1

1

PAT –kvalitativní a kvantitativní

stanovení na ID-gelových kartách

Eliška RýznarováLAB-MED Systems s.r.o.

2

Princip testu

Přímým antiglobulinovým(Coombsovým) testem (PAT)prokazujeme in vivo navázanéimunoglobuliny a nebo složkykomplementu na erytrocyty. Prokazujeme senzibilizaci ery.

3

Kdy se PAT provádí (1)V případě podezření na: 1. hemolytické onemocnění novorozenců

(HON)2. autoimunní hemolytickou anémii (AIHA)3. hemolytickou transfuzní reakci (HTR)4. medikaméntozně indukovanou hemolýzu

Dále jako:5. Negativní kontrola při průkazu ery antigenů

nepřímým Coombsovým testem (NAT)4

Kdy se PAT provádí (2)

6. V případě podezřelých laboratorních nálezů:

• pozitivní ctl / Rh kontrola• pozitivní autokontrola (vlastní ery +

vlastní sérum/plazma)• pozitivní zkouška kompatibility vždy s

určitými ery dárce (v 1 případu na 70 až 80 000 obyvatel je u dárce PAT + )

2

5

Klinický význam PAT

• Pozitivní PAT při HON, AIHA nebo HTRdiagnostikuje urychlenou destrukci eryna imunologickém podkladě s intra neboextravaskulární hemolýzou ve sleziněnebo játrech.

• Stupeň hemolýzy ery závisí na množstvínavázaných Ig nebo komplementu.

6

Lýza ery

Intravaskulární hemolýza:• vždy při inkompatibilitě v AB0 a jiných

systémech, kdy protilátka aktivuje komplement

Extravaskulární hemolýza:• v případě, kdy protilátky komplement

neváží a senzibilizované ery jsou odstraňovány v RES

7

Imunoglobuliny IgG (1)• Rozděleny do 4 podtříd: IgG1, 2, 3, 4• IgG1 a IgG3 mohou aktivovat komplement• IgG2 a IgG4 aktivují komplement zřídka• Podtřídy IgG1 a IgG3 jsou považovány za

klinicky významné• Aby mohlo dojít k indukci fagocytózy, musí

být erytrocyt pokryt:- 1 000 až 4 000 molekulami IgG1- nebo 135 až 500 molekulami IgG3

8

Imunoglobuliny IgG (2)

Ery senzibilizované IgG mohou být předmětem:- rychlého odbourávání fagocytózou- a nebo na protilátkách závislou a buňkami

zprostředkovanou cytotoxicitou, vyúsťující v extravaskulární hemolýzu ery ve slezině či játrech (ADCC- antibody dependent cell cytotoxicity)

3

9

Technika a citlivost PAT (1)

PAT by měl být prováděn s polyspecifickým AGH, obsahujícímalespoň anti-IgG + C3d

10

Technika a citlivost PAT (2)

PAT je pozitivní, pokud je na erytrocyt vázáno:• 100 až 500 molekul IgG• 400 až 1100 molekul C3d složky komplementu

Poznámka:• Při vazbě komplementu in vivo zůstává na

povrchu obvykle jen fragment C3d, což je způsobeno enzymatickou aktivitou v krevním oběhu pacienta.

• Komplement vázaný in vitro je obvykle C3b (C3c + C3d).

11

Pozitivní PAT (1)• Nutné další testování – zjištění příčiny.• Ne každý pozitivní PAT je však spojen se

zkrácenou dobou přežívání ery.• Negativní PAT nevylučuje možnost procesu

hemolýzy:- daná protilátka může mít nízkou afinitu- vazbu Ig na ery nemůžeme prokázat,

protože je pod prahem citlivostilaboratorního testování

12

Pozitivní PAT (2)

• Je nutno posuzovat společně s klinickým obrazem a dalšími laboratorními parametry:

- hemoglobin (Hb)

- hematokrit (Hk)- laktátdehydrogenáza (LDH)- haptoglobin- retikulocyty

- hladina imunoglobulinů

4

13

PAT a CTL

Reakce nemusí spolu vzájemně souhlasit:

• U pozitivní CTL je často také PAT pozitivní• U pozitivního PAT je obvykle CTL negativní• U negativní CTL může být PAT pozitivní

CTL není náhradou za PAT.

14

Příklad: HON, novorozenec B Rh+, CcD.ee, K-matka anti-D

Novorozenec: při vyšetření KS, fenotypu Rh a Kna ID-Kartě zjištěny rozdíly:• s polyklonálními reagenty falešně pozitivní

reakce na 4+, ctl 4+ • s monoklonálními reagenty ctl negativní a reakce

s anti-D negativní, nutno ověřit Rh po eluci(zablokované ery anti-D protilátkou od matky a nemožnost reakce s dg. anti-D?)

• ID-Karta „DC-Screening I“ – prokázána senzibilizace ery novorozence IgG na 4+

• Provedena eluce protilátek z ery novorozence. Zjištěno: v eluátu anti-D a ery novorozence Rh+ !

15

pokračování: Jaké Rh má novorozenec ?

Nespecifické reakce s dg.polyklonálními, opakovános dg.monoklonálními. Třeba vyšetřit PAT !

16

pokračování: Novorozenec – prokázána senzibilizace ery IgG na 4+

ID-Karta „DC-Screening I“

5

17

Pokračování: Novorozenec – prokázána senzibilizace ery IgG – jaké je Rh ?

Je novorozenec Rh negativní nebo Rh pozitivní?

Třeba ověřit po eluci.

18

Pokračování: V eluátu z ery novorozence prokázána anti-D protilátka

Vyšetření eluátu proti

panelu typových ery:

zjištěna anti-D

autokontrola:

vlastní ery + vlastní sérum

pozitivní =

volná anti-D v séru

19

Závěr: Novorozenec je po eluci protilátky anti-D chloroquinem Rh pozitivní!

Epitopy D antigenu

na ery novorozence

byly zablokovány anti-D

protilátkou od matky.

Po eluci reagují ery

pozitivně s anti-D

na ID-Kartě

s monoklonálními dg.

20

ID gelové karty

1. „LISS / Coombs“ (anti-IgG, - C3d)

2. „Coombs Anti-IgG“3. „DC - Screening II“ (IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl)

4. „DC - Screening I“ (IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl)

5. „DAT IgG- Dilution“ (anti-IgG 1:10, 1:30, 1:100,

1:300, 1:1000, ctl)

6. „DAT IgG1 / IgG 3“ (anti-IgG1 1:1, 1:100 / anti-IgG3 1:1, 1:100 / anti-IgG 1:10)

6

21

1. „LISS / Coombs“• ID-Karta LISS/Coombs se používá pro rutinní

testování PAT (NAT: protilátek, zk.kompatibility)• ID-Karta se 6 mikrozkumavkami, obsahuje

polyspecifické AGH (králičí anti-IgG, monoklonálníanti-C3d, klon C 139-9)

• Anti-IgG není specifický pro těžké (H) řetězce γ, může reagovat i s lehkými (L) řetězci Kappa a Lambda – tedy s i s IgA a IgM. Poznámka: Vzájemný poměr lehkých řetězců Kappa a Lambda ve všech molekulách Ig v organismu je specifický pro každý živočišný druh. U člověka je 65:35.

• Vyšetřované ery se ředí ID-Diluentem 2 (50µl)• Do ID-Karty 50µl ery, 10 min v ID-Centrifuze

22

„LISS / Coombs“ pozitivní výsledek

23

2. „Coombs Anti-IgG“

• ID-Karta se 6 mikrozkumavkami, obsahujekráličí anti-IgG.

• Detekce anti-IgG je nejdůležitější funkcíAGH.

• Použití anti-IgG AGH neinterferuje se složkami komplementu, které se mohou vázat na ery nespecificky.

• Protilátky, detekovatelné pouze díky jejich schopnosti vázat komplement jsou ojedinělé.

24

3. „DC- Screening II“

ID-Karta je pro vyšetření 2 pacientů aobsahuje: IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl

• ID-Karta umožní v jednom kroku rozlišit mezi IgG nebo C3d vázanými na ery

• Ery nepropírat (aby se vazba komplementu neuvolnila), ředit v ID-Diluentu 2

7

25

4. „DC- Screening I“

• ID-Karta obsahuje:IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl

• ID-Karta umožní v jednom kroku rozlišit mezi IgG, IgA, IgM a složkami komplementu C3c nebo C3d vázanými na ery

• Ery nepropírat (aby se vazba komplementu a IgM

neuvolnila), ředit v ID-Diluentu 226

„DC- Screening I“„DC-Screening II“

• Umožní v jednom kroku rozlišit mezi třídami Ig nebo komplementem, vázaným na ery:IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl (DC-Scr.I) IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl (DC-Scr.II)

• Detekce IgG navázaných na ery je nejdůležitější funkcí AGH, nicménědetekce složek komplementu je důležitápři vyšetřování pacientů s AIHA.

27

„DC-Screening I a II“ – hodnocení výsledků (1)

Výsledky testování s monospecifickými reagentypomáhají definovat klinický stav pacienta:• Smíšený typ AIHA – průkaz IgG i C3• AIHA s tepelnými protilátkami (WAIHA – warm

auto-immune haemolytic anaemia)- nejčastěji je prokazována IgG senzibilizace ery- ve 24 % IgG i C3- v 7% pouze samotný komplement- mohou být přítomny i IgM, IgA

28

„DC-Screening I a II“ – hodnocení výsledků (2)

• Onemocnění chladových aglutininů(CAD – Cold Agglutinin Disease):- častá senzibilizace ery pouze složkami komplementu- mohou být přítomny i IgM, IgA

• Paroxysmální chladová hemoglobinurie(PCH – Paroxysmal Cold Haemoglobinuria):- senzibilizace ery pouze složkami komplementu- pokud ale ery předem propereme 4°C fyziologickým

roztokem, pak lze detekovat také IgG autoprotilátky• K rozlišení CAD od PCH napomáhá test průkazu

bifázických hemolyzinů: Donath-Landsteinerův test (diagnostikuje chladovou hemoglobinurii)

8

29

5. „DAT IgG - Dilution“ (1)

ID-Karta:

• Umožňuje indikaci klinické závažnosti pozitivního výsledku PAT v souvislosti s AIHA, HTR a HON a odhad rizika hemolýzy nebo HON.

• Je určena k posouzení relativního množství IgG vázaného na ery

• V případech, kdy je pozitivní NAT lze takéstanovit hladinu IgG i séru /plazmě pomocíkorespondujících ID-DiaCell

30

„DAT IgG - Dilution“ (2)

ID-Karta:• Obsahuje anti-IgG v ředění:

1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, ctl• Testované ery musí být předem 3 x

proprány a naředěny na 0,8% suspenzi ID-Diluentem 2

• Po pipetování ery do karet, ihned centrifugovat 10 min v ID-Centrifuze

31

„DAT IgG - Dilution“ hodnocení reakcí

Titr anti-IgG:

Titr 1:30 je nezávažný, stanovení podtříd není nutné

Titr 1:300 je klinicky závažný s rizikem hemolýzy, stanovení podtříd je nezbytné

----±2+reakce

ctl1:10001:3001 : 1001 : 301 : 10ředěníanti-IgG

--1+2+3+3+reakce

ctl1:10001:3001 : 1001 : 301 : 10ředěníanti-IgG

32

„DAT Anti-IgG Dilution“titr 1:1000 závažné riziko hemolýzy

9

33

„DAT Anti-IgG Dilution“titr 1:1000 závažné riziko hemolýzy

do titru 1:30 je riziko nezávažné

34

6. „DAT IgG1 / IgG3“ (1)• ID-Karta je určena k diferenciaci mezi nízkou a

vysokou mírou rizika hemolýzy způsobené AIHA nebo HON

• ID-Karta umožní definovat rizikové množstvíklinicky závažných podtříd IgG, IgG1 a IgG3 vázaných na ery

• ID-Karta obsahuje dvě různá ředění anti-IgG1 a anti-IgG3 : anti-IgG1 1:1, 1:100

anti-IgG3 1:1, 1:100ctlanti-IgG 1:10

• Testované ery musí být předem 3 x proprány a naředěny ID-Diluentem 2

35

„DAT IgG1 / IgG3“ (2)

• Aby mohlo dojít k indukci fagocytózy, musí být erytrocyt pokryt:1000 - 4000 molekulami IgG1 nebo135 - 500 molekulami IgG3

• Na ID-Kartě představuje ředění 1:1 mez citlivosti:- pro anti-IgG1 cca 1000 IgG1 molekul / ery- pro anti-IgG3 cca 125 molekul IgG3 / ery

• Pozitivní reakce u druhého ředění 1:100 pak indukuje vysokou koncentraci IgG1 a IgG3 na erya vysoké riziko hemolýzy

36

„DAT IgG1 / IgG3“- hodnocení výsledků

Nízká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = nízké riziko hemolýzy

Vysoká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = vysoké riziko hemolýzy

vysoké

nízké

nízké

vysoké

vysoké

nízké

riziko

3+----2+reakce

3+-2+3+2+3+

3+--2+-2+

3+--2+--

3+-2+3+--

3+---2+3+

anti-IgG

1:10ctl

anti-IgG3

1:1 1:100

anti-IgG1

1:1 1:100

10

37

„DAT IgG1 / IgG3“- vysoké riziko hemolýzy

Nízká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = nízké riziko hemolýzy

Vysoká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = vysoké riziko hemolýzy

38

ZávěrPouze DiaMed nabízí kompletní řadu ID-Karet,která umožní komplexní řešení a dořešeníproblému při pozitivitě PAT:

1. „LISS / Coombs“ (anti-IgG, - C3d) 2. „Coombs Anti-IgG“3. „DC - Screening II“ (IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl)4. „DC - Screening I“ (IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl)5. „DAT IgG- Dilution“ (anti-IgG 1:10, 1:30, 1:100,

1:300, 1:1000, ctl)6. „DAT IgG1 / IgG 3“ (anti-IgG1 1:1, 1:100 / anti-IgG3

1:1, 1:100 / anti-IgG 1:10)

39Děkuji za pozornost