Mendelova univerzita v Brně
Agronomická fakulta
Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Mikrobiologie tepelně ošetřeného mléka
Bakalářská práce
Vedoucí práce: Vypracovala:
Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Jitka Lidmilová
Brno 2016
ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE
Čestné prohlášení
Prohlašuji, že jsem práci: Mikrobiologie tepelně ošetřeného mléka vypracovalasamostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použitéliteratury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákonač. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladus platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací.
Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorskýzákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvya užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona.
Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou(subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenčnísmlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhraditpřípadný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejichskutečné výše.
V Brně dne:………………………..
………………………………………………….podpis
Poděkování
Mé poděkování patří panu Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení
bakalářské práce a čas, který mi věnoval při mikrobiologických analýzách.
ABSTRAKT
Bakalářská práce řeší problematiku mikrobiologie mléka. Zabývá se
mikroorganismy přítomnými v tepelně ošetřeném mléce. Je zaměřena na
mikroorganismy, které způsobují kažení mléka, a na patogenní mikroorganismy. Část
práce je věnována boji proti nežádoucím mikroorganismům. V rámci bakalářské práce
byl proveden experiment, během kterého se stanovovaly vybrané skupiny
mikroorganismů ve vzorcích mléka.
Klíčová slova: mléko, mikroorganismy, tepelné ošetření
ABSTRACT
The bachelor thesis solves matters of microbiology of milk. It follows up by
microorganisms, which are in heat-treated milk too. The bachelor thesis describes
microorganisms, which can cause spoiling of milk, and pathogenic microorganisms.
The part of thesis focuses on fight against undesirable microorganisms. In the bachelor
thesis is described an experiment, during which some species were determined in
samples of milk.
Key words: milk, microorganisms, heat treatment
5
OBSAH
1 ÚVOD............................................................................................................................8
2 CÍL PRÁCE...................................................................................................................9
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED.............................................................................................10
3.1 Složení kravského mléka.....................................................................................10
3.1.1 Bílkoviny......................................................................................................10
3.1.2 Lipidy...........................................................................................................11
3.1.3 Laktóza.........................................................................................................12
3.1.4 Antimikrobiální látky v mléce......................................................................12
3.1.4.1 Laktoferin ............................................................................................13
3.1.4.2 Lysozym...............................................................................................13
3.1.4.3 Laktoperoxidázový systém ..................................................................14
3.2 Mikrobiologie syrového mléka............................................................................14
3.2.1 Zdroje kontaminace syrového mléka...........................................................15
3.2.2 Mikrobiologické požadavky na syrové mléko.............................................16
3.2.3 Mikroorganismy způsobující kažení mléka.................................................16
3.2.3.1 Psychrotrofní mikroorganismy.............................................................17
3.2.3.2 Koliformní bakterie..............................................................................19
3.2.3.3 Bakterie mléčného kvašení...................................................................20
3.2.3.4 Kvasinky...............................................................................................21
3.2.4 Mikroorganismy negativně ovlivňující lidské zdraví...................................22
3.2.4.1 Staphylococcus aureus..........................................................................22
3.2.4.2 Listeria monocytogenes........................................................................23
3.2.4.3 Campylobacter jejuni............................................................................24
3.2.4.4 Escherichia coli....................................................................................24
3.2.4.5 Další patogenní mikroorganismy.........................................................25
3.3 Mikrobiologie tepelně ošetřeného mléka.............................................................26
3.3.1 Pasterované mléko........................................................................................26
3.3.1.1 Mikrobiologie pasterovaného mléka....................................................27
3.3.1.2 Rekontaminace pasterovaného mléka..................................................31
3.3.2 ESL mléko....................................................................................................32
3.3.3 UHT mléko...................................................................................................33
3.3.3.1 Mikrobiologie UHT mléka...................................................................33
3.3.3.2 Rekontaminace UHT mkéka................................................................35
3.4 Boj proti nežádoucím mikroorganismům............................................................35
3.4.1 Chlazení........................................................................................................35
3.4.2 Pasterace.......................................................................................................36
3.4.3 Ultratepelné ošetření mléka..........................................................................37
3.4.4 Sanitace........................................................................................................37
3.4.5 Další možnosti boje......................................................................................38
4 MATERÁL A METODIKA........................................................................................39
4.1 Charakteristika vzorků.........................................................................................39
4.2 Metodika..............................................................................................................40
5 VÝSLEDKY A DISKUZE..........................................................................................43
6 ZÁVĚR........................................................................................................................45
7 POUŽITÁ LITERATURA..........................................................................................46
7
1 ÚVOD
Mléko je základní potravinou pro člověka. Z nutričního hlediska obsahuje řadu
významných složek, které mají pozitivní vliv na lidské zdraví. Kravské mléko je
zdrojem bílkvin, hořčíku, vápníku a řady vitaminů jako je vitamin B2, A či D. Obsahuje
také minerální a stopové prvky, z nichž lze uvést například zinek, selen, jód či fosfor
(Šustová a Sýkora, 2013).
Pro mikroorganismy mléko představuje vhodný substrát, jelikož obsahuje dostatek
vody a živin. V minulosti docházelo ke zhoršení mikrobiologické kvality mléka
a vzniku onemocnění lidí díky špatným hygienickým podmínkám během skladování
a také vlivem přepravování mléka na delší vzdálenosti. Přelom nastal až v roce 1862,
kdy Louis Pasteur a Claude Bernard provedli první pasterační zkoušky. Experimentem
bylo zjištěno, že lze eliminovat kvašení vinného moštu záhřevem na 57 – 60 °C.
Z těchto poznatků vychází i pasterace mléka. Díky pasteraci už mléko nepředstavuje
riziko pro zdraví konzumenta (Görner a Valík, 2004; Šustová a Sýkora, 2013).
V roce 2014 bylo v České republice vyprodukováno 2 856 mil. l mléka. Průměrný
celkový počet mikroorganismů v mléce byl v roce 2015 47,7 tis./ml. V 1 ml mléka se
nacházelo průměrně 203 koliformních bakterií, 0,20 tis. termorezistentních
mikroorganismů a 7,91 tis. psychrotrofních mikroorganismů. Z celkového počtu vzorků
bylo 35,4 % vzorků pozitivních na přítomnost sporotvorných anaerobních bakterií
v 0,1 ml (Kvapilík a kol., 2015; Kopunecz, 2016).
Spotřeba konzumního mléka dosahovala v roce 2014 přibližně 60 kg/os/rok
(Kvapilík a kol., 2015). V současnosti lze na trhu nalézt mléko ošetřené pasterací, ESL
či UHT záhřevem. Praktickou sterilitou se vyznačuje UHT mléko. ESL mléko má pro
konzumenta přijatelnější senzorické vlastnosti. Z hlediska trvanlivosti tepelně
ošetřeného mléka představují problém enzymy, které produkují psychrotrofní
mikroorganismy v syrovém mléce. Tyto enzymy nejsou záhřevem inaktivovány
a mohou být příčinou kažení mléka.
8
2 CÍL PRÁCE
Cílem bakalářské práce je shrnout poznatky o mikrobiologii mléka. Práce je
zaměřena na mikroorganismy působící kažení mléka a také na patogenní
mikroorganismy. Teoretická část práce se dále zabývá bojem proti nežádoucím
mikroorganismům. Praktická část bakalářské práce je věnována experimentálnímu
stanovení vybraných skupin mikroorganismů ve vzrorcích mléka.
9
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Složení kravského mléka
Mléko je tekutina produkovaná mléčnou žlázou samic savců. Tento sekret slouží
k výživě mláďat. Po porodu produkuje dojnice krátkou dobu tzv. mlezivo neboli
kolostrum. Mlezivo se svým chemickým složením liší od zralého mléka (normální
mléko v produkčním období). Zvýšený počet imunoglobulinů je důležitý pro správný
vývoj imunitního systému mláděte. Mlezivo se také vyznačuje nižším obsahem laktózy
a vyšším obsahem minerálních látek (Buňka a kol., 2013).
Největší podíl kravského mléka zaujímá voda. Mléko obsahuje 86 – 88 % vody.
Zbývající část, tedy 12 – 14 %, tvoří sušina. Sušinu lze dále rozdělit na tukoprostou
sušinu a mléčný tuk. V kravském mléce se nachází 3,5 % a více mléčného tuku.
Do tukoprosté sušiny patří laktóza, bílkoviny, vitaminy, enzymy, minerální látky a další
významné sloučeniny (Šustová a Sýkora, 2013).
3.1.1 Bílkoviny
V mléce se nachází přibližně 3,0 – 3,3 % bílkovin. Bílkoviny kravského mléka lze
rozdělit na kaseinové a syrovátkové. Toto členění je dáno rozpustností bílkovin
v prostředí o pH přibližně 4,6. V tomto prostředí se srážejí kaseinové bílkoviny nikoliv
syrovátkové proteiny. Největší část proteinů zaujímá kasein. Z celkového obsahu
bílkovin tvoří více než 75 % a tudíž kravské mléko zařazujeme mezi mléka kaseinová.
Do této skupiny patří například i mléko kozí či ovčí (Buňka a kol., 2013; Janštová
a Navrátilová, 2014).
Kaseinové bílkoviny jsou tvořeny αs1
-kaseinem, αs2
-kaseinem, β-kaseinem
a κ-kaseinem. Z chemického hlediska se jedná o fosfoproteiny. Fosfor je důležitý
při tzv. sladkém srážení mléka. Je také schopen vázat bivalentní ionty a zvyšovat
hydrofilní vlastnosti kaseinu. V mléce se kasein vyskytuje ve formě kaseinových micel.
Jedná se o částice elipsoidního tvaru, které se skládají z menších podjednotek
označovaných jako submicely. Jednotlivé submicely jsou tvořeny 25 – 30 molekulami
kaseinových frakcí. Ke spojování jednotlivých kaseinových frakcí dochází při teplotě
větší než 5 °C. Soudržnost submicel je dána koloidním fosforečnanem vápenatým.
10
Submicely, které jsou bohaté na κ-kasein se nachází na povrchu micely. κ-kasein se
totiž nesráží v přítomnosti vápenatých iontů a může tak zajistit stabilitu kaseinové
micely v mléce (Buňka a kol., 2013; Janštová a Navrátilová, 2014).
Jelikož je podíl kaseinu díky vysokému obsahu prolinu v terciárních a kvartérních
strukturách nízký, jsou mléčné proteiny snadno hydrolyzovatelné a tudíž snadno
stravitelné. Tato snadná dostupnost umožňuje bakteriím mléčného kvašení odštěpovat
aminokyseliny a využít je pro své metabolické dráhy (Buňka a kol., 2013).
Syrovátkové nebo také sérové bílkoviny jsou proteiny, které po vysrážení kaseinu
při pH 4,6 zůstanou v syrovátce. Zaujímají 17 – 20 % z celkového obsahu bílkovin.
Z nutričního hlediska jsou důležitější než kaseinové bílkoviny. A to vzhledem k obsahu
cystinu, který zvyšuje jejich biologickou hodnotu. Do skupiny syrovátkových bílkovin
zahrnujeme α-laktalbumin, β-laktoglobulin, sérový albumin, imunoglobuliny,
laktoferin, transferin a proteózo-peptony (Gajdůšek, 2003; Janštová a kol., 2012; Buňka
a kol., 2013).
3.1.2 Lipidy
Základními složkami složité struktury lipidů mléka jsou mono-, di-
a triacylglyceroly, fosfolipidy, estery, volné mastné kyseliny, steroly a jejich estery,
uhlovodíky a lipofilní vitaminy. Lipidy, které jsou energeticky nejbohatší mléčnou
složkou, jsou přítomny v mléce ve formě tukových globulí. Jejich velikost se pohybuje
v rozmezí od 0,1 do 30 μm. Toto rozptýlení tuku má za následek jeho dobrou
stravitelnost pro novorozence. Avšak nevýhodou je, že jsou tukové globule díky
většímu povrchu snadněji přístupné pro enzymy a kontaminující mikroorganismy
(Gajdůšek, 2003; Buňka a kol., 2013; Šustová a Sýkora, 2013).
K rozkladu tuku může dojít špatným vychlazením mléka, prostřednictvím
přirozených či bakteriálních lipáz. Lipolýzou dochází ke zvyšování obsahu volných
mastných kyselin. To má za následek technologické problémy při zpracování mléka
a senzorické vady produktů. Při kontaminaci mléka psychrotrofními mikroorganismy je
možná lipolýza i pasterovaného mléka v důsledku tvorby termostabilních lipáz
(Gajdůšek, 2003).
11
Lipidy mléka jsou doprovázeny řadou významných látek. Mezi ně zařazujeme
například cholesterol, fosfolipidy a lipofilní vitaminy. Proti ukládání cholesterolu
v lidském těle brání konjugovaná kyselina linolová, vápník a také lecitin (Šustová
a Sýkora, 2013).
3.1.3 Laktóza
Laktóza neboli mléčný cukr je sacharid specifický jen pro mléko. Obsah laktózy
v mléce se pohybuje v rozmezí 4,6 – 5,0 %. Jedná se o disacharid složený z glukózy
a galaktózy. Glukóza přechází do mléka z krve matky. Galaktóza se vytváří až v mléčné
žláze z glukózy. Laktóza se řadí mezi redukující disacharidy (Gajdůšek, 2003; Janštová
a Navrátilová, 2014).
Laktózu využívají bakterie mléčného kvašení, které se uplatňují při výrobě kysaných
mléčných výrobků a sýrů. Jejich působením je laktóza přeměňována na kyselinu
mléčnou. Tato kyselina inhibuje růst hnilobných bakterií a proteolytických
mikroorganismů a stimuluje acidofilní mikroflóru (Gajdůšek, 2003; Buňka a kol.,
2013).
3.1.4 Antimikrobiální látky v mléce
V mléce lze nalézt přirozeně obsažené látky působící proti mikroorganismům. Tyto
látky chrání mléčnou žlázu před infekcí a prodlužují trvanlivost čerstvého mléka. Jsou
důležité také pro mláďata, která mají po narození sníženou imunitu. Mezi
antimikrobiální látky patří laktoferin, lysozym, imunoglobuliny a laktoperoxidázový
systém (Görner a Valík, 2004; Janštová a Navrátilová, 2014).
Období, ve kterém se bakterie nerozmnožují a jejich množství klesá, označujeme
jako baktericidní fázi mléka. Délka doby trvání baktericidní fáze závisí na rychlosti
vychlazení, počtu mikroorganismů v mléce a také na individualitě dojnice (Gajdůšek,
2003).
12
3.1.4.1 Laktoferin
Laktoferin je glykoprotein, který je vytvářen v mléčné žláze. Vyznačuje se
schopností vázat ionty železa. V kravském mléce je přítomen v množství
0,07 – 0,12 mg/ml. V kolostru se jeho obsah pohybuje v rozmezí 0,2 – 5,2 mg/ml
(Janštová a Navrátilová, 2014).
Z nutričního hlediska představuje laktoferin zdroj aminokyselin a železa. Kromě
antibakteriálních účinků má také účinky antifungální a antivirové. Antimikrobiální efekt
spočívá ve vazbě laktoferinu na buněčnou stěnu mikroorganismů. Místo laktoferinu se
mohou také navázat jeho štěpné produkty označované jako laktofericiny.
U grampozitivních bakterií se vazba této antimikrobiální látky uskutečňuje na kyselinu
teichovou přítomnou v buněčné stěně. U gramnegativních bakterií je laktoferin vázán na
lipopolysacharidy buněčné stěny. Vazbou dojde ke zvýšení permeability buněčné stěny
(Janštová a Navrátilová, 2014).
Laktoferin váže ionty železa, hořčíku a vápníku, které jsou nezbytné pro růst
většiny mikroorganismů. Železo je zapotřebí například pro růst a syntézu DNA.
Hořčík je důležitý pro aktivitu enzymů vázaných na membráně a vápník se uplatňuje
při regulaci buněčných procesů. Vazbou železa laktoferinem z prostředí dochází
k inhibici růstu některých bakterií (Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas
ssp., Bacillus ssp.) a kvasinek Candida albicans (Tamine, 2009; Janštová
a Navrátilová, 2014).
3.1.4.2 Lysozym
Lysozym je enzym, který je schopen štěpit glykosidické vazby mukopolysacharidů
přítomných v buněčné stěně bakterií. Rozštěpením vazby mezi N-acetylmuramovou
kyselinou a N-acetyl-D-glukosaminem dojde k lýze buňek bakterií. Vůči působení
lysozymu jsou odolnější bakterie mléčného kvašení. Citlivější jsou nežádoucí bakterie
(Samková, 2012; Janštová a Navrátilová, 2014).
13
3.1.4.3 Laktoperoxidázový systém
Laktoperoxidáza je mléčný enzym, který katalyzuje tvorbu hypothiokyanátového
iontu. Tento iont působí na metabolické enzymy mikroorganismů. Laktoperoxidáza je
inaktivována při 75 °C do 30 minut a při 80 °C do 30 s. Z tohoto důvodu je enzym
laktoperoxidáza využíván pro důkaz správnosti vysoké pasterace (Samková, 2012;
Janštová a Navrátilová, 2014).
Ověřování vysoké pasterace se provádí tzv. Storchovou zkouškou, kdy
ke zkoušenému vzorku mléka se přidá peroxid vodíku a p-fenyldiamin. Vznikne-li
modré zbarvení, pasterace byla neúspěšná (Samková, 2012; Janštová a Navrátilová,
2014).
3.2 Mikrobiologie syrového mléka
Mléko obsahuje řadu živin, které mohou mikroorganismy využít pro svůj růst
a fermentaci. Kromě přítomnosti vhodných látek jim také vyhovuje téměř neutrální pH
a vysoký obsah vody. Vhodným prostředím je mléko zejména pro bakterie. V mléku se
mohou vyskytovat také kvasinky a plísně. Na druhou stranu pro některé
mikroorganismy není mléko vhodným substrátem, jelikož obsahuje nevyhovující
množství aminokyselin, jako je například arginin, lysin či glutamová kyselina (Walstra
a kol., 2006; Doyle a Buchanan, 2013).
Görner a Valík (2004) uvádí, že v mléku získaném ze zdravých vemen bylo
stanoveno kultivační metodou průměrné množsví bakterií 102 – 103 KTJ v 1 ml
a mikroskopickou metodou 103 – 104 KTJ v 1 ml.
Důležité je oddojení prvních střiků. U oddojeného mléka lze posoudit barvu,
konzistenci či pach a vyřadit tak nevyhovující mléko z celkového nádoje. Tím dojde ke
zlepšení mikrobiologické jakosti mléka, protože s prvními střiky odchází část
mikroorganismů nacházejících se ve strukovém kanálu. Obsah mikroorganismů se může
zlepšit až o jeden řád (Buňka a kol., 2013).
14
3.2.1 Zdroje kontaminace syrového mléka
V mléčné žláze zdravé dojnice je mléko téměř sterilní. Mikroorganismy se mohou
dostávat do mléka před dojením, potom se jedná o primární kontaminaci, anebo
v průběhu dojení či při následujícím zpracováním získaného mléka. V tomto případě se
jedná o sekundární kontaminaci (Buňka a kol., 2013).
K primární kontaminaci mléka dochází přestupem mikroorganismů z krve dojnice
nebo jejich průchodem skrze strukový kanál. Krví ke kontaminaci mléka téměř
nedochází, protože složky imunitního systému brání mikroorganismům proniknout
z trávicího traktu do krve a následně do mléka (Buňka a kol., 2013).
Strukovým kanálem se dostávají do mléčné žlázy grampozitivní koky,
pseudomonády, bakterie mléčného kvašení či kvasinky. Při zánětu mléčné žlázy dochází
ke zvýšení počtu mikroorganismů v mléce. Zánět mléčné žlázy neboli mastitida může
být způsoben řadou mikroorganismů. Původcem může být Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae či Escherichia coli. Příčinou
onemocnění mléčné žlázy mohou být i patogenní bakterie Mycobacterium bovis,
Brucella abortus nebo Listeria monocytogenes (Buňka a kol., 2013).
Sekundární kontaminace bývá způsobena dojícím zařízením, činností člověka či
nevyhovujícím krmivem nebo také například hmyzem. Dojící zařízení představuje
důležitý zdroj konataminace syrového mléka. Mikroorganismy se pomnožují na špatně
čistitelných částech zařízení, kde jsou pro ně zdrojem živin mléčné usazeniny. Snadno
se rozmnožují na vlhkém povrchu. Díky nedostatečné dezinfekci dojícího zařízení se
mohou v mléku vyskytovat například grampozitivní bakterie rodů Microbacterium,
Corynebacterium, sporulující bakterie rodů Bacillus, Clostridium a gramnegativní
bakterie rodů Flavobacterium, Pseudomonas či Enterobacter (Buňka a kol., 2013).
Příčinou sekundární kontaminace bývá také špatná osobní hygiena dojiče, nesprávná
mamipulace s dojícím zařízením a toaleta vemene. V syrovém mléce jsou potom
přítomny koliformní bakterie, patogenní bakterie rodu Salmonella nebo se také může
vyskytovat Staphylococcus aureus. Z nekvalitních siláží přechází do mléka Listeria
monocytogenes a bakterie rodu Clostridium, jejichž spory způsobují vady mléčných
výrobků (Buňka a kol., 2013).
15
3.2.2 Mikrobiologické požadavky na syrové mléko
Nařízení Evropského Parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004, kterým se stanoví
zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu, definuje syrové mléko
jako mléko produkované sekrecí mléčné žlázy hospodářských zvířat, které nebylo
podrobeno ohřevu nad 40 °C a nebylo ani ošetřeno žádným způsobem s rovnocenným
účinkem.
Výše uvedené nařízení stanovuje pro kravské mléko počet mikroorganismů
při 30 °C ≤ 100 000 v 1 ml. Obsah mikroorganismů je stanoven klouzavým
geometrickým průměrem za 2 měsíce při odběru nejméně 2 vzorků za měsíc.
Mikroorganismy se rozumí podle nařízení Komise (ES) č. 2073/2005
o mikrobiologických kritériích pro potraviny bakterie, viry, kvasinky, plísně, řasy,
cizopasní prvoci, mikroskopičtí cizopasní helminti a jejich toxiny a metabolity.
Mikrobiologickou kvalitou syrového kravského mléka určeného pro mlékárenské
ošetření a zpracování se zabývá i Česká technická norma 57 0529. Tato norma zahrnuje
do doplňkových znaků jakosti počet termorezistentních a psychrotrofních
mikroorganismů, dále počet koliformních a sporotvorných anaerobních bakterií. Počet
termorezistentních mikroorganismů musí být do 2 000 v 1 ml, psychrotrofních
mikroorganismů se smí v 1 ml nacházet maximálně 50 000. Počet koliformních bakterií
nesmí přesahovat 1000 v 1 ml a sporotvorné anaerobních mikroorganismy v 0,1 ml
nesmí být přítomny.
3.2.3 Mikroorganismy způsobující kažení mléka
Mikroorganismy zodpovědné za kažení mléka způsobují změny jeho chutě, vůně,
konzistence a vzhledu. „Sladovou a karamelovou chuť způsobují mikrokoky a Bacillus
subtilis, hořkou chuť Pseudomonas fluorescens, Streptococcus liquefaciens, mikrokoky,
Mucor, Penicillium, kovovou příchuť Lactococcus lactis, Leuconostoc – při nízkých
teplotách. Rybí pachuť bývá vyvolána Pseudomonas ichtiosmia“ (Kalhotka, 2014).
Za modrání mléka zodpovídá Pseudomonas cyanogenes. Žloutnutí nebo fluorescenci
způsobuje Pseudomonas fluorescens, červené skvrny Seratia marcescens. Escherichia
coli, Enterobacter aerogenes, kvasinky rodu Candida a Clostridium butyricum jsou
příčinou srážení mléka a tvorby plynů (Navrátilová a kol., 2012; Kalhotka, 2014).
16
K těmto změnám dochází prostřednictvím bakteriálních lipolytických
a proteolytických enzymů, které způsobují rozklad lipidů a proteinů. Na změnách
senzorických vlastností se podílí i mléčná, propionová či máselná fermentace
(Navrátilová a kol., 2012).
Při proteolýze rozlišujeme dva stupně rozkladu bílkovin. Jedná se o peptonizaci
a peptonizaci navazující. Při peptonizaci dochází ke štěpení mléčných bílkovin
na peptony a peptidy. Peptonizace navazující poskytuje produkty rozkladu proteinů jako
jsou například amoniak, skatol, sirovodík či oxid uhličitý. Za proteolýzu jsou
zodpovědné především některé druhy rodu Serratia, Pseudomonas, Clostridium,
Alcaligenes, Flavobacterium, Bacillus. Dále je to rod Microccus a Enterococcus
faecalis (Kalhotka, 2014).
Lipolytickou aktivitu vykazují mikroorganismy rodu Pseudomonas, Alcaligenes,
Proteus, Clostridium, Micrococcus, Bacillus, kvasinky a plísně. Mikrobiální lipázy tvoří
z triacylglycerolů diacylglyceroly, monoacylglyceroly a volné mastné kyseliny. Přičemž
negativní vliv na senzorické vlastnosti mléka mají zejména mastné kyseliny se 4 – 12
atomy uhlíku (například kyselina máselná). Krátké řetězce mastných kyselin způsobují
žluklou chuť mléka. Atak mléčného tuku lipázami usnadňují fosfolipázy. Tyto enzymy
napadjí fosfolipidy, které se nachází v membránách tukových globulí (Marth a Steele,
2001; Tančinová a kol., 2012; Kalhotka, 2014).
Do skupiny mikroorganismů způsobujích kažení mléka lze zařadit koliformní
bakterie, psychrotrofní a termorezistentní mikroorganismy. Dále bakterie mléčného
kvašení, kvasinky a plísně (Navrátilová a kol., 2012).
3.2.3.1 Psychrotrofní mikroorganismy
Psychrotrofní mikroorganismy se vyznačují schopností růstu při teplotě pod 7 °C.
Aktivita jejich metabolismu při této teplotě je dána vyšším obsahem nenasycených
mastných kyselin v cytoplazmatické membráně. Zdrojem této skupiny mikroorganismů
je krmivo, kontaminovaná voda, prach a nedostatečná sanitace úchovných nádrží
(Görner a Valík, 2004; Tančinová a kol., 2012; Janštová a Navrátilová, 2014).
Celkový obsah psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléce je proměnlivý.
Závisí na teplotě a době skladování mléka a na jeho kontaminaci. Je-li celkový počet
mikroorganismů v 1 ml mléka do 100 000, potom podíl psychrotrofních
17
mikroorganismů je do 10 %. Je-li ovšem mléko získáváno ve špatných hygienických
podmínkách, potom lze očekávat, že jejich podíl bude do 75 %. Přítomnost
psychrotrofních bakterií je v mléce nežádoucí, protože produkují enzymy s lipolytickou
a proteolytickou aktivitou. Řada těchto enzymů je termorezistentní a tudíž mohou
způsobovat kažení i tepelně ošetřeného mléka. Pasterací dochází ke zničení
psychrotrofních gramnegativních bakterií (Navrátilová a kol., 2012 ; Tančinová a kol.,
2012).
Do skupiny psychrotrofních mikroorganismů nacházejících se v mléce se zahrnují
především rody Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Aeromonas,
Flavobacterium (Navrátilová a kol., 2012; Tančinová a kol., 2012). „V malém množství
se mohou vyskytovat i psychrotrofní kmeny Bacillus spp., zejména druhů B. coagulans,
B. circulans, B. cereus a B. subtilis“ (Navrátilová a kol., 2012).
Rod Pseudomonas
Mikroorganismy patřící do tohoto rodu jsou gramnegativní tyčinky mírně
zakřiveného nebo rovného tvaru. Pohybují se pomocí jednoho nebo několila bičíků.
Z hlediska nároků na kyslík se jedná o aerobní bakterie. Pouze výjimečně může být
umožněn i anaerobní růst a to tehdy je-li akceptorem elektronů nitrát. Jako zdroj uhlíku
a energie využívají široké spektrum organických látek. Bakterie jsou převážně
chemoorganotrofní, některé jsou však fakultativně chemoautotrofní. Nemají kvasné
schopnosti. Nachází se na rostlinách a potravinách. Mohou být i v půdě a ve vodě.
(Šilhánková, 2002; Sedláček, 2007; Kalhotka, 2014).
Díky širokému enzymovému vybavení se bakterie uplatňují například
při průmyslových oxidacích organických sloučenin. Jejich schopnost produkovat
barviva a uvolňovat je do prostředí způsobuje kažení potravin. Mikroorganismy rodu
Pseudomonas produkují barviva zelená, modrá, žlutá, červená a žlutozelené
fluoreskující barvivo (Kalhotka, 2014).
Tato barviva jsou zodpovědná i za vady barvy mléka. Pseudomonas cyanogenes
způsobuje hnědavý nádech a Pseudomonas cyanofluorescens vyvolává tzv. modrání
mléka. Z hlediska vad barvy mléka je také důležitá bakterie Pseudomonas fluorescens,
která je příčinou žlutozelené fluroscence mléka. Silnou kontaminací Pseudomonas
synxantha dochází k žlutému zbarvení smetanové vrstvy mléka (Samková, 2012).
18
Bakterie tohoto rodu jsou také zodpovědné za vady chuti mléka. Hořkou chuť
vyvolává Pseudomonas fluorescens, rybí chuť Pseudomonas ichthyosmia, mýdlovitou
chuť Pseudomonas fluorescens. Pravděpodobnou příčinou žluklé chuti mléka je taktéž
Pseudomonas fluorescens produkující lipolytické enzymy, které rozkládají
triacylglyceroly (Samková, 2012).
Rod Alcaligenes
Mikroorganismy rodu Alcaligenes jsou grampozitivní, nesporulující,
chemoorganotrofní koky nebo tyčinky s peritrichálními bičíky. Z hlediska nároků na
kyslík se jedná o obligátně aerobní bakterie. Optimální teplota pro růst se nachází
v rozmezí 20 – 37 °C. Bakterie se vyskytují v půdě, vodě, krvi a moči (Sedláček, 2007).
U syrového mléka, které bylo skladováno delší dobu při nízkých teplotách,
způsobuje Alcaligenes viscosus slizovitost. Příčinou zatuchlé chuti mléka uchovávaného
v uzavřené nádobě je Alcaligenes faecalis (Samková, 2012).
Rod Achromobacter
Bakterie tohoto rodu jsou gramnegativní, nesporulující, obligátně aerobní,
chemoorganotrofní, rovné tyčinky bez kvasných schopností. Pohybují se pomocí
1 – 20 peritrichálních bičíků. Vyskytují se v humánním klinickém materiálu (krev,
stolice, moč), v půdě a vodě (Sedláček, 2007).
Kažení mléka vyvolává Achromobacter lipolyticum. Tato bakterie způsobuje
žluklou chuť mléka produkcí lipolytických enzymů, které štěpí triacylglyceroly
(Samková, 2012).
3.2.3.2 Koliformní bakterie
Koliformními bakteriemi se rozumí aerobní a fakultativně anaerobní, nesporulující,
gramnegativní tyčinky, které jsou schopné fermentovat laktózu za vzniku kyseliny
a plynů. Pro jejich růst je vhodná teplota 37 °C. Při záhřevu mléka nad 65 °C dochází
ke zničení bakterií. Koliformní mikroflóru syrového mléka tvoří rody Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Yersinia, Serratia a Proteus (Navrátilová a kol.,
2012; Tančinová a kol., 2012; Janštová a Navrátilová, 2014) .
19
Zdrojem koliformních bakterií je půda, hnůj a kontaminované nářadí. Přirozeně se
vyskytují v trávicím traktu teplokrevných zvířat. Jejich počet v mléce se zvyšuje také
špatně prováděnou sanitací používaných zařízeních. Jelikož lze podle obsahu
koliformních mikroorganismů hodnotit úroveň hygieny získávání mléka a fekální
kontaminaci, řadíme tyto bakterie mezi indikátorové mikroorganismy (Navrátilová
a kol., 2012; Tančinová a kol., 2012; Janštová a Navrátilová, 2014).
Koliformní bakterie jsou také zodpovědné za kažení mléka. Některé z nich
(například Serratia marcescens) tvoří enzymy, které způsobují gelovatění UHT mléka.
Pasterací se koliformní mikroflóra sice ničí, ale sekundární kontaminací může docházet
k časnému duření sýrů a dále k senzorickým změnám mléčných výrobků, jako je vznik
nečistého, fekálního zápachu nebo slizovatění (Navrátilová a kol., 2012).
3.2.3.3 Bakterie mléčného kvašení
Do skupiny bakterií mléčného kvašení se zahrnují některé druhy rodů
Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcos, Lactococcus.
Jedná se především o koky a tyčinky. Pro velkou část bakterií mléčného kvašení není
kyslík toxický a proto mohou být tyto mikroorganismy aerotolerantní, mikroaerofilní či
fakultativně anaerobní (Görner a Valík, 2004).
Bakterie mléčného kvašení rozkládají laktózu na kyselinu mléčnou. Vzniká-li
při fermentaci pouze kyselina, potom se bakterie označují jako homofermentativní.
Mezi homofermentativní mikroorganismy se řadí Lactococcus lactis subsp. lactis,
Pediococcus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei. Docházi-li však k tvorbě i dalších
produktů, jako je kyselina octová, ethanol, či oxid uhličitý, označují se příslušné
mikroorganismy jako heterofermentativní. Mezi heterofermentativní bakterie patří
Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides subsp.
cremoris, Lactobacillus brevis a Lactobacillus fermentum (Navrátilová a kol., 2012;
Tančinová a kol., 2012).
Bakterie mléčného kvašení se vyznačují schopností produkovat látky a vytvářet
takové podmínky v prostředí, které jsou pro jiné bakterie škodlivé. K vytvoření
nepříznivého prostředí dochází tvorbou kyseliny mléčné, která rychle okyselí prostředí
na pH 4 (Görner a Valík, 2004).
20
Negativně působí bakterie mléčného kvašení také tvorbou peroxidu vodíku, oxidu
uhličitého, diacetylu, nízkomolekulárních antimikrobiálních látek a polysacharidových
metabolitů. Konzervační účinky bakterií rodu Lactococcus jsou dány také produkcí
kyseliny jantarové, propionové, fenylmléčné a bakteriocinů na bázi bílkovin. Některé
bakteriociny působí negativně na příbuzné mikoorganismy, zatímco jiné antimikrobiální
látky inhibují patogenní a sporotvorné mikroorganismy (Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium tyrobutyricum). Z potravinářského
hlediska je také důležitý bakteriocin nisin, který je schopen inhibovat klíčení spor rodu
Clostridium a Bacillus a negativně působit na grampozitivní mikroorganismy
(Hladíková a kol., 2012).
Výskyt bakterií mléčného kvašení v přírodě je běžný. V mléku jsou přítomné až
po nadojení. Jejich zdrojem je například vzduch, výkaly, krmivo. Chlazením mléka
na teplotu pod 10 °C dochází k omezení růstu bakterií (Navrátilová a kol., 2012;
Tančinová a kol., 2012).
Pozitivní využití bakterií mléčného kvašení spočívá při výrobě mléčných
fermentovaných výrobků, kde se uplatňují jako tzv. startovací kultury. Z opačného
pohledu způsobují tyto mikroorganismy nežádoucí kysnutí a senzorické změny mléka
(Navrátilová a kol., 2012).
3.2.3.4 Kvasinky
Kvasinky jsou mikroskopické jednobuněčné houby rostoucí převážně v koloniích.
Řadí se mezi eukaryotické, chemoheterotrofní organismy. Vyznačují se schopností
zkvašovat mono-, di-, trisacharidy za vzniku ethanolu a oxidu uhličitého. Pro svůj růst
vyžadují kyslík. Za anaerobních podmínek mění svůj metabolismus na fermentační.
Kvasinky se uplatňují v potravinářském průmyslu při výrobě vína, piva, pekařských
pruduktů a v dalších odvětvích. Zároveň však způsobují kažení masa či mléčných
výrobků (Görner a Valík, 2004; Kalhotka, 2014).
Do mléčné žlázy a mléka se kvasinky dostávají z krmiva, výkalů zvířat a steliva.
Mohou vyvolat nejen kažení mléčných výrobků ale také onemocnění člověka. U krav
mohou být příčinou mastitid. Do skupiny kvasinek vyvolávajících onemocnění, jak
člověka, tak i zvířete patří rody Candida, Trichosporon, Cryptococcus nebo
Rhodotorula (Seydlová a kol., 2009; Navrátilová a kol., 2012).
21
Z mléka dojnic se zánětem mléčné žlázy byla izolována kvasinka
Candida lusitaniae. Tato kvasinka se vyskytuje v trávicím traktu teplokrevných
živočichů. Přítomna je i na kůře citrusů, v kukuřičných výrobcích a ovocných džusech
(Seydlová a kol., 2009).
Seydlová a kol. (2009) uvádí, že při vysoké kontaminaci mléka kvasinkou Candida
lusitaniae dochází prostřednictvím enzymů ke změnám ve složení syrového mléka.
V mléku se snižuje obsah tuku, bílkovin. Zvyšuje se obsah volných aminokyselin,
volných mastných kyselin, močoviny a kyseliny máselné. Při koncentaci 1,9x105
kvasinek Candida lusitaniae došlo ke snížení v obsahu tuku z 3,41 % na 1,9 %,
v obsahu bílkovin z 3,29 % na 2,45 %, v obsahu laktózy z 4,88 % na 2,98 %. Nárůst
močoviny byl značný. Došlo ke zvýšení ze 172,5 mg/l na 860,5 mg/l (Seydlová a kol.,
2009).
3.2.4 Mikroorganismy negativně ovlivňující lidské zdraví
Syrové mléko může být zdrojem řady patogenních mikroorganismů, které
vyvolávají alimentární infekce nebo intoxikace. Jejich růst podporuje složení mléka.
Negativní účinek na patogenní mikroflóru má chlazení a také kompetitivní
mikroorganismy. Ze syrového mléka lze izolovat z patogenních mikroorganismů
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp., Salmonella spp.,
Escherichia coli, Bacillus spp., Clostridium spp. či Mycobacterium (Navrátilová a kol.,
2012).
3.2.4.1 Staphylococcus aureus
Zástupci Staphylococcus aureus jsou grampozitivní, fakultativně anaerobní
nepohyblivé koky, které vytváří hroznovité shluky. Mohou se však vyskytovat
i ve dvojicích nebo jednotlivě. Mikroorganismy jsou schopny růst a produkovat
enterotoxin při teplotě 10 – 45 °C. Optimální teplota je 30 – 37 °C. Pro svůj růst
vyžadují prostředí o pH 4,2 – 9,3. Staphylococcus aureus snese 10% koncentraci NaCl
(Jičínská a Havlová, 1995).
Zástupci se vyskytují v nosní a ústní dutině teplokrevných živočichů a člověka.
Zdrojem mikroorganismů může být i půda, odpadní voda či krmivo. Do mléka se
dostávají z povrchu vemen při dojení nebo z ovzduší. Za nejdůležitější zdroj
22
kontaminace je považována subklinická a klinická mastitida. Významným zdrojem
Staphylococcus aureus jsou hnisavá poranění na rukou lidí, kteří manipulují s mlékem
(Jičínská a Havlová, 1995; Šilhánková, 2002; Samková, 2012).
Staphylococcus aureus produkuje v kontaminované potravině enterotoxiny, které
mohou vyvolat až smrtelné otravy. Styfylokokové enterotoxiny snesou var po dobu
30 minut a jsou také odolné vůči působení proteolytických enzymů trávicího traktu.
Otravu člověka vyvolají mikroorganismy při počtu buněk 105 – 107/g. Po požití
kontaminované potraviny se objevují příznaky za 1 – 6 hodin. Otrava se projevuje
žaludeční nevolností, zvracením, průjmy, bolestí hlavy. Onemocnění nevyžaduje léčení
a zpravidla odezní během 24 hodin. Avšak mnoho kmenů nacházejících se
v mléce, neprodukuje enterotoxiny. Vhodným prostředím pro růst mikroorganismů
a produkci toxinů je pasterované mléko. Absence nepatogenní mikroflóry (laktokoky,
laktobacily, pseunomonády) umožňuje pomnožení Staphylococcus aureus (Jičínská
a Havlová, 1995; Šilhánková, 2002; Samková, 2012).
3.2.4.2 Listeria monocytogenes
Zástupci Listeria monocytogenes jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně
anaerobní, rovné tyčinky se zakulacenými konci. Pohybují se při teplotě 20 – 25 °C.
Jsou-li teploty vyšší mikroorganismy se nepohybují. Mléčný cukr rozkládají za vzniku
kyseliny mléčné. Pro svůj růst vyžadují prostředí o pH 5,0 – 9,0. Zástupci se vyznačují
psychrotrofními vlastnostmi. Při teplotě –0,1 – 0,4 °C dokážou ještě růst. Optimální
teplota růstu je 30 – 37 °C. K devitalizaci mikroorganismů dochází při teplotě
58 – 59 °C po dobu 10 minut. Pasterace mléka by měla zajistit usmrcení Listeria
monocytogenes (Jičínská a Havlová, 1995; Sedláček, 2007; Kalhotka, 2014).
Listerie se vyskytují v půdě, nedostatečně prokysaných siláži a povrchových vodách.
Nachází se také ve střevech zdravých hospodářských zvířat i člověka. Syrové mléko
bývá kontaminováno většinou při dojení. Méně častá je listeriová mastitida.
V prvovýrobě lze kontaminaci zabránit sanitací, dodržováním hygienických pravidel při
dojení a kvalitními krmivy. Problém však představuje kontaminace prostředí
zpracovatelských závodů, odkud se Listeria monocytogenes obtížně odstraňuje.
Zástupci mají schopnost kolonizovat technické prostředí (Jičínská a Havlová, 1995;
Navrátilová a kol., 2012; Samková, 2012).
23
Listeria monocytogenes způsobuje onemocnění označované jako listerióza. Tato
nemoc se projevuje průjmy, zvracením a horečkou. V případě těžkých forem listeriózy
je postihován nervový systém a vnitřní orgány. Onemonění je zvlášťe nebezpečné
pro těhotné ženy. Může vyvolat potrat či záněty mozkových blan novorozenců
(Samková, 2012; Kalhotka, 2014).
3.2.4.3 Campylobacter jejuni
Zástupci rodu Campylobacter jsou gramnegativní bakterie spirálovitého tvaru, které
se pohybují pomocí bičíků. Vyznačují se charakteristickým pohybem na způsob
vývrtky. Mikroorganismy nezkvašují cukry. Optimální teplota pro růst Campylobacter
se pohybuje v rozmezí 42 – 45 °C. Při teplotě vyšší než 63 °C po dobu 16,2 sekund jsou
mikroorganismy devitalizovány. Dokážou přežívat i chlazení potravin. Nesnesou však
1,5 – 2,0 % koncentraci NaCl v prostředí (Jičínská a Havlová, 1995; Šilhánková, 2002;
Sedláček, 2007).
Campylobacter jejuni žije ve střevě skotu, kde se živí zbytky, ale neškodí. Syrové
mléko může být tudíž kontaminováno mikroorganismy během dojení. Možná je
i kontaminace mléka vlivem kampylobakteriových mastitid. U člověka vyvolává
Campylobacter jejuni akutní průjmové onemocnění nazývané kampylobakterióza
(Jičínská a Havlová, 1995; Samková, 2012).
3.2.4.4 Escherichia coli
Zástupci rodu Escherichia jsou gramnegativní, nesporulující, fakultativně anaerobní,
pohyblivé, rovné tyčinky. Pro jejich růst je optimální teplota 30 – 37 °C. Dokážou však
růst při teplotě 7 – 46 °C a pH 4,5 – 9. K devitalizaci mikroflóry dochází při teplotě
vyšší než 64,5 °C po dobu 16 – 17 sekund. Mikroorganismy rozkládají cukry za vzniku
kyseliny mléčné, pyrohroznové, octové, mravenčí a plynu (Sedláček, 2007; Kalhotka,
2014).
Zdravotní nezávadnost mléka ohrožují zejména enterohemoragicé kmeny (EHEC),
jejichž rezervoárem je hovězí dobytek. Do mléka se bakterie dostávají z výkalů. Dalším
zdrojem kontaminace mléka je voda. Je-li Escherichia coli přítomna ve vodě, je
indikátorem fekálního znečištění. Bakterie jsou také považovány za indikátory špatné
nebo nedostatečné hygieny. V syrovém mléce, které má špatnou mikrobiologickou
24
jakost, dochází k inhibici Escherichia coli nepatogenními mikroorganismy, jako jsou
pseudomonády či bakterie mléčného kvašení (Jičínská a Havlová, 1995; Šilhánková,
2002; Samková, 2012; Kalhotka, 2014).
EHEC jsou příčinou krvácení ve střevě. Po uplynutí inkubační doby, která trvá
3 – 4 dny, vyvolávají bakterie u člověka bolesti břicha a vodnatý průjem, který se
následně mění na krvavý. U některých případů může dojít ke vzniku
hemolyticko-uremického syndromu. K vyvolání onemocnění je zapotřebí
102 – 103 buněk (Samková, 2012; Kalhotka, 2014).
3.2.4.5 Další patogenní mikroorganismy
Mléko může být kontaminováno také zástupci rodu Salmonella. Avšak riziko
onemocnění člověka salmonelózou z mléka je nízké. Nákaze brání dobrá hygienická
praxe v prvovýrobě a skladování mléka při nízkých teplotách. Ze siláží se dostávají
do mléka zástupci rodu Clostridium. Jejich množství v mléce je malé a jsou nežádoucí
při výrobě polotvrdých a tvrdých sýrů, kdy způsobují pozdní duření sýrů. Clostridium
butyricum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium pasteurianum a Clostridium
sporogenes patří z mlékárenskénského hlediska mezi nejzávažnější druhy.
Z patogenního hlediská jsou významné Clostridium perfingens a Clostridium
botulinum. Zástupci rodu Clostridium tvoří spory, které jsou termorezistentní.
Při pasteraci mléka nedochází ke snížení jejich klíčivosti. Avšak vyklíčení spor nehrozí
v pasterovaném mléku, jelikož zde není anaerobní prostředí (Jičínská a Havlová, 1995;
Görner, Valík, 2004; Samková, 2012; Navrátilová a kol., 2012).
Pro konzumenty syrového mléka představuje další zdravotní nebezpečí virus
klíšťové encefalitidy. Rizikové je především kozí a ovčí mléko. U kravského mléka je
pravděpodobnost nákazy nízká. Po uplynutí inkubační doby, která trvá 7 – 14 dnů, se
onemocnění projevuje teplotou, malátností, zvracením a bolestmi hlavy. Virus klíšťové
encefalitidy se ničí pasteračním záhřevem (Samková, 2012).
Zdravotní problém představují také mykotoxiny produkované plísněmi. Na polních
rostlinách se nachází plíseň Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Rod
Aspergillus produkuje mykotoxiny B1, B
2, G
1, G
2. Zkrmováním zaplísněných krmiv se
25
aflatoxin B1
dostává do organismu dojnice, kde je přeměněn na aflatoxin M1. Tento
aflatoxin se následně dostává do mléka. Je odolný vůči pasteraci a je považován
za lidský karcinogen (Samková, 2012).
3.3 Mikrobiologie tepelně ošetřeného mléka
3.3.1 Pasterované mléko
Pasterace je tepelné ošetření mléka, které zajistí jeho zdravotní nezávadnost
a prodlouží trvanlivost. Jejím cílem je zničit všechny choroboplodné zárodky.
Při tepelném ošetření dochází i ke změnám ve složení mléka a proto se současně se
zdravotní nezávadností dbá na to, aby záhřev ovlivnil co nejméně chemické, nutriční,
fyzikální a senzorické vlastnosti (Görner a Valík, 2004; Şenel a Gürsoy, 2015).
Zvýšením teploty se buňce dodává kinetická energie, která způsobí rozštěpení
disulfidových, sulfidových a vodíkových můstků v bílkovinách. Bílkoviny ztrácejí
pevnost a jejich struktura se mění. Denaturací bílkovin se narušují jejich funkce, které
v buňce zastávají. To má za následek ztátu schopnosti růst a rozmnožovat se
při optimálních podmínkách (Görner a Valík, 2004).
Nařízení Komise (ES) č. 1662/2006, kterým se mění nařízení Evropského
parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro
potraviny živočišného původu, považuje za pasteraci ošetření vysokou teplotou po
krátkou dobu (nejméně 72 °C po dobu 15 sekund), nízkou teplotou po dlouhou dobu
(nejméně 63 °C po dobu 30 minut) nebo jakoukoli jinou kombinací času a teploty, která
bude mít rovnocenný účinek.
Výše uvedené kombinace teplot a času zajistí nepřítomnost Mycobacterium
tuberculosis, Mycobacterium bovis a Coxiella burnetii v mléce. Jelikož jsou
Mycobacterium bovis a Coxiella burnetii ze všech choroboplodných nesporulujících
mikroorganismů v mléce nejvíce odolné vůči záhřevu, lze předpokládat, že ostatní
nesporulující mikroorganismy budou také devitalizovány. Mírné zvýšení pasterační
teploty a času na 20 – 30 sekund zajistí inaktivaci tepelně odolnějších kmenů Listeria
monocytogenes, Cympylobacter spp. a Escherichia coli (Görner a Valík, 2004; Şenel
a Gürsoy, 2015).
26
3.3.1.1 Mikrobiologie pasterovaného mléka
Mikrobiologická kvalita pasterovaného mléka je ovlivněna mikroflórou syrového
mléka. Není-li mléko před tepelným ošetřením řádně chlazeno, dochází k rozvoji
nežádoucí mikroflóry, která svou činností způsobuje vady mléka a zkracuje jeho
trvanlivost. Negativně ovlivňují kvalitu syrového mléka například bakterie mléčného
kvašení, které vytváří kyselinu mléčnou. Ačkoliv tepelným ošetřením se
mikroorganismy usmrcují, jejich produkty mohou pokračovat v kažení mléka
i po záhřevu. Toto kažení mohou vyvolávat například enzymy, jejichž aktivita nebyla
narušena pasterací. Na nežádoucích změnách mléka se podílí i mikroorganismy, které
přežívají pasterační záhřev (Boor a Murphy, 2002; Görner a Valík, 2004).
Negativní vliv na mikrobiologickou jakost pasterovaného mléka mají také mléčné
zbytky, které ulpívají na povrchu zařízeních používaných v prvovýrobě. Tyto mléčné
usazeniny jsou rozkládány bakteriemi na vodorozpustné štěpné produkty (peptidy
až aminokyseliny), které se dostávají do mléka. Jejich aktivita není pasterací narušena.
Nepříznivý efekt vodorozpustných štěpných produktů na mikrobiologickou jakost
spočívá v podpoře růstu a metabolismu termorezistentních bakterií a mikroorganismů,
které kontaminovaly mléko po tepelném ošetření (Görner a Valík, 2004).
Pasterací mléka dochází k usmrcení vegetativních forem všech patogenních
mikroorganismů a většiny ostatní mikroflóry. Ničí se kvasinky, mikromycety
a koliformní mikroorganismy. Z hlediska celkového počtu mikroorganismů je
v pasterovaném mléce tím větší počet, čím vyšší množství mikroorganismů bylo
před záhřevem (Tančinová a kol., 2012). Görner a Valík (2004) však uvádí, že celkový
počet mikroorganismů v pasterovaném mléce není přímo úměrný celkovému počtu
v syrovém mléce, ale je úměrný počtu termorezistentních bakterií nacházejících se
v tepelně neošetřeném mléku. Své tvrzení odůvodňují tím, že počet termolabilních
laktokoků je v syrovém mléce vyšší než počet termorezistentních enterokoků. Laktokoci
se totiž nachází v logaritmické fázi růstu a jsou tedy citlivější vůči záhřevu než
enterokoci, kteří jsou v lag-fázi. Příslušníci rodu Enterococcus se v mléce při teplotě
15 – 20 °C množí pomalu. Potom lze konstatovat, že pasterační efekt je vyšší u mléka
s vysokým obsahem bakterií než u mléka s nízkým obsahem. Pasterační efekt závisí
27
kromě na převládajícím druhu mikroorganismů také na zvolené výšce teploty a době
jejího působení. Po pasteraci je v mléku přítomno obvykle
500 – 10000 KTJ/ml (Görner a Valík, 2004).
Z tepelně ošetřeného mléka lze izolovat aerobní sporotvorné mikroorganismy, jako
je Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus. Dále některé termorezistentní
mikroorganismy (Streptococcus bovis, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus,
Microbacterium lacticum, Enterococcus faecalis, Micrococcus, Staphylococcus,
Sarcina) a anaerobní sporotvorné mikroorganismy Clostridium butyricum, Clostridium
sporogenes a Clostridium perfingens, jak uvádějí Tančinová a kol. (2012).
Rod Bacillus
Zástupci rodu Bacillus jsou grampozitivní, rovné tyčinky různé délky pohybující se
pomocí bičíků. Tvoří velmi rezistentní endospory oválného nebo kulatého tvaru, které
jim umožňují přežít nepříznivé podmínky až po dobu několika let. Mikroorganismy jsou
aerobní nebo fakultativně anaerobní. Produkují amylolytické, pektolytické
a proteolytické enzymy, které jim umožňují rozkládat nejrůznější organické látky.
Někteří zástupci tvoří antibiotka. Pro většinu zástupců je optimální teplota růstu
30 – 37 °C (například Bacillus cereus, Bacillus subtilis). Některé bakterie jsou schopny
růst při teplotě 45 – 55 °C (například Bacillus stearothermophilus, Bacillus
licheniformis) a řada zástupců je psychrotrofní (Bacillus weihenstephanensis) s růstem
při 4 – 6,5 °C (Kulovaná, 2001; Šilhánková, 2002; Sedláček, 2007).
Zdrojem kontaminace syrového mléka je dojící zařízení, podestýlka, hnůj, voda,
půda a siláže. Zástupci rodu Bacillus jsou zodpovědní za kažení syrového,
pasterovaného a UHT mléka. Ze syrového kravského mléka byly izolovány druhy
Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus luteus, Bacillus
weihenstephanensis a další. V tepelně ošetřeném mléce se nachází Bacillus cereus,
Bacillus licheniformis a Bacillus subtilis (Kulovaná, 2001; Marth a Steele, 2001).
Kažení tepelně ošetřeného mléka vyvolávají enzymy, které jsou záhřevem jen
částečně inaktivovány. Je-li mléko ošetřeno teplotou 70 °C po dobu 10 minut, aktivita
lipolytických enzymů zůstává v závislosti na kmenu v rozmezí 42 – 99 %. Lipázy jsou
příčinou žluklé pachuti. Proteasy mikroorganismů jsou vůči záhřevu citlivější.
28
Ošetřením mléka teplotou 72 °C po dobu 2 minut si zachovávají 50 % původní aktivity.
U tekutých mléčných výrobků mohou být tyto enzymy příčinou houstnutí, hořknutí,
gelovatění a srážení (Němečková a kol., 2010).
Bacillus cereus
Bacillus cereus se běžně vyskytuje v prostředí. Je přítomný v půdě, prachu,
na rostlinách a přirozeně se vyskytuje i v trávicím traktu některých živočichů. Tudíž je
kontaminace potravin tímto mikoorganismem velmi pravděpodobná. Jeho spory
nacházející se v mléku přežívají pasteraci, která zároveň působí jako aktivátor jejich
klíčení. Spory se ničí UHT záhřevem psychrotrofní kmeny Bacillus cereus mohou
vyvolat kažení neasepticky baleného mléka, které je skladováno při chladírenských
teplotách. V mléku jim nekonkurují gramnegativní psychrotrofní mikororganismy
(Samková, 2012; Doyle a Buchanan, 2013).
„Některé jeho kmeny jsou pro lidi nebezpečné, neboť vyvolávají alimentární infekce
a gastrointestinální onemocnění, některé kmeny jsou naopak prospěšné a u zvířat působí
jako probiotika. Ve střevě soutěží B. cereus s ostatními mikroorganismy, např.
s bakteriemi Salmonella a Campylobacter, a redukuje tak jejich výskyt u hospodářských
zvířat, jako jsou kuřata, králíci nebo prasata“ (Julák, 2012).
Bacillus cereus vyvolává u lidí tvorbou toxinů dva typy onemocnění. Jedná se
o emetický a diarhogenní syndrom. Příčinou emetického syndromu je enterotoxin
cereulid, který není produkován všemi kmeny, ale pouze některými. Tento toxin se již
nachází v potravině, kterou člověk konzumuje. Při pasteraci nedochází k jeho inaktivaci,
protože snese teplotu 121 °C po dobu 90 minut. Odolává i proteolytickým enzymům
a snese pH 2 – 11. K onemocnění může dojít konzumací kontaminovaných potravin,
které mají vysoký obsah škrobu (rýže, těstoviny) a které nebyly skladovány při teplotě
bránící vyklíčení spor (pod 4 °C). Emetický syndrom se projevuje zvracením
a nevolností. Příznaky otravy se objevují za 0,5 – 6 hodin po konzumaci a během
24 hodin odeznívají (Julák, 2012; Samková, 2012).
Mléko může být také zdrojem diarhogenních kmenů, které produkují toxiny až
v tenkém střevě. Zde Bacillus cereus tvoří nehemolytický enterotoxin, hemolysin BL
a cytotoxin K. Diarhogenní syndrom se projevuje vodnatým průjmem, nevolností
29
a křečemi v břiše za 8 – 16 hodin po požití kontaminované potraviny a poté za
12 – 24 hodin příznaky odeznívají. Vzniku onemocnění lze zabránit správnou přípravou
pokrmů a jejich skladováním při chladírenských teplotách (Samková, 2012).
Na kažení pasterovaného mléka se Bacillus cereus podílí svými proteolytickými
enzymy, které štěpí kasein bez vzniku kyselin. Tato vada se označuje jako sladké
srážení mléka. Enzymem lecitáza narušuje membránu tukových globulí, čímž dochází
až k srážení smetany (Navrátilová a kol., 2012).
Rod Enterococcus
Zástupci rodu Enterococcus jsou grampozitivní bakterie, které se vyskytují
ve shlucích, po dvou nebo v krátkých řetízcích. Mikroorganismy jsou fakultativně
anaerobní a vyžadují média bohatá na živiny. Sacharidy rozkládají na kyselinu mléčnou
bez současné tvorby plynu. Optimální teplota pro jejich růst je 37 °C. Dokážou však
růst při 10 °C i 45 °C. Snesou 6,5 % NaCl a pH 9,6. Vyznačují se i termorezistencí.
Záhřevem na 60 °C po dobu 30 minut se nedevitalizují (Sedláček, 2007; Bursová a kol.,
2014).
Pro svůj častý výskyt ve střevním traktu člověka a zvířat byly bakterie vyčleněny
z rodu Streptococcus a zařazeny do nového rodu. Do mléka se dostávají z krmiva,
prachu, vody, povrchu vemene anebo z oděvu dojiče. V syrovém mléce je enterokoků
0 – 50 % z celkové mikroflóry. Díky termorezistenci mohou tyto mikroorganismy přežít
pasterační záhřev a kontaminovat pasterované mléko. Nejčastějším zástupcem
nacházejícím se v pasterovaném mléku je Enterococcus faecium. Dalším významným
zástupcem pro mlékárenský průmysl je Enterococcus faecalis (Šilhánková, 2002;
Fabiánová a kol., 2010).
Zástupci se řadí mezi indikátorové mikroorganismy. Jsou-li přítomny
v pasterovaném mléku, signalizují, že pasterace a další technologické operace nebyly
správně provedeny. Dále se uplatňují jako indikátory fekálního znečištění vody (Görner
a Valík, 2004; Bursová a kol., 2014).
Pro lidské zdraví představují enerokoky nebezpečí, protože jsou rezistentní vůči
poměrně velkému množství antibiotik a jsou schopny přežívat v nepříznivých
podmínkách. Odolnost vůči širokému spektru antibiotik je podpořena navíc schopností
výměny genetického materiálu. Enterokoky jsou rezistentní vůči glykopeptidům,
30
aminoglykosidům či tetracyklinům (Fabiánová a kol., 2010). Fabiánová a kol. (2010)
uvádí, že enterokoky, které byly izolovány ze syrového mléka, měly největší rezistenci
vůči tetracyklinu. Naopak nejcitlivější byly na teikoplanin.
Rod Micrococcus
Zástupci rodu Micrococcus jsou přísně aerobní, nesporulující, nepohyblivé,
grampozitivní koky, které jsou uspořádany ve dvojicích, čtveřicích nebo ve shlucích.
Nevyskytují se v řetízcích. Optimální teplota růstu je 25 – 37 °C. Ve svých buňkách
obsahují karotenoidní barviva, která vytváří na solených potravinách oranžové, žluté až
růžové kolonie. Tyto pigmenty mají ochrannou funkci vůči ultrafialové složce
slunečního záření (Šilhánková, 2002; Sedláček, 2007).
Mikroorganismy se vyskyují na kůži člověka a zvířat. Přítomny jsou i v půdě, vodě,
a ve vzduchu. Neřadí se mezi patogenní mikroorganismy. V pasterovaném mléce jsou
kmeny příčinou slizovitosti (Sedláček, 2007; Samková, 2012).
3.3.1.2 Rekontaminace pasterovaného mléka
K rekontaminaci pasterovaného mléka dochází v regenerátoru, chladiči, potrubí,
zásobních tancích a plnících zařízeních. Typickými zdroji kontaminace jsou pastéry
a plnící zařízení. Častou příčinou rekontaminace je jejich nedostačná sanitace nebo
porucha. Příčinou kontaminace tepelně ošetřeného mléka mohou být také
mikroorganismy pocházející ze vzduchu či vody (Boor a Murphy, 2002; Görner
a Valík, 2004).
Kontaminující mikroflóra mléka, které bylo ošetřeno pasterací, se skládá zejména
z grampozitivních psychrotrofních tyčinek. Tyto mikroorganismy jsou schopny
rozmnožovat se při chladírenských teplotách a zvyšovat tak své počty v mléce až
do jeho konzumace. Rekontaminací se do mléka dostávají zástupci rodu Pseudomonas,
psychrotrofní kmeny rodu Bacillus a koliformní bakterie (Görner a Valík, 2004).
Indikátorem rekontaminace pasterovaného mléka jsou koliformní bakterie, které se
pasterací ničí. Zástupci rodu Pseudomonas se nachází na povrchu technologických
zařízení, u kterých nebyla provedena správná sanitace. Účinnost sanitace snižují
mikroskopické trhliny, které se nachází na povrchu nádrží. Na kažení mléka se
pseudomonády podílí tvorbou lipáz, proteáz a pigmentů. Jsou příčinou ovocné, hořké
31
a žluklé příchuti mléka. Za přítomnosti kyslíku jsou schopny se rozmnožovat
i při nízkých teplotách. Z pasterovaného mléka byly izolovány Pseudomonas fragi,
Pseudomonas putida, Pseudomonas maltophilia a Pseudomonas fluoroscens.
V přítomnosti pseudomonád se vyskytují i psychrotrofní kmeny rodu Flavobacterium,
Alcaligenes a Aeromonas. Kmeny rodu Aeromonas jsou zodpovědné za rybí příchuť
mléka, která je způsobena tvorbou trimethylaminu. Rekontaminací se do mléka
dostávají také nekulturní druhy Streptococcus salivarius ssp. thermophilus.
Při prodloužení doby pasterace se mohou tyto mikroorganismy zachytit v pasteračních
zařízeních, dále se rozmnožovat a kontaminovat mléko (Boor a Murphy, 2002; Görner
a Valík, 2004; Şenel a Gürsoy, 2015).
3.3.2 ESL mléko
ESL mléko je obvykle ošetřeno teplotou 120 – 130 °C po dobu 1 – 4 sekund.
Trvanlivost mléka se bleskovým záhřevem prodlouží až na 21 dnů. Musí být však
skladováno při chladírenských teplotách (8 °C). Produkt se ze senzorického hlediska
podobá čerstvému mléku. Zkažení výrobku mohou vyvolat psychrotrofní
mikroorganismy. I při nízkém počtu psychtrofních druhů rodu Bacillus spp. může dojít
ke zkažení mléka po pár týdnech, přestože je skladováno za běžných podmínek
(Tamine, 2009; Šustová a Sýkora, 2013).
Po ošetření mléka ESL záhřevem (127 °C, 5 sekund) byl izolován Bacillus
licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Brevibacillus brevis a Bacillus pumilus.
Při teplotě 8 °C roste pouze Bacillus cereus. Patogenita některých jeho kmenů
představuje zdravotní riziko pro konzumenty. Na kažení ESL mléka se nejčastěji podílí
grampozitivní nesporulující bakterie z rodů Microbacterium, Entererococcus,
Arthrobacter, Micrococcus či Staphylococcus (Tamine, 2009).
Prostřednictvím obalových materiálů může být mléko kontamoniváno plísněmi rodu
Penicillium a aerobními sporulujícími bakteriemi Bacillus megaterium, Bacillus cereus
či Paenibacillus macerans. Výskyt gramnegativních bakterií, které se do mléka dostaly
rekontaminací, je méně častý v porovnání s pasterovaným mlékem (Tamine, 2009;
Şenel a Gürsoy, 2015).
32
3.3.3 UHT mléko
UHT záhřevem se v mléce ničí včechny vegetativní buňky včetně spor. Přežít
mohou některé velmi termorezistentní spory. Účinek tohoto tepelného ošetření má
za následek dlouhou trvanlivost mléka a skladování při pokojových teplotách. Negativní
efekt spočívá ve změně senzorických vlastností. Dochází například k hnědnutí mléka
(Fernandes, 2009).
Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky,
mražené krémy a jedlé tuky a oleje, definuje vysokotepelné ošetření (UHT) jako tepelné
ošetření mléka a mléčných výrobků krátkodobým záhřátím nepřerušovaného proudu
mléka na vysokou teplotu odpovídající účinku zahřátí na teplotu nejméně 135 °C
po dobu nejméně 1 sekundy, s následným aseptickým balením do neprůsvitných obalů
tak, aby chemické, fyzikální a smyslové změny byly sníženy na minimum. Nařízení
Komise (ES) č. 1662/2006, kterým se mění nařízení Evropského parlamentu a Rady
(ES) č. 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny
živočišného původu, požaduje, aby ve výrobku ošetřeném UHT záhřevem nebyly
žádné živé mikroorganismy ani spory schopné růstu v prostředí aseptické uzavřené
nádoby při pokojové teplotě. Přičemž výrobky musí zůstat mikrobiologicky stabilní
po patnáctidenní inkubaci při 30 °C v uzavřených nádobách nebo po sedmidenní
inkubaci při 55 °C v uzavřených nádobách nebo po jakékoliv jiné metodě prokazující,
že bylo použito vhodné tepelné ošetření.
3.3.3.1 Mikrobiologie UHT mléka
Cílem UHT záhřevu je dosáhnout praktické sterility mléka. Ošetřený produkt by
neměl obsahovat mikroorganismy schopné růstu během skladování při teplotách
pod 30 °C. UHT záhřev mohou přežít spory některých zástupců rodu Bacillus. Jedná se
o Bacillus stearothermophilus, který byl přejmenován na Geobacillus
stearothermophilus. Dále lze z UHT mléka izolovat Bacillus megaterium, Bacillus
subtilis a Bacillus sporothermodurans. Kažení UHT mléka může být vyvoláno
proteolytickými a lipolytickými enzymy, ktreré produkují psychrotrofní
mikroorganismy v syrovém mléce. Působením enzymů vznikají vady mléka jako je
hořká, žluklá chuť nebo gelovatění (Fernandes, 2009; Tamine, 2009; Julák, 2012;
Šustová a Sýkora, 2013).
33
Tepelná odolnost spor není dosud zcela objasněna. Vysoká rezistence bývá
spojována s dehydratací protoplastů, adaptací na teplo a mineralizací. Množství vody
ve spoře může být snižováno tvorbou dipikolinátu vápenatého a kortexu.
Je-li v prostředí při sporulaci nízký obsah vápníku, omezuje se tvorba dipikolinátu
a také se snižuje termorezistence. Tepelná odolnost spor je podporována zvýšenou
teplotou během sporulace, ale pouze do určité hranice. Po jejím překoročení se buď
sporulace naruší nebo vzniklé spory mají sníženou odolnost. Ke zvýšení
termorezistence napomáhá nejspíše také zvýšený obsah lipidů v obalových vrstvách
spor (Šilhánková, 2002; Jay a kol., 2005).
Bacillus sporothermodurans
Bacillus sporothermodurans byl poprvé izolován z UHT mléka v roce 1990
v Německu. Jeho spory vykazují vyšší rezistenci při teplotách nad 130 °C než spory
jiných druhů náležíjících do rodu Bacillus. Termorezistenci zvyšuje také tuk přítomný
v mléce. Lipidové molekuly obklopují spory a poskytují jim tak ochranu. V tepelně
ošetřeném produktu mohou spory po záhřevu vyklíčit a negativě ovlivňovat trvanlivost
výrobku. Pokojová teplota, při které se UHT mléko skladuje, vyhovuje růstovým
podmínkám této bakterie. Bacillus sporothermodurans však není považován
za patogenní mikroorganismus. Použití vyšší teploty a času za účelem zničení jeho spor
by vedlo k negativnímu ovlivnění senzorické a nutriční hodnoty mléka. Produkt by
vykazoval vařivou chuť a Maillardova reakce by zapříčinila snížení výživové hodnoty
proteinů. Bacillus sporothermodurans se v UHT mléku nachází zpravidla v množství
do 105/ml (Fernandes, 2009; Tamine, 2009; Neumann a kol., 2010; Tabit a Buys, 2011).
Studie Tabit a Buys (2011) se zabývala porovnáváním počtu spor v případech, kdy
mléko bylo buď ošetřeno jen UHT záhřevem nebo bylo kromě tepelného ošetření
použito i chlazení mléka po dobu 24 hodin při teplotě 7 °C. Před UHT záhřevem bylo
v mléku přítomno 7,40 log KTJ/ml. V případě, kdy mléko prošlo pouze tepelným
ošetřením, se snížil počet spor na 2,25 KTJ/ml. V kombinaci záhřevu s chlazením došlo
k inaktivaci spor až na hranici, kdy je nebylo možné detekovat.
Tabit a Buys (2011) dále uvádí, že počty spor Bacillus sporothermodurans
v UHT mléku lze ovlivnit dobou působení 30% peroxidu vodíku, který se používá
ke sterilizaci obalů. Na obalovém materiálu peroxid nezanechává rezidua a neovlivňuje
34
vůni produktu. Spory jsou vůči němu méně citlivé než vegetativní buňky. Výzkum
zjistil, že s každým tříminutovým zvýšením doby působení 30% peroxidu vodíku,
dochází k lineárnímu snížení počtu spor. Při tříminutovém působení bylo detekováno
4,84 log KTJ/ml a při patnáctiminutovém působení peroxidu vodíku se snížil počet
na 1,67 log KTJ/ml.
3.3.3.2 Rekontaminace UHT mkéka
Jednou z možných příčin rekontaminace UHT mléka je porucha těsnosti
technologického zařízení určeného k tepelnému ošetření a plnění. Dojde-li k poruše
v aseptické části zařízení, mohou být v mléku přítomny laktokoky, enterobakterie,
streptokoky či achromobakterie. Nedostatečná sanitace balící části linky se může také
podílet na rekontaminaci. Ke zkažení mléka může také dojít kvůli netěsnosti svarů.
Skrze malé otvory je mléko vytlačováno na povrch obalu, kde je kontaminováno
bakteriemi z prostředí. Po rozmnožení se mohou bakterie dostat do mléka v obalu
(Görner a Valík, 2004).
Z kontaminovaného vzduchu v plnících zařízeních se do UHT mléka může dostat
Fusarium oxysporum. Plíseň produkuje plyn a je příčinou vůně podobné vůni sýrů
s modrou plísní. Tento organismus se stěží odstraňuje z kontaminovaného plnícího
zařízení (Tamine, 2009).
3.4 Boj proti nežádoucím mikroorganismům
3.4.1 Chlazení
Rozmnožování kontaminujících mikroorganismů v syrovém mléce se zabraňuje
chlazením. Po nadojení se teplota mléka pohybuje kolem 33 °C a nejpozději
do 150 minut by mělo mít mléko požadovanou teplotu (Samková, 2012). Nařízení
Komise (ES) č. 1662/2006, kterým se mění nařízení Evropského parlamentu a Rady
(ES) č. 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny
živočišného původu, požaduje aby mléko, které je sváženo každý den, bylo vychlazeno
na teplotu nejvýše 8 °C a v případě, kdy svoz není prováděn každý den na teplotu
nejvýše 6 °C. Dle nařízení nesmí teplota mléka během přepravy přesáhnout 10 °C.
35
Chlazení zpomaluje růst mezofilních a temofilních mikroorganismů a současně
snižuje aktivitu enzymů. Při teplotě pod 10 °C bakterie mléčného kvašení nerostou,
nerozkládají laktózu a mléko tudíž nekysne. Nízká teplota je však ideální
pro rozmnožování psychrotrofních bakterií, které mají proteolytické a lipolytické
schopnosti (Marth a Steele, 2001; Görner a Valík, 2004).
Mléko je na farmách chlazeno v úchovných chladících nádržích. Nejčastěji se
používají duplikátorové tanky z nerezové oceli. Nádrže jsou opatřeny rotačním
míchadlem, které zabraňuje vyvstávání tuku. Je-li v jedné nádrži skladováno mléko, jak
z ranního, tak večerního dojení, je zapotřebí chladit mléko v předchladiči, aby nedošlo
ke zvýšení počtu mikroorganismů (Samková, 2012).
3.4.2 Pasterace
Při pasteraci mléka se používají nejčastěji tři druhy záhřevu. Rozlišuje se pasterace
dlouhodobá, šetrná a vysoká. Dlouhodobá pasterace probíhá při teplotě 63 – 65 °C
po dobu 30 – 20 minut, šetrná při teplotě 71 – 74 °C po dobu 20 – 30 sekund a vysoká
pasterace trvá několik sekund při 85 °C. Správnost provedení vysoké pasterace dokládá
enzym laktoperoxidáza, který je tímto záhřevem inaktivován. K ověření účinnosti
dlouhodobé a šetrné pasterace se využívá stanovení aktivity alkalické fosfatázy. Tento
enzym, který má nepatrně vyšší rezistenci vůči záhřevu než Mycobacterium
tuberculosis, musí být pasterací inaktivován (Šustová a Sýkora, 2013; Janštová
a Navrátilová, 2014).
Pasterace mléka se provádí v kotlových, trubkových nebo deskových pastérech.
K tepelnému ošetření mléka se nejvíce využívá deskový pastér. Toto zařízení umožňuje
ohřívání a chlazení mléka vzájemnou výměnou tepla. Deskový pastér je tvořen
tvarovanými deskami z nerezového ocelového plechu, které jsou vzájemně spojeny
gumovým těsněním (Šustová a Sýkora, 2013; Janštová a Navrátilová, 2014).
„V prostorách mezi deskami prochází po jedné straně desky zahřívaná kapalina
a po druhé straně v protisměru ohřívací kapalina. Obdobná situace je i při chlazení
mléka“ (Janštová a Navrátilová, 2014). K ohřevu se používá mléko, pára nebo horká
voda. Chlazení se provádí mlékem nebo ledovou vodou (Janštová a Navrátilová, 2014).
První sekcí deskového pastéru je první regenerační fáze, kde se mléko předehřívá
na teplotu 40 – 45 °C. Následně mléko přechází na odstředivku, kde se odděluje
36
smetana, která je pasterována samostatně. V druhém stupni regenerátoru je mléko
přicházející z odstředivky zahřáto zpasterizovaným mlékem na teplotu 60 – 65 °C.
K vlastní pasteraci dochází v pasterační sekci. K záhřevu se používá horká voda.
Následně je pasterované mléko odváděno zpět do druhé a první regenerační fáze.
Z druhé strany desek je využito k ohřevu syrového mléko a současně je syrovým
mlékem chlazeno. Vzájemnou výměnou tepla je dosaženo zlepšení ekonomiky (Šustová
a Sýkora, 2013; Janštová a Navrátilová, 2014).
3.4.3 Ultratepelné ošetření mléka
Ultratepelné ošetření méka (UHT) se provádí přímým nebo nepřímým ohřevem.
Nepřímý ohřev se provádí pomocí deskových nebo trubkových výměníků. Přímý ohřev
spočívá v smísení syté páry o vysokém tlaku s předehřátým mlékem. Mléko se
předehřívá v regenerátorech na teplotu kolem 80 °C. Samotný ohřev probíhá v těsně
uzavřených nádržích dvojím způsobem. Buď je mléko vstřikováno do nasycené páry,
potom se jedná o palarizaci, nebo je pára vstřikována do mléka, potom se jedná
o uperizaci. Zkondenzovaná pára ihned předá teplo mléku, čímž dojde k jeho zahřátí
na požadovanou teplotu. Zkapalněná pára způsobí, že se mléko částečně zředí. Mléko je
chlazeno ve vakuové komoře, kde je teplota o 2 – 3 °C vyšší než byla teplota
předehřívaného mléka. Díky tomu dojde k odpaření zkapalněné páry a mléko bude mít
svoji původní sušinu (Šustová a Sýkora, 2013; Janštová a Navrátilová, 2014).
3.4.4 Sanitace
Omezit či zabránit kontaminaci mléka mikroorganismy, které vyvolávají
onemocnění nebo jeho kažení, v prvovýrobě nebo mlékárně lze zabránit důkladným
čištěním technologických zařízeních. Čištění je prvním krokem sanitace, během kterého
se odstraňují zbytky anorganických a organických látek. Mléčné usazeniny mohou
poskytovat mikroorganismům ochranu vůči dezinfekčním prostředkům.
Při nedokonalém odstranění nečistot lze na povrchu zařízení pozorovat biofilmy. Jelikož
bakterie přítomné v biofilmu mohou mít výrazně odlišné vlastnosti než bakterie téhož
druhu vyskytujících se v planktonické formě, představují riziko pro bezpečnost
37
potravin. Při procesu čištění se používají alkalické přípravky, které odstraňují organické
látky, a přípravky kyselé, které odstraňují anorganické látky (Kunová a kol., 2009;
Tamine, 2009; Samková, 2012; Janštová a Navrátilová, 2014).
Druhým krokem sanitace je dezinfekce, jejíž cílem je zničení patogenních
mikroorganismů a redukce ostatní nežádoucí mikroflóry. Při dezinfekci se používají
přípravky, jejichž aktivní složkou je chlór. Po aplikaci je nutný oplach pitnou vodou
(Samková, 2012; Janštová a Navrátilová, 2014).
3.4.5 Další možnosti boje
V boji proti nežádoucím mikroorganismům se uplatňují další metody, mezi něž lze
zařadit přídavek oxidu uhličitého, nisinu, baktofugaci a mikrofiltraci. Inhibiční účinek
oxidu uhličitého spočívá ve vytěsnění kyslíku, potlačení tvorby mikrobiálních enzymů
a také ve snižení pH mléka díky tvorbě kyselině uhličité. Kyselina uhličitá působí proti
psychrotrofním mikroorganismům, koliformním bakteriím a bakteriím mléčného
kvašení. Do syrového mléka se oxid uhličitý přidává v koncentraci 20 – 30 mmol/l.
Přídavek do pasterovaného mléka by mohl představovat riziko z hlediska tvorby toxinu
bakterií Clostridium botulinum (Fernandes, 2009; Tamine, 2009).
Jednou z dalších metod je přídavek bakteriocinu nisin, který je produkován
Lactococcus lactis subsp. lactis. Nisin působí proti grampozitivním bakteriím a sporám.
Neúčinný je proti gramnegativním bakteriím a kvasinkám. K odstraňování bakterií
z mléka se používá také baktofugace. Pomocí odstředivé síly jsou bakterie a těžší složky
předehřátého mléka hnány ke stěně bubnu, odukud se přesouvají do odlučovače.
Oddělený boktofugát je sterilizován, zchlazen a posléze může být smíchán s mlékem.
Baktofugací lze z mléka odstranit 95 – 99 % sporotvorných bakterií a jejich spor
(Tamine, 2009; Janštová a Navrátilová, 2014).
V boji proti mikroorganismům lze také uplatnit mikrofiltraci. Metoda umožňuje
odstranit z mléka bakterie a spory, aniž by došlo k jeho zahřátí. Mléko má delší
trvanlivost než pasterované, senzorická jakost zůstává nezměněna a přítomné enzymy
nejsou inaktivovány (Ečer a Kinčl, 2014).
38
4 MATERÁL A METODIKA
K experimentálnímu stanovení mikroorganismů bylo použito polotučné mléko.
Pro analýzu byly vybrány mléka od 3 privátních značek, které jsou běžně dostupné
na českém trhu. Od každé značky bylo zakoupeno mléko ošetřené pasterací a mléko
ošetřené UHT záhřevem. U jednotlivých vzorků se sledoval celkový počet
mikroorganismů, počet psychrotrofních mikroorganismů, počet termorezistentních
sporulujících aerobních a anaerobních mikroorganismů a obsah enterokoků.
4.1 Charakteristika vzorků
K analýze bylo použito celkem 6 vzorků polotučného mléka.
Vzorek č. 1: Trvanlivé mléko polotučné. Minimální trvanlivost do 20. 9. 2016.
Prodávající Kaufland Česká republika v.o.s.
Vzorek č. 2: Mléko polotučné, čerstvé, ošetřené vysokou pasterací. Minimální
trvanlivost do 20. 4. 2016. Prodávající Kaufland Česká republika v.o.s.
Vzorek č. 3: Trvanlivé mléko polotučné. Minimální trvanlivost do 23. 9. 2016. Výrobce
Mlékárna Pragolaktos, a.s., značka Pilos.
Vzorek č. 4: Mléko čerstvé polotučné, vysoce pasterované. Spotřeba do 24. 4. 2016.
Výrobce Mlékárna Čejetičky, spol. s.r.o, značka Pilos.
Vzorek č. 5: Trvanlivé mléko polotučné. Minimální trvanlivost do 30. 7. 2016.
Výrobce Madeta a. s., značka AH Basic.
Vzorek č. 6: Čerstvé mléko polotučné pasterované. Spotřeba do 26. 4. 2016. Výrobce
Moravia Lacto a.s, značka AH Basic.
39
4.2 Metodika
K analýzám byly použity originálně uzavřené vzorky mléka. Před odběrem byla
nádoba s mlékem intenzivně protřepána a za sterilních podmínek otevřena. Do sterilních
Petriho misek byl naočkován vzorek mléka v množství 1 ml nebo 0,1 ml. Pro stanovení
sporulujících aerobních a anaerobních mikroorganismů se mléko před očkováním
zahřálo na pasterační teplotu 85 °C po dobu 10 min. Po zaočkování bylo inokulum
zalito příslušným živným médiem. Pro stanovení psychrotrofních, sporulujících
aerobních a anaerobních mikroorganismů a celkového počtu mikroorganismů byla
použita živná půda PCA se sušeným odstředěným mlékem. Pro entorokoky byla využita
živná půda Slantez - Bartley agar. Po ztuhnutí živné půdy proběhla kultivace.
Při stanovení celkového počtu mikroorganismů probíhá kultivace po dobu 72 hodin
při 30 °C. Pro stanovení entorokoků byla použita teplota 37 °C s kultivací 72 hodin.
Termorezistentní mikroorganismy se kultivují při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin.
Psychrotrofní mikroorganismy se kultivují při teplotě 22 °C po dobu 48 hodin.
Po skončení kultivace byly odečteny výsledky. Na Petriho miskách byly spočítány
kolonie. Počet mikroorganismů vyjádřený v KTJ/ ml byl zjištěn podle vzorce:
N.........počet kolonií tvořících jednotku v 1 ml (KTJ/ml)
∑C......suma kolonií ze všech Petriho misek od příslušné skupiny mikroorganismů
V.........objem inokula
d..........první použité ředění
n1, n
2...počet misek z prvního a druhého ředění
40
N=∑ C
V .d . (n1+0,1.n2)
Složení živných půd
Plate count agar with skimmed milk
Složení:
V 1 média:
Trypton................................5,0 g
Kvasničný extrakt................2,5 g
Glukóza................................1,0 g
Sušené odstředěné mléko.....1,0 g
Agar....................................12,0 g
Příprava:
Dehydratovaný agar v množství 21,5 g se rozpustí v destilované vodě. Úplného
rozpuštění se dosáhne pomalým zahříváním k varu za stálého míchání. Půda se steriluje
v autoklávu po dobu 15 minut při teplotě 121 °C. U agaru se upravuje pH při teplotě
25 °C na 7,0 ± 0,2.
Výrobce: Biokar Diagnostics
Slanetz and Bartley agar
Složení:
tryptóza..........................................20 g/l
Kvasničný extrakt............................5 g/l
Glukóza............................................2 g/l
Difosfát sodný..................................4 g/l
Azid sodný.....................................0,4 g/l
Agar................................................10 g/l
2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid....0,1 g/l
Příprava:
Půda v množství 41,5 g se rozpustí v 1 l destilované vody. Úplného rozpuštění se
dosáhne zahříváním ve vodní lázni. Následně se provádí sterilace. U agaru se upravuje
pH při teplotě 25 °C na 7,2 ± 0,1.
Výrobce: Merck
41
5 VÝSLEDKY A DISKUZE
Ve vzrorcích polotučného, tepelně ošetřeného mléka byly zjišťovány počty
psychrotrofních, sporulujících aerobních a anaerobních mikroorganismů, dále se
sledoval počet enterokoků a celkový počet mikroorganismů. Výsledky analýzy jsou
uvedeny v tabulkách č. 1 a č. 2.
Tabulka č. 1: Počet mikroorganismů ve vzorku trvanlivého mléka v KTJ/ml
Tabulka č. 2: Počet mikroorganismů ve vzorku pasterovaného mléka v KTJ/ml
Vysvětlivky:
CPM....celkový počet mikroorganismů
ND.......nedetekováno
Z výsledků analýzy je patrné, že pasterované mléko prodávané pod značkou
Kaufland, mělo nejnižší počet mikroorganismů. Görner a Valík (2004) uvádí, že
po pasteraci je v mléku přítomno obvykle 500 – 10000 KTJ/ml. Všechny analyzované
vzorky pasterovaného mléka měly podstatně nižší hodnoty. Nejvyšší CPM dosáhlo
trvanlivé mléko značky Pilos. Příčinou vyššího počtu mikroorganismů může být
rekontaminace. Z mlék ošetřených UHT záhřevem dopadlo z hlediska CPM nejlépe
mléko značky AH Basic. U všech vzorků byly ale CPM velice nízké.
Teoreticky by mělo mít nejnižší CPM trvanlivé mléko. Zjištěné hodnoty celkového
počtu mikroorganismů však poukazují na to, že lepší účinek tepelného ošetření
na mikroflóru syrového mléka měla pasterace než UHT záhřev. To je případ mlék
značek Kaufland a Pilos. Teoretický předpoklad byl dosažen pouze u mlék značky
AH Basic.
42
Trvanlivé Kaufland Trvanlivé Pilos Trvanlivé AH BasicCPM 2 6 2Psychrotrofní 3 8 3Enterokoky ND ND NDSporulující anaerobní ND 5 2Sporulující aerobní 1 1 1
Pasterované Kaufland Pasterované Pilos Pasterované AH Basic CPM 1 3 3Psychrotrofní 1 4 1Enterokoky ND ND NDSporulující anaerobní ND 2 3Sporulující aerobní 1 3 3
Z hlediska počtu psychrotrofních mikroorganismů je z tabulky č. 1 a č. 2 patrné, že
nejvyššího počtu bylo dosaženo ve vzorku trvanlivého mléka značky Pilos.
Z pasterovaných mlék, která dosahovala lepších výsledků než mléka trvanlivá, mělo
nejhorší výsledky taktéž mléko prodávané pod značkou Pilos. Psychrotrofní
gramnegativní bakterie přítomné v syrovém mléce pasteraci nepřežívají (Navrátilová
a kol., 2012). Jsou-li tyto mikroorganismy přítomnny v pasterovaném mléce, signalizují,
že došlo k pospasterační kontaminaci (Navrátilová a kol., 2012). Rekontaminací se
do mléka dostávají mikroorganismy rodu Pseudomonas a psychrotrofní kmeny rodu
Bacillus (Görner a Valík; 2004). Enzymy produkované těmito mikroorganismy mohou
způsobit kažení mléka (Tančinová a kol., 2012).
Termorezistentní aerobní a anaerobní mikroorganismy byly také detekovány téměř
ve všech analyzovaných vzorcích mléka. Vyšší počet sporulujících aerobních
mikroorganismů byl zjištěn v pasterovaném mléce značky Pilos a AH Basic. Sporulující
anaerobní mikroorganismy nebyly detekovány v mléku značky Kaufland.
Enterokoky nebyly přítomny ve všech analyzovaných vzorcích. Lze tedy konstatovat, že
pasterace a další technologické postupy byly provedeny správně. Neboť přítomnost
enterokoků v pasterovaném mléce signalizuje nedostatečnost těchto operací (Bursová
a kol., 2014).
43
6 ZÁVĚR
V praktické části bakalářské práce byla provedena analýza polotučného
pasterovaného a trvanlivého mléka. K rozboru bylo použito celkem 6 vzorků
od 3 privátních značek běžně dostupných na českém trhu. Ve vzrorcích byly zjišťovány
počty psychrotrofních, sporulujících aerobních a anaerobních mikroorganismů, dále se
sledoval počet enterokoků a celkový počet mikroorganismů.
Z výsledků analýzy je patrné, že celkové počty mikroorganismů ve všech vzorcích
pasterovaného mléka byly nízké. Tepelné ošetření bylo tedy provedeno správně.
Přítomnost psychrotrofních mikroorganismů může signalizovat rekontaminaci. Počty
jsou sice nízké, ale skladovací teplota výrobků je vhodná pro jejich růst a může tedy
docházet k navyšování počtů. Ve většině vzorcích mléka byly detekovány také
sporulující mikroorganismy. Nejlepších výsledků z pasterovaných mlék dosáhlo mléko
prodávané pod značkou Kaufland.
Trvanlivá mléka měla zpravidla vyšší počty mikroorganismů než mléka ošetřená
pasterací. Teoreticky měla dosahovat lepších výsledků. Přítomnost sporulujících
mikroorganismů by mohla představovat riziko pro lidské zdraví. Jedná se například
o kmen Bacillus cereus, který se může podílet i na kažení mléka. Dobrých výsledků
dosáhla trvanlivá mléka značky Kaufland a AH Basic.
44
7 POUŽITÁ LITERATURA
BOOR K. J., MURPHY S. C., 2002. Microbiology of market milks. In: ROBINSON R. K.,
ed. Dairy microbiology Handbook: The Microbiology of Milk nd Milk Products [online] 3rd.
John Wiley and Sons, s. 91 – 122. [cit. 2015-10-02]. ISBN: 0471-38596-4. Dostupné na:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471723959.ch3/pdf
BUŇKA F., PACHLOVÁ V., BUŇKOVÁ L., ČERNÍKOVÁ M., 2013: Mlékárenské
technologie I. Zlín: Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně. ISBN 978-80-7454-254-1.
BURSOVÁ Š., NECIDOVÁ L., DUŠKOVÁ M., 2014: Mikrobiologie potravin
a mikrobiologické laboratorní metody: obecná mikrobiologie. Brno: Veterinární
a farmaceutická univerzita Brno. ISBN: 978-80-7305-741-1.
DOYLE M. P., BUCHANAN R. L., 2013: Food microbiology. 4th ed. Herndon: ASM
Press. ISBN 978-1-55581-626-1.
EČER J., KINČL J., 2014: Membránové procesy v mlékárenském průmyslu.
Databáze online [cit. 2016-03-17]. Dostupné na:
http://www.mlekarskelisty.cz/upload/soubory/pdf/2014/145_i-iv.pdf
FABIANOVÁ J., DUCKOVÁ V., ČANIGOVÁ M., KROČKO M., 2010: Výskyt
enterokokov v kravskom mlieku a ich rezistencia na antibiotiká. Databáze online
[cit. 2016-03-04]. Dostupné na:
http://www.potravinarstvo.com/journal1/index.php/potravinarstvo/article/view/45/9
FERNANDES R. (ed.), 2009: Microbiology handbook: dairy products. Leatherhead:
Leatherhead Publishing. ISBN 978-1-905224-62-3.
GAJDŮŠEK S., 2003: Laktologie. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita
v Brně. ISBN 80-7157-657-3.
45
GÖRNER F., VALÍK L´, 2004: Aplikovaná mikrobiológia poživatin. Bratislava: MALÉ
CENTRUM. ISBN: 80-967064-9-7.
HLADÍKOVÁ Z., SMETANKOVÁ J., GREIF G., GREIFOVÁ M., 2012: Characterization
of Lactococcus strains and their using in dairy technology. Databáze online [cit. 2016-02-
24]. Dostupné na:
http://www.potravinarstvo.com/journal1/index.php/potravinarstvo/article/view/162/166
JANŠTOVÁ B., VORLOVÁ L., NAVRÁTILOVÁ P., KRÁLOVÁ M., NECIDOVÁ L.,
MAŘICOVÁ E., 2012: Technologie mléka a mléčných výrobků. Brno: Veterinární
a farmaceutická univerzita Brno. ISBN 978-80-7305-635-3.
JANŠTOVÁ B., NAVRÁTILOVÁ P., 2014: Produkce mléka a technologie mléčných
výrobků. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. ISBN 978-80-7305-712-1.
JAY J. M., LOESSNER M. J., GOLDEN D. A., 2005: Modern Food Microbiology. 7th ed.
New York: Springer Science+Business Media. ISBN 0-387-23180-3.
JIČÍNSKÁ E., HAVLOVÁ J., 1995: Patogenní mikroorganismy v mléce a mlékárenských
výrobcích. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací. ISBN 80-85120-47-X.
JULÁK J. (přeložil), 2012: Klinicky významné bakterie. Praha: Triton.
ISBN: 978-80-7387-588-6.
KALHOTKA L., 2014: Potravinářská mikrobiologie pro zahradnickou fakultu. Brno:
Mendelova univerzita v Brně. ISBN: 978-80-7509-016-4.
46
KOPUNECZ P., 2016: Výsledky kvality nakupovaného mléka v roce 2015 podle analýz
bazénových vzorků. Databáze online [cit. 2016-03-19]. Dostupné na:
http://www.cmsch.cz/store/prehledy-jakosti-nakupovaneho-mleka-2015.pdf
KULOVANÁ E., 2001: Výskyt bakterií rodu Bacillus v syrovém, pasterovaném a UHT
mléce. Databáze online [cit. 2016-02-29]. Dostupné na: http://naschov.cz/vyskyt-bakterii-
rodu-bacillus-v-syrovem-pasterovanem-a-uht-mlece/
KVAPILÍK J., RŮŽIČKA Z., BUCEK P., a kol., 2015: Ročenka 2014. Chov skotu v České
republice. Databáze online [cit. 2016-03-19]. Dostupné na:
http://www.cmsch.cz/store/rocenka-chovu-skotu-2014.pdf
KUNOVÁ G., PECHAČOVÁ M., PEROUTKOVÁ J., ROUBAL P., JAGLIČ Z.,
PAZLAROVÁ J., 2009: Kontrola a monitorování úrovně a účinnosti sanitace
v mlékárenských provozech. Databáze online [cit. 2016-03-15]. Dostupné na:
http://www.mlekarskelisty.cz/upload/soubory/pdf/2009/116_s-_18-23.pdf
MARTH E. H., STEELE J. L., 2001: Applied dairy microbiology. 2nd ed. New York:
Marcel Dekker. ISBN: 0-8247-0536-X.
NAVRÁTILOVÁ P., KRÁLOVÁ (DRÁČKOVÁ) M., JANŠTOVÁ B.,
PŘIDALOVÁ H., CUPÁKOVÁ Š., VORLOVÁ L., 2012: Hygiena produkce mléka. Brno:
Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. ISBN 978-80-7305-624-7.
NĚMEČKOVÁ I., HANUŠOVÁ J., BUŇKA F., ROUBAL P., 2010: Nežádoucí
enzymové aktivity B. Cereus a B. Licheniformis v mléce. Databáze online
[cit. 2016-02-29]. Dostupné na:
http://www.mlekarskelisty.cz/upload/soubory/pdf/2010/123_s._x-xiii.pdf
47
NEUMANN F. D., SALVATORI R. U., MAJOLO C., FRÖDER H., 2010: Occurence of
Bacillus sporothermodurans in UHT Milk Commercialized in the State of Rio Grande Do
Sul, Brazil. Databáze online [cit. 2016-03-08]. Dostupné na:
http://www.idosi.org/gv/gv4(2)10/11.pdf
SAMKOVÁ E., 2012: Mléko: produkce a kvalita. České Budějovice: Jihočeská univerzita
v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, 240 s. ISBN 978-80-7394-383-7.
SEDLÁČEK I., 2007: Taxonomie prokaryot. Brno: Masarykova univerzita.
ISBN: 80-210-4207-9.
ŞENEL E., GÜRSOY A., 2015. Microbiology of Processed Liquid Milk. In: ÖZER B. H.,
AKDEMIR – EVRENDILEK G., eds. Dairy Microbiology and Biochemistry Recent
Developments [online]. CRC Press, s. 95 - 112. ISBN: 978-1-4822-3504-3.
[cit. 2015-10-02]. Dostupné na: http://www.crcnetbase.com/doi/pdfplus/10.1201/b17297-6
SEYDLOVÁ R., SNÁŠELOVÁ J., SOUKUPOVÁ A., 2009: Vliv obsahu Prototheca
zopfii a Candida lusitaniae na kvalitu syrového mléka. Databáze online [cit. 2016-02-26].
Dostupné na: http://www.mlekarskelisty.cz/upload/soubory/pdf/2009/112_s._15-22.pdf
ŠILHÁNKOVÁ L., 2002: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3rd ed. Praha:
Academia. ISBN: 80-200-1024-6.
TABIT F. T., BUYS E. M., 2011: Incidence and survival of Bacillus
sporothermodurans during processing of UHT milk. Databáze online [cit. 2016-03-08].
Dostupné na: http://repository.up.ac.za/bitstream/handle/2263/17113/Tabit_Incidence
%282011%29.pdf?sequence=1&isAllowed=y
48
TAMINE A. Y. (ed.), 2009: Milk Processing and Quality Management [online].
Malden: Blackwell Publishing Ltd. ISBN 978-1-405-14530-5 [cit. 2016-03-10]. Dostupné
na: http://www.foodtechnologist.yolasite.com/resources/Milk%20Processing%20and
%20Quality%20Management.pdf
TANČINOVÁ D., MAKOVÁ J., FELŠÖCIOVÁ S., KAČANIOVÁ M., KMEŤ V.,
2012: Mikrobiológia potravín. Nitra: Slovenská pol'nohospodárska univerzita v Nitre.
ISBN: 978-80-552-0904-3.
WALSTRA P., WOUTERS J. T. M. a GEURTS T. J., 2006: Dairy Science and
Technology. 2nd ed. Boca Raton: CRC Press, 782 s. ISBN: 0-8247-2763-0.
ČSN 57 0529 Syrové kravské mléko pro mlékárenské ošetření a zpracování
NAŘÍZENÍ EVROPSKÉHO PARLAMENTU A RADY (ES) č. 853/2004, kterým se
stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu.
NAŘÍZENÍ EVROPSKÉHO PARLAMENTU A RADY (ES) č. 2073/2005
o mikrobiologických kritériích pro potraviny.
NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1662/2006, kterým se mění nařízení Evropského
parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro
potraviny živočišného původu
VYHLÁŠKA č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky,
mražené krémy a jedlé tuky a oleje
49
