP bioluminiscence lze využít také při detekci vybraných původců alimentárních

onemocnění. Obecný postup stanovení je následující: 1) rozeznání cílových bakterií, 2) lýza

cílových bakterií a uvolnění ATP a 3) vlastní ATP bioluminiscenční test. Rozeznání cílových

bakterií se provádí pomocí specifických protilátek nebo specifických bakteriofágů.

Výhodou fágů, oproti použití specifických protilátek, je vyšší specifita a rychlejší vazba na

cílové buňky. Masivní produkce bakteriofágů je také výrazně levnější než produkce

protilátek. Využití bakteriofágů umožňuje současnou koncentraci a detekci cílových buněk.

Bakteriální buňky jsou zachyceny na biosorbent obsahující fágy, následná lýza buněk je

detekována ATP bioluminiscenční metodou. Lze stanovit počet navázaných bakterií.

Jiným přístupem je využití rekombinantních fágů. Fágy specifické pro sledovanou bakterii

jsou geneticky upraveny vložením genů pro bakteriální luciferasu (tzv. lux geny). Samotné

fágy nejsou schopné gen exprimovat a zůstávají „tmavé“. Po infekci hostitelské buňky dojde

k syntéze luciferasy, bakteriální buňky se „rozsvítí“ a mohou být detekovány luminometrem.

Byly připraveny rekombinantní fágy pro detekci bakterií čeledi Enterobacteriaceae, Listeria

monocytogenes, Salmonella spp. či Mycobacterium tuberculosis.

6.4.5. Měřicí přístroje Na trhu jsou k dispozici 3 hlavní skupiny přístrojů schopných měřit nízké hladiny

bioluminiscence. První z nich jsou trubicové luminometry, které jsou uzpůsobeny k měření

intenzity luminiscence v jednotlivých zkumavkách, obvykle využívají fotonásobiče. Mohou

být víceúčelové pro široké spektrum vzorků či specifické pro určitý typ zkumavek a činidel

určených pro daný přístroj. Přenosné bateriové luminometry jsou vhodné pro monitoring

hygieny v potravinářském průmyslu.

Vzhledem k popularitě mikrotitračních destiček našli své uplatnění na trhu i luminometry

umožňující automatické odečítání destiček. Měření luminiscence je zde však doprovázeno

určitými konstrukčními problémy.

V některých případech jsou kromě intenzity luminiscence zapotřebí i informace o jejím

prostorovém uspořádání. Pro tento účel se používají zobrazovací zařízení pro hodnocení

objektů různého tvaru a velikosti jako jsou Petriho misky či blottovací membrány, mezi

nejpoužívanější patří CCD kamery různého typu.

Stanovení rezistence k AML

53

7. STANOVENÍ CITLIVOSTI MIKROORGANISMŮ K AML

Rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám (AML) je dnes celosvětově jedním

z největších problémů nejen klinické a veterinární praxe. Velký zájem o tuto problematiku je i

v oblasti mikrobiologie potravin, protože řada rezistentních bakterií je šířena nebo má svůj

rezervoár právě v potravinách a potravinových surovinách. Z tohoto důvodu se při vyšetření

potravinových izolátů stále častěji využívají i metody stanovení citlivosti k antimikrobiálním

látkám.

V současnosti jsou klinické laboratorní standardy pro testování citlivosti pravidelně

aktualizovány např. americkou organizací CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute;

dříve NCCLS – National Committee for Clinical and Laboratory Standards). Metody

stanovení citlivosti, resp. rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám lze rozdělit

na semikvantitativní (disková difúzní metoda) a kvantitativní (tzv. diluční metody – např.

agarová diluční metoda, diluční mikrometoda, Etest).

7.1. Rezistence mikroorganismů k AML

7.1.1. Antimikrobiální látky a jejich účinek na mikroorganismy Jako antimikrobiální látky se označují léčiva používaná k profylaxi či terapii infekčních

onemocnění. Tyto látky mohou být v podstatě dvojího druhu – antibiotika, která jsou

přírodního původu (dnes často chemicky modifikovaná či synteticky vyráběná) a

chemoterapeutika, která jsou připravená pouze chemicky.

Působení antimikrobiálních látek může být mikrobistatické (reverzibilní zastavení růstu a

množení mikroorganismů) nebo mikrobicidní (usmrcení mikroorganismů). Účinek

mikrobistatických látek nastupuje později, mikrobicidní látky působí ireverzibilně a rychle.

Mezi mikrobistatické látky patří např. tetracykliny, makrolidy, sulfonamidy; mikrobicidní

účinek mají např. β-laktamy, aminoglykosidy či polypeptidy.

Mimo antibiotika a chemoterapeutika mohou mít antimikrobiální účinek také další skupiny

látek. Jedná se o látky působící na mikrobiální enzymy (např. oxidační činidla, chelatační

látky, těžké kovy), látky reagující s DNA (např. chemické mutageny či cytostatika) či látky

působící jako imunosupresiva. Antibiotika a chemoterapeutika mohou zasahovat různými

způsoby na různých místech mikrobiální buňky.

Mezi hlavní mechanismy patří:

- inhibice syntézy buněčné stěny (např. β-laktamy, glykopeptidy),

- poškození syntézy cytoplasmatické membrány (např. polypeptidy – polymyxin B),

- inhibice proteosyntézy (např. aminoglykosidy, tetracykliny, chloramfenikol),

- porucha syntézy nukleových kyselin (např. chinolony, nitroimidazoly),

- antagonismus a kompetitivní inhibice (např. sulfonamidy).

7.1.2. Rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám Jako rezistenci obecně označujeme schopnost mikrobiální populace přežít účinek inhibiční

koncentrace dané antimikrobiální látky. Některé mikroorganismy jsou přirozeně (primárně)

rezistentní k některým antimikrobiálním látkám. Přirozená rezistence je geneticky podmíněná

necitlivost k dané látce, a to bez ohledu na to, zda došlo k předchozímu kontaktu

mikroorganismu s touto látkou. Příkladem může být rezistence gramnegativních střevních

tyčinek vůči penicilinu a makrolidům, rezistence streptokoků k aminoglykosidům či

enterokoků a listerií k cefalosporinům.


54

Příčinou primární rezistence může být nepropustnost zevní membrány gramnegativních

bakterií pro danou antimikrobiální látku, produkce enzymů schopných antimikrobiální látku

inaktivovat, absence cílové struktury nebo její necitlivost k působení antimikrobiální látky.

U mikroorganismů se stále více setkáváme se získanou (sekundární) rezistencí. Tento typ

rezistence vzniká při působení antimikrobiální látky na populaci mikroorganismů, kdy se pod

selekčním tlakem antimikrobiální látky selektují rezistentní kmeny. Může se jednat o

rezistenci negenetického i genetického původu. V prvním případě může rezistence vzniknout

např. v důsledku ztráty specifických receptorových struktur. Sekundární rezistence

genetického původu může být chromosomální (např. spontánní mutace) či

extrachromosomální (reprezentovaná např. plasmidy či transpozony, viz též kapitola 9.2.3.).

Velkým problémem je multirezistence (mnohočetná rezistence), kdy je mikroorganismus

současně rezistentní k většímu počtu antimikrobiálních látek. Dále potom zkřížená rezistence

– současná necitlivost mikroorganismů na antibiotika s podobnou chemickou strukturou a

stejným mechanismem účinku.

7.1.2.1. Mechanismy rezistence mikroorganismů k AML

Jednou z možností je změna cílové struktury, tedy změna v místě působení antimikrobiální

látky. Mikroorganismy jsou schopné změnit strukturu cílové molekuly zásahu antimikrobiální

látky (obvykle esenciálního enzymu) nebo exprimovat alternativní cílovou molekulu, která

není antimikrobiální látkou inhibována.

Dalším mechanismem je změna propustnosti (permeability). Jde buď o úplnou nepropustnost

– impermeabilitu pro danou antimikrobiální látku, nebo dochází k jejímu aktivnímu vyloučení

z buňky. Ke změně propustnosti dochází např. změnou molekuly přenašeče či alterací

aktivního transportního proteinu, může se jednat i o omezení tvorby ATP v případech, kdy je

antimikrobiální látka přenášena aktivním transportem. Příkladem aktivního vyloučení již

nakumulované antimikrobiální látky je efflux systém, kdy prostřednictvím transmembránové

pumpy dochází k transportu antimikrobiální látky ven z buňky. Effluxní systém je schopen

zachytit molekuly AML nejen v periplasmatickém prostoru, ale i v cytoplasmě.

Mezi mechanismy rezistence patří i velmi častá změna antimikrobiální látky, kdy

mikroorganismus produkuje enzymy, které antimikrobiální látku pozmění nebo štěpí a tím ji

inaktivují. V některých případech mikroorganismus produkuje cílový enzym v takovém

množství, že jej nelze danou koncentrací antimikrobiální látky vyblokovat – hovoří se o tzv.

hyperprodukci cílové struktury.

7.1.2.2. Vznik a šíření rezistence mikroorganismů k AML

Rezistence genetického původu může vznikat v podstatě dvojím způsobem – modifikací genu

na chromosomu nebo převzetím genetického materiálu. K modifikaci chromosomálního genu

dochází obvykle spontánní mutací bez ohledu na předchozí kontakt s antimikrobiální látkou.

Vzniklá rezistence má trvalý charakter a přenáší se do další generace v populaci. Jinou

možností vzniku rezistence je převzetí genetického materiálu neseného na mobilních

elementech, jako jsou R plasmidy, transpozony, integrony či genové kazety, příp. i

bakteriofágy. Geny rezistence získávají mikroorganismy vertikálně (dědí je) nebo

horizontálně (od jiných buněk v ekosystému), mimo to tyto geny vznikají i mutacemi.

Mezi základní způsoby přenosu genetického materiálu řadíme konjugaci, transdukci a

transformaci. Při konjugaci dochází k přenosu plasmidu z donorové buňky (F+) do buňky

recipientní (F-) pomocí tzv. sex-pilů, konjugace může probíhat v rámci jednoho druhu

mikroorganismu nebo i mezidruhově. Transdukce představuje přenos pomocí bakteriofága, do

jehož genetické informace je včleněna chromosomální či plasmidová DNA, která je následně


55

s bakteriofágem přenesena do další bakteriální buňky. Transformace je přenos uvolněné DNA

(např. z lyzované buňky) vedoucí ke vzniku nových forem rezistence.

7.2. Semikvantitativní metody Semikvantitativní metody nachází uplatnění zejména při rutinním screeningu citlivosti

mikroorganismů k antimikrobiálním látkám. Do této skupiny náleží disková difúzní metoda,

která se používá zejména pro vyšetření citlivosti u rychle rostoucích, nenáročných bakterií a

některých náročnějších bakterií. Hodnocení se provádí na základě měření velikosti

inhibičních zón vzniklých okolo disků s antimikrobiální látkou. Podle velikosti inhibiční

zóny jsou vyšetřované kmeny mikroorganismů zařazeny do kategorie citlivý (S),

intermediálně rezistentní (I) (kmeny na rozmezí mezi citlivými a rezistentními) nebo

rezistentní (R) k dané antimikrobiální látce. Při správném provedení prokazují výsledky

diskové difúzní metody a výsledky kvantitativních dilučních metod vysokou shodu.

7.2.1. Disková difúzní metoda První metodou hodnocení účinku antibiotik na bakterie byla disková difúzní metoda. Poprvé

byla standardizována jako paper disk method v roce 1954. Navzdory své jednoduchosti, je

disková difúzní metoda založena na sofistikovaných fyzikálně-chemických principech, které

upravují dynamiku šíření (difúze) antibiotika ve vztahu k růstu bakterií v agarovém systému.

Po kontaktu disku napuštěného antibiotikem s povrchem inokulovaného agaru, začnou

molekuly antibiotika okamžitě difundovat do agaru a vytváří dynamicky se měnící gradient

koncentrace antimikrobiální látky. Mikroorganismy se začínají dělit, jejich počet vzrůstá až

do kritického množství. Okraj inhibiční zóny vzniká v okamžiku, kdy je koncentrace

antibiotika ještě schopná inhibovat mikroorganismus narůstající do velké buněčné masy.

Současně je hustota buněk dostatečně vyšší než absorbovatelné množství antibiotika

v bezprostřední blízkosti, subinhibiční množství antibiotika dovoluje mikroorganismu růst.

Difúzní koeficient antimikrobiální látky je ovlivněn nejen její molekulovou hmotností,

velikostí, iontovým nábojem či rozpustností ve vodě, ale také viskozitou a výškou agaru,

teplotou a dalšími inkubačními podmínkami. Růst mikroorganismu ovlivňuje zejména

dostupnost živin, hustota populace, růstová fáze inokula a inkubační teplota.

Výsledky in vitro testů citlivosti mohou být použity jako kvalifikovaný odhad k predikci

léčebného výsledku běžných dávek antibiotik u zdravých pacientů. Na druhou stranu

potenciální klinická účinnost antibiotika může být ovlivněna řadou dalších faktorů, proto

výsledky kvalitativních testů musí být v korelaci s kvantitativními hodnotami MIC

(minimální inhibiční koncentrace).

Některé disky mohou být využity i pro screening některých speciálních mechanismů

rezistence. Jedná se např. o detekci rezistence k vysokým hladinám aminoglykosidů u

enterokoků nebo detekci přítomnosti širokospektré β-laktamasy (ESBL) u izolátů E. coli,

Klebsiella pneumoniae či K. oxytoca.

Mezi hlavní výhody diskové difúzní metody patří jednoduché provedení bez nutnosti

náročného vybavení, flexibilní změna spektra vyšetřovaných antimikrobiálních látek a nízká

cena. Hlavní nevýhodou, mimo toho, že se nejedná o kvantitativní metodu, je do jisté míry

časová náročnost, zahrnující zejména přípravu agarových ploten a dobu potřebnou

k manuálnímu odečítání inhibičních zón a interpretaci výsledků. Přesto má v klinické praxi

disková difúzní metoda svou nezastupitelnou roli.

Provedení a využití diskové difúzní metody je detailně studováno v rámci předmětu Mikrobiologie

potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení

I. Obecná mikrobiologie).


56

7.3. Kvantitativní – diluční metody Diluční metody jsou kvantitativní metody určené ke stanovení minimální inhibiční

koncentrace (MIC), tedy nejnižší testované koncentrace daného antibiotika, která inhibuje

viditelný růst mikroorganismu. MIC se obvykle vyjadřuje v mg.l-1, příp. v µg.ml-1. Odečtené

hodnoty MIC se porovnávají s interpretačními kriterii a testovaný mikroorganismus se označí

jako citlivý (S), intermediárně rezistentní (I) či rezistentní (R) k danému antibiotiku.

Vyšetření se provádí na agarových nebo bujonových půdách, které obsahují zvolené

koncentrace antibiotika, obvykle v dvojnásobné geometrické řadě. Do půd se očkuje

standardní inokulum testovaného mikroorganismu. Kvalita získaných výsledků závisí na

přesném dodržení metody a ověřuje se systémem kontrol.

Stanovení hodnoty MIC je důležité pro určení terapeutické dávky antimikrobiální látky. Mezi

nejpoužívanější metody patří agarová diluční metoda, diluční mikrometoda a Etest.

7.3.1. Agarová diluční metoda Agarová diluční metoda je referenční metodou stanovení citlivosti mikroorganismů

k antimikrobiálním látkám, používá se mimo jiné pro ověřování spolehlivosti ostatních

metod.

7.3.1.1. Provedení a vyhodnocení testu

Jako živné médium se používá Mueller-Hinton agar, který je obohacený o testovanou

antimikrobiální látku. Antimikrobiální látka se naředí a jednotlivá ředění se přidávají

k rozpuštěnému a vytemperovanému agaru (45 – 50 °C), který je po promíchání rozléván do

Petriho misek tak, aby výsledná vrstva agaru byla 3 – 4 mm. Po ztuhnutí lze připravené plotny

skladovat při chladničkové teplotě po dobu několika dnů. Obvykle se připravuje 12 – 15

koncentrací jednoho antibiotika ředěných dvojnásobně geometrickou řadou.

Inokulum vyšetřovaných bakterií se aplikuje na povrch předsušeného agaru formou spotů

speciálním vzorkovačem. Na jedné Petriho misce (tj. jedné koncentraci antibiotika) můžeme

testovat až 20 různých kmenů bakterií. Soubor vyšetřovaných kmenů takto naočkujeme na

všechny připravené koncentrace testovaného antibiotika. Po příslušné době inkubace

odečteme pro každý testovaný bakteriální kmen hodnotu MIC. Inkubační podmínky se volí

tak, aby odpovídali testovanému mikroorganismu. Příklad provedení a vyhodnocení agarové

diluční metody je uveden na obrázku 24.

1.

2.

Obrázek 24: Agarová diluční metoda: 1. inokulované plotny, 2. plotny po inkubaci s nárůstem

mikroorganismů. (Engelkirk and Duben-Engelkirk, 2008 – upraveno)

V uvedeném příkladu se jedná se o testování rezistence k penicilinu, kdy bylo připraveno 5

ředění antibiotika. Na agarových plotnách bylo současně testováno šest různých kmenů,

každý z nich byl vždy aplikován na stejnou pozici. Po ukončení inkubace se hodnotí nárůst


57

mikroorganismů na jednotlivých plotnách. Jako MIC se odečte první koncentrace bez

viditelného růstu mikroorganismu, tj. kmen 1 – 32 U/ml, kmen 2 – 16 U/ml, kmen 3 – 4 U/ml,

kmen 4 – 4 U/ml, kmen 5 – více než 32 U/ml, kmen 6 – 32 U/ml.

7.3.1.2. Výhody a nevýhody agarové diluční metody

Nespornou výhodou agarové diluční metody je vysoká standardizovanost provedení

(referenční metoda). Můžeme jí vyšetřit velký soubor kmenů za standardních podmínek.

Využívá se také k hodnocení účinku nových antibiotik. Ve srovnání s mikrodiluční metodou

spolehlivěji odhaluje kontaminaci kmenů a lépe detekuje heterorezistenci, tj. rezistentní

subpopulaci bakterií.

Na druhou stranu je tato metoda poměrně pracná, časově a ekonomicky náročná, a proto není

praktická pro vyšetření citlivosti malého počtu nebo jednotlivých kmenů. Agarová diluční

metoda může selhat v průkazu klinicky významné rezistence některých bakterií, problém

mohou být i mikroorganismy s plazivým růstem (např. Proteus spp.).

7.3.2. Diluční mikrometoda (mikrodiluční metoda) Původní provedení bujonového dilučního testu bylo ve zkumavkách (tzv. makrodiluční

metoda), v současnosti se upřednostňuje varianta v mikrotitračních destičkách (tzv. diluční

mikrometoda nebo též mikrodiluční metoda).


Antimikrobiální látka je ředěna dvojnásobnou ředící řadou v tekuté živné půdě (např.

Mueller-Hinton bujon). Půdy s antibiotiky se rozplňují mechanickými rozplňovači do jamek

mikrotitrační destičky s 96 jamkami s kulatým nebo kónickým dnem. Rozplňovaný objem je

obvykle 100 μl/jamku. Počet koncentrací antibiotika závisí na uspořádání destičky. Obvykle

se připravuje 8 koncentrací jednoho antibiotika

v dvojnásobné geometrické řadě a na jedné destičce

se vyšetřuje MIC 12 antibiotik na jeden kmen.

Jedna jamka obvykle slouží jako kontrola růstu

testovaného mikroorganismu (zaočkované živné

médium bez antibiotika), příp. se jedna jamka vůbec

mikroorganismem nezaočkuje a slouží jako kontrola

kontaminace bujonu. Destičky lze připravit

v laboratoři nebo získat od komerčního výrobce.

K jednotlivým ředěním se následně přidává

standardní inokulum testovaného kmene. Po

příslušné době inkubace se odečítají pro jednotlivá antibiotika hodnoty MIC. Odečet může

probíhat vizuálně nebo za použití readeru, který změří hodnotu absorbance v každé jamce. Při

vizuálním hodnocení se odečítá koncentrace, která zřetelně inhibuje růst mikroorganismu.

V případě trimethoprimu, sulfonamidu nebo jejich kombinace se odečítá koncentrace, která

inhibuje 80 % růstu ve srovnání s růstem v kontrolní jamce bez antibiotika. Při

spektrofotometrickém hodnocení na hodnotu MIC ukazuje skoková změna hodnoty

absorbance.

Jedna čirá jamka v řadě jamek se zřetelným růstem se ignoruje, pokud se nejedná o poslední

jamku s nejvyšší koncentrací antibiotika. Dvě čiré jamky v řadě jamek se zřetelným růstem se

ignorují, pokud jsou následovány alespoň dvěma jamkami se zřetelným růstem (obrázek 26).

Jiné kombinace jamek se zřetelným nebo částečně potlačeným růstem a čirými jamkami,

podezření na kontaminaci či nedostatečný růst v kontrolní jamce jsou indikací k opakování

vyšetření.

Obrázek 25: Diluční mikrometoda.


58

růst

sloupec 1 – MIC jamka D

sloupec 2 – MIC jamka C

sloupec 3 – MIC jamka D

sloupec 4 – MIC jamka C

sloupec 5 – MIC jamka D (trimethoprim a sulfonamidy – 80% inhibice)

sloupec 6 – MIC je menší než nejnižší použitá koncentrace

sloupec 7 – MIC je vyšší než nejvyšší použitá koncentrace

Obrázek 26: Diluční mikrometoda – pravidla pro stanovení hodnoty MIC. (jamka A – nejvyšší koncentrace AML, jamka H – nejnižší koncentrace AML)

7.3.2.2. Výhody a nevýhody diluční mikrometody

Výhodou mikrodiluční metody je vysoká shoda s výsledky agarové diluční metody. Klinické

laboratoře ocení pružnou a snadnou přípravu velkého množství destiček s různými půdami,

antibiotiky a jejich koncentracemi, které lze dlouhodobě uchovávat, aniž by došlo ke snížení

jejich kvality (obvykle 1 měsíc při teplotě -20 °C). Další výhodou je jednoduché provedení a

možnost automatizace odečítání výsledků a jejich vyhodnocení. Na rozdíl od ostatních metod

koncentrace inokula neovlivní významně výsledek.

Mezi omezení mikrodiluční metody patří zejména obtížné rozpoznání případné kontaminace

testovaného bakteriálního kmene a neschopnost detekce rezistentní subpopulace. Metodu

nelze použít u kmenů, které v tekutém prostředí autolyzují. Stabilní sestava a koncentrace

antibiotik v komerčních destičkách nemusí vyhovovat potřebám dané laboratoře.

7.3.3. Etest Etest je moderní gradientová metoda kombinující

principy diskové difúzní a agarové diluční

metody. Byla vyvinuta ve Švédsku a poprvé

prezentována v roce 1988. Pro vysoký stupeň

shody s výsledky MIC získanými referenční

agarovou diluční metodou je Etest vhodný ke

stanovení MIC u řady mikroorganismů, včetně

náročných bakterií a anaerobů.

Vlastní Etest je plastový proužek, na jehož

spodní straně je imobilizovaný předdefinovaný

koncentrační gradient daného antibiotika ve

vysušeném stavu. Koncentrační gradient je

kalibrován jako odpovídající hodnoty MIC,

jedná se o stupnici nejméně 15-ti dvojnásobných

geometrických ředění, která je umístěna na horní

straně Etestu.


Nejdříve se připraví inokulum – suspenze vyšetřovaného mikroorganismu o stanovené

denzitě. Inokulum se aplikuje na povrch předsušené agarové plotny buď sterilním tamponem,

nebo se provede přelití, kdy se inokulum sterilní pipetou nanese na povrch agaru a po přelití

celého povrchu se přebytečná tekutina odsaje pryč. Inokulum se nechá krátce zaschnout.

Obrázek 27: Schéma Etestu. (Schwalbe et al., 2007 – upraveno)


59

Na klasické Petriho misky o průměru 90 mm se umísťují 1 až 2 Etesty, u velkých misek

(průměr 150 mm) lze paprskovitě umístit až 6 stripů. Proužky se umísťují ručně nebo pomocí

automatického dispenzoru. Nanesený gradient antibiotika musí být v přímém kontaktu

s povrchem agaru (stupnice je nahoře). Inkubační podmínky se volí podle nároků testovaného

mikroorganismu. Po umístění na povrch plotny, dochází k uvolňování antibiotika do agaru.

Pod proužkem a v jeho bezprostřední blízkosti se vytvoří stabilní a kontinuální gradient

antibiotika, který je udržován po dobu 18 – 20 hodin. Hodnota MIC se odečte v místě křížení

eliptické inhibiční zóny se stupnicí gradientu.

7.3.3.2. Výhody, nevýhody a využití Etestu v praxi

Podobně jako v případě diskové difúzní metody, je provedení Etestu velmi rychlé a

jednoduché. Výhodou Etestu je dále lepší možnost odhalení kontaminace testovaných kmenů

mikroorganismů a detekce heterorezistence.

Hlavní nevýhodou, která brání masivnímu rozšíření Etestu, je bezesporu vysoká cena

testovacích proužků. Podobně jako u ostatních metod, mohou být výsledky stanovení

ovlivněny koncentrací inokula.

Test lze provádět na různých živných půdách a za různých inkubačních podmínek, a proto

nachází široké využití v klinické diagnostice aerobních i anaerobních mikroorganismů

(streptokoky, pneumokoky, hemofily, gonokoky, atd.). Mimo antibiotik jsou k dispozici i

Etesty s některými antifungálními látkami umožňující např. testování citlivosti izolátů

Candida spp. Upravené Etesty lze použít k detekci speciálních mechanismů rezistence, např.

širokospektrých β-laktamas či metalo-β-laktamas.

7.4. Genotypové metody stanovení rezistence Standardizované metody využívané k určení fenotypu rezistence bakterií (diluční metody či

disková difúzní metoda) nejsou schopny rozlišit mechanismus rezistence. Ačkoli ke vzniku

rezistence může dojít v důsledku mutace v klíčových genetických lokusech bakteriálního

genomu, za většinu rezistencí k antimikrobiálním látkám jsou zodpovědné geny získané

prostřednictvím mobilních genetických elementů, jako jsou plasmidy a transpozony.

Identifikace genotypů rezistence se provádí pomocí detekce genů rezistence a charakterizace

mutací ve specifických genech. Při detekci genů rezistence se nejčastěji využívají metody na

bázi DNA sond, polymerázová řetězová reakce či další amplifikační techniky. Nové

technologie umožňující rychlou sekvenční analýzu DNA výrazně zvyšují schopnost detekce

mutací a genů rezistence u řady mikrobiálních patogenů.

7.4.1. Odhalování mutací spojených s rezistencí k AML V posledních letech dramaticky vzrostl počet molekulárních metod schopných identifikovat

specifické DNA nebo RNA sekvence či mutace v konkrétních lokusech. Pokud vznikle

rezistence jako důsledek mutace genu přítomného v citlivém kmeni, je přesná analýza mutace

zcela nezbytná. V molekulární diagnostice mutací se rozlišují dvě skupiny metod – metody

pro skenování mutací a metody sloužící ke screeningu mutací.

Cílem skenovacích metod je najít neznámé mutace v potenciálních genech rezistence, což

může zahrnovat posouzení širokého či mnohočetného genetického regionu a pečlivé

posouzení identifikovaných polymorfismů. Referenční metodou je v tomto případě kompletní

genová sekvenace, mezi další metody patří SSCP (Single-Strand Conformation

Polymorphism), denaturační gradientová gelová elektroforéza, DNA čipy, atd.


60

Cílem screeningových metod je najít známé mutace, které již byly určeny jako relevantní a

užitečné genotypové markery. Nejpoužívanější techniky jsou založeny na použití

oligonukleotidových čipů a fluorescenčních technik. Metody mohou být rozděleny do dvou

skupin: 1) vysoce účinné automatické zařízení schopné detekovat řadu cílů (tzv. „genetický

antibiogram“) a 2) jednoduché metody pro použití při práci v terénu nebo v méně

technologicky náročných situacích. První skupinu reprezentují mikroarray technologie,

druhou potom např. real-time PCR.

Tabulka 3: Vybrané geny rezistence u potravinářsky významných mikroorganismů.

Aminoglykosidy

Enterococcus spp. produkce modifikujících enzymů ant6, aac6-aph2

β-laktamy

S. aureus inhibice vazby β-laktamů díky produkci

pozměněného Penicilin-binding proteinu 2a

mecA

gramnegativní MO produkce různých typů β-laktamas včetně

širokospektrých β-laktamas (ESBL)

blaTEM, blaSHV, blaOXA

Glykopeptidy

Enterococcus spp. změna cílového místa díky produkci

modifikovaných prekurzorů peptidoglykanu

vanA, vanB, vanC1, vanC2, vanC3, vanD

Makrolidy, linkosamidy a streptogramin

S. aureus produkce modifikujících enzymů mphC, vatA

efflux systém msrA, mefA

změna cílového místa na ribosomu ermA, ermC

Chinolony a fluorochinolony

změna cílového místa – gyrasa gyrA, gyrB

změna cílového místa – topoizomerasa II parC, parE

Tetracykliny

E. coli efflux systém tetA, tetB, tetC, tetD, tetG

Enterococcus spp. efflux systém

produkce proteinů chránících ribosomy

tetK, tetL

tetM, tetO, tetS

Chloramfenikol

gramnegativní MO produkce modifikujících enzymů catI, catII, catIII

Clostridium spp. produkce modifikujících enzymů catP, catQ, catD

(zpracováno podle Lewis et al., 2002)

7.4.2. Výhody a nevýhody použití genotypových metod Důvody, proč identifikovat geny rezistence a mutace vyvolávající rezistenci mikroorganismů

jsou následující. Rychlá detekce rezistence může optimalizovat terapii sepsí a meningitid před

tím, než jsou k dispozici výsledky kultivace. Přímá analýza klinických vzorků umožňuje

detekci nekultivovatelných forem mikroorganismů nebo organismů s náročnými růstovými

požadavky. Jsou užitečné také pro posouzení hraničních výsledků MIC (na úrovni

breakpointu), které mohou mít dopad na terapeutické rozhodnutí. Poskytují zlatý standard pro

přehodnocení stávajících breakpointů nebo stanovení nových breakpointů pro nové

antimikrobiální látky, které je založené na mechanismu rezistence.

Nevýhodou je omezená citlivost v přítomnosti nízkého počtu mikroorganismů nebo směsné

populace citlivých a rezistentních kmenů. Vícečetné mechanismy rezistence u některých

mikroorganismů omezují typy determinant, které mohou být detekovány. V současné době je

nedostatek univerzálních metod pro testování všech genů rezistence. K provedení analýzy je

potřeba speciální laboratorní vybavení.

Stanovení bakteriálních toxinů

61

8. STANOVENÍ BAKTERIÁLNÍCH TOXINŮ

Alimentární intoxikace představují významnou skupinu onemocnění z potravin ohrožující

zdraví konzumentů. Příčinou vzniku onemocnění jsou toxiny přítomné v potravině, které

vznikají jako metabolické produkty při množení patogenních bakterií. Mezi významné

původce alimentárních intoxikací se řadí Staphylococcus aureus, Bacillus cereus a

Clostridium botulinum. Zdrojem kontaminace potravin ve výrobním procesu mohou být

suroviny, prostředí nebo i člověk. Také nevhodné podmínky skladování a manipulace

s potravinami během přípravy v domácnostech nebo stravovacích zařízeních, kde nejsou

důsledně dodržovány zásady správné hygienické praxe, mohou negativně ovlivnit zdravotní

nezávadnost potravin.

8.1. Toxiny Staphylococcus aureus Bakterie Staphylococcus aureus, jako hlavní zástupce koagulasa pozitivních stafylokoků, je

jedním z nejvýznamnějších patogenních mikroorganismů a původců alimentárních intoxikací.

Je to fakultativně anaerobní, nepohyblivý, grampozitivní kok. Významná je jeho schopnost

produkovat celou řadu toxických exoproteinů, faktorů virulence a především enterotoxinů.

Velké riziko kontaminace je u potravin s vysokým podílem ruční práce. Dále stafylokoky

nejčastěji kontaminují mléčné výrobky, lahůdky, pudinky a salátové dresinky, také maso,

šunky, ryby a mořské plody. Rizikové množství S. aureus v potravině, které je schopno

vyprodukovat dostatečné množství stafylokokových enterotoxinů (SEs) – alespoň 1 ng. g-1

potraviny, je 105 KTJ.g-1.

Podle ČSN EN ISO 6888-1 (1999) je pro izolaci koagulasa pozitivních stafylokoků užíván

selektivně-diagnostický agar Baird-Parker, kde S. aureus vytváří charakteristické černé

kolonie (redukce teluričitanu), které jsou obklopeny zónou projasnění, což je výsledkem

působení lecitinasy na suplement žloutkovou emulzi.

V současné době se pro stanovení stafylokokových enterotoxinů (SEs) používají především

imunologické metody, které jsou snadno dostupné formou různých komerčně vyráběných

setů. Kromě nich existuje také možnost detekce pomocí metod založených na fyzikálně-

chemických principech, které jsou označované jako alternativní. Uvedené metody detekují

toxin přímo z potraviny a označují se tedy jako metody přímé. Molekulárně biologické

metody jsou označovány jako metody nepřímé, protože pomocí nich nejsme schopni stanovit

přítomnost SEs přímo ve vyšetřované potravině. Nepřímé metody spočívají v detekci genů

zodpovědných za produkci SEs. K analýze se používá DNA, která byla získána z bakterie S.

aureus, izolované z vyšetřované potraviny.

8.1.1. Stafylokokové enterotoxiny V současnosti je známo 22 typů stafylokokových enterotoxinů – SEs (SEA, SEB, SEC, SED,

SEE, SEF, SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SEO, SEP, SEQ, SER, SES, SET,

SEU, SEV), přičemž SEC lze dále rozdělit na jednotlivé subtypy (SEC1, SEC2, SEC3,

SEChovězí, SECovčí, SECkozí) podle odlišných izoelektrických bodů (pI). Těchto 22 typů SEs se

rozděluje do dvou skupin. Toxiny SEA – SEE se označují jako skupina tzv. klasických SEs,

ostatní SEs se označují jako tzv. nové typy.

SEs jsou proteiny o molekulové hmotnosti pohybující se v rozmezí 24 – 29 kDa, složené

z jednoduchých polypeptidových řetězců s podobným zastoupením aminokyselin u

jednotlivých typů SEs. Polypeptidové řetězce obsahují jednu disulfidickou vazbu a jsou

bohaté na lysin, kyselinu asparagovou, glutamovou a tyrosin.


62

Schopnost produkovat stafylokokové enterotoxiny lze prokázat asi u poloviny kmenů S.

aureus izolovaných z potravin. SEs jsou termostabilní (snesou i půlhodinový var) a jsou

odolné vůči trávicím enzymům. Lze obecně říct, že podmínky vhodné pro pomnožování S.

aureus jsou vhodné i pro produkci SEs (tabulka 4).

Tabulka 4: Limity pro růst S. aureus a produkci enterotoxinů. (Roberts et al., 1996 – upraveno)

Faktor Růst bakterií Produkce enterotoxinů

Rozmezí Optimum Rozmezí

teplota (°C) 7 – 48 40 – 45 10 – 48

pH 4,0 – 10,0 7,0 – 8,0 4,5 – 9,6

aktivita vody – aw 0,83 – > 0,99 0,98 0,87 – > 0,99

Na druhou stranu ne všechny SEs vyvolávají u konzumentů intoxikaci z potravin. Jako toxiny

schopné vyvolat gastroenterický syndrom byly prokázány vedle klasických SEs (SEA – SEE)

pouze SEH, nicméně i u SEG a SEI byla stanovena emetická aktivita. Minimální toxická

dávka se u nejvíce účinných SEs pohybuje okolo 0,5 ng.g-1 (ml-1) potraviny. Stafylokoková

enterotoxikóza má rychlý nástup (2 – 6 hodin po konzumaci potraviny obsahující SEs) i

průběh. Příznaky onemocnění jsou zvracení, bolesti hlavy a břicha, někdy také průjem.

Onemocnění probíhá zpravidla bez zvýšené teploty. Symptomy obvykle samovolně vymizí po

24 hodinách, maximálně do 48 hodin.

8.1.2. Přímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů

8.1.2.1. Imunologické metody

Základem imunologických metod je specifická reakce mezi protilátkou a antigenem.

Antigenem je stafylokokový enterotoxin přítomný v potravině a produkovaný bakterií S.

aureus během růstu.

Reverzní pasivní latexová aglutinace – RPLA

RPLA využívá latexové částice potažené protilátkami proti příslušným toxinům. Latexové

částice nehrají aktivní roli při reakci antigen-protilátka. Ve vzorku přítomný toxin (rozpustný

antigen) reaguje (aglutinuje) s navázanou protilátkou za vzniku pouhým okem viditelné

mřížkové struktury. Není-li antigen ve vzorku přítomen nebo je pod detekčním limitem testu,

mřížková struktura se nevytvoří a latexové částice vytvoří na dně jamky mikrotitrační

destičky kompaktní sediment v podobě „knoflíku“. Posuzování přítomnosti či nepřítomnosti

toxinu ve vzorku závisí také na množství testovaného toxinu. Výsledky mohou být

vyhodnoceny jako falešně negativní a to v případě, kdy množství toxinu ve vzorku je nižší,

než mez detekce RPLA.

Obrázek 28: Vyhodnocení RPLA. Jako pozitivní je hodnocena reakce (+) až (+++).


63

Příkladem této metody je testovací souprava SET-RPLA (výrobce Denka-Seiken), která

slouží k detekci SEA, SEB, SEC, SED přímo ve vzorcích potravin nebo v kultivačních

médiích. Mezi SEA a SEE může docházet ke křížové reakci, a proto SET-RPLA neobsahuje

specifickou protilátku pro SEE a kmeny s produkcí SEE jsou klasifikovány jako SEA

produkující. Citlivost této metody se pohybuje kolem 1 – 2 ng.g-1 (ml-1) vzorku.

Po nanesení vzorků a příslušných protilátek do jamek se mikrotitrační destička inkubuje při

teplotě 20 – 24 hodin. Výsledky reakce lze hodnotit semikvantitativně podle mřížkové

struktury vzniklé na dně jamek mikrotitrační destičky (obrázek 28). Výhodou testu je možnost

detekce SEs bez potřeby komplikovaného laboratorního vybavení.

Metoda ELISA

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) patří

mezi rychlé a citlivé imunologické techniky využívající

vysoce specifické reakce mezi protilátkou a antigenem.

Principem metody je vazba antigenu a protilátky značené

enzymem, který štěpením substrátu vyvolá barevnou

změnu. Komerčně dostupný 3M™ Tecra™ Staph

Enterotoxins VIA set (výrobce TECRA) funguje na

principu sendvičové ELISA metody. Detekuje SEA –

SEE jako sumu. Specifická identifikace jednotlivých

enterotoxinů A, B, C, D a E je možná podobnou

soupravou s názvem 3M™ Tecra™ Staph Enterotoxins

Identification Test.

Výhodou TECRA setu oproti ostatním je použití antisér

zaměřených proti všem pěti základním enterotoxinům

SEA – SEE. V současnosti byly již vyvinuty soupravy

pro stanovení nového typu SEH, který byl také popsán jako původce alimentární intoxikace.

ELISA testy detekují 0,1 – 1,0 ng enterotoxinu na 1 g (ml) potraviny, čas potřebný pro

provedení a vyhodnocení metody jsou 3 – 4 hodiny.

Metoda ELFA

Plně automatický systém založený na metodě ELFA (Enzyme Linked Immunofluorescent

Assay) využívá přístroj miniVIDAS® (výrobce bioMérieux). Pro detekci klasických SEs (SEA

– SEE) v potravinách se používá testovací souprava VIDAS SET 2. Nevýhodou této metody

je skutečnost, že SEs přítomné ve vzorku jsou detekovány jako suma a přístroj určí pouze

jejich přítomnost či nepřítomnost. Z výsledků nelze vyvodit, který typ SE je ve vzorku

přítomen. Detekční limit je od 0,5 ng.g-1 (ml-1) (pro SEA a SEB) do 1,0 ng.g-1 (ml-1) (pro

SEC, SED a SEE). Velkou výhodou metody je rychlost stanovení (asi 2 h) a jednoduchá

příprava vzorků.

Další imunologické metody

K imunologickým metodám, které byly úspěšně použity k detekci SEs, ale bez jejich širšího

využití v běžné každodenní laboratorní praxi, patří např. imunomagnetická separace (IMS)

v kombinaci s průtokovou cytometrií. IMS využívá magnetické částice potažené specifickou

protilátkou proti hledanému antigenu (toxinu). Tyto protilátky jsou označeny fluorescenčním

barvivem. Vzniklý komplex je detekován průtokovým cytometrem. Tento postup byl zatím

testován pouze pro detekci SEB, s detekčním limitem 100 pg. ml-1 za dobu méně než 45 min.

Možnou nevýhodou bránící širšímu využití tohoto testu jsou investiční náklady nezbytné pro

pořízení přístrojového vybavení.

Obrázek 29: ELISA – vyhodnocení.


64

Princip metody western blotting je založen na kombinaci metody elektroforetického rozdělení

proteinů v polyakrylamidovém gelu, následném přenesení těchto proteinů na nitrocelulosovou

membránu a převrstvení protilátkami značenými chromoforem. Vazba protilátky na antigen

se projeví barevnou skvrnou. Detekční limit metody je 100 pg. ml-1 (g-1).

8.1.2.2. Fyzikálně-chemické metody

Biosenzory (biochips, chips, protein microarrays) jsou založeny na interakci mezi

bakteriálním toxinem a povrchově vázaným imobilizovaným receptorem (většinou

protilátkou), ale využívají i interakce mezi proteiny, případně vazby mezi DNA a proteinem

(tzv. záchytné sondy, capture probe).

Pro bližší určení jednotlivých toxinů lze použít metodu hmotnostní spektrometrie MALDI-

TOF/MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry).

Tato metoda umožní přesnou analýzu testovaného toxinu, a to stanovením jeho molekulární

hmotnosti a sekvencí jednotlivých aminokyselin. Princip spočívá v přenesení energie laseru

do matrice. Tento přenos způsobí rozštěpení bílkovin na menší části, které jsou poté

analyzovány hmotnostní spektrometrií. Metodu lze využít pro detekci SEs, pro které zatím

nebyly připraveny vhodné protilátky využitelné v imunologických metodách.

Dále lze využít elektrické proteinové microarrays. Princip je založen na metodě sendvičové

ELISA, kdy po navázání enzymaticky značené protilátky s antigenem a následném přidání

substrátu dojde k enzymové přeměně neaktivního substrátu a tato interakce je transformována

do elektrického signálu, který je následně analyzován.

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je jednou z dalších metod detekce SEs.

V současné době byly chromatografickými metodami stanoveny pouze SEA a SEB. Metodu

lze využít pro kvalitativní i kvantitativní stanovení. Vlastní analýze předchází časově náročná

příprava vzorků, zahrnující složité extrakční postupy a následné čištění extraktů.

Metoda LC-MS kombinuje fyzikální separaci pomocí kapalinové chromatografie (LC)

s detekcí hmotnostní spektrometrií (MS). Princip spočívá v přesném stanovení hledaného

proteinu na základě jeho molekulové hmotnosti a také na základě pořadí aminokyselin po

enzymatickém štěpení. Touto metodou byl stanoven SEB ve vzorku vody již v koncentraci 3

pmol.ml-1.

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) je elektroforéza

v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS). Umožňuje separaci

proteinů na základě jejich pohyblivosti v elektrickém poli. SDS uděluje proteinům uniformní

záporný náboj, a ty se pak všechny pohybují k anodě, přičemž pohyblivost je dána velikostí

molekuly. Proteiny v gelu mohou být přeneseny na nitrocelulosovou, nylonovou nebo jinou

membránu a mohou být poté analyzovány imunologicky protilátkami, které se specificky

navážou na daný protein a mohou být zviditelněné různými technikami. Pomocí SDS-PAGE

byly úspěšně detekovány i některé nové typy stafylokokových enterotoxinů.

8.1.3. Nepřímé metody stanovení stafylokokových enterotoxinů Využití nepřímých metod detekce SEs u tepelně opracovaných potravin může představovat

specifický problém. Na rozdíl od stafylokoků, jež jsou v průběhu tepelného ošetření zničeny,

jsou SEs termostabilní proteiny, které nedegraduje běžné tepelné ošetření při kulinární úpravě

potravin a pokrmů. Z tepelně ošetřených potravin nemusí být možné získat izolát S. aureus

ani DNA pro vlastní detekci genů. V tomto případě je nutné použít přímé metody stanovení

toxinů.


65

Polymerázová řetězová reakce – PCR

Principem metody PCR je klonování (opakovaná amplifikace) specifického úseku DNA.

Metoda PCR se používá pro stanovení genů zodpovědných za tvorbu toxinů (např. sea, seb,

sec), tedy pro potvrzení toxigenity kmenů S. aureus. V současné době jsou známy primery

pro jednotlivé typy enterotoxinů. Nevýhodou metody PCR je, že potvrzení přítomnosti genu

automaticky neznamená, že příslušný enterotoxin bude bakteriálním kmenem produkován.

Absence přítomnosti SEs v potravinách, kde byla přítomnost kmenů S. aureus s geny

kódujícími tvorbu klasických SEs prokázána, lze vysvětlit tak, že nedošlo k expresi genu nebo

produkované množství toxinu bylo pod detekční mezí použitých metod (ELISA, RPLA). PCR

metoda je nejpoužívanější metodou v případě detekce tzv. nových SEs, neboť pro všechny

nové typy nejsou dostupné specifické protilátky využitelné při imunologickém stanovení.

Real-time PCR

Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (real-time PCR) je založena na principu

klasické PCR s tím rozdílem, že speciální přístroj umožňuje kontinuálně monitorovat

přírůstky DNA během každého cyklu (u klasické PCR se detekuje až finální produkt).

Základní podmínkou je přítomnost nespecifického nebo specifického fluorescenčního

substrátu (tzv. detekční sondy), který se váže na syntetizovanou DNA. Úroveň detekované

fluorescence odráží množství syntetizované nukleové kyseliny. Metoda umožňuje nejen

detekci, ale také kvantifikaci syntetizovaného produktu. Při hodnocení platí skutečnost, že

čím vyšší je obsah nukleové kyseliny v testovaném vzorku, tím rychlejší je přírůstek

fluorescence. Velkou výhodou metody real-time PCR je možnost určení exprese hledaného

genu. Metoda má vysokou specifitu a citlivost. Ve srovnání s klasickou PCR je doba vlastního

stanovení kratší, protože odpadá nutnost provedení elektroforézy v závěru analýzy.

DNA microarrays

Tato metoda je založena na principu hybridizace, probíhá na membráně nebo skleněné

destičce, na které jsou mikrodávkovačem naneseny jednotlivé oligonukleotidy (DNA sondy).

Po převrstvení testovaným vzorkem dojde v případě pozitivní reakce k navázání cílové DNA

na DNA sondu. Cílová DNA je označená fluoroforem schopným emitovat světlo, vazba

cílové DNA na sondu se tedy projeví fluorescencí. Intenzita fluorescenčního signálu odpovídá

množství navázané cílové DNA. Metoda umožňuje kvalitativní i kvantitativní stanovení a

sledování až stovek specifických úseků DNA v jedné reakci.

8.1.4. Využití v praxi V praxi jsou z uvedených metod běžně používány imunologické metody – reverzní pasivní

latexová aglutinace, ELISA a ELFA, pomocí kterých lze detekovat klasické stafylokokové

enterotoxiny (SEA, SEB, SEC, SED, SEE).

Nařízení (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny ve znění pozdějších

předpisů zahrnuje požadavky pro stanovení SEs u vybraných potravin (sýry, sušené mléko a

sušená syrovátka). Referenční metody podle tohoto nařízení jsou ELISA a ELFA. Používá se

ELISA test (Ridascreen® SET Total, výrobce R-Biopharm AG) s dialyzační metodou

zakoncentrování SEs a s detekčním limitem 0,25 ng.ml-1 (g-1). Nízkého detekčního limitu

1 ng.ml-1 (g-1) můžeme dosáhnout i pomocí přístroje miniVIDAS® využívajícího metodu

ELFA při využití zakoncentrování vzorku před vlastním stanovením toxinu. Obě metody se

však omezují pouze na detekci klasických enterotoxinů SEA – SEE.

Stafylokokové enterotoxiny jsou platnou legislativou (zákon č. 281/2002 Sb.) zařazeny do

skupiny vysoce rizikových biologických toxinů. Jedná se o povinné opatření související se

zákazem bakteriologických (biologických) a toxinových zbraní a možnosti jejich případného


66

zneužití. Pracoviště, které se analýzou SEs zabývají, mají povinnost žádat Státní úřad pro

jadernou bezpečnost (SÚJB) o udělení povolení nakládat s těmito vysoce rizikovými

biologickými toxiny. Nákup vyšetřovacích setů, jejichž součástí jsou SEs v podobě pozitivní

kontroly, je možný pouze na základě udělení zmíněného povolení. Pracoviště je vedeno

v evidenci, podléhá dozorové činnosti SÚJB a musí plnit povinnosti držitelů povolení

v souladu s platnou legislativou.

8.2. Toxiny Bacillus cereus Bacillus cereus je fakultativně anaerobní, sporotvorná, grampozitivní tyčinka. Je producentem

celé řady toxinů a enzymů, z pohledu alimentárních onemocnění jsou nejvýznamnější

emetický toxin a diarhogenní enterotoxiny. Konzumace potravin kontaminovaných

bakteriemi B. cereus může vyústit ve 2 různé formy alimentárního onemocnění – emetický a

diarhogenní syndrom. Spory B. cereus se běžně vyskytují v prostředí a často kontaminují

potraviny. Bakterie je také běžnou součástí střevní mikroflory člověka. K alimentárním

otravám dochází po pomnožení bakterií v potravinách na množství přibližně 107 buněk

v gramu (v případě dětí 105 v gramu).

Pro stanovení B. cereus je podle ČSN EN ISO 7932 (2005) určen Mannitol Yolk Polymyxine

B agar (MYP), kde B. cereus roste ve velkých suchých drsných koloniích s nepravidelnými

okraji, růžové barvy (negativní manitol), obklopených růžovou zónou precipitace

(lecitinázová aktivita). Pro izolaci B. cereus lze využít i chromogenní média.

Toxiny B. cereus lze opět prokazovat přímými i nepřímými metodami. Nejčastěji se uvedené

metody používají na hodnocení toxinogenity izolátů B. cereus. Komerčně dostupné kity jsou

určeny k detekci přítomnosti diarhogenních enterotoxinů B. cereus. Emetický toxin se

zpravidla detekuje nepřímo metodou PCR.

8.2.1. Emetický toxin a diarhogenní enterotoxiny Emetický toxin (cereulid) je termostabilní lipofilní cyklický polypeptid o velikosti 1152 Da.

Odolává záhřevu až 121 °C po dobu 90 minut. Aktivitu si zachovává při pH 2 – 11, je odolný

vůči působení proteolytických enzymů (pepsin, trypsin). Maximální produkce cereulidu je

pozorována během stacionární fáze růstu bakterií v potravině a může být vázána na sporulaci.

Emetický syndrom je alimentární intoxikace a vzniká po konzumaci potravin obsahujících

vyprodukovaný emetický toxin. Toxická dávka je přibližně 30 μg na kg živé váhy. Toxin

cereulid se váže na receptory nervus vagus v žaludku a indukuje zvracení. Typické symptomy

– nauzea a zvracení, se objevují 1 – 6 hodin po konzumaci kontaminované potraviny a

nepřetrvávají obvykle déle než 24 hodin, poté onemocnění spontánně odezní. Průběh

onemocnění připomíná stafylokokovou enterotoxikózu. Emetický syndrom bývá obvykle

spojen s konzumací těstovin a rýže, dále masa (hovězí, vepřové), mléčných pudinků a

kojenecké výživy.

B. cereus produkuje tři základní diarhogenní enterotoxiny – hemolysin BL (HBL toxin),

nehemolytický enterotoxin (NHE) a cytotoxin K, nově byly izolovány i enterotoxin T (BceT)

a enterotoxin FM. HBL toxin je jedním z nejvýznamnějších faktorů virulence a skládá se ze

tří komponent: vazebného proteinu B a lytických komponent L1 a L2. Proteinový komplex

nehemolytických enterotoxinů (NHE) se také skládá ze tří komponent: NheA, NheB, NheC.

Diarhogenní enterotoxiny jsou zpravidla produkovány během pozdní exponenciální a na

začátku stacionární fáze růstu při množení bakterií ve střevě, tedy až po kolonizaci bakterií

v tenkém střevě. Jsou stabilní při pH 4 – 11 a termolabilní (účinně jsou inaktivovány teplotou

56 °C po dobu 5 minut). Proteolytické enzymy je štěpí. Pokud dojde k produkci enterotoxinů


67

v potravině, obvykle jsou tedy inaktivovány nízkým pH a účinkem proteolytických enzymů

v žaludku.

Diarhogenní syndrom se objevuje 8 – 16 hodin po konzumaci kontaminované potraviny. Mezi

klinické příznaky patří vodnatý průjem, nauzea a abdominální bolesti, příležitostně se může

objevit i zvracení. Potíže přetrvávají 12 – 24 hodin, potom spontánně odezní. Kmeny

zodpovědné za diarhogenní syndrom jsou obvykle izolovány z masa a masných výrobků, ryb,

omáček, zeleniny (např. kukuřice), vařených brambor a mléčných výrobků.

8.2.2. Přímé metody detekce toxinů B. cereus

8.2.2.1. Imunologické metody

Reverzní pasivní latexová aglutinace

Princip metody je identický s testem na průkaz

stafylokokových enterotoxinů. Po nanesení

vzorků a příslušných protilátek do jamek se

mikrotitrační destička inkubuje při laboratorní

teplotě 18 – 24 hodin. Výsledky reakce lze

hodnotit semikvantitativně podle mřížkové

struktury na dně jamek. Citlivost testu je

kolem 1 – 2 ng.g-1 (ml-1) vzorku. Komerčně

dostupný test BCET-RPLA (výrobce Oxoid

Ltd) detekuje L2 komponentu proteinového

komplexu hemolyzinu BL (HBL toxinu).

Metoda ELISA

Komerčně dostupný Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immunoassay (BDE-VIA™,

výrobce TECRA) funguje na principu sendvičové ELISA metody. Je určen pro detekci

průjmového enterotoxinu, konkrétně A komponenty (NheA) proteinového komplexu

nehemolytických enterotoxinů (NHE) v potravinách, příbuzných vzorcích a pomnožovacích

kulturách. Metoda detekuje toxin přítomný v koncentracích až 1 ng na 1 ml extraktu vzorku.

Výsledky testu prováděného v mikrotitračních destičkách lze obdržet během 4 hodin.

Test je běžně využíván u izolátů Bacillus spp. k posouzení jejich schopnosti tvořit

enterotoxiny. V tomto případě se testovaná kultura inkubuje v pomnožovacím bujónu při

teplotě 35 – 37 °C po dobu 16 – 18 hodin a průkaz toxinů se provádí v odstředěném

supernatantu. V průběhu analýzy a přípravy vzorku je nutné brát na zřetel, že diarhogenní

toxin BDE se váže na sklo. Nádoby a ostatní vybavení musí být vyrobeny z materiálu, na

který se toxin neváže, proto je doporučeno použití polypropylenových nádob a lakmusových

papírků místo sondy pH metru.

8.2.2.2. Fyzikálně-chemické metody

Mezi moderní fyzikálně-chemické metody patří vysoce citlivá a specifická metoda

hmotnostní spektrometrické detekce HPLC-MS, která kombinuje vysoceúčinnou kapalinovou

chromatografii (HPLC) s detekcí hmotnostní spektrometrií (MS). Lze jí využít pro stanovení

cereulidu (emetického toxinu) v potravinách, a to i kvantitativně. Nevýhodou je nutnost

přípravy vysoce čistého vzorku a standardu. Jako standard se využívá syntetický cereulid.

Kromě HPLC-MS byly k detekci cereulidu použity metody s tandemovou hmotnostní detekcí

(LC-MS/MS) a kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií s analyzátorem doby

letu (LC-TOF-MS).

Obrázek 30: BCET-RPLA – vyhodnocení.


68

Příkladem využití fyzikálně-chemických metod při detekci diarhogenních toxinů je metoda

MALDI-TOF/MS, kterou byl detekován cytotoxin K (CytK1) a nehemolytické enterotoxiny

(NHE) produkované patogenními kmeny B. cereus.

8.2.2.3. Další přímé metody

Pro detekci emetického toxinu se kromě již zmiňované HPLC-MS používají metody

využívající tkáňové kultury (HEp-2 cell assay), biologický pokus (myši) či kančí sperma.

Vizuálním hodnocením motility kančího spermatu bývá posuzována přítomnost cereulidu

v testovaných vzorcích a jeho toxická aktivita. Metoda je doporučována jako rychlá,

(výsledek je znám za 5 - 20 minut), na rozdíl od testů HEp-2 prokazujících mitochondriální

toxicitu, jejichž trvání je více než 15 hodin. Další výhodou je nenáročnost na laboratorní

vybavení a možnost množství cereulidu kvantifikovat. Metodu tak lze použít pro rychlé

hodnocení toxinogenních schopností izolátů B. cereus. Hodnocení motility kančího spermatu

využívá např. automatizovaná metoda CASA (Computer-Aided Semen Analysis).

8.2.3. Nepřímé metody stanovení toxinů B. cereus Polymerázová řetězová reakce, za použití specifických primerů, se používá pro stanovení

genů zodpovědných za tvorbu toxinů u kmenů B. cereus. Emetický toxin cereulid je kódován

ces geny a jeho nepřímý průkaz bývá založen na detekci genu cereulid syntetasy (cesB).

Nehemolytické enterotoxiny (NHE) jsou kódovány geny nheA, nheB a nheC. U hemolysinu

BL (HBL) jsou to geny hblA (pro komponentu B), hblC (pro komponentu L2) a hblD (pro

komponentu L1). Dále lze metodou PCR detekovat gen cytK zodpovědný za tvorbu

cytotoxinu K nebo gen bceT kódující enterotoxin T. I v tomto případě platí, že detekce genů

metodou PCR je metoda nepřímá, protože geny kódující tvorbu toxinů nemusí být

exprimovány.

Při genotypové charakterizaci izolátů B. cereus lze mimo různých modifikací PCR (např.

RAPD, RFLP-PCR, real-time PCR) využít i metodu MLST (Multilocus Sequence Typing),

ribotypizaci či microarrays.

8.2.4. Využití v praxi K posouzení schopnosti tvorby enterotoxinů u kmenů B. cereus se v praxi využívají nejčastěji

vyšetřovací sety ELISA nebo RPLA. Výskyt nehemolytických enterotoxinů – komponenty A

(NheA), která je detekovatelná ELISA soupravou, je u toxinogenních kmenů B. cereus

častější než L2 komponenta HBL toxinu detekovatelná soupravou RPLA. Využití obou setů je

jednoduché a vhodné pro laboratoře vybavené k základnímu mikrobiologickému testování.

Vzhledem k tomu, že toxiny B. cereus nejsou vedeny v kategorii bakteriologických

(biologických) a toxinových zbraní, není nákup souprav omezen žádným speciálním

povolením. Nároky na vybavení laboratoří využívajících nepřímé metody k detekci toxinů B.

cereus, jsou vyšší, včetně nezbytných zkušeností pracovníků s prováděním molekulárně

biologických metod.

V případě průkazů cereulidu nejsou dostupné imunologické metody. Specializovaná

pracoviště mohou využít metodu kombinující vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii

s detekcí hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS). Pro své rychlé a jednoduché provedení je

doporučován test s hodnocením aktivity kančího spermatu.


69

8.3. Toxiny Clostridium botulinum Clostridium botulinum je grampozitivní, endospory tvořící, obligátně anaerobní bakterie.

Patogenní působení je vyvoláno nervovým toxinem nazývaným botulotoxin. Kmeny C.

botulinum způsobující botulinové intoxikace u lidí produkují jeden nebo více botulotoxinů

typů A, B, E, F. Hlavním rezervoárem C. botulinum je půda a prach, vodní sedimenty (typ E),

ve velmi nízkých koncentracích může být obsaženo v zažívacím traktu hospodářských zvířat a

následně kontaminovat potraviny živočišného původu.

Detekce C. botulinum z potravin nebo jiného materiálu se provádí po pomnožení v tekutých

půdách za anaerobních podmínek a následném vyočkování na krevní agar a selektivní půdy.

Na krevním agaru vytváří C. botulinum 1 – 4 mm velké ploché kolonie se zónou hemolýzy.

Předpokládá-li se přítomnost spor, je vhodné před analýzou vzorek zahřát na 80 °C.

8.3.1. Botulotoxiny Patogenní působení C. botulinum vyvolávají toxiny, které se uvolňují z bakteriální buňky po

její lýze. Celkově bylo popsáno 7 hlavních botulotoxinů a řada subtypů (např. typ A zahrnuje

subtypy A1, A2, A3, A4 a A5), které se od sebe liší aminokyselinovým složením. Humánní

botulismus vyvolávají především typy A, B a E. Botulotoxin bývá nazýván jako klobásový

jed, protože v minulosti býval spojován s otravami způsobenými nedokonale tepelně

opracovanými klobásami (klobása – latinsky botulus).

Botulotoxin je jednoduchý polypeptid o velikosti 150 kDa produkovaný jako protoxin. Tato

forma botulotoxinu je relativně neškodná, patogenní působení nastává až po změně terciální

struktury bílkovinného řetězce vyvolané působením extracelulárních proteas, k čemuž

dochází po uvolnění z bakteriální buňky. Po rozpadu protoxinu na dva bílkovinné řetězce –

těžký (100 kDa), který má vazebně receptorovou funkci a lehký (50 kDa), který má

endopeptidázovou aktivitu, začíná botulotoxin patogenně působit. Těžký řetězec má dvě

funkční oblasti s odlišnými funkcemi. C-konec bílkovinného řetězce umožňuje vazbu toxinu

na nervová zakončení, N-konec pak přenos lehkého řetězce do cytosolu nervových buněk.

Lehký bílkovinný řetězec má endopeptidázovou aktivitu, obsahuje molekuly zinku a

zabraňuje uvolňování acetylcholinu, což je neurotransmiter ve vegetativním nervovém

systému a také jediný neurotransmiter v somatickém systému. Po inaktivaci uvolnění

acetylcholinu je znemožněn přenos vzruchů a rozvíjí se postupná paralýza.

Botulotoxin patří mezi nejsilnější známé jedy. LD50 se pro člověka pohybuje okolo 5 – 50

ng/kg ž. hm., pro myši je letální dávka menší než 0,1 ng/kg ž. hm. Toxin je rezistentní

k nízkému pH (je aktivní v rozmezí 3,5 – 6,5), ale inaktivují ho alkalie (např. 0,1N NaOH).

Botulotoxin je termolabilní, tepelnou úpravou při 85 °C je zničen za 15 minut.

Botulismus je charakterizován jako postupná symetrická paralýza nervů, která nastává po

botulotoxiny vyvolaném přerušení nervosvalových spojení. Toxiny C. botulinum mohou mít

různé místo působení a podle toho jsou rozeznávány jednotlivé typy botulismu: alimentární

otrava, botulismus u dětí, u dospělých a traumatický botulismus po infekci ran. Příznaky

onemocnění jsou u různých typů shodné.

Alimentární intoxikace se projevuje za 12 – 36 hodin po pozření kontaminovaného jídla,

podle množství bakterií a toxinů se příznaky mohou objevit už za 6 hodin, ale také za 8 – 10

dní. Rizikovými potravinami jsou domácí masozeleninové konzervy, nedostatečně tepelně

opracované maso, syrové solené ryby nebo ryby uzené studeným kouřem. Prvotní příznaky

jsou nevolnost, zvracení, bolest břicha a průjem, typické je rozmazané a dvojité vidění.

Postupná paralýza začíná od hlavy ochablostí očních víček a mimických svalů, řeč je špatně

srozumitelná, zhoršuje se dýchání a polykání. Smrt bývá vyvolána ochrnutím dýchacích

svalů.


70

8.3.2. Metody detekce toxinů C. botulinum Přítomnost botulotoxinů v potravinách lze zjistit biologickým pokusem na myších, k určení

typu toxinu se používají diagnostická séra.

8.3.2.1. Průkaz botulotoxinu

Průkaz botulotoxinu z potravin, zvratků, krve, střevního obsahu je založen na zjištění

onemocnění a úhynu bílých myší za klinických příznaků botulismu (zježená srst, ztížené

dýchání, ochablé svaly břišní stěny = vosí pas, křeče, paralýza zadních končetin). Vzorek v

bujonu po anaerobní inkubaci (výchozí tekutina) se aplikuje intraperitoneálně třem skupinám

obsahujícím alespoň 2 myši. První skupině je aplikována výchozí tekutina bez úpravy, druhé

skupině výchozí tekutina po zahřátí na 100 °C po dobu 10 minut a třetí skupině myší výchozí

tekutina po 1 hodinovém účinku proteolytického enzymu (trypsin, pankreatin). Jako průkaz

botulotoxinu je považováno onemocnění a úhyn myší první skupiny.

8.3.2.2. Identifikace typu botulotoxinu

Stanovení typu botulotoxinu lze provádět neutralizační reakcí na bílých myších. Používají se

antibotulinická séra pro jednotlivé typy botulotoxinu. Ve zkumavce se k výchozí tekutině

přidá antisérum, jež inaktivuje příslušný typ botulotoxinu a po 45 minutách se aplikuje

myším. Posuzuje se onemocnění a úhyn myší za klinických příznaků botulismu.

8.3.2.3. Další metody

V roce 1999 byl v Anglii vyvinut ELISA test pro detekci neurotoxinu B s obchodním názvem

BoNT, který je nyní komerčně dostupný. Detekci mikroorganismu i jeho toxinu lze dále

provést také polymerázovou řetězovou reakcí (nevýhodou je detekce i mrtvých buněk),

ribotypizací nebo pulzní gelovou elektroforézou.

8.3.3. Využití v praxi Počty hlášených případů botulismu v České republice se podle databáze Epidat pohybovaly

v letech 2004 – 2013 v rozmezí 0 až 4 případy ročně. Z tohoto pohledu není stanovení

botulotoxinu pro většinu laboratoří rutinní záležitostí, na druhou stranu je, vzhledem k jeho

závažnosti, znalost vhodných vyšetřovacích postupů zcela nezbytná. Přestože je výskyt

botulotoxinu v potravinách vzácnou záležitostí, musí riziko jeho možné přítomnosti v

potravinách výrobci potravin akceptovat. Jde především o oblast konzervárenství a

masozpracujícího průmyslu. Svého velkého významu dosáhl botulotoxin v posledních letech

v kosmetickém průmyslu díky schopnosti paralyzovat mimické svaly a eliminovat činnost

potních žláz. Clostridium botulinum a botulinové toxiny jsou vedeny v kategorii

bakteriologických (biologických) a toxinových zbraní, a proto musí být laboratoře, které

s nimi pracují, dozorovány SÚJB.

Typizační metody

71

9. TYPIZAČNÍ METODY A JEJICH VYUŽITÍ PŘI

EPIDEMIOLOGICKÉM ŠETŘENÍ ALIMENTÁRNÍCH ONEMOCNĚNÍ

9.1. Alimentární onemocnění Onemocnění z potravin jsou velmi významnou skupinou nemocí lidí. Každoročně je v České

republice hlášeno několik desítek tisíc případů a několik pacientů v důsledku tohoto

onemocnění ročně zemře. Skutečná nemocnost je však oproti hlášené mnohonásobně vyšší.

Velká část dospělých pacientů při mírnějších klinických příznacích nenavštíví lékaře a infekce

tak uniká systému hlášení. Nejvyšší nemocnost je zaznamenávána u dětí (u kojenců a batolat

zejména kvůli nezralosti imunitního systému, rychlé dehydrataci a možnosti selhání

oběhového systému). Rodiče dětí této věkové kategorie častěji navštěvují lékaře kvůli

jakýmkoli klinickým příznakům onemocnění svých dětí.

Alimentární onemocnění dělíme podle mechanismu působení na infekce a intoxikace, nebo

podle původu etiologického agens na onemocnění bakteriální, virové a parazitární.

Nejčastějšími alimentárními infekcemi bakteriálního původu u nás jsou kampylobakterózy a

salmonelózy. K alimentárním infekcím dále řadíme listeriózy, které jsou vyvolávány

bakteriemi Listeria monocytogenes a které postihují především imunosuprimované jedince,

seniory a gravidní ženy. Závažná onemocnění vyvolávají i některé toxigenní kmeny bakterií

druhu Escherichia coli (Shiga Toxin produkující E. coli – STEC), které způsobují různé

formy onemocnění od krvavých průjmů až po život ohrožující hemolyticko-uremický

syndrom (HUS). Další velmi významnou skupinou infekcí jsou virové nákazy, které

způsobují onemocnění explozivního charakteru s rychlou úpravou zdravotního stavu, což

omezuje možnosti jejich diagnostiky a hlášení. Také alimentární intoxikace se mohou podílet

na vzniku velkých epidemií, zejména pokud vzniknou ve stravovacích zařízeních. Toxin,

který onemocnění vyvolává, se vytváří již v potravině v důsledku nesprávné manipulace nebo

skladování potravinových surovin nebo potravin a pokrmů. K nejvýznamnějším bakteriím

produkujícím toxiny patří Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus a Bacillus cereus.

Původci alimentárních infekcí se vyznačují potenciálem pro způsobování epidemických

výskytů a vysokou tenacitou (schopnost přežívat v prostředí), či schopností množení se i

v nepříznivých podmínkách, např. Listeria monocytogenes při chladírenských teplotách. Při

vzniku epidemií alimentárního původu hrají významnou úlohu také asymptomatičtí nosiči

(osoby bez klinických příznaků onemocnění, ale vylučující ve stolici původce alimentárních

onemocnění), kteří mohou při nedodržování zásad osobní hygieny potraviny či pokrmy

kontaminovat.

Zdroje jednotlivých původců alimentárních onemocnění se mohou lišit. V případě salmonel

jsou to nejčastěji potraviny živočišného původu a výrobky z nich, u kampylobakterů je to

zejména drůbeží maso a droby (hlavně chlazené), u listerií zrající sýry, některé masné

výrobky a lahůdkové saláty, u STEC syrové maso a mléko přežvýkavců a u Yersinia

enterocolitica zejména vepřové maso.

9.2. Typizační metody Metody typizace jsou využívány k detailní identifikaci bakterií (např. na úroveň druhu,

poddruhu, sérotypu, subtypu) a jsou založeny na sledování jejich fenotypových a

genotypových vlastností. Od konce minulého století se rozvíjí zejména molekulárně

biologické metody, které umožňují detailní porovnání kmenů až na úroveň klonu. Původně

byly tyto metody vyvíjeny ke sledování zdrojů a cest šíření infekčních agens epidemiologicky

významných antroponóz. V posledním desetiletí se tyto metody již využívají i při rutinním

šetření alimentárních onemocnění a společně s jejich aplikací se vytvořil nový obor –

Typizační metody

72

molekulární epidemiologie. Současně lze tyto metody použít i ke sledování výskytu

nežádoucích (patogenních i technologicky významných) bakterií a jejich šíření

v potravinářských provozovnách či v tržní síti. Postupně se tyto metody začínají uplatňovat i

v České republice.

Z fenotypových metod se pro účely typizace používají například biotypizace, sérotypizace,

fágová typizace a rezistence k antimikrobiálním látkám. Z genotypových metod se využívají

metody založené na principu PCR (např. PCR sérotypizace) nebo zlatý standard v typizačních

metodách makrorestrikční analýza (PFGE) a dále metody založené na principu sekvenace,

jednak specifického úseku bakteriální DNA nebo tzv. celogenomová sekvenace.

9.2.1. Sérotypizace Sérotypizace je metoda založená na reakci antigenu neseného mikroorganismem a protilátky

ve formě antiséra. Tato metoda je velmi významná např. u bakterií rodu Salmonella, který

sice má pouze dva druhy a 6 poddruhů, ale zahrnuje podle Kauffmann-White-LeMinor

schématu více než 2500 sérotypů (tabulka 5). Dále je tato metoda využívána i pro další

původce alimentárních onemocnění, např. Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Yersinia

enterocolitica a Cronobacter sakazakii.

Tabulka 5: Zastoupení druhů, poddruhů a sérotypů bakterií rodu Salmonella.

Název druhu Název poddruhu Počet sérotypů

S. enterica enterica 1531

S. enterica salamae 505

S. enterica arizonae 99

S. enterica diarizonae 336

S. enterica houtenae 73

S. enterica indica 13

S. bongori 22

Celkem 2579

(Grimont and Weill, 2007)

9.2.1.1. Antigenní struktura

Buňky bakterií rodu Salmonella vykazují na svém povrchu tři typy antigenů. Těmi jsou

somatický, bičíkový a kapsulární antigen (typický především pro sérotyp Typhi a Paratyphi).

Detekce antigenní struktury je závislá na fenotypovém projevu buňky, a pokud například

buňka v některé životní fázi netvoří bičíky, pak není možné bičíkový antigen pomocí

fenotypové sérotypizace prokázat. Existují ovšem sérotypy, které přirozeně postrádají geny

kódující některé antigeny. Pak je nutné odlišit kmen, který je přirozeně bez antigenu a kmen,

který je v daném antigenu defektní.

Somatický antigen

Somatický antigen (O antigen) je představován polysacharidy přítomnými na povrchu

gramnegativních buněk, je typický pro zástupce čeledi Enterobacteriaceae. Je součástí vnější

lipopolysacharidové vrstvy. U rodu Salmonella se vyskytuje 46 různých somatických

antigenů, na jejichž základě jsou sérotypy rozděleny do několika skupin.

Flagelární antigeny

Flagelární neboli bičíkové antigeny (H antigen) se mohou vyskytovat ve dvou takzvaných

fázích (jsou kódovány geny fliC a fljB). Některé sérotypy přirozeně postrádají gen pro jednu

nebo druhou fázi (například u salmonel se to týká nejčastějšího sérotypu v České republice

Typizační metody

73

Salmonella Enteritidis, který ve svém genomu nenese gen fljB, nekóduje tudíž protein druhé

bičíkové fáze).

Kapsulární antigen

Kapsulární antigen (Vi antigen) je přítomný např. u E. coli a některých sérotypů salmonel.

Názvy sérotypů

Dříve byly sérotypy salmonel pojmenovávány podle symptomů onemocnění, které vyvolávaly

(S. Abortusequi, S. Choleraesuis, S. Typhimurium, S. Bovismorbificans), ale posléze byl tento

systém již neudržitelný a přešlo se na pojmenovávání podle místa první izolace (S. London, S.

Kentucky, S. Zanzibar, S. Praha). Z důvodů velkého množství sérotypů je typizační schéma

založeno na postupném zařazení kmene do skupin pomocí polyvalentních antisér. Bližší

dourčení se provádí pomocí monovalentních antisér pro jednotlivé somatické antigeny a

antigeny dvou bičíkových fází. Nakonec dostáváme tzv. antigenní strukturu. Například

struktura pro S. Enteritidis je následující: somatické antigeny - 9,12; bičíkové antigeny první

fáze - g,m; druhá fáze není vyjádřena. Antigenní struktura se uvádí jako: 9,12:g,m:-. Pro S.

Typhimurium, druhý nejfrekventněji se vyskytující sérotyp, je antigenní struktura následující:

4,[5],12:i:1,2. U vzácných sérotypů salmonel je sérotypizace dostatečnou metodou pro

odhalení hromadného výskytu onemocnění.

U bakterií rodu Listeria rozlišujeme pouze 13 sérotypů (označované číselným a písmenným

kódem např. 1/2a, 1/2b, 4b). Tato metoda je proto pouze prvním typizačním krokem a vždy je

potřeba pokračovat dalšími metodami, např. detailnější charakteristikou metodou PCR

sérotypizace, makrorestrikční analýzou a případně i sekvenačními metodami.

U bakterií E. coli jsou sérotypy uváděny číselným kódem např. O157:H7.

9.2.2. Fágová typizace Fágová typizace je metoda sledující rezistenci bakterií k sadám standardně naředěných

fágových suspenzí. Tato metoda se používá při typizaci bakterií S. aureus, L. monocytogenes,

STEC, ale nejčastěji je využívána k typizaci nejfrekventnějších sérotypů salmonel (Enteritidis

a Typhimurium).

Fágy jsou aplikovány ve formě kapek na živný agar inokulovaný přes noc pomnoženou

kulturou testovaného bakteriálního kmene. K provedení je potřeba použít také kontrolní

kmeny se známými reakcemi. Pozitivní reakce se projeví tvorbou plaků viditelných jako

tečkovité projasnění svrchní vrstvy agaru s narostlou bakteriální kulturou.

Pro sérotyp Enteritidis se využívá 17 fágů, jejichž reakce s bakteriálním kmenem jsou

schopny rozlišit 96 fágových typů. Pro sérotyp Typhimurium pak testovaná sada fágů

obsahuje 30 fágů a rozlišují 208 fágových typů. Výsledné reakce fágů a testovaných bakterií

jsou odečítány podle příslušného schématu a určí se příslušný fágový typ (tabulka 6).

V některých případech jsou fágové typy signifikantní pro určitou zemi (například S.

Enteritidis PT3 pro Polsko) nebo druh zvířat (S. Typhimurium DT2 pro holuby). Pomocí této

metody lze snadno sledovat ovlivňování epidemické situace turismem, globálním obchodem

s potravinami nebo lze naznačit původ vehikula i u dominantních sérotypů.

Pokud jsou u více izolátů zaznamenány shodné fágové typy, které jsou navíc v dané zemi

považovány za vzácné, je tato metoda dostatečnou při epidemiologickém šetření.

9.2.3. Rezistence k antimikrobiálním látkám Sledování rezistence k antimikrobiálním látkám se u střevních bakterií využívá jako

epidemiologický marker. U některých sérotypů salmonel jsou některé rezistenční vzorce

Typizační metody

74

typické pro daný sérotyp, například S. Typhimurium fágový typ DT104 má typickou

rezistenci k ampicilinu, chloramfenikolu, streptomycinu, sulfonamidům a tetracyklinu.

Vzhledem k tomu, že významná část alimentárních onemocnění se řadí mezi zoonózy

(onemocnění přenosná ze zvířete na člověka), je rezistence také dobrým ukazatel šíření genů

rezistence v potravinovém řetězci.

Bakterie kromě mutací v jednotlivých genech také ochotně přijímají geny rezistence pomocí

horizontálního přenosu. V poslední době jsou často sledovány plasmidově vázané rezistence

k chinolonovým antibiotikům, které navíc bývají často přenášeny společně s geny pro ESBL

(širokospektré betalaktamasy). K dalším významným enzymům zodpovědným za vznik

rezistencí řadíme i karbapenemasy a metalobetalaktamasy.

Tabulka 6: Ukázka fagotypizačního schématu pro bakterie sérotypu Salmonella Enteritidis.

Reakce fágů v pracovním ředění Typ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

1b OL SCL CL <OL CL SCL CL OL <OL OL CL CL CL CL <OL OL <OL

1d SCL SCL +++ SCL <OL SCL ++ SCL OL OL + OL +++ CL SCL OL SCL

1 OL SCL CL <OL CL SCL CL OL OL OL CL CL CL CL – – <OL

1a OL SCL CL <OL CL OL CL OL OL OL CL CL CL +++m – – <OL

1c OL SCL CL <OL CL SCL +++ OL <OL OL ++ CL SCL CL – – <OL

1e OL SCL ++

/SCL SCL –/SCL SCL

+

/SCL OL OL OL +

++

/SCL

+++

/SCL CL – – <OL

43 OL SCL CL SCL CL SCL CL OL OL OL <CL CL – CL – – OL

32 OL SCL CL SCL CL SCL + OL <OL OL – OL – CL CL CL CL

32a OL SCL OL SCL CL SCL – OL <OL SCL – SCL – CL – -/+ CL

44 OL SCL CL – CL <OL <CL OL – OL SCL CL CL CL – – –

41 OL SCL SCL – CL SCL SCL OL – OL ++ CL CL – – – –

21c OL SCL – <OL – SCL -

/+m OL <OL OL – – – CL <CL <CL SCL

21 OL SCL – <OL – OL -

/+m OL <OL OL – – – CL –

-

/+ <OL

21a OL +++ – SCL – SCL -

/+m OL <OL OL – – – – – – SCL

21b ++/ <OL +++ – SCL – SCL – OL <OL OL – – – ++ – – SCL

49 CL + CL SCL CL SCL CL OL +++ OL CL CL CL + – – +++

17 ++ SCL + SCL <CL – CL – OL – <CL +++ CL +++ – – <OL

60 OL – CL – CL SCL – OL – OL – CL CL CL – – –

2 OL – CL SCL <CL SCL CL OL <OL OL <CL CL – CL – – <OL

37 OL – CL – OL SCL OL OL – <OL CL CL CL CL – – –

20 OL – CL – CL – + OL – OL + CL + CL <CL CL –

20a OL – CL – CL – CL OL – OL CL CL + CL – + –

22 OL – – SCL – SCL – OL <OL OL – – – CL – – SCL

3 OL – – – – ++ – OL – OL – – – CL – – –

Legenda: OL – opalescentní lýza, CL – splývavá lýza, SCL – polosplývavá lýza (HPA, Colindale, 2008)

9.2.4. Makrorestrikční analýza a pulsní gelová elektroforéza (PFGE) Makrorestrikční analýza a následná pulsní gelová elektroforéza jsou považovány za zlatý

standard při konfirmaci epidemických kmenů různých patogenních agens. Jedná se o izolaci

DNA ukotvenou v agarózových bločcích a její štěpení v místech specifických pro daný

restrikční enzym, který štěpí pouze na limitovaném počtu míst v genomu. Používány jsou

restrikční enzymy izolované z různých mikroorganismů a pro každé agens je vhodný jiný

restrikční enzym, například XbaI pro salmonely nebo E. coli, SmaI pro kampylobaktery, ApaI

pro listerie. Rozdělení fragmentů probíhá v agarózovém gelu ve speciálně upravené

elektroforetické vaně hexagonálního tvaru. Gel je poté obarven v roztoku ethidium bromidu a

fragmenty DNA jsou vizualizovány v UV světle. Gely jsou analyzovány vhodným software

například programem BioNumerics (Applied Maths, Belgie), který vypočítá podobnost

srovnávaných kmenů.

Typizační metody

75

Metoda makrorestrikční analýzy je poměrně náročná na čas (postup podle standardního

protokolu trvá 2-3 dny). I přesto je tato metoda považována za standard v typizačních

metodách a umožňuje mezilaboratorní (mezinárodní) porovnávání kmenů.

9.2.5. Sekvenační metody Nejmodernější typizační metody jsou založeny na principu sekvenace, ať už se jedná o

sekvenování určitého úseku DNA (MLVA, MLST) nebo celého bakteriálního genomu.

Při metodě MLVA (Multi-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis, multilokusová

analýza tandemových repetic) jsou zjišťovány sekvence určitých oblastí obsahující různé

počty tandemových repetic. Podle počtu těchto repetic je pak definována příbuznost kmenů.

Tato metoda umožňuje detailní rozlišení kmenů, protože ke změnám v repeticích dochází

velmi snadno a často. Tato metoda je vhodná k porovnávání blízce příbuzných kmenů

jednoho sérotypu, například v rámci jedné epidemie v jedné lokalitě.

Při metodě MLST (Multi-Locus Sequence Typing, multilokusová sekvenační typizace) jde

naopak o sekvenaci oblastí tzv. housekeeping – provozních genů, kdy jsou oblasti těchto genů

obvykle konzervativní. Metoda je vhodná například po porovnání kmenů jednoho sérotypu

z různých zdrojů nebo různých států pro vytvoření fylogenetických stromů.

Celogenomová sekvenace poskytuje maximální diskriminační schopnost. Z výsledné

sekvence lze zjistit například celkové údaje o genech rezistence (rezistom) anebo genech

virulence (virulom). Tyto metody umožňují získání detailních informací o genetické stavbě

bakterií, odpadá při tom tedy vybírání nejvhodnějších cílů analýz. Získaná data poskytují

velkou variabilitu výběru porovnávaných vlastností. Nicméně je tato metoda a především pak

nové rychlé variace sekvenování (např. pyrosekvenace) velmi drahá a tudíž nevhodná

k rutinní typizaci bakterií. Do budoucna však metody celogenomové sekvenace budou

představovat jedinou možnost, jak v krátkém čase zjistit o daném patogenu co nejvíce

informací a tím zrychlit diagnostiku a typizaci při šetření hromadných výskytů.

9.3. Případové studie

9.3.1. Případová studie 1 Na luxusní lodi při plavbě po středomoří došlo k hromadnému výskytu alimentárního

onemocnění. Na lodi cestovalo 850 cestujících, délka výletu byla naplánována na 5 dní.

Šéfkuchař den před vyplutím trpěl střevními potížemi, ale v den plavby nastoupil do práce.

Šéfkuchař se svým týmem připravoval stravu pro pasažéry i posádku, prvním společným

pokrmem byla večeře. Téže noci se objevily trávicí obtíže u 150 cestujících, problémy se

vyznačovaly rychlým nástupem nevolnosti a prudkým průběhem onemocnění, z příznaků

bylo zaznamenáno zvracení, bolesti břicha, průjem, schvácenost, bolest celého těla. Už druhý

den většina příznaků u postižených osob ustoupila a třetí den po onemocnění došlo k úpravě

zdravotního stavu. Postupně se však onemocnění šířilo na další cestující, především na

příbuzné a nejbližší spolucestující osob, kteří již onemocnění prodělali.

Na základě explozivního charakteru epidemie, klinických příznaků postižených osob a

anamnézy kuchaře lze usuzovat na onemocnění virového původu. Přenos se obvykle děje

fekálně orální cestou. U pacientů by mělo být provedeno bakteriální a virologické vyšetření

stolice či zvratků. Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je indikováno jejich virologické

vyšetření.

Typizační metody

76

9.3.2. Případová studie 2 Na svatební hostině se podávala polévka s játrovými knedlíčky, svíčková na smetaně

s karlovarským knedlíkem a jako moučník tiramisu z domácích vajec. Druhý den večer 10 lidí

z 50 přítomných začalo trpět bolestmi břicha, průjmem bez příměsi krve, nevolností a

teplotou. Všech 50 účastníků konzumovalo polévku a hlavní jídlo. Do týdne došlo k úpravě

zdravotního stavu postižených osob.

Klinické příznaky onemocnění (včetně teploty) naznačují, že se jedná o bakteriální infekci.

Přenos se děje obvykle kontaminovaným vehikulem (potravinou). U pacientů by mělo být

provedeno bakteriální vyšetření stolice. Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je

indikováno jejich bakteriologické vyšetření. Podezřelými potravinami jsou zejména játrová

zavářka, houskový knedlík a tiramisu. Možným etiologickým agens je salmonela.

9.3.3. Případová studie 3 V restauraci nižší cenové skupiny s nízkým hygienickým standardem bylo podáváno jednotné

menu – těstoviny se sýrovou omáčkou. Pokrm byl připravován v době od 10 do 11 hodin a

poté byl uchováván při pokojové teplotě až do doby vydání (od 12. do 14. hodiny). Porce byly

vydávány postupně a ohřívány v mikrovlnné troubě. U části strávníků (porce vydané mezi 13.

a 14. hodinou) došlo přibližně hodinu po konzumaci k náhlé nevolnosti a zvracení, u části

postižených se přidal i průjem. Během několika hodin došlo k samovolné úpravě zdravotního

stavu postižených.

Podle klinických příznaků a rychlého nástupu onemocnění lze usuzovat na alimentární

intoxikaci. Pravděpodobně došlo k pomnožení toxinogenních bakterií v průběhu nesprávného

uchovávání pokrmu (těstoviny se sýrovou omáčkou). U pacientů by mohlo být provedeno

vyšetření zvratků či stolice na přítomnost toxinů (např. metodou ELFA). Pokud jsou

k dispozici zbytky potravin, pak je indikováno jejich vyšetření na přítomnost toxinů, případně

i bakteriologické vyšetření na počty S. aureus a B. cereus.

9.3.4. Případová studie 4 V průběhu letní dovolené někteří rekreanti kempu konzumovali grilované kuře prodávané

z pojízdného stánku. Do 48 hodin se u některých konzumentů projevily horečka, křeče

v břiše, průjem, u některých postižených s příměsí krve a celková slabost. Přidružila se

horečka, a zatímco u části pacientů došlo k samovolné úzdravě, u několika pacientů (děti

předškolního věku a jeden senior) klinické příznaky neustupují a museli navštívit zdravotní

středisko, jedna osoba byla pro závažné potíže hospitalizována v místním zdravotnickém

zařízení. V nemocnici byla provedena rehydratace a lékaři podali postiženému antibiotika ze

skupiny makrolidů.

Klinické příznaky onemocnění (včetně teploty) naznačují, že se jedná o bakteriální infekci.

Přenos se děje obvykle kontaminovaným vehikulem (potravinou). U pacientů by mělo být

provedeno bakteriální vyšetření stolice. Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je

indikováno jejich bakteriologické vyšetření. Podezřelým pokrmem je grilované kuře. U

pacientů by mělo být provedeno bakteriální vyšetření stolice. Pokud jsou k dispozici zbytky

potravin, pak je indikováno jejich bakteriologické vyšetření. Klinické příznaky (křeče v břiše)

a suspektní vehikulum naznačují, že by se mohlo jednat o kampylobakterovou infekci.

Použitá literatura

77

POUŽITÁ LITERATURA

ALBERTS, B., BRAY, D.; JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P. (eds.)

Základy buněčné biologie (Úvod do molekulární biologie). 1. vyd. Ústí nad Labem, CZ: Espero Publishing,

s.r.o. 2005. 630 s.

ANDERSON, E.S., WARD, L.R., DE SAXE, M.J., DE SA, J.D. Bacteriophage typing designations of

Salmonella typhimurium. The Journal of Hygiene, 1977, vol. 78, no. 2, p. 297-300.

BABACAN, S., PIVARNIK, P., LETCHER, S., RAND, A.. Piezoelectric flow injection analysis biosensor

for the detection of Salmonella Typhimurium. Journal of Food Science, 2002, vol. 67, no. 1, p. 314-320.

BAERT, L., UYTTENDAELE, M., DEBEVERE, J. Evaluation of viral extraction methods on a broad

range of Ready-To-Eat foods with conventional and real-time RT-PCR for Norovirus GII detection.

International Journal of Food Microbiology, 2008, vol. 123, no. 1-2, p. 101-108.

BARBOSA-CANOVAS, G.V., MORTIMER, A., LINEBACK, D., SPIESS, W., BUCKLE, K.,

COLONNA, P. (eds.) Global Issues in Food Science and Technology. 1st ed. Burlington, USA: Academic

Press. 2009. 520 p.

BRITZ T., ROBINSON, R.K. (eds.) Advanced Dairy Science and Technology. 1st ed. Oxford, UK:

Blackwell Publishing Ltd. 2008. 312 p.

CARBONNELLE, E., MESQUITA, C., BILLE, E., Day, N., DAUPHIN, B., BERETTI, J., FERRONI, A.,

GUTMANN, L., NASSIF, X. MALDI-TOF mass spectrometry tools for bacterial identification in clinical

microbiology laboratory. Clinical Biochemistry, 2011, vol. 44, no. 1, s. 104-109.

ČSN EN ISO 6888-1. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení počtu

koagulázopozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy) – Část 1: Technika s použitím

agarové půdy podle Baird-Parkera. Praha: Český normalizační institut. 1999.16 s.

ČSN EN ISO 7932. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního

Bacillus cereus – Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C. Praha: Český normalizační institut.

2005. 20 s.

DASEN, A., BERTHIER, F., GRAPPIN, R., WILLIAMS, A.G., BANKS, J. Genotypic and phenotypic

characterization of the dynamics of the lactic acid bacterial population of adjunct-containing Cheddar

cheese manufactured from raw and microfiltered pasteurised milk. Journal of Applied Microbiology, 2003,

vol. 94, no. 4, p. 595-607.

DEMNEROVÁ, K. Microbiological Food Safety: Current Strategy of Efficient Control. Chemické listy,

2012, vol. 106, no. 10, p. 920-925.

DOSTÁLEK, P., BRÁNYIK, T. Prospects for Rapid Bioluminescent Detection Methods in the Food

Industry – a Review. Czech Journal of Food Sciences, 2005, vol. 23, no. 3, p. 85-92.

DUŠKOVÁ, M., ŠEDO, O., KŠICOVÁ, K., ZDRÁHAL, Z., KARPÍŠKOVÁ, R. Identification of

lactobacilli isolated from food by genotypic methods and MALDI-TOF MS. International Journal of Food

Microbiology, 2012, vol. 159, no. 2, s. 107-114.

EASTER, M.C. (ed.) Rapid Microbiological Methods in the Pharmaceutical Industry. 1st ed. Boca Raton,

USA: Interpharm/CRC Press. 2003. 288 p.

EDWARDS-JONES, V., CLAYDON, M.A., EVASON, D.J., WALKER, J., FOX, A.J., GORDON D.B.

Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus by

intact cell mass spectrometry. Journal of Medical Microbiology, 2000, vol. 49, no. 3, p. 295-300.

ENGELKIRK, P.G., DUBEN-ENGELKIRK, J. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: Essentials of

Diagnostic Microbiology. Baltimore, USA: Lippincott Williams & Wilkins. 2008. 754 p.

FENSELAU, C., DEMIREV, P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass

spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2001, vol. 20, no. 4, p. 157-171.

FRATAMICO, P.M., BHUNIA, A.K., SMITH, J.L. Foodborne pathogens: Microbiology and molecular biology. Norfolk, UK: Caister Academic Press, 2005. 454 p.


78

GOYAL, S.M. (ed.) Viruses in Foods. 1st ed. New York, USA: Springer. 2006. 331 p.

GRIMONT, P., WEILL, F.-X. Antigenic formulae of the Salmonella serovars [online]. 9th ed. Paris: Pasteur

Institute, 2007, 166 p. [cit. 2013-01-20].

Dostupný na www: http://www.pasteur.fr/ip/portal/action/WebdriveActionEvent/oid/01s-000036-089

GRUENWEDEL, D.W., WHITAKER, J.R. (eds.) Food Analysis: Principles and Techniques. Volume 3

Biological Techniques. 1st ed. New York, USA: Marcel Dekker, Inc. 1985. 397 p.

HANSEN, K., MIKKELSEN, T., MØLLER-MADSEN. Use of the Limulus test to determine the hygienic

status of milk products as characterized by levels of Gram-negative bacterial lipopolysaccharide present.

The Journal of Dairy Research, 1982, vol. 49, no. 2, p. 323-328.

HATCHER, W.S., DIBENEDETTO, S., TAYLOR, L.E., MURDOCK, D.I. Radiometric analysis of frozen

concentrated orange juice for total viable microorganisms. Journal of Food Science, 1977, vol. 42, no. 3,

p. 636-639.

HEWITT, W. Microbiological Assay for Pharmaceutical Analysis: A Rational Approach. 1st ed. Boca

Raton, USA: Interpharm/CRC Press. 2003. 260 p.

HOLST, O. (ed.) Microbial Toxins. Methods and Protocols. 1st ed. Borstel, Germany: Humana Press. 2011.

239 p.

HUI, Y.H. (ed.) Handbook of Food Science, Technology, and Engineering, Volume 4. 1st ed. Boca Raton,

USA: CRC Press. 2006. 928 p.

IKNER, L.A., GERBA, C.P., BRIGHT, K.R. Concentration and Recovery of Viruses from Water: A

Comprehensive Review. Food and Environmental Virology, 2012, vol. 4, no. 2, p. 41-67.

JACKSON, K.A., EDWARDS-JONES, V., SUTTON, C.W., FOX A.J. Optimisation of intact cell MALDI

method for fingerprinting of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods, 2005, vol. 62, no. 3, p. 273-84.

JAY, J.M., MARGITIC, S., SHEREDA, A.L., COVINGTON, H.V. Determining Endotoxin Content of

Ground Beef by the Limulus Amoebocyte Lysate Test as Rapid Indicator of Microbial Quality. Applied and Environmental Microbiology, 1979, vol. 38, no. 5. p. 885-890.

JEßBERGER, N., DIETRICH, R., BOCK, S., DIDIER, A. Bacillus cereus Enterotoxin Act as Major

Virulence Factors and Exhibit Distinct Cytotoxicity to Different Human Cell Lines. Toxicon, 2014, vol. 77,

p. 49-57.

LAY, J.O. MALDI-TOF mass spectrometry and bacterial taxonomy. Trac-Trends in Analytical Chemistry,

2000, vol. 19, no. 8, p. 507-516.

LAY, J.O. MALDI-TOF mass spectrometry of bacteria. Mass Spectrometry Reviews, 2001, vol. 20, no. 4,

p. 172– 194.

LEWIS, K., SALYERS, A.A., TABER, H.W., WAX, R.G. (eds.) Bacterial Resistance to Antimicrobials.

1st ed. New York, USA: Marcel Dekker, Inc. 2002. 495 p.

LI, X.H., MA, H.M., DONG, S.Y., DUAN, X.J., LIANG, S.C. Selective labeling of histidine by a designed

fluorescein-based probe. Talanta, 2004, vol. 62, no. 2, p. 367-371.

LINSTEDT, B.A., VARDUND, T., AAS, L., KAPPERUD, G. Multiple-locus variable-number tandem-

repeats analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and

multicolor capillary electrophoresis. Journal of Microbiological Methods, 2004, vol. 59, no. 2, p.163-172.

LÓPEZ-CAMPOS, G., MARTÍNEZ-SUÁREZ, J.V., AQUADO-URDA, M., LÓPEZ-ALONSO, V.

Microarray Detection and Characterization of Bacterial Foodborne Pathogens. 1st ed. New York, USA:

Springer. 2012. 135 p.

LORENCOVÁ, A., VAŠÍČKOVÁ, P. Viry jako původci alimentárních onemocnění. Maso, 2013, vol. 24,

no. 2, s. 34-40.

MAZZEO, M.F., SORRENTINO, A., GAITA, M., CACACE, G., DI STASIO, M., FACCHIANO, A., COMI, G, MALORNI, A., SICILIANO, R.A. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight


79

mass spectrometry for the discrimination of food-borne microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 2006, vol. 72, no. 2, p. 1180-1189.

MCMEEKIN, T.A. (ed.) Detecting pathogens in food. 1st ed. Cambridge, UK: Woodhead Publishing

Limited. 2003. 384 p.

MELLO, L.D., KUBATO, L.T. Review of the use of biosensors as analytical tools in the food and drink

industries. Food Chemistry, 2002, vol. 77, no. 2, p. 237-256.

Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Úřední věstník Evropské unie, 2005, L 338, s. 1-26.

OLSON, W.P. (ed.) Automated Microbial Identification and Quantification: Technologies for the 2000s. 1st

ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 1996. 424 p.

PECK, M.W., STRINGER, A.T., CARTER, A.T. Clostridium botulinum in the Post-genomic Era. Food

Microbiology, 2011, vol. 28, no. 2, p. 183-191.

PILIARIK, M., PÁROVÁ, L., HOMOLA, J. High-throughput SPR sensor for food safety. Biosensors &

Bioelectronics, 2009, vol. 24, no. 5, 1399-1404.

PREVITE, J. Radiometric Detection of Some Food-Borne Bacteria. Applied Microbiology, 1972, vol. 24,

no. 4, p. 535-539.

RAJKOVIC, A., UYTTENDAELE, M., VERMEULEN, A., ANDJELKOVIC, M., FITZ-JAMEZ, I.,

VELD P. in 't DENON, Q., VERHE, R., DEBEVERE, J. Heat Resistant of Bacillus cereus Emetic Toxin,

Cereulid. Letters in Applied Microbiology, 2008, vol. 46, p. 536-541.

RAUGEL, P-J. Rapid Food Analysis and Hygiene Monitoring: Kits, Instruments and Systems. 1st ed.

Berlin, Germany: Springer-Verlag. 1999. 921 p.

RAY, B., BHUNIA, A. Fundamental Food Microbiology. 5th ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 2013.

663 p.

REIWALD, A., SAUER, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.

Nature Protocols, 2009, vol. 4, p. 732-742.

RIBOT, E.M., FAIR, M.A., GAUTOM, R., CAMERON, D.N., HUNTER, S.B., SWAMINATHAN, B.,

BARRETT, T.J. Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of

Escherichia coli O157:H7, Salmonella and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathogens and Disease,

2006, vol. 3, no. 1, p. 59-67.

ROBERTS, T.A., BAIRD-PARKER, A.C., TOMPKIN, R.B. Microorganisms in food: Characteristics of microbial pathogens. 1st ed. London, UK: Blackie Academic & Professional. 1996. 524 p.

ROWLEY, D.B., PREVITE, J.J., SRINIVASA, H.P. A radiometric metod for rapid screening of cooked

foods for microbial acceptability. Journal of Food Science, 1978, vol. 43, no. 6, p. 1720-1722.

RYZHOV, V., FENSELAU, C. Characterization of the protein subset desorbed by MALDI from whole

bacterial cells. Analytical Chemistry, 2001, vol. 73, no. 4, p. 746-750.

SEDLÁČEK, I. Taxonomie prokaryot. 1. vyd. Brno, CZ: Masarykova Univerzita. 2007. 278 s.

SCHWALBE R., STEELE-MOORE, L., GOODWIN, A.C. (eds.) Antimicrobial Susceptibility Testing

Protocols. 1th ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 2007. 432 p.

SHAMA, G., MALIK, D.J. The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays. International

Journal of Hygiene and Environmental Health, 2013, vol. 216, no. 2, p. 115-125.

SINGHAL, R., KULKARNI, P.R., REGE, D.V. Handbook of indices of food quality and authencity. 1st ed.

Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. 1997. 561 p.

SKLÁDAL, P. Biosenzory [online]. [cit. 2014-03-20]. Dostupný na www:

http://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.pdf

SOBEL, J. Botulism. Clinical Infectious Diseases, 2005, vol. 41, no. 8, p. 1167-1173.

STALS, A., BAERT, L., VAN COILLIE, E., UYTTENDAELE, M. Extraction of food-borne viruses from

food samples: A review. International Journal of Food Microbioly, 2012, vol. 153, no. 1-2, p. 1-9.


80

SVOBODOVÁ, I. Clostridium botulinum: vlastnosti a význam v oboru zpracování masa. Maso, 2014, roč.

25, č. 1, s. 50-55.

ŠEDO, O., SEDLÁČEK, I., ZDRÁHAL, Z. Sample preparation methods for MALDI-MS profiling of

bacteria. Mass Spectrometry Reviews, 2011, vol. 30, no. 3, p. 417-434.

ŠMARDA, J., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ, V., KOPTÍKOVÁ, J. Metody molekulární

biologie. 1. vyd. Brno, CZ: Vydavatelství Masarykova Univerzita. 2005. 188 s.

ŠŤÁSTKOVÁ, Z., KARPÍŠKOVÁ, R., BORKOVCOVÁ, I. Možnosti detekce stafylokokových

enterotoxinů. Chemické Listy, 2012, vol. 106, s. 745-749.

TAYLOR, A.D., LADD, J., YU, Q.M., CHEN, S., HOMOLA, J., JIANG S. Quantitative and simultaneous

detection of four foodborne bacterial pathogens with a multi-channel SPR sensor. Biosensors &

Bioelectronics, 2006, vol. 22, no. 5, 752-758.

URBÁŠKOVÁ, P. Rezistence bakterií k antibiotikům – vybrané metody. 1. vyd. Praha: Trios, spol. s r.o.

1999. s. 1.1-10.2.8.

VOTAVA, M. Lékařská mikrobiologie obecná. 1. vyd. Brno, ČR: Neptun. 2001. 247 s.

WALKER, J., FOX, A.J., EDWARDS-JONES, V., GORDON, D.B. Intact cell mass spectrometry (ICMS)

used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility.

Journal of Microbiological Methods, 2002, vol. 48, no. 2-3, p. 117-126.

WELKER, M., MOORE, E.R.B. Applications of whole-cell matrix-assisted laser-desorption/ionization

time-of-flight mass spectrometry in systematic mikrobiology. Systematic and Applied Microbiology, 2011,

vol. 34, no. 1, p. 2-11.

WARD, L.R., DE SA, J.D.H., ROWE, B. A phage-typing scheme for Salmonella enteritidis. Epidemiology

and Infection, 1987, vol. 99, no. 2, p. 291-294.

WICTOME, M., NEWTON, K., JAMESON, K., HALLIS, B., DUNNIGAN, P., MACKAY, E., CLARKE,

S., TAYLOR, R., GAZE, J., FOSTER, K., SHONE, C. Development of an In Vitro Bioassay for

Clostridium botulinum Type B Neurotoxin in Foods That Is More Sensitive than the Mouse Bioassay.

Applied and Environmental Microbiology, 1999, vol. 65, no. 9, p. 3787-3792.

WILSON, CH.L. (ed.) Microbial Food Contamination, Second Edition. 2nd ed. Boca Raton, USA: CRC

Press. 2007. 632 p.

YAO, C.Y., ZHU, T.Y., QI, Y.Z., ZHAO, Y.H., XIA, H., FU, W.L. Development of a Quartz Crystal

Microbalance Biosensor with Aptamers as Bio-recognition Element. Sensors, 2010, vol. 10, no. 6,

p. 5859-5871.

YENI, F., ACAR, S., POLAT, Ö.G., SOYER, Y., ALPAS, H. Rapid and standardized methods for

detection of foodborne pathogens and mycotoxins on fresh produce. Food Control, 2014, vol. 40,

p. 359-367.

Zákon č. 281/2002 Sb. o některých opatřeních souvisejících se zákazem bakteriologických (biologických) a

toxinových zbraní a o změně živnostenského zákona. Sbírka zákonů České republiky, 2002, částka 102,

s. 6025-6032.

ISBN 978-80-7305-676-6

Autoři:

Název:

Ústav:

Počet stran:

Vydání:

Povoleno:

Podpořeno:

Vydavatel:

MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.

Mgr. Marta Dušková, Ph.D.

MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.

doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

Mgr. Petra Myšková

Mikrobiologické laboratorní metody

Ústav hygieny a technologie mléka

80

1.

Rektorátem VFU Brno

Projektem OP VK reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Date post:	01-Jan-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	18 times
Download:	0 times

MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ METODY...Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu...

Documents