Nová mutace v genu Nová mutace v genu ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1 u nemocného s benigní rekurentní u nemocného s benigní rekurentní
intrahepatální cholestázouintrahepatální cholestázou
Jirsa M., Budišová L., Taimr P., Cebecauerová D., Dvořáková L., Hřebíček M.,
Brodanová M., Vítek L., Wurm P., Hůlek P.
Podpořeno grantem IGA MZ ČR reg.č. NM/ 7510-3
Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza Benigní rekurentní intrahepatální cholestáza (BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)(BRIC, syndrom Summerskill- Walsheův)
• Geneticky podmíněná intrahepatální cholestáza • Ataky žloutenky provázené úporným svěděním • Manifestace obvykle do konce 2. dekády, trvání ataky
týdny až řadu měsíců, počet atak 1 až 30 za život• Laboratorně hyperbilirubinémie, zvýšená aktivita ALP a
koncentrace sérových žlučových kyselin• Normální S-GMT a cholesterol • Prognóza většinou dobrá, asi 6% progreduje v cirhózu
Protein ATP8B1/FIC1Protein ATP8B1/FIC1
Exprimovaný v apikální membráně hepatocytů,cholangiocytů, enterocytů a acinárních buněkpankreatu, nízká exprese v řadě dalších tkání
Funkce neznámá, hypotézy:flipáza membránových fosfolipidůtransportér hydrofobních žlučových kyseliiontový kanál
Gen Gen ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1
• je lokalizovaný na 18q21, zaujímá 98kb• sestává z 27 exonů• kóduje ATPasu o MW 140 kDa
mutace exon důsledek zdroj
T1982C 17 I661T Bull 1998
2384del9 20 795delGNR Bull 1998
Splice site 24 Skipped exon van Ooteghem 2002
Mutace v genu Mutace v genu ATP8B1/FIC1 ATP8B1/FIC1 asociované s BRICasociované s BRIC
Pacient M.K. – anamnézaPacient M.K. – anamnéza
RA: negativní
• 1972 protrahovaná novorozenecká žloutenka• 1973 žloutenka po varicele, závěr nejasný, léčba kortikoidy• 1975 dvouměsíční ataka žloutenky• 1976 roční ataka, chir. revize žluč. cest bez patol. nálezu• 1990 po sinusitidě další ataka, vyloučena IHE, normální ERCP,
závěr nejasný, opět léčen kortikoidy • 1990-98 3x jaterní biopsie• 1998 další ataka, hosp. na Ústavu Klin. Imunologie LFHK
OA, NO:
Pacient M.K. – laboratorní nálezy, USG a ERCPPacient M.K. – laboratorní nálezy, USG a ERCP
• FW 50/86
• KO: anémie, leuko 12
• Hyperbilirubinémie, ALP 14,4 kat/l, celk. žluč. kyseliny 220 mol/l
• GMT a cholesterol opakovaně normální
• Fe, transferin, Cu, ceruloplasmin, alfa1-AT v normě
• Imunologická vyšetření v normě
• USG jater a žluč. cest bez patol. nálezu
• ERCP bez patol. nálezu
• 4. jaterní biopsie: intrahepatální cholestáza bez známek přestavby
Určení sekvence Určení sekvence ATP8B1/FIC1ATP8B1/FIC1zz genomové DNA genomové DNA
Izolace genomové DNA z periferních leukocytů
PCR amplifikace jednotlivých exonů
Agarosová elektroforéza
Izolace produktů z gelu
Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery
Sekvenování
M.K. – heterozygotní bodová mutace M.K. – heterozygotní bodová mutace v 17. exonu v 17. exonu ATP8B1ATP8B1
AGAAGTCAAAGGAACATCB ases 240241242243244245246247248249250251252253254255256
T1982T+C
ę
M.K. kontrola
...GCTACAAGGAAATTGAAGAAAAAGAATTTACA...
...CGATGTTCCTTTAACTTCTTTTTCTTAAATGT...
Tsp509ITsp509I
95 bp 14 bp
M.K. – heterozygotní delece ve 24. exonu M.K. – heterozygotní delece ve 24. exonu ATP8B1ATP8B1
G C A T G G G G W C M T M R C A K C T GB ases188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205206
Mutovaná alela: G G G G A C A T C G A T G ... Normální alela : G G G G T C C T A A C A T ...
del3122TCCTA
ę
...CTTGTTGCATGGGGTCCTAACATCGATGATC...
...GAACAACGTACCCCAGGATTGTAGCTACTAG...
M.K. kontrola
EcoO109I
715 bp 220 bp
Vyšetření rodinyVyšetření rodiny
Restrikční analýza delece v 24. exonuRestrikční analýza mutace v 17. exonu
MK
PeK PaK PV
Ověření sekvence exonu 24 genu Ověření sekvence exonu 24 genu ATP8B1/FIC1 zATP8B1/FIC1 z klonovaného fragmentu DNA klonovaného fragmentu DNA
PCR amplifikace exonu 24 z genomové DNA
Agarosová elektroforéza, izolace produktu
ligace do vektoru pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
Transformace buněk TOP10 (Invitrogen)
Kultivace transformovaných buněk, selekce klonů, izolace plasmidů
Sekvenační PCR s univerzálními značenými primery
Sekvenování
M.K. – sekvence mutované klonované alelyM.K. – sekvence mutované klonované alely24. exonu genu 24. exonu genu ATP8B1ATP8B1
T G G G G A C A T C G A T G T T G A T G T T A G G A C A T C G A T G ABases230 235 240 245 250 255 260
3117 TGGGGTCCTAACATCGATGATCCTCTTCTTCATAC
3117 TGGGGTCCTAACATCGATGATCCTCTTCTTCATAC
3122
ę
TTGATGTTAGGACATCGATG
3131 (3136 normální sekvence)
ę
ACATCGATGTTGATGTTAGG
Potvrzení delečně - inzerční mutacePotvrzení delečně - inzerční mutacemetodou RFLPmetodou RFLP
...CTTGTTGCATGGGGTCCTA ACATCGATGATC...
...GAACAACGTACCCCAGGAT TGTAGCTACTAG...
EcoO109I202 bp 167 bp
...CTTGTTGCATGGGGACATCGATGTTGATGTTAGGACATCGATGATC...
...GAACAACGTACCCCTGTAGCTACAACTACAATCCTGTAGCTACTAG...
Bsp143I
Bsp143I
167 bp233 bp
16 bp
Závěr IZávěr I
1. Fenotyp choroby je u studovaného nemocného podmíněn dvěma různými mutacemi v genu ATP8B1/FIC1
2. Bodová mutace T1982C (I661T) je známá mutace asociovaná s BRIC bez progrese jaterního onemocnění
3. Mutace v pozici 3122 je dosud neznámá delečně - inzerční mutace, jejímž důsledkem je záměna dvou hydrofobních aminokyselin 1041 Val-Leu uprostřed 7. membránové domény proteinu ATP8B1/FIC1 za Asp--Ile-Asp--Val-Asp--Val-Arg+ vedoucí pravděpodobně k chybnému vložení proteinu do buněčné membrány a tím k narušení jeho funkce
Závěr IIZávěr II
4. Studovaný nemocný je prvním případem složeného heterozygota s BRIC
5. Mutace nalezená v exonu 24 je novou v pořadí čtvrtou mutací nalezenou u pacienta s tímto onemocněním
6. Prognóza pacienta M.K. je vzhledem k heterozygotnímu stavu pro mutaci T1982C (I661T) pravděpodobně příznivá
?Máte v péči nemocné s chronickou cholestázou či s konjugovanou hyperbilirubinémií nejasné etiologie?
Nabízíme spolupráci při jejich vyšetřování.
Kontakt: MUDr. Milan Jirsa, CSc. Laboratoř experimentální hepatologie IKEM e-mail: [email protected]