20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

PŘÍPRAVA, FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ VLASTNOSTI A VYUŽITÍ NANOČÁSTIC V BIOANALÝZE

PREPARATION, PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES AND APLLICATION OF NANOPARTICLES IN BIOANALYSES

Svobodová Ivona, Hezinová Věra, Lišková Marcela, Přikryl Jan, Maděránková Denisa, Klepárník Karel a Foret František

Ústav analytické chemie AV ČR, v.v.i., Veveří 97, 602 00 Brno, ČR, svobodova@iach.cz

Abstrakt

Nanočástice jsou definovány jako struktury, u nichž nejméně jeden rozměr nepřesahuje velikost jednotek až

stovek nanometrů. Nejčastěji studované a používané nanočástice jsou magnetické nanočástice, kovové

nanočástice (např. Au, Ag, Ni) a polovodičové nanokrystaly. Polovodičové nanočástice, známé též jako

kvantové tečky, jsou používány jako luminiscenční značky v analytické chemii, molekulární biologii a

medicíně. Jsou tvořeny polovodičovým jádrem tvořeným kombinací prvků II. a VI. nebo III. a V. skupiny,

které může být stabilizováno obalem (např. CdS, ZnS). Ve vodě rozpustné tečky jsou modifikovány polárními

molekulami kovalentně vázanými na jejich povrchu.

Připravili jsme řadu nanočástic na bázi CdTe o velikosti 2,5 až 5,2 nm a vlnové délce fluorescenčního

emisního maxima 500 až 750 nm. V prezentaci budou ukázány charakteristické parametry: excitační a

emisní fluorescenční spektra, doba života fluorescence, kvantový výtěžek fluorescence, separace pomocí

kapilární elektroforézy s detekcí laserem indukované fluorescence, snímky z transmisní elektronové

mikroskopie a velikosti nanočástic změřené ve formě aerosolu. Možnosti konjugace nanočástic s funkčními

biomolekulami např. protilátkami nebo proteiny a makrocyklickými ligandy budou demonstrovány na

imunofluorescenčních analýzách a Försterově rezonančním přenosu energie.

Dále jsme zkoumali možnosti konjugace nanočástic zlata s protilátkami. Takto značené protilátky mohou

nalézt uplatnění v medicíně při léčbě nádorů. Protilátka se selektivně naváže na nádorové buňky a následně

se tkáň ozáří světlem, které absorbují zlaté nanočástice mnohonásobně více než okolní tkáň. Tímto

způsobem může dojít k tepelnému zničení označené tkáně. Na površích nanočástic prvků podskupiny IB

(Cu, Ag, Au) dochází také k mnohonásobnému zvýšení signálu Ramanova rozptylu adsorbovaných molekul.

Tato metoda se nazývá spektrometrie povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS). V tomto příspěvku

budou ukázána Ramanova spektra karotenu zesílená na povrchu koloidní suspenze stříbrných nanočástic.

Abstract

Nanoparticles are structures with sizes from one to hundreds nanometers. The mostly investigated ones are

magnetic nanoparticles, metal nanoparticles (e.g. Au, Ag, Ni) and semiconductor nanocrystals so called

quantum dots. Quantum dots are used as luminescent labels in analytical chemistry, molecular biology and

medicine. They consist of semiconductor core which should be stabilized by a shell (e.g. CdS, ZnS). Their

surface is modified by covalently bonded polar molecules to increase hydrophilicity.

A set of CdTe nanoparticles with sizes from 2.5 to 5.2 nm and fluorescence emission wavelength maximum

between 500 and 750 nm was prepared. Characteristic parameters as an excitation and emission

fluorescence spectra, fluorescence lifetime, fluorescence quantum yield, separation using capillary

electrophoresis with laser induced fluorescence detection, nanoparticle size determination using

20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

transmission electron microscopy and free mobility particle sizer will be shown. The possibility of

nanoparticle conjugation with functional biomolecules will be demonstrated on immunofluorescence analyses

and Förster resonance energy transfer.

The possibilities of conjugation of gold nanoparticles with antibodies were studied as well. These conjugates

should find applications in medicine in tumor treatment. Antibody is selectively bonded to the tumor cells and,

consequently, they are irradiated by visible light, which is absorbed by gold nanoparticles. The tumor cells

are thermally destroyed by this process. Extensive enhancement of Raman scattering signal of adsorbed

molecules occur on the surface of the nanoparticles Cu, Ag, Au. This signal enhancement utilizes surface

enhanced Raman scattering spectrometry. The Raman spectra of carotene enhanced on colloid silver

nanoparticle surface was measured.

1. ÚVOD

Nanočástice jsou struktury, které mají alespoň jeden rozměr v řádu jednotek až stovek nanometrů, a jsou

dostatečně malé, aby se v nich mohly uplatňovat kvantové jevy. Nanostruktury lze dělit podle chemického

složení na kovové (např. Au, Ag, Ni, Fe2O3), polovodičové – kvantové tečky (např. CdTe, CdSe) a nekovové

(např. uhlíkové nanotrubky). Další možností je dělení podle struktury na částice, tyčinky, trubky, atd.

2. KVANTOVÉ TEČKY

Kvantové tečky jsou polovodičové nanočástice skládající se z polovodičového jádra, které může být

stabilizováno obalem z anorganických solí, nejčastěji CdS a ZnS [1]. Rozpustnost ve vodě je zajištěna

nabitými organickými molekulami, které jsou kovaletně vázány na povrch kvantové tečky pomocí thiolových

skupin [2]. Tyto molekuly mohou sloužit pro navázání dalších funkčích ligandů nebo biomolekul [3, 4].

Kvantové tečky nacházejí použití jako fluorescenční značky v analytické chemii, molekulární biologii a

medicíně díky svým výborným optickým vlastnostem. Vyznačují se úzkými a symetrickými emisními spektry,

širokými excitačními spektry, dobrou chemickou i foto- stabilitou [5] a vlnová délka emise je závislá na

velikosti částice [2].

2.1 Příprava a fyzikálně-chemické vlastnosti

CdTe kvantové tečky rozpustné ve vodě byly připraveny reakcí chloridu kademnatého s hydrogenteluridem

sodným v přítomnosti kyseliny 3-merkaptopropionové (MPA) v poměru 2:1:4,8 [6]. Nejprve byl připraven

hydrogentelurid sodný reakcí 85 mg boritanu sodného se 127 mg práškového teluru v 2 ml deionizované

vody. Reakce probíhala při 0 ºC přibližně 4 hodiny. Potom byly 2 ml tmavě fialového roztoku NaHTe přidány

k roztoku 370 mg CdCl2 s 420 l MPA v 80 ml deionizované vody probublávaném 30 minut N2. pH roztoku

bylo nastaveno na 7 pomocí NaOH a MPA. Reakční směs potom byla zahřívána pod zpětným chladičem.

Velikost kvantových teček a maximum jejich emise závisí na době varu reakční směsi. Takto byly během

jediné syntézy připraveny částice o velikostech od 2,5 nm (10 minut varu) až po 5,2 nm (44 hodin varu)

s maximem vlnových délek emise od 500 do 750 nm a pološířkou emisního pásu od 45 do 100 nm Obr. 1.

Excitační spektra všech připravených nanočástic byla skoro stejná a široká od 300 do 500 nm.

20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

Obr.1 Luminiscenční emisní spektra kvantových teček s různou dobou varu reakční směsi, spektra byla

normallizována

Doba života a kvantový výtěžek luminiscence, veličiny používané v analytické chemii pro charakterizaci

fluoroforů, byly změřeny pomocí časově rozlišené fluorescenční spektroskopie a fluorescenční

spektroskopie. Bylo zjištěno, že doba života fluorescence roste s velikostí částice od 3,05 do 20,5 ns. Doba

života fluorescence nejmenších měřených kvantových teček (3,05 ns) je srovnatelná s dobou života

nízkomolekulárních fluoroforů, např. fluoresceinu (3,8 ns). Pro měření kvantového výtěžku byla použita

srovnávací metoda [7] a jako referenční fluorofor byl použit

fluorescein rozpuštěný v etanolu s kvantovým výtěžkem 0,91.

Kvantový výtětžek připravených částic byl v rozmezí 0,01 až

0,25.

Úzká emisní a široká excitační spektra jsou výhodou pro

paralelní stanovení několika různých analytů značených

kvantovými tečkami o různé velikosti. Výhodou je možnost

použití jediného excitačního zdroje pro všechny fluorofory

místo několika světelných zdrojů pro každou fluorescenční

značku zvlášť. Odolnost proti fotodegradaci umožňuje sběr

signálu po dlouhou dobu a opakovaná měření jednoho

vzorku bez ztráty intenzity signálu.

Obr. 2 HRTEM snímek CdTe kvantových teček s maximem vlnové délky emise 610 nm a velikosti 3,5 n

20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

Velikost syntetizovaných nanočástic byla ověřena dvěma nezávislými metodami a to vysoce rozlišující

transmisní elektronovou mikroskopií (HRTEM) Obr.2. a přístrojem pro určování velikosti částic v aerosolu

(Scanning Mobility Particle Sizer Spectrometr – SMPS). Oběma metodami byly potvrzeny vypočtené velikosti

nanočástic odvozené od vlnové délky maxima emise [2]. HRTEM byla stanovena krystalová mřížka F 43m

s velikostí jedné buňky a = 6,48 Å, což se shoduje s údaji uvedenými v literatuře pro „makroskopický“ CdTe

[8].

2.2 Neselektivní značení buněk kvantovými tečkami

Bylo studováno neselektivní značení buněk kvantovými

tečkami. Pro používání kvantových teček konjugovaných

s funkčními biomolekulami pro specifické a selektivní značení

analytů v buňkách je nezbytné znát dobu pronikání

nanočástic do buněk. Jako modelové buňky regující na

změny v jejich okolí byly vybrány lidské lymfocyty a kvasinky

Saccharomyces cerevisiae. Buňky byly smíchány s

kvantovými tečkami a průnik do buněk byl sledován pomocí

dvou technik: epifluorescenční mikroskopie a TIRF

mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence). TIRF

mikroskopie umožňuje, podobně jako konfokální mikroskopie,

pozorování tenké vrstvy preparátu v řádu stovek nanometrů.

Tímto dochází k výraznému zvyšení kontrastu získaných

snímků Obr. 3. Pronikání nanočástic do buněk bylo patrné po

3 hodinách v případě kvasinek a po 30 minutách u lidských

lymfocytů Obr. 4.

Obr. 3

Lidský lymfocyt neselektivně značený QD

pozorovaný TIRF technikou

Obr. 4 Pronikání nekonjugovaných kvantových teček do lidských lymfocytů (A) a kvasinek Saccharomyces

cerevisiae (B)

2.3 Konjugace kvantových teček s protilátkami a makrocyklickými ligandy

Kvantové tečky pokryté MPA byly konjugovány s molekulami obsahujícími primární aminoskupinu pomocí

reakce s hydrochloridem 1-ethyl-3-(3-dimethyl-3-aminopropyl) karbodiimidu (EDC) a N-

20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

hydroxysulfosukcinimidem (NHS) za vzniku peptidické vazby mezi karboxylovou skupinou a primární amino

skupinou [9]. NHS bylo přidáváno pro zvýšení stability aktivního intermediátu v pH 5 až 7. Nejprve bylo

100 ml kvantových teček o koncentraci 2,6 mg.ml-1 rozpuštěných ve fosfátovém pufru pH = 7,4 smícháno se

3 mg EDC a 0,5 mg NHS. Potom byla přidána protilátka nebo ligand a reakční směs byla ponechána 60

minut při laboratorní teplotě. Byly optimalizovány poměry kvantových teček a ligandů. Konjugace byla

kontrolována pomocí kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescenční detekcí (CE-LIF). Pro

měření byla použita nepokrytá kapilára o průměru 75 m, efektivní délce 12 cm a celkové délce 20 cm,

separační pufr 100 mM TRIS/TAPS o pH = 8,3 a napětí 6 kV.

Makrocyklické ligandy se vyznačují tvorbou velmi termodynamicky stabilních a kineticky inertních komplexů

s ionty kovů. Skládají se z cykloalkanového kruhu se čtyřmi atomy dusíku, přes které jsou vázány ramena

s různými funkčními skupinami. Tato ramena, spolu s velikostí kruhu, určují selektivitu daného ligandu

k iontu kovu a zároveň mohou sloužit k navázání fluorescenční značky nebo funkční biomolekuly. Konjugát

makrocyklického ligandu s kvantovou tečkou bude použit jako fluorescenční sonda pro měření Försterova

rezonančního energetického posunu (FRET). S kvantovými tečkami byl konjugován makrocyklický ligand

MPI (1,4,7-triacetyl-10-aminopentyl-1,4,7,10-tetraazacyklododekan). Konjugace byla ověřena metodou CE-

LIF Obr.5.

Obr. 5 CE-LIF CdTe kvantových teček a konjugátu kvantových teček s MPI

Na testování možnosti využití kvantových teček jako luminiscenčních značek v imunoanalýze byla vybrána

protilátka membránovému proteinu CD3 (anti-CD3). Tento protein je specifický pro lidské T-lymfocyty. B-

lymfocyty tento protein neobsahují. Protilátka anti-CD3 byla konjugována jak s kvantovými tečkami, tak pro

kontrolu, s fluoresceinem. Tyto konjugáty byly přidány do směsi T- a B-lymfocytů a sledováno jejich značení

pomocí epifluorescenčního mikroskopu. V případě T-lymfocytů bylo pozorováno značení bezprostředně po

smíchání Obr.6 A a B, zatímco v případě B-lymfocytů žádné značení pozorovatené nebylo Obr.6 C.

Fluorescence pozadí na Obr.6 C je dána dlouhou dobou expozice (10 – 100x delší než v případě Obr.6 A a

B) a je zachycena fluorescence kvantových teček v roztoku.

20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

Obr. 6 Lidské T-lymfocyty značené konjugátem anti-CD3 s kvantovými tečkami (A), s fluoresceinem (B) a

lidské B-lymfocyty ve směsi s konjugátem anti-CD3 s kvantovými tečkami (C)

3. KONJUGACE ZLATÝCH NANOČÁSTIC S PROTILÁTKAMI

Protilátky značené zlatými nanočásticemi mohou nalézt uplatnění v medicíně při léčbě nádorů, ve

fotodynamické terapii. Fotodynamická terapie je diagnostická a léčebná metoda, kdy se do organismu

aplikuje fotosenzitivní látka, která se přednostně hromadí v nádorových buňkách. Po osvícení tkáně světlem

dochází k jeho absorpci fotosenzitivní látkou a k tepelnému zničení označené tkáně. Jako fotosenzitivní látky

jsou používány deriváty hematoporfyrinu, chloriny, ftalocyaniny, bakteriochloriny, purpuriny a další. Au

nanočástice konjugovaná s protilátkou je zkoumána jako potenciální fotosenzitivní látka s vysokou

selektivitou k buňkám cílové tkáně.

Byla testována možnost konjugace protilátek s Au nanočásticemi stejným postupem jako v případě

konjugací s kvantovými tečkami. Karboxylová skupina kyseliny 3-merkaptopropionové na povrchu Au

nanočástice reagovala s amino skupinou protilátky za vzniku peptidické vazby v přítomnosti konjugačních

činidel EDC a NHS. Konjugace byla kontolována konjugací s protilátkou anti-CD51 značenou fluorescenčně

pomocí fluorescein thiokyanátu (FITC). Komplex Au nanočástice-anti-CD51-FITC byl centrifugován

v kapilární baničce a konjugace byla potvrzena fluorescencí nanočástic usazených ve špičce kapiláry

sledovaná pomocí epifluorescenčního mikroskopu Obr.7.

Obr. 7 Au nanočástice konjugované s protilátkou anti-CD51 fluorescenčně značenou FITC A) bílé světlo, B)

fluorescence excitovaná laserem 473 nm

4. VYUŽITÍ STŘÍBRNÝCH NANOČÁSTIC V SERS

Povrchově zesílená Ramanova spektroskopie (SERS) využívá zesílení signálu Ramanova rozptylu

elektromagnetickým zesílením a chemickým zesílením. K elektromagnetickému zesílení dochází vybuzením

A B C

A

B

20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

povrchového plazmonu na povrchu kovové nanočástice nebo drsném kovovém povrchu, nejčastěji z Ag, Au,

Cu a alkalických kovů. Povrchvý plazmon je hromadná excitace vodivostních elektronů kovových materiálů

při vybuzení elektromagnetickým polem o vlnových délkách ve viditelné oblasti spektra. Toto zesílení může

dosáhnout až řádu 1012. SERS je využíván v analytické chemii, kdy zesílení signálu umožňuje měření

nízkých koncentrací látek až jednotlivých molekul. Jeho aplikace je limitována pouze schopností vytvořit

vhodné nanočástice a umístit analyt do jejich blízkosti. [10, 11]

Jako modelový analyt pro měření SERS byl vybrán -karoten. Klasické Ramanovo spektrum nebylo možno

na používaném přístroji naměřit, proto bylo pro identifikaci signálů -karotenu použito tabelovaných hodnot.

Stříbrné nanočástice byly připraveny podle postupu Lee a Meisela [12], kdy 250 ml 0,25 mM dusičnanu

stříbrného bylo přivedeno k varu a za stálého míchání bylo po kapkách přidáno 5 ml 1% citronanu sodného a

vařeno dalších 50 minut. Před měřením byl 1 ml částic odstředěn a dekantován. 20 l částic bylo

rozmícháno v 1 ml ethanolu s 4 l nasyceného roztoku NaCl, pro vytvoření klastrů nanočástic. K takto

připraveným nanočásticím byl přidán roztok -karotenu v chloroformu o koncentracích 2,5.10-3 až 2,5.10-6 M

a změřeno SERS spektrum Obr. 8.

Obr. 8 Srovnání SERS spekter -karotenu v Ag nanočásticích

5. ZÁVĚR

Byly připaveny nanočástice Au, Ag a CdTe, ověřena možnost jejich konjugace s makrocyklickými ligandy a

protilátkami a aplikace v bioanalytické chemii. Byly připraveny velikosti CdTe nanočástic pokrytých MPA od

2,5 nm po 5,2 nm a charakterizovány pomocí fluorescenčních spekter, doby života fluorescence, kvantového

výtěžku fluorescence, HRTEM a SMPS. Kvantové tečky s maximem emise 610 nm a Au nanočástice byly

konjugovány s protilátkami a makrocyklickým ligandem MPI pomocí činidel EDC a NHS. V případě

kvantových teček byla konjugace ověřena separací na CE-LIF a specifickou vazbou v buňkách. V případě

zlatých nanočástic konjugací s fluorescenčně značenou protilátkou a následnou centrifugací. Byla potvrzena

možnost využití konjugátů kvantových teček s protilátkami jako fluorescenčních značek v bioanalýze. Ag

nanočástice byly použity pro vybuzení povrchového plazmonu v SERS a bylo potvrzeno zvýšení intenzity

signálu Ramanova rozptylu -karotenu na jejich povrchu.

20. - 22. 10. 2009, Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika

6. PODĚKOVÁNÍ

Autoři děkují Dr. Marianě Klementové z Ústavu anorganické chemie AVČR za snímky struktur kvantových

teček pořízené vysoce rozlišovacím elektronovým mikroskopem, Mgr. Petru Táborskému, Ph.D. a doc. Janu

Preislerovi, Ph.D. z Ústavu chemie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity za spolupráci při měření

doby života fluorescence a kvantového výtěžku fluorescence, doc. Přemyslu Lubalovi, Ph.D. z Ústavu

chemie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity za poskytnutí makrocyklického ligandu MPI. Tato

práce byla podporována Grantovou agenturou Akademie věd České republiky (KAN400310651 a

KJB400310709), Grantovou agenturou České republiky (GA203/08/1680), Ministerstvem školství, mládeže a

tělovýchovy (LC06023) a AV0Z40310501.

LITERATURA

[1] van Embden, J., aj. Review of the Synthetic Chemistry Involved in the Production of Core/Shell

Semiconductor NanocrystalsAustralian Journal of Chemistry 2007, 60, 457-471.

[2] Eychmuller, A.; Rogach, A. L. Chemistry and photophysics of thiol-stabilized II-VI semiconductor

nanocrystalsPure and Applied Chemistry 2000, 72, 179-188.

[3] Burda, C., aj. Chemistry and properties of nanocrystals of different shapesChem. Rev. 2005, 105,

1025-1102.

[4] Klostranec, J. M.; Chan, W. C. W. Quantum dots in biological and biomedical research: Recent

progress and present challengesAdvanced Materials 2006, 18, 1953-1964.

[5] Ma, J., aj. Photostability of thiol-capped CdTe quantum dots in living cells: the effect of photo-

oxidationNanotechnology 2006, 17, 2083-2089.

[6] Li, L., aj. Significant enhancement of the quantum yield of CdTe nanocrystals synthesized in aqueous

phase by controlling the pH and concentrations of precursor solutionsJournal of Luminescence 2006,

116, 59-66.

[7] Eaton, D. F. Reference Materials for Fluorescence MeasurementPure and Applied Chemistry 1988,

60, 1107-1114.

[8] Zachariasen, W. H. Die kristallstruktur der telluride von zink, cadmium und quecksilber.Nor. Geol.

Tidsskr 1926, 8, 5.

[9] Hermanson, G. Bioconjugate techniques1995.

[10] Tian, Z. Q. Surface-enhanced Raman spectroscopy: advancements and applicationsJournal of Raman

Spectroscopy 2005, 36, 466-470.

[11] Sackmann, M.; Materny, A. Surface enhanced Raman scattering (SERS) - a quantitative analytical

tool?Journal of Raman Spectroscopy 2006, 37, 305-310.

[12] Lee, P. C.; Meisel, D. Adsorption and Surface-Enhanced Raman of Dyes on Silver and Gold

SolsJournal of Physical Chemistry 1982, 86, 3391-3395.