Příprava materiálu byla podpo řena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Část 9 – Kolony a stacionární fáze

Kolony pro HPLC Většina HPLC kolon je zhotovena z nerezové oceli 316, jedná se o chrom-nikl-

molybdenovou ocel, odolnou k běžným tlakům v HPLC a relativně inertní i vzhledem ke

korozi (chloridové a lithné ionty jsou výjimkou). Vnitřní povrch kolon by měl být hladký,

takže ocel musí být pečlivě vrtána, leštěna, nebo elektro-leštěna po běžné výrobě.

Skleněné trubice mohou být také použity jako chromatografické kolony. Jsou chemicky

inertní a nekorodují.

PEEK, je tlakově odolný plast použitelný nejen pro výrobu kapilár, ale i HPLC kolon.

Flexibilní polyethylenové trubice představují speciální typ kolonových systémů (Waters).

Stěny kolony mají snahu se přizpůsobit stacionární fázi a zamezit tak vzniku kanálků u stěn

kolony.

Kolony s vnitřním průměrem 2–5 mm jsou obecně používané pro analytické aplikace.

Kolony s větším vnitřním průměrem mezi 10 mm a jedním palcem (25,4 mm) mohou být

použity pro preparativní účely. Některé firmy nabízejí i kolony o větších průměrech i 30 cm a

více. Mikro a kapilární kolony mají vnitřní průměr do 1 mm.

Kolony délek 5, 10, 15 nebo 25 cm jsou nejběžnější pokud jsou plněny tzv.

mikropartikulárními stacionárními fázemi s velikostí částic 10 a méně mikrometrů. Pokud je

nutné dosáhnout většího počtu pater, je vhodnější aplikovat menší částice sorbentu než delší

kolonu. Delší kolona prodlužuje retenční čas, koncentrace analytu v eluovaném píku je nižší

a zhorší se limit detekce. Nicméně pro preparativní separace je běžná délka kolon do 1 m.

Obrázek níže znázorňuje různé konce kolon. První komerční kolony měly koncovky se

zakončením dle schématu A. Tato konfigurace je schopna vydržet léta, pokud není závit příliš

dotažen. Typ B je novější uspořádání než typ A. Verze C je kartridžový design. Kolona jako

taková nemá žádné koncovky, je proto levnější, dá se snadno vyměnit bez užití nástrojů a je

možno jich spojit několik za sebou (s použitím adaptéru) bez vzniku mimokolonových

prostor.

Kolona je uzavřena nerezovými fritami menších rozměrů/pórů než je velikost částic

sorbentu. Standardní rozměr pórů frity je 2.0 µm, ale pro částice 3,5 µm a menší, je třeba frity

s póry rozměru 0.5 µm. Pokud je frita ucpána je nejlepší ji vyměnit; pokud to nejde provést,

je vhodné zkusit čištění ultrazvukem.

Výhody kolon s malým průměrem

Kolony s malým vnitřním průměrem nabízí dvě hlavní výhody vzhledem ke kolonám

s větším průměrem:

(a) Menší spotřeba rozpouštědel (méně odpadů). Retenční objem VR je úměrný čtverci

vnitřního průměru kolony, dc:

VR ~ dc2 (protože

4)1(

2cc

R

LdkV

πε+= .

Pokud je potřeba 10 ml mobilní fáze k eluci analytu na koloně o vnitřním průměru 4.6 mm,

odpovídá to:

4.8 ml na kolně 3.2 mm i.d.,

1.9 ml na koloně 2.0 mm i.d.,

0.5 ml na koloně 1.0 mm i.d., (20x méně rozpouštědla!).

(b) Lepší poměr výšky signálu k hmotnosti analytu. Koncentrace látky v maximu píku cmax je

úměrná obrácené hodnotě čtverce vnitřního průměru kolony, dc:

cmax = 1/dc2 (protože

π2max

N

V

Vcc

R

ii= , a VR ~ dc2)

Když např. 1 µg analytu poskytne signál o výšce 0.1 mV na koloně o i.d. 4.6 mm, pak to

odpovídá:

0.21 mV na 3.2 mm i.d. koloně

0.53 mV na 2.0 mm i.d. koloně

2.1 mV na 1.0 mm i.d. koloně (signál 20x větší!).

Předkolony Jak je znázorněno na obrázku dole rozlišují se dva typy předkolon.

Předkolony umístěné před nástřikovým ventilem jsou užívány kondicionaci mobilní fáze.

Jejich náplně jsou částečně rozpouštěny, takže tento typ je označován jako “scavenger

column”. Každý solvent mírně rozpouští silikagel a tento efekt se zvětšuje se zvýšením jeho

polarity a zvýšením iontové síly a pH mobilní fáze. Scavenger column naplněná hrubými

částicemi silikagelu se využívá k ochraně separační kolony před rozpouštěním její stacionární

silikagelové náplně. Tím je dosaženo nasycení mobilní fáze rozpuštěnými produkty

z předklony a prodloužena životnost separační kolony.

Na druhou stranu, krátké “guard”ochranné kolony se používají k ochraně mezi injektorem

a hlavní kolonou. Tyto předklony jsou většinou plněny stejným nebo velmi podobným

sorbentem, jaký je v hlavní koloně a jejich smyslem je zabránit vstupu nečistot a silně

zadržovaných látek ze vzorku přímo na analytickou kolonu. To je zvlášť důležité pokud jsou

analyzovány biologické vzorky. Pokud je ochranná kolona dobře vybrána a instalována,

neovlivňuje separační schopnosti hlavní kolny. Ochranné předkolony jsou měněny pravidelně

po určité době nebo po jistém počtu nástřiků, a tím je opět prodlužována životnost separační

kolny.

Obecné vlastnosti stacionárních fází Vysoké počty pater jsou dosahovány jen když je zajištěna krátká difuzní dráha v pórech

stacionární fáze; proto jsou v HPLC preferovány mikročástice. Molekuly vzorku nemohou

penetrovat více než 2.5 µm v částici o velikosti 5 µm. Dva chromatogramy na obrázku níže

ukazují, jak se zvýší výkonnost systému použitím malých částic sorbetu. kolona plněná

částicemi s rozměrem 10 µm musí být 20 cm dlouhá (dole), aby poskytla účinnost 7000

teoretických pater, na druhou stranu kolona se sorbentem 3 µm poskytuje stejnou účinnost při

délce jen 6 cm. Analýza na delší koloně přitom trvá 15 min a na kratší jen desetinu uvedené

doby. Tento efekt velké úspory času je dán jednak kratší kolonou, ale i tím, že minimum van

Deemterovy závislosti leží při vyšších lineárních průtocích pro částice malých rozměrů ve

srovnání se sorbenty s větší velikostí částic. Avšak, je třeba také zmínit, že tlak na koloně

plněné sorbentem menšího zrna bude 10 x vyšší než na hrubším materiálu.

Velikostní distribuce sorbentu by měl být co nejužší (s poměrem velikosti nejmenší k

největší velikosti částic 1:1.5 nebo 1:20), protože nejmenší částice určují permeabilitu kolony

a největší možnou účinnost kolony. Malé částice způsobují velký odpor proti proudění

kapaliny a velké jsou důvodem velkého rozmytí píků. Z těchto důvodů je u řady komerčních

sorbentů uvedena i velikostní distribuce částic.

Velikostní distribuje ale většinou neříká nic o rozměrech částic s extrémními velikostmi.

V současnosti se v HPLC používají nejrůznější typy stacionárních fází: porézní částice,

neporézní částice malých rozměrů, částice mající porézní vrstvu a monolitické materiály.

Porézní částice

Jedná se o obvyklý typ HPLC stacionárních fází. Tyto materiály jsou velikosti 1,8; 3,0; 3,5;

5,0 nebo 10 µm. Platí, že účinnost vztažená na jednotku délky kolony vždy vzroste přibližně

2 x při poklesu velikosti částic z 10 na 5 a z 5 na 3 µm, tlak přitom vzroste pokaždé přibližně

4 x. Vnitřní struktura částic je plně porézní. Uvnitř pórů mobilní fáze skoro neproudí a analyt

se pohybuje především difúzí.

Neporézní částice, částice malých rozměrů

Pokud je stacionární fáze neporézní, složka odporu proti přenosu hmoty ve stacionární fází

přispívající k rozmývání píků, tj. složka C van Deemterovy závislosti, úplně zmizí nebo je

malá, protože analyt nedifunduje do vnitřního prostoru částic. Důsledkem je velmi plochá van

Deemterova závislost v pravé části s minimem posunutým k velkým lineárním rychlostem,

rychlá chromatografie se tak dá provozovat bez ztráty separační účinnosti. Kapacita sorbentu

je ale zhruba 50 x menší než u konvenčního plně porézního sorbentu a tlak na koloně je

vysoký. Retenční objem píků je nízký, protože póry v sorbentu neexistují; frakce kapaliny

v koloně (potozita kolony ε) je jen asi 0.4 ve srovnání s kolonou naplněnou klasickým

porézním materiálem, tam je kolonová porozita kolem 0.8. Proto musí být mimokolonové

objemy a časová konstanta velmi malé. Chromatografie biopolymerů bývá na tomto typu

sorbentů poměrně výhodná vzhledem ke zmenšení potíží s denaturací biolátek a jejich

výtěžností.

Částice s porézní vrstvou

Tyto částice jsou tvořeny neprostupným tedy neporézním jádrem a na jeho povrchu je

porézní vrstva aktivní stacionární fáze. Tento typ částic dnes prožívá velkou renesanci.

Perfuzní částice

Podobně jako neporézní částice i částice perfuzní byly navrženy pro rychlé separace

biopolymerů. Jsou tvořeny vysoce zesílenými částicemi styren-divinyl benzenu a obsahují

dva typy pórů: velmi velké “throughpores” s velikostí 600-800 nm a malé “diffusion pores“

s velikostí 80-150 nm. Aktivní stacionární fáze (např. reverzní, iontově výměnná nebo

afinitní) pokrývá celý vnitřní i vnější povrch částic. Velké póry umožňují protékání mobilní

fáze skrz částice a malé póry zajišťují dostatečně velký povrch částic pro interakce s

analytem. Separovaná látka je rychle transportována dovnitř a ven z částic a krátké difuzní

dráhy vedou k příznivému průběhu van Deemterovy závislosti a umožňují dosahování

separace makromolekul bez ztáty účinnosti i při vysokých průtocích mobilní fáze (obrázek

dole). Není potřeba, a ani to není možné, připravovat velmi malé částice tohoto sorbentu,

běžná velikost je 20 µm. Tlakový spád na kolonách je velmi malý.

Monolitické stacionární fáze

Je možné syntetizovat stacionární fáze ve formě jednolitých porézních monolitů organických

polymerů nebo silikagelu (viz obrázek níže). Při tomto konceptu není stacionární fáze tvořena

částicemi sorbentu, ale blokem porézního materiálu zaplňujícím kolonu. V případě

silikagelových monolitů velikost velkých pórů (kterými protéká mobilní fáze) je např. 2 µm a

tzv. mesopórů např. 12 nm. Tyto materiály mají porozitu více než 0.8, jejich separační

účinnost je podobná jako 3 µm porézního silikagelu, a van Deemterova křivka má velmi

výhodný tvar. Monolity navíc nepotřebují frity v kolonách na stabilizaci stacionární fáze.

Každá kolona je originální šarže. Často je možné na monolity nadávkovat poměrně

znečištěné vzorky (sérum, extrakt z potravin) bez ztráty separačních vlastností nebo zkrácení

životnosti kolony.

Silikagel Silikagel je sorbent s vynikajícími vlastnostmi. Může být použit také pro vylučovací

chromatografii a tvoří základní matrici pro mnoho tzv. chemicky vázaných stacionárních fází.

Je tvořen 3D sítí tvořenou atomy křemíku spojenými s atomy kyslíku. Níže uvedený obrázek

znázorňuje povrch silikagelu, je vidět že je pokryt OH skupinami, tzv. silanolovými

skupinami. Materiál je amorfní a má heterogenní povrch, není snadné jej tedy připravovat

definovaným způsobem. Ačkoli všechny funkční skupiny na povrchu mají adsorpční

vlastnosti, různé typy mají odlišné vlastnosti:

(a) volné silanoly jsou slabě kyselé, proto se na nich snadno adsorbují bazické látky. To často

vede k chvostování píků.

(b) geminální silanoly nejsou kyselé.

(c) asociované, vicinální, silanoly nejsou kyselé. Látky mající OH skupiny mají tendenci se

na nich adsorbovat.

(d) silanoly poblíž kationtů kovů jsou silně kyselé. Zvyšují heterogenitu povrchu sorbentu a

mohou značně nepříznivě ovlivnit dělení bazických látek.

(e) siloxany vznikají kondenzací asociovaných silanolů. Tepelné zpracování silikagelu

zvyšuje množství siloxanů a snižuje koncentraci siloxanů.

Silikagel může být připraven mnoha různými způsoby jako např. kompletní hydrolýzou

sodných silikátů nebo polykondenzací emulzifikovanáho polyethoxysilanu následovanou

dehydratací. Vzniklé gely poskytují částice nepravidelného i pravidelného tvaru v závislosti

na postupu přípravy; navíc vlastnosti konečného produktu jsou závislé na reakčních

podmínkách (pH, koncentraci, aditivech, rychlosti míchání velikosti nádoby). Jedním

z nejdůležitějších parametrů výchozích látek je obsah kovů, protože ty jsou odpovědné za

koncentraci výsledných kyselých silanolů. Běžné silikagely jsou kontaminovány až 250 ppm

sodíku a 150 ppm hliníku vedle dalších kationtů. Jejich povrchové reakce mohou být i

bazické podle typu a koncentrace inkorporovaných iontů. Moderní špičkové silikagely

obsahují méně než 1 ppm sodíku, vápníku, hořčíku a hliníku, a jen mírně vyšší množství

železa. Jenom takovéto silikagely jsou dobře použitelné pro dělení bazických látek jak

v normálním modu (nemodifikovaný silikagel), tak reverzním mechanizmem (ve formě

vázaných fází).

Vedle tvaru částic se silikagely různých výrobců mohou lišit i dalšími vlastnostmi:

(a) Velikost pórů: měla by být větší než 5 nm (50 Å). Makromolekuly musí být děleny na

makroporézním silikagelu (30nm = 300 Å nebo větším).

(b) Specifický povrch: je inverzně úměrný šířce pórů a uvádí se v m2 g-1: asi 100 m2 g-1 pro 30

nm silikagel, 300 m2 g-1 pro 10 nm silikagel a 500 m2 g-1 pro 6 nm materiál. Čím menší je

specifický povrch, tím menší je retence analytu při stejných chromatografických

podmínkách.

(c) Distribuce šířky pórů: úzká distribuce šířky pórů je důležitá pro dosažení symetrických

píků.

(d) Hustota: hustota silikagelu je asi 2.2 g cm-3; hustota naplnění v koloně (packing density)

je podle jednotlivých produktů v rozmezí od 0.3 do 0.6 g cm-3.

Silikagel je stabilní v rozsahu pH asi od 1 do 8. Silikagely s šířkou pórů do 400 nm (a

velikostí částic 10 µm) jsou užívány pro vylučovací chromatografii. Musí mít dobře

definovanou šířku pórů a minimální adsorpční vlastnosti.

Chemicky modifikované silikagely Silikagely mají OH skupiny (silanolové skupiny) na svém povrchu s ty mohou být chemicky

modifikovány, a tak poskytovat stacionární fáze se specifickými vlastnostmi. Obrázek dále

ukazuje některé možné reakce.

I. Silanolové skupiny mohou být esterifikovány alkoholy, ROH, kde R může být alkyl nebo

jiná funkční skupina. Ze sterických důvodů dochází k reakci především na povrchu silikagelu

a ne uvnitř struktury, takže navázané řetězce jsou orientovány ven ze sorbentu.

Esterifikovaný silikagel je náchylný k hydrolýze a nemůže být použit s mobilními fázemi

obsahujícími vodu nebo alkohol, produkty s Si-O-Si-C vazbami jsou mnohem důležitější.

II. reakce s thionyl chloridem SOCl2 poskytují chloridy reagující s aminy za vzniku vazby Si-

N. R může být různé. Výsledný produkt má lepší hydrolytickou stabilitu.

III. Silikagely s funkční skupinou vázanou vazbou Si-O-Si-C (reakcí s mono- nebo

dichlorsilanem) jsou nejběžnější.

Oktadecyl silan ODS, ve kterém R = -(CH2)17CH3, je nejčastěji používanou chemicky

vázanou fází. Je nepolární a je používán jako reverzní fáze.

Příklad přípravy chemicky vázané fáze: 100 ml suchého toluenu + 4 g suchého silikagelu

+ 2.5 ml suchého pyridinu jsou smíchány se čtyřnásobným přebytkem silanu RSi(CH3)Cl

(počítáno pro silikagel s pokrytím povrchu 2.4 skupiny na mm-2.). Teplota u držena 10 °C pod

bodem varu nejtěkavější složky po dobu 40až 150 h (podle skupiny R). Směs je čas od času

opatrně protřepána. Nakonec je produkt filtrován, promyt a vysušen.

Následné opracování trimethylchlorsilanem může snížit počet silanolových skupin, které

zůstaly ze sterických důvodů nezreagovány, to se označuje jako end-capping.

Možné funkční skupiny jsou uvedeny v tabulce.

Silikagel může být funkcionalizován vhodnými skupinami pro iontově výměnnou

chromatografii, afinitní chromatografii nebo dělení enantiomerů.

Chemická stabilita vázaných fází

Vysoké pH vede k rozpouštění silikagelové matrice stacionární fáze. Nízká hodnota pH vede

k hydrolýze siloxanové vazby: SiO-Si-R -> Si-OH + HO-Si-R. Malé funkční skupiny užívané

pro end capping jsou k hydrolýze zvláště málo odolné. Proto end-cappované fáze mění svoje

vlastnosti, pokud jsou provozovány v mobilních fázích s pH<3. Fáze modifikované delšími

alkylovými řetězci (např. oktadecyl) jsou stabilnější než fáze s řetězci kratšími (např.

dimethyl).

Chemická stabilita je vyšší pro materiály připravené z vysoce čistého silikagelu s malým

obsahem kovů, které jsou hustě pokryté end-cappovanou vázanou fází, pro jejíž přípravu bylo

použito derivatizační činidlo vedoucí k sterickému chránění vazby k silikagelu. Životnost

sorbentu klesá při vyšších teplotách, při vysoké koncentraci pufrů a při použití měně

vhodných pufrů: anorganické pufry jako je fosforečnan nebo uhličitan jsou agresivnější než

organické pufry jako je např. glycin.

Styren-divinylbenzen Zesítěný styren je všestranná stacionární fáze připravená kopolymerací styrenu a

divinylbenzenu (Figure 7.11).

Množství divinylbenzenu použité při reakci určuje stupeň zesítění, a tím strukturu pórů.

Polymery s menším obsahem divinylbenzenu než 6% nejsou tlakově stabilní a nejsou

použitelné jako HPLC sorbenty. Semi-rigidní polystyreny s 8% divinylbenzenu jsou stabilní

do 60 bar. Mění svůj objem v koloně v závislosti na rozpouštědle a iontové síle (např. botnají

při nízké a sráží se při vysoké iontové síle); takže pokud je solvent a jeho iontová síla

zvolena, není vhodné již mobilní fázi následně měnit. Rigidní polystyreny jsou plnohodnotné

vysokoúčinné sorbenty. Jsou vysoce zesítěné, a proto vůbec nebotnají a jsou stabilní asi do

350 bar.

Styren-divinyl benzenové fáze mohou být mikroporézní nebo mohou obsahovat mikro i

makrospory. Přítomnost makropórů s velikostí několik desítek nanometrů usnadňuje přístup

objemných analytů k aktivním centrům.

Na rozdíl od silikagelu jsou styren-divinylbenzenové fáze stabilní v rozmezí pH 1-13.

Styren-divinylbenzenové fáze jsou aplikovatelné pro chromatografii na obrácených fázích při

použití vodných mobilních fází a mají výbornou odolnost v extrémním pH, to rozšiřuje jejich

aplikovatelnost sorbentů ve srovnání s modifikovanými silikagely. Za užití méně polárních

rozpouštědel je možno pracovat v normálním/adsorpčním módu.

Měniče iontů jsou získány zavedením vhodných skupin do matrice sorbentu, jak je

znázorněno na obrázku. Podobnou cestou lze imobilizovat C18H37 skupiny; tento typ

oktadecylové fáze neobsahuje žádné zbytkové (nezreagované) OH skupiny nerozdíl od fází

na silikagelu.

Po zesítění vedoucí ke vzniku dobře definovaných pórů, představují styren-

divinylbenzenové fáze důležitý typ sorbentů určených pro vylučovací chromatografii.

Alumina

Alumina je zásaditá, nicméně vhodným zpracování lze připravit aluminu neutrální a kyselou

s tím, že neutrální forma je nejužívanější v adsorpční chromatografii. Bazická alumina je

slabý měnič kationtů, a kyselá slabý měnič aniontů. Alumina je zvlášť efektivní při děleních

polyaromatických uhlovodíků a strukturních izomerů. Na rozdíl od silikagelu je stabilní

v rozmezí pH 2-12. Je náchylnější k chemisorpci ve srovnání se silikagelem, především pro

kyselé komponenty, které mohou vykazovat chvostování. Alumina by neměla být zahřívána

nad 150°C. Kolony plněné aluminou poskytují menší účinnosti než kolony na bázi silikagelu.

Chemická derivatizace je možná, ale bývá nekovalentní.

Křemičitan hořečnatý

Musí být používána obezřetně, protože aromáty, aminy, estery a mnohé další látky mohou být

chemisorbovány.

Porézní sklo

Je připravováno kontrolovaným ”odskelněním” složek borosilikátového skla. Malé kapičky

B2O3 jsou segregovány a odstraňovány z matrice SiO2 parou. Tento materiál je znám jako

porézní sklo, sklo s kontrolovanou porozitou (CPG), a je tlakově stálé a má vynikající

chemickou stabilitu (s výjimkou k silným alkáliím), lze sterilizovat. Povrchové OH skupiny

je možno chemicky modifikovat podobně jako silikagel, a tak získat sorbenty pro adsorpční,

rozdělovací, iontově výměnnou, vylučovací a afinitní chromatografii.

Methakrylátové gely

Velký počet OH skupin v methakrylátových gelech dává těmto sorbentům vysokou polaritu a

tyto fáze mohou být přímo užity ke gelové filtraci nebo po derivatizaci pro afinitní

chromatografii. Hydroxylalkylové funkční skupiny bývají odvozeny od glykolu a glycerinu.

Hydroxylapatit

Jedná se hexagonálně krystalizovaný fosforečnan vápenatý, Ca(PO4)6(OH)2. Je připravován

v tlakově stabilní formě (do 150 bar) a je použitelný pro dělení bílkovin a jiných

biopolymerů.

Porézní grafitický uhlík

Porézní grafitický uhlík (PGC) je plně porézní sférická stacionární fáze vykazující jedinečné

reverzně fázové vlastnosti, ale může být použit i v normálním modu. PGC má krystalický

grafitický povrch. Je chemicky stabilní v rozmezí od 10 M kyseliny po 10 M zásady a snáší

vysokou teplotu. Selektivita (tj. eluční pořadí) je odlišná než na reverzních fázích na bázi

silikagelu. PGC je doporučován pro dělení vysoce polárních a ionizovaných látek a

stereoizomerů. Je vhodný pro separaci velkých poměrně rigidních molekul s mnoha

polárními skupinami, např. pro mnohé přírodní látky a léčiva. Obrázek ukazuje dělení dvou

izomerů proléčiva se sumarním složením C50H80N8O20PK.

Oxid titaničitý

Oxid titaničitý je krystalická forma TiO2 se zásaditými OH skupinami na povrchu (opak

oproti silikagelu), takže je stabilní za vysokých hodnot pH. Může být aplikován v normálním

i obráceném modu.

Oxid zirkoničitý

Oxid zirkoničitý má podobné vlastnosti jak oxid titaničitý, ale může interagovat s analyty

také ligandovou výměnou, neboť je Lewisovou kyselinou. Jeho chemická derivatizace je

možná. Pokrytí polybutadienem nebo polystyrenem poskytuje fázi stabilní v rozmezí pH

přinejmenším 1-13 a tepelnou stabilitou nejméně do 200 °C.

Fáze s omezeným přístupem

Tento speciální typ fází byl vyvinut pro analýzu léčiv a jejich metabolitů v séru (a dalších

tělních tekutinách). Pokud je správně zvoleno pH a iontová síla mobilní faze, nezachycuje

proteiny, ale selektivně malé středně polární analyty. Proto je možné na takovou kolonu

nastříknout přímo sérum, aniž by došlo k denaturaci proteinu a znehodnocení stacionární fáze

nevratnou sorpcí bílkovin. Jedna z možností syntézy uvedené stacionární fáze je představena

na obrázku. Šířka pórů je tak malá, že proteiny nemohou do pórů proniknout (podobný

princip jako vylučovací chromatografie). Navíc nemá vnější povrch absorpční ani

denaturující povahu. Stacionární fáze odpovědná za separační selektivitu je jen uvnitř pórů.

Péče o kolony a jejich regenerace Pokud kolona není používána, měla by být přechovávána v rozpouštědle, vzduchotěsně

uzavřená a neměla by být vystavena vibracím. Voda není příliš vhodným konzervačním

solventem, protože v ní poměrně snadno mohou začít růst bakterie. Pufry mohou

krystalizovat a ucpat kolonu.

Kolon musí být vždy řádně označena štítkem s označením solventu uvnitř.

Po dlouhé době používání kolony nebo při nedostačující opatrnosti během aplikace

kolony může dojít k nahromadění adsorbovaných látek především na jejím začátku, a tím ke

snížení dělící schopnosti kolony. Před tím, než je kolona vyřazena z provozu, je možné se

pokusit o regeneraci (ovšem bez záruky). Ochranná kolona musí být před zahájením

experimentů vyřazena ze systému. Bývá dobré zapojit kolonu v obráceném směru.

Silikagelové kolony

Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 1-3 ml min-1.

75 ml tetrahydrofuran;

75 ml methanol;

75 ml 1-5% vodná kyselina octová, pokud jsou přítomny zásadité nečistoty;

75 ml 1-5% vodný pyridin, pokud jsou přítomny kyselé nečistoty;

75 ml tetrahydrofuran;

75 ml terc-butylmethyl ether;

75 ml hexan (pokud je hexan použit jako následující mobilní fáze, jinak zastavte na etheru)

Pokud je dělící schopnost snížena příliš velkým množstvím adsorbované vody, je možné jí

odstranit chemicky s aplikací činidel připravených v laboratoři nebo komerčních činidel

(Alltech Associates, Deerfield, Illinois, USA).

Oktadecyl, oktyl, fenyl a nitrilové kolony

Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0.5-2,0 ml min-1.

75 ml voda + 4 x nástřik 100 µl dimethyl sulfoxidu;

75 ml metanol;

75 ml chloroform;

75 ml metanol.

Voda -> 0.1 M kyselina sírová -> voda je další možnost.

Pokud sorbent ztratil vázanou fázi, může být provedena příslušná silanizace sorbentu ve

snaze obnovit stacionární fázi.

Anexy

Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0.5-2,0 ml min-1.

75 ml voda;

75 ml metanol;

75 ml chloroform;

Metanol -> voda.

Katexy

Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0.5-2,0 ml min-1.

75 ml voda + 4 x nástřik 100 µl dimethyl sulfoxidu;

75 ml tetrahydrofuran;

voda.

Následující sekvence je vhodná pro anexy a katexy:

75 ml voda;

75 ml 0.1-0.5 M roztoku pufru používaného dříve (ke zvýšení iontové síly);

75 ml voda;

75 ml 0.1 M kyselina sírová;

75 ml voda;

75 ml aceton;

75 ml voda;

75 ml 0.1 M EDTA sodná sůl;

75 ml voda.

Pro styren-divinylbenzenové katexy: 0.2 M hydroxid sodný je čerpán přes noc za teploty

70 °C(k odstranění bakterií, které mohou být na povrchu částic).

Styren-divinylbenzenové kolony

Následující rozpouštědla jsou postupně čerpána kolonou při průtoku 0,5-2,0 ml min-1.

40 ml toluen nebo tetrahydrofuran (s obsahem peroxidů do 50 ppm);

200 ml 1% merkaptooctové kyseliny v tetrahydrofuranu nebo toluenu, pokud je kolona

ucpána styren-butadienovou gumou nebo přírodní nebo syntetickou gumou.

Speciální regenerační procedury jsou doporučeny pro kolny používané pro dělení

biopolymerů.

Plnění kolon

Kolony mohou být otevřeny pro kontrolu chromatografického lože. Pokud sorbent v koloně

zkolaboval, pak je kolona opravena podle následující procedury: (b) nadbytek sorbentu je

odstraněn špachtlí a zarovnán; (c) prázdný objem je doplněn skleněnými 35 µm kuličkami

nebo vhodným povrchově porézním sorbentem a kolona je uzavřena. Stará frita je nahrazena

novou fritou.

Kolony s 3 µm částicemi jsou často vybaveny odlišnými fritami, na vstupu 2 µm a

výstupu z kolony např. 0.5 µm.

Pochopitelně, pokud je o kolonu dobře postaráno (potlačení pulzů, správná příprava

mobilní fáze, zamezení srážení v koloně, apod.), není třeba kolonu regenerovat. Na uvedené

téma publikoval řadu výborných prací Rabel, Nugent a Dolan.

Prázdný prostor v koloně s kolabovanou stacionární fází vybavenou tzv. axiální kompresí

je snadno eliminován posunutím pístu kolony.

Vyprazdňování kolon

Obsah kolon by neměl být vyprazdňován špachtlí, drátkem apod., neboť může dojít

k poškrábání vnitřního povrchu kolon. Nejvhodnější je odejmout jednu koncovku a tlakem

stacionární fázi z kolony vysunout.

Směr toku

Nejlepší je používat kolonu stále ve stejném směru nebo vědět, z jakého důvodu byl směr

změněn. Řada kolon má na svém povrchu vyznačen směr toku a tehdy není zřejmé, jestli je

možné otočit kolonu. Pokud mají frity na obou koncích kolony stejnou velikost otvorů, je

možné kolonu otočit, pokud tomu tak není, platí, že frita s většími otvory by měla být na

vstupu solventu do kolony. Když kolona směr průtoku označen nemá, je vhodné na ní směr

vyznačit. Kolona by pak měla být používána v tomto směru, prach a sorbující se látky jsou

zadrženy na začátku kolony. Kolona by měl být zapojena v opačném směru jen při

regeneraci.